CN113913504A - 一种以三角褐指藻藻细胞为模板无需提取纯化dna的快速pcr检测方法 - Google Patents

一种以三角褐指藻藻细胞为模板无需提取纯化dna的快速pcr检测方法 Download PDF

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唐振洲
罗小卫
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Abstract

本发明公开了一种以三角褐指藻藻细胞为模板无需提取纯化DNA的快速PCR检测方法，在本发明中粗DNA模板的快速获得主要采用适当的物理方法对三角褐指藻藻细胞进行破壁，该检测方法通过简化基因组DNA获取过程，选用高效PCR聚合酶，提高遗传转化体系构建的效率，来实现对三角褐指藻的快速PCR检测。

Description

一种以三角褐指藻藻细胞为模板无需提取纯化DNA的快速PCR 检测方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体来说涉及一种以三角褐指藻藻细胞为模板无需提取纯化DNA的快速PCR检测方法。
背景技术
PCR检测是三角褐指藻的遗传转化体系中的一项关键步骤。三角褐指藻通过转基因导入载体后首先通过抗性筛选初步获得转基因阳性藻株，继而通过PCR技术检测载体上的分子标记来一步确证筛选结果。通常抗性筛选后得到的阳性克隆数量较多，在PCR之前需要对厚壁的三角褐指藻破壁提取一定纯度的基因组DNA，在工序上繁琐耗时，影响了PCR检测的效率。在大肠杆菌的遗传转化中，可以挑取少量菌斑到PCR反应体系中作为模板进行反应，这大大节省了阳性克隆筛选的时间，提高了效率。这也说明只要能够将样品中的DNA释放到酶反应体系中，就可以实现PCR片段扩增。但是微藻的细胞壁普遍较厚实，破壁效率低，如果将藻细胞样品简单加入反应体系中，难以达到DNA的有效释放，PCR的反应效率低，重复性差。
三角褐指藻是一种海洋模式硅藻，富含多不饱和脂肪酸、岩藻黄素等多种生物活性物质，在营养学、医药学和生物能源领域都具有重要应用前景和研究价值，还是水产养殖的重要饵料，在生物柴油方面也有较高的开发潜力。近几十年来，三角褐指藻作为一种模式硅藻和能源微藻已在多方面被大量研究，并逐渐由以生理生态研究为主转移到以转录组学、功能基因组学和蛋白质组学为代表的分子机制研究。分子水平的研究需要用到三角褐指藻的遗传转化技术。在三角褐指藻的遗传转化体系中，如果重组质粒带GFP标签，可由荧光显微镜观察来快速检测，否则就需要提取一定纯度的基因组DNA，通过PCR或Southernblotting的方法进行检测，目前这2种方法在操作比较繁琐，尤其是DNA的提取，费时费力。本发明的目的在于找到一种三角褐指藻的快速PCR检测方法，也是对上述方法的优化。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种以三角褐指藻藻细胞为模板无需提取纯化DNA的快速PCR检测方法，用于提高遗传转化体系构建的效率，该检测方法通过简化基因组DNA获取过程，选用高效PCR聚合酶，来实现对三角褐指藻的快速PCR检测。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种以三角褐指藻藻细胞为模板无需提取纯化DNA的快速PCR检测方法，按照下述步骤进行：
步骤一：挑取藻细胞样品于离心管中，加入无菌水重悬，离心后去上清，加入磷酸缓冲液重悬备用；
步骤二：选取下述破壁方法中的一种对三角褐指藻进行破壁，释放胞内DNA到胞外缓冲液中：
破壁方法A：将重悬藻液放入液氮中，然后取出置于水浴，溶解后在涡旋振荡器震荡，重复以上过程，冷却后作为DNA模板使用；
破壁方法B：将重悬藻液放入微波炉中，使用微波中等火力模式加热，取出后在涡旋振荡器震荡，冷却后作为DNA模板使用；
步骤三：利用步骤二得到DNA模板进行PCR和电泳检测。
在上述技术方案中，在所述步骤二的破壁方法A中，放入液氮中的时间为1-2min，水浴的温度为40-45度，震荡的时间为10-15s，重复的次数为4-5次。
在上述技术方案中，在所述步骤二的破壁方法B中，微波加热的时间为4-5min，震荡的时间为10-15s。
在上述技术方案中，在所述步骤三中，PCR所采用的DNA聚合酶为TAKARA公司的PrimeSTAR GXL酶。
在上述技术方案中，在所述步骤三中，PCR反应体系如下：
Figure BDA0003289097430000021
Figure BDA0003289097430000031
本发明的优点和有益效果为：
本发明通过采用适当的物理方法便捷、高效的实现三角褐指藻粗DNA模板的提取。PCR检测结果表明直接用藻细胞作为PCR模板不能扩增出目的条带，而使用本方法提取的粗DNA样品可以作为PCR反应的模板扩增出目的条带。本发明显著加快了三角褐指藻遗传转化阳性克隆的筛选过程，具有简单，快速，容易实现，经济适用的优点。
附图说明
图1为实施案例中PCR样品的琼脂糖凝胶电泳图。
图2为实施案例中PCR样品的琼脂糖凝胶电泳图。
对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，可以根据以上附图获得其他的相关附图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
实施例1
(1)挑取F2固体培养基上培养15天的藻细胞样品(约0.02克)于1.5ml离心管中，加入100ul无菌水重悬，3000rpm离心后去上清(洗去盐离子)，加入20ul磷酸缓冲液重悬备用。
(2)将重悬藻液放入液氮中1min，然后取出置于42℃水浴，溶解后在涡旋振荡器震荡10s。重复以上过程4-5次，使用微波模式加热5min，冷却后作为DNA模板使用。
(3)采用TAKARA公司的PrimeSTAR GXL DNA聚合酶，以引物1和引物2为引物组合扩增DNA片段；模板分别为藻细胞样品和基于破壁方法A的粗提取DNA模板。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳检测，通过观察是否有目的条带来判断PCR是否成功，进而判断粗DNA的提取是否成功。
(4)核酸电泳检测结果显示直接以藻细胞样品为PCR模板的扩增样品没有看到目的条带(图1)，以基于破壁方法A的粗提取DNA为模板扩增的样品能够看到目的条带(图1)。
实施例2
(1)挑取F2固体培养基上培养15天的藻细胞样品(约0.02克)于1.5ml离心管中，加入100ul无菌水重悬，3000rpm离心后去上清(洗去盐离子)，加入20ul磷酸缓冲液重悬备用。
(2)将重悬藻液放入微波炉中，使用微波中等火力模式加热4min，取出后在涡旋振荡器震荡10s，冷却后作为DNA模板使用。
(3)采用TAKARA公司的PrimeSTAR GXL DNA聚合酶，模板分别为藻细胞样品和基于破壁方法B的粗提取DNA模板。以引物1和引物2为引物组合扩增DNA片段，PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳检测，通过观察是否有目的条带来判断PCR是否成功，进而判断粗DNA的提取是否成功。
(4)核酸电泳检测结果显示直接以藻细胞样品为PCR模板的扩增样品没有看到目的条带(图2)，以基于破壁方法B的粗提取DNA为模板扩增的样品能够看到目的条带(图2)。
以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种以三角褐指藻藻细胞为模板无需提取纯化DNA的快速PCR检测方法，其特征在于，按照下述步骤进行：
步骤一：挑取藻细胞样品于离心管中，加入无菌水重悬，离心后去上清，加入磷酸缓冲液重悬备用；
步骤二：选取下述破壁方法中的一种对三角褐指藻进行破壁，释放胞内DNA到胞外缓冲液中：
破壁方法A：将重悬藻液放入液氮中，然后取出置于水浴，溶解后在涡旋振荡器震荡，重复以上过程，冷却后作为DNA模板使用；
破壁方法B：将重悬藻液放入微波炉中，使用微波中等火力模式加热4min，取出后在涡旋振荡器震荡，冷却后作为DNA模板使用；
步骤三：利用步骤二得到DNA模板进行PCR和电泳检测。
2.根据权利要求1所述的一种以三角褐指藻藻细胞为模板无需提取纯化DNA的快速PCR检测方法，其特征在于：在所述步骤二的破壁方法A中，放入液氮中的时间为1-2min，水浴的温度为40-45度，震荡的时间为10-15s，重复的次数为4-5次。
3.根据权利要求1所述的一种以三角褐指藻藻细胞为模板无需提取纯化DNA的快速PCR检测方法，其特征在于：在所述步骤二的破壁方法B中，微波加热的时间为4-5min，震荡的时间为10-15s。
4.根据权利要求1所述的一种以三角褐指藻藻细胞为模板无需提取纯化DNA的快速PCR检测方法，其特征在于：在所述步骤三中，PCR所采用的DNA聚合酶为TAKARA公司的PrimeSTAR GXL酶。
5.根据权利要求1所述的一种以三角褐指藻藻细胞为模板无需提取纯化DNA的快速PCR检测方法，其特征在于，在所述步骤三中，PCR反应体系如下：
Figure FDA0003289097420000011
Figure FDA0003289097420000021
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