CN106086203A - 一种小球藻核酸模板的制备方法及其应用 - Google Patents

一种小球藻核酸模板的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种小球藻核酸模板的制备方法及其应用。本申请的小球藻核酸模板制备方法，包括以下步骤，(1)将小球藻藻液在低温下离心，弃上清液；(2)双蒸水对小球藻沉淀重悬、洗涤、低温下离心，重复重悬、洗涤、低温下离心至少一次；(3)双蒸水重悬小球藻沉淀，在95℃～100℃热浴10～30min，即得核酸模板。本申请的小球藻核酸模板制备方法，用少量藻液就可制备出能直接用于PCR的核酸模板，与传统小球藻DNA提取相比，本申请的方法所需藻液量少，所需时间短，仅用双蒸水即可，无需额外试剂，操作简单方便，成本低。本申请为小球藻快速PCR扩增和核酸研究提供了一种简单、高效、稳定，且重复性好的核酸模板制备方法。

Description

一种小球藻核酸模板的制备方法及其应用
技术领域
本申请涉及小球藻核酸研究领域，特别是涉及一种小球藻核酸模板的制备方法及其应用。
背景技术
聚合酶链式反应(缩写PCR)，是一种分子生物学技术，其作用是体外酶促进合成特异DNA片段。PCR技术作为扩增目的DNA片段和检测鉴定的手段，广泛运用于生命科学、医学工程、遗传科学、法医鉴定等领域。PCR技术原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR扩增反应由三个基本反应步骤构成：变性-退火-延伸。而进行PCR的基础是，基因组DNA的提取，以基因组DNA为扩增模板，利用人工设计的靶序列两端互补的寡核苷酸引物，进行特异DNA片段扩增。
小球藻(Chlorella spp.)是一类普生性单细胞绿藻，细胞形态呈球形或广椭圆形，直径3～12μm，无鞭毛。属于绿藻门(Chlorphyta)绿藻纲(Chlorophyceae)绿球藻目(Chlorococcales)卵囊藻科(Oocystaceae)小球藻属(Chlorella)。小球藻具有结构简单、分布广泛、生长迅速、富含油脂和蛋白质等优点，目前已逐渐成为藻类分子生物学和基因工程研究的热点，特别是在污水处理、生物柴油、饲料与食品、药用等方面。
小球藻基因工程研究的基础是基因组DNA提取和靶标序列PCR，但由于小球藻细胞壁的组分和结构较为特殊，细胞壁外层还含有可抑制多糖降解作用的孢粉质(sporopollenin)，该结构很大地影响了细胞壁的破碎效果，使得小球藻基因组DNA提取和PCR扩增工序复杂，耗费时间，且效果不佳。
此外，采用试剂盒法提取小球藻基因组DNA时，所需样本量大，一般需要20mL浓度为2.0×107/mL的藻量；样本量小时，往往会发生小球藻基因组DNA提取失败，浪费样本的同时也影响了实验进程。
发明内容
本申请的目的是提供一种新的小球藻核酸模板的制备方法及其应用。
为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：
本申请的一方面公开了一种小球藻核酸模板的制备方法，包括以下步骤，
(1)将培养的小球藻藻液在低温下离心，弃上清液；
(2)采用双蒸水对小球藻沉淀进行重悬、洗涤、低温下离心，重复双蒸水重悬、洗涤、低温下离心至少一次；
(3)双蒸水清洗后，再采用双蒸水重悬小球藻沉淀，并将重悬的藻液在95℃～100℃热浴10～30min，即获得核酸模板，存放4℃冰箱备用。
其中，步骤(2)中重复双蒸水重悬、洗涤、低温下离心至少一次是指，在进行了一次的双蒸水重悬、洗涤、低温下离心后，再进行至少一次的双蒸水重悬、洗涤、低温下离心，即采用双蒸水洗涤至少两次。
需要说明的是，本申请的小球藻核酸模板制备方法，所制备的核酸模板可以直接用于PCR扩增，但本申请并没有对DNA进行提取，相对于传统的DNA提取后进行PCR扩增而言，本申请的制备方法，第一，采用极其少量的藻液就可以实现PCR扩增，本申请的一种实现方式中，仅采用500μL浓度为2.0×107/mL小球藻藻液，就可以制备出用于PCR扩增的核酸模板，而传统的小球藻DNA提取，至少需要相同浓度的藻液20mL，否则可能导致DNA提取失败；第二，本申请的制备方法，与DNA提取相比，时间更短，更简单易操作，本申请的一种实现方式中制备核酸模板仅仅需要30-40分钟，而传统的DNA提取至少需要2-3小时。
还需要说明的是，相对于传统的原核细胞如大肠杆菌等的菌液PCR而言，本申请的小球藻属于真核生物，并且，如背景技术里面提到的，小球藻特殊的细胞壁结构，使其无法像菌液PCR那样直接采用培养的藻液进行PCR扩增。正是如此，本申请提出了将其藻液在低温下离心、洗涤后，再进行高温处理；经过大量的试验证实，通过这样的方法获得的样品，可以直接用于PCR扩增，从而提出了本申请的核酸模板制备方法。
优选的，核酸模板制备方法的步骤(1)和(2)中的低温下离心的温度为4℃。
可以理解，4℃离心只是实验室中一个比较常规的设定，在不影响核酸模板的情况下，可以在试验允许的范围内适当调整，例如4℃左右2℃，或更多，在此不做具体限定。
优选的，核酸模板制备方法的步骤(3)中，采用双蒸水重悬小球藻沉淀后，在重悬的藻液表面加一滴石蜡油，然后再进行热浴。
本申请的另一面公开了本申请的制备方法所获得的小球藻核酸模板。
可以理解，本申请的制备方法所获得的小球藻核酸模板，其可以直接用于PCR扩增，因此，也可以直接用于其它需要用到核酸模板的小球藻的核酸研究中，因此，本申请的再一面公开了本申请制备的小球藻核酸模板在小球藻PCR或核酸研究中的应用。其中，核酸研究包括但不仅限于DNA测序、基因克隆等。
本申请的再一面公开了一种小球藻快速PCR方法，包括以下步骤，
(1)采用少量的小球藻藻液，在低温下离心，弃上清液；采用双蒸水对小球藻沉淀进行重悬、洗涤、低温下离心，重复双蒸水重悬、洗涤、低温下离心至少一次；双蒸水清洗后，再采用双蒸水重悬小球藻沉淀，并将重悬的藻液在95℃～100℃热浴10～30min，获得小球藻核酸模板，存放4℃冰箱备用；
(2)采用人工设计的引物，对步骤(1)制备的小球藻核酸模板进行PCR扩增。
其中，步骤(1)中“采用少量的小球藻藻液”，其少量是针对于小球藻核酸提取所需要的量而言的，如前面提到的，为了保障小球藻核酸提取成功，通常需要采用浓度为2.0×107/mL的小球藻藻液至少20mL，而本申请的核酸模板制备方法仅需要相同浓度的小球藻藻液500μL即可，所以说“采用少量的小球藻藻液”，至于其具体量可以是浓度为2.0×107/mL的小球藻藻液500μL-2mL，其中经本申请的试验证明500μL是完全可以成功制备核酸模板的，并不排除少于500μL，同样也可以制备出符合使用需求的核酸模板。
可以理解，本申请的小球藻快速PCR方法，实际上就是在本申请的小球藻核酸模板制备方法的基础上提出的，至于PCR扩增所采用的引物，可以是已知的任意的常规PCR、实时荧光PCR等的引物。本申请的一种实现方式中，为了验证本申请的核酸模板，重新设计了PCR引物，这将在后续的方案中详细描述。
需要说明的是，本申请的小球藻快速PCR，是相对于传统的提取小球藻DNA，然后进行PCR而言的。本申请的小球藻快速PCR，其核酸模板制备方法简单，仅采用双蒸水即可，制备时间短，仅30-40分钟即可完成；而传统的DNA提取，不仅需要大量的藻液，而且需要特殊的试剂盒，操作繁琐，DNA提取试剂也相对较长，需要2-3小时。所以，相对而言，本申请提出了小球藻快速PCR。
优选的，本申请的人工设计的引物包括第一组引物和/或第二组引物；第一组引物的上下游引物分别为Seq ID No.1和Seq ID No.2所示序列，第二组引物的上下游引物分别为Seq ID No.3和Seq ID No.4所示序列；
Seq ID No.1：5’-ACTTGGACGACTGTATGGACTG-3’
Seq ID No.2：5’-AATACCGTGAGGAGGACCTTG-3’
Seq ID No.3：5’-AATAAGCATCGGCTAACTCTGTG-3’
Seq ID No.4：5’-CCCTCTGCCCCTACCAAAC-3’。
由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：
本申请的小球藻核酸模板制备方法，采用少量的藻液就可以制备出能直接用于PCR的核酸模板，与传统的小球藻DNA提取方式相比，本申请的制备方法所需藻液量少，并且，所需时间短，仅仅采用双蒸水即可，无需额外的试剂，操作简单方便，成本低。本申请为小球藻快速PCR扩增和核酸研究提供了一种简单、高效、稳定，且重复性好的核酸模板制备方法，提高了相关研究的工作效率，节约研究成本。
附图说明
图1是本申请实施例中制备的小球藻核酸模板的琼脂糖凝胶电泳图；
图2是本申请实施例中采用制备的小球藻核酸模板进行PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳图；
图3是本申请另一实施例中采用制备的小球藻核酸模板进行PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳图；
图4是本申请另一实施例中采用制备的小球藻核酸模板进行PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
现有技术中，小球藻DNA研究的基础就是DNA提取，但是，DNA提取不仅操作繁琐、复杂；而且还需要大量的小球藻藻液，研究显示，至少需要约20mL浓度为2.0×107/mL的藻液，否则很可能会导致DNA提取失败，DNA提取失败不仅造成资源的极大浪费，也耽误时间，影响科研进度。正是基于这样的研究背景，本申请的发明人提出，可否像菌液PCR那样，直接采用藻液进行PCR扩增的设想；但是，研究证实，小球藻特殊的细胞壁结构，使得该设想无法实现。基于这样的认识，本申请的发明人尝试了多种藻液处理方法，最终提出了，采用少量藻液在低温下离心，双蒸水洗涤后，重悬，在高温下热浴10～30min，由此获得的样品，可以直接用于PCR扩增，从而提出了本申请的核酸模板制备方法。
通过本申请的核酸模板制备方法，可以避免提取DNA，从而避免了因DNA提取失败而带来的风险。并且，本申请的制备方法，相对于DNA提取而言，所需藻液量小，仅500μL浓度为2.0×107/mL小球藻藻液即可，处理时间也较DNA提取短。本申请的核酸模板制备方法，为小球藻快速PCR扩增奠定了基础；同时也为其它基于核酸模板的研究提供了一种行之有效的方法。
下面通过具体实施例和附图对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。
实施例一
一、小球藻核酸模板的制备
本例采用培养的浓度为2.0×107/mL的小球藻藻液进行研究，同时制备了三个重复样本的小球藻核酸模板。本例的小球藻核酸模板制备方法，具体包括如下步骤：
1)离心机4℃预冷；
2)取3个1.5mL离心管，用于三个重复实验，各吸取500μL小球藻藻液，在4℃转速1394g离心5min，弃上清；
3)各离心管中加入1mL ddH2O，重悬，4℃1394g离心5min，弃上清；
4)重复步骤3)操作1次；
5)向各离心管的小球藻沉淀中，加入100μL ddH2O重悬，重悬的藻液转移至PCR管中，每个PCR管中加一滴石蜡油，防止加热过程中液体挥发；
6)将小球藻悬浮液置于PCR扩增仪或水浴锅中100℃热浴15min；
7)100℃热浴结束，取出PCR管，即获得本例的小球藻核酸模板，标记为CK藻液，置4℃冰箱中待用。
同时，本例按照传统的方法提取了小球藻DNA，用以对照。本例采用了20mL培养的浓度为2.0×107/mL的小球藻藻液进行DNA提取，DNA提取按照QIAGEN公司的DNeasy PlantMini Kit试剂盒操作说明书进行。提取后的基因组DNA(缩写gDNA)取1μL用NanoDrop-2000(Thermo SCIENIFIC)检测DNA浓度。结果显示，本例提取的gDNA浓度为17.9ng/μL。
取5μL提取的gDNA，用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性。凝胶电泳结果如图1所示，图中第一泳道为空白、第二泳道为λDNA/Hind III、第三和第四泳道为对照、第五泳道为本例提取的其中一个核酸模板样品的电泳条带、第六泳道为DL2000、第七泳道为空白。其中λDNA/Hind III的电泳条带中，由上到下依序为23130bp、9416bp、6557bp、4361bp、2322bp、2027bp；DL2000的电泳条带中，由上到下依序为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp。图1的结果显示，本例提取的核酸模板样品，在23K处有一明显条带，与预期相符；该条带有一些拖尾，从拖尾情况看表示样品有轻微降解，但不影响作为PCR模板等使用。
二、引物设计和合成
本例以小球藻基因组RbcL基因为靶标序列设计引物，引物设计采用软件PrimerPremier 5，设计好的引物交由上海Invitrogen公司合成。本例设计的RbcL基因扩增上下游引物分别如Seq ID No.1和Seq ID No.2所示序列。
Seq ID No.1：5’-ACTTGGACGACTGTATGGACTG-3’
Seq ID No.2：5’-AATACCGTGAGGAGGACCTTG-3’。
本例设计的引物扩增的片段理论上为273bp。
三、PCR扩增
采用本例设计的引物，对本例制备的三个小球藻核酸模板进行扩增，以验证本例的小球藻核酸模板是否可以直接进行PCR，同时，以提取的gDNA作为参考。具体的，设计3个CK藻液、3个gDNA重复和3个水空白对照，共计9个PCR反应。
本例的PCR反应体系为：10mmol/L上游引物0.5μL、10mmol/L下游引物0.5μL、2×Taq PCR Mastermix 5μL、扩增模板2μL，补充水至10μL。其中扩增模板即CK藻液或gDNA或水。
本例的PCR反应条件为，95℃预变性5min，然后进入35个循环：94℃变性30s、62℃退火30s、72℃延伸1min，循环结束后，72℃延伸5min，然后4℃待机。
PCR扩增产物采用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，电泳时间约为0.5h。
琼脂糖凝胶液：用天平称取1.5g琼脂糖，置于干净的三角瓶中，加入100mL1×TAE缓冲液，在微波炉中加热1min，使之彻底融化。之后按照1:100000比例加入SYBR Safe DNAGel stain染料，即100mL凝胶液中加1μL染料，充分混匀。
凝胶板制备：将电泳装置所配备的塑料胶托放置在胶槽中，注意胶托的放置位置，在胶托的标有黑色条带的一端插上样品梳。将上述琼脂糖溶液放在室温下，或将三角瓶在冷水中浸泡待温度下降至60℃时，将琼脂糖溶液倒在胶托上，室温放置30min左右。待琼脂糖彻底凝固后，轻轻拔出样品梳。
加样：将凝胶连同胶托一起放到电泳槽中，加入1×TAE缓冲液，使缓冲液淹过凝胶表面约1mm。用移液器吸取5μL PCR扩增产物，按上样缓冲液:PCR扩增产物＝1:5的体积比例，将两者混匀，混匀后小心地将混合液加到凝胶的加样孔中。并在其中一个加样孔中加入DNA Ladder，本例采用的是50bp ladder。
加样完成后，电泳约0.5h，当指标剂泳动到距凝胶前沿约1.5cm的位置上，停止电泳。
采用凝聚成像系统观察电泳情况，结果如图2所示，图中，泳道1-3为gDNA的泳道为三个gDNA平行试验的PCR产物电泳结果，泳道4-6为三个水空白平行试验的PCR产物电泳结果，第7泳道为50bp ladder，泳道8-10为三个CK藻液的PCR产物电泳结果；其中50bp ladder由上到下的条带分别代表500bp、400bp、350bp、300bp、250bp、200bp、150bp、100bp、50bp。由图2的结果可见，三个水空白对照都没有条带，证明PCR扩增结果是没问题的；而三个gDNA和三个CK藻液都有相同的扩增产物，根据50bp ladder判断，六个扩增产物的片段大小在250-300bp的中间约为275bp，与理论扩增片段273bp相符，证明本例制备的小球藻核酸模板与传统的提取的gDNA一样，可以用于小球藻PCR扩增，并且从亮度来看，六个PCR扩增效率相当，证明本例制备的小球藻核酸模板可以替换gDNA进行PCR扩增，且具有良好的扩增效率。
实施例二
本例的小球藻核酸模板制备方法与实施例一相同，唯一的区别在于，本例针对小球藻悬浮液在PCR扩增仪上热浴的温度改为95℃，并对热浴的时间设计了三个梯度，即对三组样品分别热浴10min、20min、30min，每个热浴组设计两个重复。最终获得了六个CK藻液，即两个热浴10min的CK藻液、两个热浴20min的CK藻液和两个热浴30min的CK藻液。
采用实施例一相同的引物和PCR扩增体系对本例的CK藻液进行检测。PCR扩增具体设计了两个热浴10min的CK藻液、两个热浴20min的CK藻液、两个热浴30min的CK藻液、两个水空白对照、两个gDNA平行试验，共计10个PCR反应。
PCR结束后，采用实施例一相同的方法对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。检测结果如图3所示，图中，泳道1为50bp ladder，泳道2-7依序为两个热浴10min的CK藻液、两个热浴20min的CK藻液、两个热浴30min的CK藻液的PCR产物电泳结果，泳道8和9为水空白试验的PCR产物电泳结果，泳道10和11为两个gDNA平行试验的PCR产物电泳结果，泳道12空白没有点样。由图3的结果可见，两个水空白对照都没有条带，证明PCR扩增结果是没问题的；六个CK藻液和两个gDNA都有相似的条带，虽然从图中看来似乎有些倾斜，但是，应该是相同的扩增产物，产生倾斜的原因可能是胶板没放正或者电压不稳定，六个CK藻液和两个gDNA的扩增结果与理论预期相符，并且，六个CK藻液的扩增结果都很亮，与gDNA的扩增结果相当，可见，95℃热浴10min、20min或30min都可以制备出符合PCR扩增使用需求的核酸模板。
实施例三
本例设计了不同的引物，对实施例二制备的六个小球藻核酸模板进行扩增，PCR扩增条件和PCR反应个数设计与实施例二相同。本例的引物是针对小球藻16s基因全长序列设计的，同样采用用软件Primer Premier 5设计，设计好的引物交由上海Invitrogen公司合成。本例设计的16s基因扩增上下游引物分别如Seq ID No.3和Seq ID No.4所示序列。
Seq ID No.3：5’-AATAAGCATCGGCTAACTCTGTG-3’
Seq ID No.4：5’-CCCTCTGCCCCTACCAAAC-3’。
本例设计的引物扩增的片段理论上为180bp。
PCR结束后，采用实施例一相同的方法对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。检测结果如图4所示，图中，泳道1为50bp ladder，泳道2-7依序为两个热浴10min的CK藻液、两个热浴20min的CK藻液、两个热浴30min的CK藻液的PCR产物电泳结果，泳道8和9为水空白试验的PCR产物电泳结果，泳道10和11为两个gDNA平行试验的PCR产物电泳结果，泳道12和13空白没有点样。由图4的结果可见，两个水空白对照都没有条带，证明PCR扩增结果是没问题的；六个CK藻液和两个gDNA都有相似的条带，虽然从图中看来似乎有些倾斜，但是，应该是相同的扩增产物，产生倾斜的原因可能是胶板没放正或者电压不稳定，六个CK藻液和两个gDNA的扩增结果在150-200bp之间，约180bp，与理论预期相符，并且，六个CK藻液的扩增结果都很亮，与gDNA的扩增结果相当，可见，95℃热浴10min、20min或30min都可以制备出符合PCR扩增使用需求的核酸模板。此外，本例采用了16s的扩增引物，同样可以扩增出与传统gDNA相同的靶标条带，可见本申请制备的小球藻核酸模板，可以适用于各种不同靶标的小球藻PCR扩增。
可以理解，虽然本申请没有穷举小球藻全基因组的所有靶标基因，但是，RbcL基因和16s基因，是小球藻基因工程研究中比较重要的两个基因，采用本申请的核酸模板，都可以扩增出符合预期的靶标序列，因此，有理由相信，本申请制备的小球藻核酸模板，可以替换传统的小球藻基因组DNA提取，用于小球藻PCR扩增或其它基因工程研究。
以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本申请的保护范围。

Claims (9)

1.一种小球藻核酸模板的制备方法，其特征在于：包括以下步骤，
(1)将培养的小球藻藻液在低温下离心，弃上清液；
(2)采用双蒸水对小球藻沉淀进行重悬、洗涤、低温下离心，重复双蒸水重悬、洗涤、低温下离心至少一次；
(3)双蒸水清洗后，再采用双蒸水重悬小球藻沉淀，并将重悬的藻液在95℃～100℃热浴10～30min，即获得所述核酸模板。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)和(2)中的低温下离心的温度为4℃。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中，采用双蒸水重悬小球藻沉淀后，在重悬的藻液表面加一滴石蜡油，然后再进行热浴。
4.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法获得的小球藻核酸模板。
5.根据权利要求4所述的小球藻核酸模板在小球藻PCR或核酸研究中的应用。
6.一种小球藻快速PCR方法，其特征在于：包括以下步骤，
(1)采用少量的小球藻藻液，在低温下离心，弃上清液；采用双蒸水对小球藻沉淀进行重悬、洗涤、低温下离心，重复双蒸水重悬、洗涤、低温下离心至少一次；双蒸水清洗后，再采用双蒸水重悬小球藻沉淀，并将重悬的藻液在95℃～100℃热浴10～30min，获得小球藻核酸模板，存放4℃冰箱备用；
(2)采用人工设计的引物，对步骤(1)制备的所述小球藻核酸模板进行PCR扩增。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述人工设计的引物包括第一组引物和/或第二组引物；所述第一组引物的上下游引物分别为Seq ID No.1和Seq ID No.2所示序列，所述第二组引物的上下游引物分别为Seq ID No.3和Seq ID No.4所示序列；
Seq ID No.1：5’-ACTTGGACGACTGTATGGACTG-3’
Seq ID No.2：5’-AATACCGTGAGGAGGACCTTG-3’
Seq ID No.3：5’-AATAAGCATCGGCTAACTCTGTG-3’
Seq ID No.4：5’-CCCTCTGCCCCTACCAAAC-3’。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的低温下离心的温度为4℃。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，采用双蒸水重悬小球藻沉淀后，在将重悬的藻液进行热浴之前，在重悬的藻液表面加一滴石蜡油，然后再进行热浴。
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