CN105531381B

CN105531381B - 应用寡聚体dT分子来避免生成由多聚A载运体诱导的高分子量PCR产物

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Publication number: CN105531381B
Application number: CN201480050339.0A
Authority: CN
Inventors: F.伯格曼; S.弗勒纳
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2013-09-13
Filing date: 2014-09-10
Publication date: 2019-08-09
Anticipated expiration: 2034-09-10
Also published as: EP3044326B1; WO2015036434A1; CA2923083A1; CA2923083C; US20150079600A1; EP3044326A1; US9611505B2; HK1219301A1; ES2657988T3; JP6556728B2; JP2016529914A; SG11201601890UA; CN105531381A

Abstract

在RNA分离期间，使用载运体核酸如多聚A‑RNA以增加分离的RNA的收率。所述载运体核酸可能产生高分子量产物，其可能干扰后续步骤如逆转录、PCR和凝胶电泳。本发明因此涉及用于逆转录的方法和试剂盒以及封闭性核酸分子用来封闭载运体多聚A‑RNA的用途。

Description

应用寡聚体dT分子来避免生成由多聚A载运体诱导的高分子量PCR产物

发明背景

在RNA分离期间，使用载运体(carrier)核酸如多聚A-RNA(polyA-RNA)以增加分离的RNA的收量(yield)。所述载运体核酸可能产生高分子量产物，其可能干扰后续步骤如逆转录、PCR和凝胶电泳。本发明因此涉及用于逆转录的方法和试剂盒以及封闭性核酸分子(blocking nucleic acid)用来封闭载运体多聚A-RNA的用途。

将少量病毒RNA分离出血浆需要一种确保RNA的低损失率的方法，这是对病毒基因组的进一步分析所需要的。可使用不同方法分离病毒RNA。一种最常见的方法是手动RNA分离。对于大多通过基于柱的方法进行的血浆中的手动RNA分离，使用载运体RNA，像多聚A、MS2RNA或tRNA来抑制靶RNA对柱材料的不可逆结合。另外，已显示合成的多聚A载运体RNA增强RNA对分离柱中二氧化硅(sliica)表面的可逆结合，这也导致增加的RNA收量(DN.Hengen等,Trends of Biochemical Sciences 1996,21,224-225；ML.Gallagher等Biochemicaland Biophysical Research Communications 1987,144,271-276)。载运体RNA封闭柱材料，从而可将靶RNA定量分离出血浆样品。使用载运体RNA还可具有另外的有益效果，如改进靶RNA稳定性(D.Andreasen等,Methods 2010,50,S6-S9；R.Kishore等,J.Forensic.Sci.2006,51(5),1055-1061)。

在分离后，实施RNA的逆转录以生成cDNA用于后续PCR反应。将多聚A-RNA作为RNA载运体用于分离步骤和将随机六聚体引物用于逆转录步骤，在PCR反应期间产生不想要的非特异性的高分子量产物，其来自多聚A-RNA分子和能结合多聚A-RNA的随机六聚体引物的一部分的杂交。然后，该高分子量杂交产物在PCR期间扩增，其在琼脂糖凝胶上可见为高分子量(HMW)拖尾带(smear)。HMW产物的生成最终导致更低量的扩增的靶DNA。

因此，本说明书的目的是提供不显示上述缺点的方法。

发明概述

发现如果通过在3’端封闭的寡聚体dT分子(oligo-dT molecules)来封闭用作载运体的多聚A-RNA，则可以防止上文描述的HMW产物，该产物不利地影响逆转录后的规程。

因此，本说明书涉及逆转录方法，其中所述方法包括以下步骤：a)提供包含RNA的样品，b)使所述样品与载运体核酸接触，由此生成混合物，c)在如下条件下将该混合物施加到基质，该条件使得发生所述RNA和所述载运体核酸对所述基质的结合，d)将所述基质与所述混合物分离，所述基质具有结合于该基质的所述RNA和所述载运体核酸，e)从所述基质洗脱所述RNA和所述载运体核酸，由此产生洗脱物，f)在如下条件下向所述洗脱物添加封闭性核酸，该条件使得发生所述封闭性核酸对所述载运体核酸的杂交，g)在如下条件下向来自步骤f)的洗脱物添加引物，该条件使得发生所述引物对所述RNA的杂交，和h)将所述RNA逆转录成cDNA。

在一个具体的实施方案中，所述载运体核酸是RNA载运体。在一个更具体的实施方案中，所述RNA载运体是多聚A-RNA。

在一个具体的实施方案中，所述封闭性核酸是寡聚体dT分子。在一个更具体的实施方案中，所述寡聚体dT分子是5’-(dT)n-X-3’，其中所述(dT)n是n聚体同型2’-脱氧-胸苷寡核苷酸，其中所述n是18、19、20、21或22，其中所述X选自下组：p、pC3、pC3p、pC3pC3和pC3pC3p，且其中X结合于(dT)n的3’末端羟基基团且其中p是磷酸根和C3是1,3-丙二醇间隔物。在一个甚至更具体的实施方案中，n是20且X是pC3pC3p。

在一个具体的实施方案中，引物是随机引物。在一个更具体的实施方案中，所述随机引物是随机六聚体引物。

在一个具体的实施方案中，所述基质包含玻璃纤维绒(glass fiber fleece)。

在一个具体的实施方案中，所述样品选自下组：血清、血液、血浆、泪(tear)、细胞培养上清、尿和母乳(breast milk)、唾液、脑脊髓液和精液。

本说明书进一步涉及封闭性核酸分子用于在逆转录期间封闭载运体多聚A-RNA的用途，其中所述封闭性核酸分子是5’-(dT)n-X-3’，其中所述(dT)n是n聚体同型2’-脱氧-胸苷寡核苷酸，其中所述n是18、19、20、21或22，其中所述X选自下组：p、pC3、pC3p、pC3pC3和pC3pC3p，且其中X结合于(dT)n的3’末端羟基基团和其中p是磷酸根和C3是1,3-丙二醇间隔物。在一个具体的实施方案中，n是20且X是pC3pC3p。

本说明书进一步涉及用于实施逆转录的试剂盒，所述试剂盒包含a)作为载运体的多聚A-RNA，和b)如上文描述的封闭性核酸。

附图简述

图1:该图显示了在有和无逆转录前的寡聚体dT预处理的情况下，使用针对HCV基因型1a的HCV特异性引物组的PCR产物的比较。比较不同浓度的寡聚体dT和不同浓度的HCVcDNA。

图2:该图显示了在有和无逆转录前的寡聚体dT预处理的情况下，使用针对HCV基因型1a的HCV特异性引物组的PCR产物的比较。以不同浓度的HCV cDNA比较不同浓度的寡聚体dT。

发明详述

列出以下定义以例示和定义本文中使用的多个术语的含义和范围。

术语“一个”、“一种”和“该”一般包括复数指代物，除非上下文清楚地另外指示。

如本文中使用的，术语“约”连同数值通过扩展数值的上限和下限来修饰该数值。一般地，术语“约”修饰所述数值为差异为高5％的数值和低5％的数值。例如，“约100”的值意为“95至105”的范围。

术语“扩增”一般指从靶核酸产生多个核酸分子，其中引物与靶核酸分子上的特定位点杂交以提供由聚合酶延伸的起始位点。扩增可通过本领域中一般已知的任意方法进行，如但不限于：标准PCR、长PCR、热启动PCR、qPCR、RT-PCR和等温扩增。

术语“3’-封闭的引物”在本文中如本领域专业人员所知的使用，且指在其末端3’羟基基团由封闭性基团修饰的寡核苷酸，该封闭性基团能阻止通过聚合酶反应的引物延伸。适宜的封闭性基团具体为不含有2’-脱氧核糖模块的任意基团。这类封闭性基团为例如但不限于磷酸根(phosphate)，经取代的磷酸根如烷基或芳基取代的磷酸根，醚基团如烷基醚如甲基、乙基或苯甲基，3’-脱氧核糖衍生物如2’,3’-双脱氧核苷或在扩增条件下稳定的任何其他羟基保护性基团，如酯如苯甲酸酯或硝酸酯。经取代的磷酸根可以多重掺入至3’末端羟基基团，其通过使用二醇，如烷二醇，像1,3-丙二醇(本文中称为C3-间隔物或C3)。为了易于合成这类用3’-磷酸根或经取代的磷酸根封闭的引物，可以使用商品化的3’-磷酸-CPG或3’-间隔物C3CPG或3’-磷酸-CPG连同间隔物C3亚磷酰胺(phosphoramidite)(GlenResearch Corporation,Sterling,VA)的应用。尤其适用的是3’-羟基修饰如磷酸根(p)、磷酸-1,3-丙二醇(pC3)、磷酸-1,3-丙二醇–磷酸(pC3p)、磷酸-1,3-丙二醇–磷酸–1,3-丙二醇(pC3pC3)或磷酸-1,3-丙二醇–磷酸–1,3-丙二醇–磷酸(pC3pC3p)。

术语“载运体核酸”在本文中如本领域专业人员所知的使用，且指不同类型的RNA，如多聚A-RNA、tRNA和MS2RNA。这类不同的载运体RNA通常起源于噬菌体。载运体核酸用于增加核酸分离规程期间少量靶核酸如靶RNA的回收。这类分离意味着从样品分离靶核酸，例如通过使用固相。一般地，向包含靶核酸的样品大量添加载运体核酸。载运体核酸的量相比于靶核酸大得不成比例。载运体核酸和靶核酸竞争例如退化(degeneration)过程(酶促、物理、化学)，由此保护靶核酸。由于载运体核酸的较大量，其相比于靶核酸按比例更强地受这类过程的影响。因此，靶核酸受到的影响程度低得多，由此增加了靶核酸的收量。载运体核酸是本领域中公知且商业可获的。

如本文中使用的，术语“杂交”用于提述互补性核酸的成对。杂交和杂交的强度(即核酸之间的联合强度)受到因素如核酸之间互补程度、涉及的条件的严格性、形成的杂合体的Tm、和核酸内G:C比率的影响。虽然本发明不限于一组具体的杂交条件，但优选采用严格杂交条件。严格杂交条件是序列依赖性的且随着不同环境参数(例如，盐浓度和有机物的存在)而变化。一般地，“严格”条件选择为比特定核酸序列在限定的离子强度和pH的热熔解点(Tm)低约5℃至20℃。优选地，严格条件比结合于互补核酸的特定核酸序列的热熔解点(Tm)低约5℃至10℃。Tm是50％的核酸(例如标签核酸)与完美匹配的探针杂交的温度(在限定的离子强度和pH下)。

如本文中使用的，术语“基质”指被核酸特定结合而污染性物质不结合的表面。更具体地，基质是玻璃纤维绒的二氧化硅表面，其能包含在核酸分离柱中。通过使包含核酸的样品与这类基质接触，核酸在存在离液盐的情况下结合于玻璃纤维绒的表面。这允许基质特定地固定化核酸。为了使RNA结合基质，可以相应地优化结合条件以确保RNA的增加的固定化。核酸的分离通过将核酸特定地结合于玻璃纤维绒来实现，而污染性物质(如盐、蛋白质和其他组织污染物)不与其结合。为了从基质除去DNA，可在其上直接用DNA酶消化结合于基质的核酸。在除去消化的DNA片段和其他污染性物质(例如通过清洗)后，可随后在小体积的水或低盐缓冲液中洗脱剩余的分离的RNA。

术语“核酸”一般指DNA或RNA，不管其为扩增产物，合成创造的，RNA逆转录的产物还是天然存在的。核酸通常是单链或双链分子且由天然存在的核苷酸组成。双链核酸分子可具有3’或5’悬突，如此不需要或推定为在其整个长度上都是完全双链的。此外，术语核酸可由非天然存在的核苷酸和/或对天然存在的核苷酸的修饰构成。在本文中列出了例子，但不限于：5’或3’核苷酸的磷酸化以分别允许连接或预防外切核酸酶降解/聚合酶延；氨基、巯基、炔或生物素基修饰以用于共价和近共价附接；荧光团和猝灭剂；核苷酸之间的硫代磷酸酯、膦酸甲酯、氨基磷酸酯(phosphoramidate)和磷酸三酯连接以防止降解；甲基化；和经修饰的碱基或核苷酸如2’-脱氧肌苷、5-溴-2’-脱氧尿苷、2’-脱氧尿苷、2-氨基嘌呤、2’,3’-双脱氧胞苷、5-甲基-2’-脱氧胞苷、锁核酸(LNA’s)、异-dC和–dG碱基、2’-O-甲基RNA碱基和用氟修饰的碱基。

如本文中使用的，术语“寡聚体dT”或“寡聚体dT分子”指仅仅由胸苷组成的均聚物。优选的寡聚体dT分子的长度是10至100个碱基，更优选长度为10至30个碱基，更优选长度为20个碱基。寡聚体dT分子优选在其3’-羟基基团被封闭性基团封闭以阻止通过聚合酶反应的延伸。本领域专业人员知晓也可以修饰寡聚体dT分子，只要该分子仍能与多聚A-RNA杂交。修饰为但不限于所有类型的胸苷类似物，像2’-脱氧尿苷、2’-O-甲基-尿苷、LNA(锁核酸)胸苷或尿苷衍生物、PNA(肽核酸)胸苷或尿嘧啶衍生物、HNA(己糖醇核酸)胸苷或尿苷衍生物或碱基经修饰的尿嘧啶衍生物，如5-丙炔基-尿嘧啶，而且还有具有标记物如荧光标记物或半抗原的修饰，或具有除胸苷和尿苷以外的核苷酸或核苷酸序列的修饰。

如本文中使用的，术语“寡核苷酸”指由两个或更多个，优选超过3个，且通常超过10个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸构成的分子。确切的大小将依赖于许多因素，其继而依赖于寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸可以任意方式生成，包括化学合成、DNA复制、逆转录、或其组合。术语寡核苷酸也可以与术语“多核苷酸”交换使用。

术语“聚合酶链式反应”(或“PCR”)指用于在基因组DNA的混合物中增加靶序列区段的浓度的方法，不用克隆或纯化。这一用于扩增靶序列的过程由以下组成：向含有期望的靶序列的DNA混合物引入大量过量的两种寡核苷酸引物，接着是在存在DNA聚合酶情况下的一系列精确的热循环。两种引物与双链靶序列的其分别的链互补。为了实现扩增，将混合物变性，然后将引物退火至其在靶分子内的互补序列。在退火后，用聚合酶延伸引物以形成一对新的互补链。变性、引物退火和聚合酶延伸的步骤可重复许多次(即变性、退火和延伸构成一个“循环”；可以有大量“循环”)以获得高浓度的扩增的期望靶序列区段。期望的靶序列的扩增区段的长度由引物相对于彼此的相对位置决定，因此，该长度是一个可控的参数。对于PCR，可以将基因组DNA中单拷贝的特定靶序列扩增至可通过本领域技术人员已知的几种不同的方法学检测到的水平。除了基因组DNA以外，可以用适宜的引物分子集扩增任意寡核苷酸或多核苷酸序列。具体地，通过PCR过程本身创建的扩增区段自身即为后续PCR扩增的有效模板。连接介导的PCR指实施的PCR，其中引物与连接于DNA末端(例如DNA片段)的接头同源(例如互补)。

术语“qPCR”一般指称为实时定量聚合酶链式反应、定量聚合酶链式反应或动态聚合酶链式反应的PCR技术。该技术使用PCR同时扩增和量化靶核酸，其中定量通过插入的荧光染料或含有荧光报告分子的序列特异性探针，所述报告分子仅在杂交于靶核酸后是可检测的。

如本文中使用的，术语“引物”指在诱导与核酸链互补的引物延伸产物的合成的条件下(即存在核苷酸和诱导剂如DNA聚合酶且处于适宜的温度和pH)能充当合成启动点的寡核苷酸，不管是天然存在的(如在纯化的限制性消化中)还是合成产生的。引物优选是单链的，用于在扩增中的最大效率，但还可以或是双链的。如果是双链，则首先在用于制备延伸产物之前处理引物以将其链分离。优选地，引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长以在存在诱导剂的情况下引发延伸产物的合成。引物的确切长度将依赖于许多因素，包括温度、引物源和方法的使用。

如本文中使用的，术语“随机六聚体引物”指长度为6个碱基的寡核苷酸，其通过在每个偶联步骤使用4个碱基A、G、C和T的混合物以产生大范围的所有可能的6聚体序列(4096个序列)而完全随机合成，所述6聚体序列具有与核酸序列上的多个互补序列退火和充当引物以启动第一链cDNA合成的潜力。

术语“RNA”如本领域专业人员已知的用于本文，且指前体mRNA(pre-mRNA)、前体mRNA转录本、mRNA、转录本加工中间物、miRNA、非编码RNA、用于翻译的成熟mRNA和来自一个或多个基因的转录本、或源自其的核酸。转录本加工包括以下过程，如剪接、编辑、修饰和降解。包含mRNA的样品包括但不限于mRNA、一个或多个基因的mRNA转录本、使用逆转录源自mRNA的cDNA、从扩增的DNA转录的RNA、从cDNA转录的cRNA、从基因扩增的DNA等等。此外，在本说明书的范围内，术语“RNA”还可以指tRNA、rRNA、miRNA和载运体RNA。

如本文中使用的，术语“样品”以其最广含义使用。在一种含义中，其意图包括从任何来源获得的核酸标本。生物学核酸样品可以获自动物(包括人)且涵盖从流体、固体、组织等分离的核酸。生物学核酸样品还可以来自非人动物，包括但不限于，脊椎动物如啮齿动物、非人灵长类、绵羊类、牛类、反刍类、兔类、猪类、山羊类、马类、犬类、猫类、鸟类等。生物学核酸还可以获自原核生物如细菌和其他非动物类真核生物如植物。涵盖本发明不受核酸样品来源的限制，且来自任意生物界的任意核酸均可用于本文描述的方法中。

如果通过基质从复杂样品分离RNA，则通常使用载运体核酸来提高分离的RNA的收量。这类提高是必要的，特别是当感兴趣的RNA以非常低的量包含在复杂样品中时(例如血浆中的病毒RNA)。这类收量中的提高增加后续规程，如逆转录及继之的PCR的成功几率。如果将多聚A-RNA用作分离步骤的载运体核酸且另外如果将随机六聚体用于逆转录步骤，则在PCR反应期间产生不想要的、非特异性的高分子量(HMW)产物。这类HMW产物来自多聚A-RNA分子对随机六聚体引物一部分的杂交，由此导致一系列的多聚A-RNA分子和随机六聚体引物的多个元件。这类HMW产物在PCR期间扩增，其表现为琼脂糖凝胶上HMW范围中的拖尾。HMW产物的生成最终导致更少量的扩增的靶物DNA。

因此，本说明书的目的是在使用多聚A-RNA和随机六聚体引物进行通过逆转录的cDNA生成时，防止上文解释的HMW产物的发生。因此，合成了寡聚体dT分子，其能与多聚A-RNA杂交且能封闭分子以避免其与随机六聚体的杂交和HMW产物的生成。为了确保寡聚体dT分子不导致寡聚体dT分子3’端的延伸，所述寡聚体dT分子包含封闭基团。

本说明书的一个方面是逆转录方法，其中所述方法包括以下步骤：a)提供包含RNA的样品，b)使所述样品与载运体核酸接触，由此生成混合物，c)在如下条件下将该混合物施加到基质，该条件使得发生所述RNA和所述载运体核酸对所述基质的结合，d)将所述基质与所述混合物分离，所述基质具有结合于该基质的所述RNA和所述载运体核酸，e)从所述基质洗脱所述RNA和所述载运体核酸，由此产生洗脱物，f)在如下条件下向所述洗脱物添加封闭性核酸，该条件使得发生所述封闭性核酸对所述载运体核酸的杂交，g)在如下条件下向来自步骤f)的洗脱物添加引物，该条件使得发生所述引物对所述RNA的杂交，和h)将所述RNA逆转录成cDNA。

在一个具体的实施方案中，所述载运体核酸是RNA载运体。在一个更具体的实施方案中，所述RNA载运体选自下组：多聚A-RNA,tRNA和MS2RNA。在一个更具体的实施方案中，所述RNA载运体是多聚A-RNA。在一个甚至更具体的实施方案中，所述多聚A-RNA源自噬菌体。如上文详细描述的，该载运体核酸用于增加核酸分离规程期间低量靶核酸如靶RNA的回收。多聚A-RNA具有约100至约500kDa的分子量且由一系列腺苷核苷酸组成。

在一个具体的实施方案中，所述封闭性核酸是寡聚体dT分子。在一个更具体的实施方案中，所述寡聚体dT分子包含10至30个核苷酸。在一个甚至更具体的实施方案中，所述寡聚体dT分子包含15至25个核苷酸。在一个甚至更具体的实施方案中，所述寡聚体dT分子包含18至22个核苷酸。在一个甚至更具体的实施方案中，所述寡聚体dT分子包含20个核苷酸。

在一个具体的实施方案中，所述寡聚体dT分子在3’端封闭。在一个更具体的实施方案中，所述寡聚体dT分子在3’羟基基团通过经取代的磷酸根封闭。在一个甚至更具体的实施方案中，经取代的磷酸根包含C3。在一个甚至更具体的实施方案中，C3是1,3-丙二醇间隔物。

在一个具体的实施方案中，所述寡聚体dT分子是5’-(dT)n-X-3’，其中所述(dT)n是n聚体同型2’-脱氧-胸苷寡核苷酸，其中所述n是10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29或30，其中所述X选自下组：p、pC3、pC3p、pC3pC3和pC3pC3p，且其中X结合于(dT)n的3’末端羟基基团且其中p是磷酸根和C3是1,3-丙二醇间隔物。

在一个更具体的实施方案中，所述寡聚体dT分子是5’-(dT)n-X-3’，其中所述(dT)n是n聚体同型2’-脱氧-胸苷寡核苷酸，其中所述n是18、19、20、21或22，其中所述X选自下组：p、pC3、pC3p、pC3pC3和pC3pC3p，且其中X结合于(dT)n的3’末端羟基基团且其中p是磷酸根和C3是1,3-丙二醇间隔物。在一个优选的实施方案，n是20且X是pC3pC3p。

在一个更具体的实施方案中，所述寡聚体dT分子是5’-(dT)20-X-3’，其中所述(dT)20是20聚体同型2’-脱氧-胸苷寡核苷酸，其中所述X选自下组：p、pC3、pC3p、pC3pC3和pC3pC3p，且其中X结合于(dT)20的3’末端羟基基团且其中p是磷酸根和C3是1,3-丙二醇间隔物。在一个优选的实施方案，X是pC3pC3p。

如此，在一个优选的实施方案中，所述寡聚体dT分子是5’-(dT)20-pC3pC3p-3’，其中所述(dT)20是20聚体同型2’-脱氧-胸苷寡核苷酸，且其中p是磷酸根和C3是1,3-丙二醇间隔物。

在一个具体的实施方案中，引物是随机引物。在一个更具体的实施方案中，随机引物包含5至7个核苷酸。在一个更具体的实施方案中，随机引物包含6个核苷酸，即随机引物是随机六聚体引物。该随机六聚体引物通过在每个偶联步骤使用A、G、C和T的混合物以产生大范围的所有可能的6聚体序列(4096个序列)而完全随机合成。所得多个随机六聚体引物与核酸序列上的多个互补序列退火和充当引物以启动第一链cDNA合成。

在一个具体的实施方案中，基质包含二氧化硅表面。在一个具体的实施方案中，基质包含玻璃纤维绒的二氧化硅表面。在一个更具体的实施方案中，基质包含玻璃纤维绒。将包含核酸的样品与这类基质接触，其中所述核酸结合玻璃纤维绒的二氧化硅表面。因此RNA对基质的结合可通过优化结合条件来增加。污染物质不结合基质且可通过清洗除去。

在一个具体的实施方案中，样品从第一生物获得。在一个更具体的实施方案中，所述第一生物是动物，如人。在一个具体的实施方案中，样品获自动物。在一个更具体的实施方案中，所述样品获自人。在一个甚至更具体的实施方案中，所述样品选自下组：血清、血液、血浆、泪、细胞培养上清、尿和母乳、唾液、脑脊液和精液。

在一个具体的实施方案中，RNA源自第二生物。在一个更具体的实施方案中，第二生物是病毒。在一个甚至更具体的实施方案中，第二生物是丙肝病毒(HCV)。在一个具体的实施方案中，RNA是病毒RNA。在一个更具体的实施方案中，所述RNA是来自HCV的RNA。在一个具体的实施方案中，来自第一生物的样品包含来自第二生物的RNA。在一个更具体的实施方案中，所述样品选自下组：血清、血液、血浆、泪、细胞培养上清、尿和母乳、唾液、脑脊液和精液。在一个甚至更具体的实施方案中，所述样品是血浆。在一个更具体的实施方案中，所述人血浆包含来自HCV的RNA。

本说明书的另一个方面是封闭性核酸分子用于封闭载运体多聚A-RNA的用途，其中所述封闭性核酸分子是5’-(dT)n-X-3’，其中所述(dT)n是n聚体同型2’-脱氧-胸苷寡核苷酸，其中所述n是10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29或30，其中所述X选自下组：p、pC3、pC3p、pC3pC3和pC3pC3p，且其中X结合于(dT)n的3’末端羟基基团且其中p是磷酸根和C3是1,3-丙二醇间隔物。

在一个更具体的实施方案中，所述寡聚体dT分子是5’-(dT)n-X-3’，其中所述(dT)n是n聚体同型2’-脱氧-胸苷寡核苷酸，其中所述n是18、19、20、21或22，其中所述X选自下组：p、pC3、pC3p、pC3pC3和pC3pC3p，其中所述X结合于(dT)n的3’末端羟基基团且其中p是磷酸根和C3是1,3-丙二醇间隔物。在一个优选的实施方案中，n是20且X是pC3pC3p。

在一个甚至更具体的实施方案中，所述封闭性核酸分子是5’-(dT)20-X-3’，其中所述(dT)20是20聚体同型2’-脱氧-胸苷寡核苷酸，其中所述X选自下组：p、pC3、pC3p、pC3pC3和pC3pC3p，其中所述X结合于(dT)20的3’末端羟基基团且其中p是磷酸根和C3是1,3-丙二醇间隔物。在一个优选的实施方案中，X是pC3pC3p。

如此，在优选的实施方案中，寡聚体dT分子是5’-(dT)20-pC3pC3p-3’，其中所述(dT)20是20聚体同型2’-脱氧-胸苷寡核苷酸，且其中p是磷酸根和C3是1,3-丙二醇间隔物。

本说明书的另一个方面是用于实施逆转录的试剂盒，所述试剂盒包含a)作为载运体的多聚A-RNA，和b)如本文中描述的封闭性核酸。

在一个具体的实施方案中，所述封闭性核酸是寡聚体dT分子。在一个更具体的实施方案中，所述寡聚体dT分子包含10至30个核苷酸。在一个甚至更具体的实施方案中，所述寡聚体dT分子包含15至25个核苷酸。在一个甚至更具体的实施方案中，the寡聚体dT分子包含18至22个核苷酸。在一个甚至更具体的实施方案中，the寡聚体dT分子包含20个核苷酸。

在一个具体的实施方案中，所述寡聚体dT分子在3’端封闭。在一个更具体的实施方案中，所述寡聚体dT分子在3’羟基基团处由经取代的磷酸根封闭。在一个甚至更具体的实施方案中，所述经取代的磷酸根包含C3。在一个甚至更具体的实施方案中，C3是1,3-丙二醇间隔物。

在一个更具体的实施方案中，所述寡聚体dT分子是5’-(dT)n-X-3’，其中所述(dT)n是n聚体同型2’-脱氧-胸苷寡核苷酸，其中所述n是18、19、20、21或22，其中所述X选自下组：p、pC3、pC3p、pC3pC3和pC3pC3p，且其中X结合于(dT)n的3’末端羟基基团且其中p是磷酸根和C3是1,3-丙二醇间隔物。在一个优选的实施方案中，n是20且X是pC3pC3p。

在一个更具体的实施方案中，所述寡聚体dT分子是5’-(dT)20-X-3’，其中所述(dT)20是20聚体同型2’-脱氧-胸苷寡核苷酸，其中所述X选自下组：p、pC3、pC3p、pC3pC3和pC3pC3p，且其中X结合于(dT)n的3’末端羟基基团且其中p是磷酸根和C3是1,3-丙二醇间隔物。在一个优选的实施方案中，X是pC3pC3p。

如此，在优选的实施方案中，所述寡聚体dT分子是5’-(dT)20-pC3pC3p-3’，其中所述(dT)20是20聚体同型2’-脱氧-胸苷寡核苷酸，且其中p是磷酸根和C3是1,3-丙二醇间隔物。

提供以下实施例1至6以协助理解本发明，其真实范围在所附权利要求中列出。理解可在所列的规程中进行修饰而不背离本发明的精神。

实施例

实施例1

病毒稀释物的制备

使用具有限定数目的HCV病毒拷贝的丙肝病毒(HCV)阳性样品(EDTA血浆GT1A，Trina，货号DH1302，Lot 13BDH 28725，HCV：876487IU/ml＝2,364x 10e6拷贝/ml)来制备含有5,000,25,000和100,000拷贝/ml的病毒载量的HCV样品。对于HCV阳性样品的稀释，使用HCV阴性血浆材料(Plasma-K3EDTA Hum.Pool PCR-NEG,Roche Diagnostics GmbH,Mat.:03357163001,Lot:10942000)。将HCV阳性血浆以及HCV阴性血浆材料融化并以1,898x g离心10min以分离可能抑制后续PCR的固体杂质。离心步骤后制备稀释物。

实施例2

RNA分离

使用高纯度病毒核酸大体积试剂盒(Roche Diagnostics GmbH,Mat.:05114403001)分离病毒RNA。该试剂盒的原理是基于旋转柱技术。病毒在含有离液盐盐酸胍、非离子型表面活性剂和蛋白酶K的缓冲液中裂解。所释放的核酸在存在离液盐的情况下其结构中受破坏。如此，它们能结合整合在旋转柱中的玻璃纤维绒。将结合的核酸从PCR抑制剂、蛋白质、盐和其他化合物纯化。之后，将其用恢复其结构的水洗脱。应用该试剂盒，其具有多聚A-RNA作为载运体用于增加的核酸回收。

根据制造商的用法说明实施RNA分离。将1ml稀释的HCV阳性血浆样品添加至15ml管。添加补充有15μl多聚A-RNA和250μl蛋白酶K的1ml结合缓冲液并在70℃温育15min。接着，添加400μl的结合缓冲液并混合。然后将样品转移至High Pure Extender装置。因此，将全部样品移液到High Pure Extender装置(Assembly)的上部储槽中。然后，将整个HighPure过滤管装置插入具有摆斗式转子(swing-bucket rotor)的标准台式离心机中并以4,000x g离心5min。离心后，从High Pure Extender装置取出过滤管并弃去流通物(flowthrough)。将过滤管与新的收集管组合，向过滤管的上部储槽添加500μl的抑制剂除去缓冲液，并以8,000x g离心1min。离心后，从收集管取出过滤管，并将过滤管与新的收集管组合。再次弃去流通物。之后，向过滤管的上部储槽添加450μl的清洗缓冲液，以8,000x g离心1min，并再次弃去流通物。重复该清洗步骤。之后，将过滤管收集管装置留在离心机中，以最大速度离心30sec以除去任何残余的清洗缓冲液。弃去收集管并将过滤管插入无核酸酶的无菌1.5ml微离心管中。使用50μl洗脱缓冲液将病毒RNA洗脱至于室温温育1分钟的过滤管的上部储槽，然后将管装置以8,000x g离心1min。在RNA分离后，浓缩提取的RNA以获得用于后续步骤的更小体积。对于该方法，使用Agencourt Ampure RNA Clean XP Beads(BeckmanCoulter)。磁珠结合核酸，且通过将板置于SPRI Plate 96Super Magnet Plate(BeckmanCoulter)上将珠子从溶液分离。通过这种方式洗掉污染物，之后从珠子洗脱核酸。

根据制造商的用法说明测定RNA浓度。

实施例3

5’-(dT)20-pC3pC3p-3’的合成

在ABI 394DNA合成仪上以1μmole规模合成来合成封闭性寡核苷酸5’-(dT)20-pC3pC3p-3’，其使用标准自动化固相DNA合成规程并应用亚磷酰胺化学。使用3’-磷酸CPG(Glen Research，货号20-2900-41)和dT亚磷酰胺(Sigma Aldrich，货号T111031)以及间隔物亚磷酰胺C3(Glen Research，货号10-1913)作为构件块。两种亚磷酰胺均以DNA级乙腈中0,1M的浓度应用。将标准的DNA循环和试剂用于寡核苷酸的装配。然后，将标准的切割程序用于通过浓缩氨水(conc.ammonia)从支持物切割5’-DMT保护的寡核苷酸。通过用浓缩氨水处理切割剩余保护性基团(56℃ 4h)。蒸发粗制DMT保护的寡核苷酸并通过RP HPLC(柱：PRP1(Hamilton part no.79352))纯化，其使用0,1M三乙基乙酸铵pH 7/乙腈梯度。组合产物级分并通过对水渗析(MWCO 1000,SpectraPor 6,part no.132638)3天来脱盐，由此还切割DMT基团。最后，将寡核苷酸冻干。

收量：360纳摩。

实施例4

载运体RNA的封闭

为了阻止高分子量产物的生成，将5μg、2.5μg和1.25μg的寡聚体dT(5’-(dT)20-pC3pC3p-3’)添加至分离的RNA。使用具有以下浓度的不同的HCV病毒载量血浆样品：5,000拷贝/ml；25,000拷贝/ml；50,000拷贝/ml(见图1)。

为了阻止高分子量产物的生成，将2.5μg、1.25μg和0.625μg的寡聚体dT添加至分离的RNA。HCV病毒载量血浆样品浓度为5,000拷贝/ml(见图2)。

实施例5

逆转录

在逆转录之前，将不同量的寡聚体dT添加到如实施例4中描述的浓缩的RNA样品。然后，使用Transcriptor First Strand cDNA合成试剂盒(Roche Diagnostics GmbH,Mat.:0489703001)与用于引发的随机六聚体引物(RH)组合实施逆转录。将13.5μl的样品与4μl 400μM RH混合，接着是在65℃达10min的变性步骤。之后，将样品立即放置在冰上，并添加8μl的试剂主混合物。每份反应，主混合物由5μl转录酶反应缓冲液(5x)、0.5μl RNase抑制剂(40U/μl)、2μl dNTP混合物(各10mM)和0.5μl逆转录酶(40U/μl)组成。将反应在25℃温育25min(温育步骤)，接着是在50℃ 60min(逆转录)，最后是在85℃5min(使逆转录酶失活)。接着，添加1ml RNase(1U/ml)，之后在37℃温育20min。将生成的cDNA用作模板用于后续PCR反应。

实施例6

PCR

将针对HCV基因型1a的HCV特异性引物组用于扩增。对于扩增子PCR，使用FastStart高保真PCR系统(Roche Diagnostics GmbH,Mat.:04738284001)和PCR核苷酸混合物(Roche Diagnostics GmbH,Mat.:11581495001)。主混合物由12.75μl H₂O(PCR级),2.5μl10x Fast Start PCR反应缓冲液(包含18mM MgCl₂),1μl DMSO,1μl dNTP(各10mM)和0.75μl Fast Start高保真酶(5U/μl)组成。添加2μl的正向和逆向引物(各10mM)和3μl的cDNA。将板密封、短暂离心并入表1中所示的温育(扩增程序)。

实施例7

凝胶电泳

为了分析生成的PCR产物，实施使用1％琼脂糖凝胶的凝胶电泳。因此，将1％琼脂糖溶解于1x TBE(Tris-Borat-EDTA)缓冲液中。将溶液加热直至所有琼脂糖晶体均溶解。向冷却的溶液小心添加每1ml的1x TBE缓冲液0.06μl的溴化乙啶。接着，将琼脂糖溶液浇置于期望的凝胶盒中。在加载样品之前，将一份10x Blue Juice上样缓冲液(Invitrogen,Mat.:10816015)施加到4份样品。另外，将6μl的DNA分子量标志XIII 50碱基对梯(RocheDiagnostics GmbH,Mat.:11721925001)填充到另一个凝胶袋中。以120V实施电泳35min，之后使用UV光盒使DNA条带可视。如下加载琼脂糖凝胶。

图1中绘出的琼脂糖凝胶如下加载：右道：6μl分子量标志物。N：对照，无(w/o)试剂混合物的水对照。有寡聚体dT:NC：阴性对照，道NC 1、NC 2、NC 3–不包含样品材料，将HCV特异性引物添加到PCR试剂混合物，用水代替HCV cDNA；将不同预处理浓度的寡聚体dT添加至阴性对照；NC 3＝1.25μg寡聚体dT，NC 2＝2.5μg寡聚体dT，NC 1＝5μg寡聚体dT。寡聚体dT样品5：HCV样品-5,000拷贝/ml：在逆转录前以下述不同浓度的寡聚体dT进行寡聚体dT预处理的情况下扩增浓度为5,000拷贝/ml的HCV cDNA：道5-3＝1.25μg寡聚体dT，道5-2＝2.5μg寡聚体dT，道5-3＝5μg寡聚体dT。寡聚体dT样品25：HCV样品25,000拷贝/ml：在逆转录前以下述不同浓度的寡聚体dT进行寡聚体dT预处理的情况下扩增浓度为25,000拷贝/ml的HCVcDNA：道5-3＝1.25μg寡聚体dT，道5-2＝2.5μg寡聚体dT，道5-3＝5μg寡聚体dT。寡聚体dT样品100：HCV样品100,000拷贝/ml：在逆转录前以下述不同浓度的寡聚体dT进行寡聚体dT预处理的情况下扩增浓度为100,000拷贝/ml的HCV cDNA：道5-3＝1.25μg寡聚体dT，道5-2＝2.5μg寡聚体dT，道5-3＝5μg寡聚体dT。无(w/o)寡聚体dT：样品25：HCV样品25,000拷贝/ml：扩增浓度为25,000拷贝/ml的HCV cDNA，在逆转录之前没有寡聚体dT预处理。

如下加载图2中绘出的琼脂糖凝胶：右道：6μl分子量标志物。N：对照，无试剂混合物的水对照。有寡聚体dT:NC：阴性对照(不包含样品材料)，向PCR试剂混合物添加HCV特异性引物，使用水取代HCV cDNA，寡聚体dT预处理以浓度为0.625μg的寡聚体dT进行。寡聚体dT样品0.625μg：扩增浓度为5,000拷贝/ml的HCV cDNA样品，在逆转录之前使用0.625μg寡聚体dT预处理。寡聚体dT样品1.25μg：扩增浓度为5,000拷贝/ml的HCV cDNA样品，在逆转录之前使用1.25μg寡聚体dT预处理。寡聚体dT样品2.5μg：扩增浓度为5,000拷贝/ml的HCVcDNA样品，在逆转录之前使用2.5μg寡聚体dT预处理。没有(w/o)寡聚体dT样品：扩增浓度为5,000拷贝/ml的HCV cDNA样品，在逆转录之前没有寡聚体dT预处理。

观察到的结果：

如可从图1看到的，对于所有HCV cDNA样品生成了特定的392bp PCR产物。在逆转录前有寡聚体dT预处理的样品中没有生成高分子量产物(有寡聚体dT：道1、2和3，分别对应于样品5、25和100)。然而，在逆转录前没有寡聚体dT预处理的样品中生成了高分子量产物(无寡聚体dT：样品25，两道)。

如可从图2看到的，该特定的392bp PCR产物存在于除了2.5μg寡聚体dT样品中的一个重复和无寡聚体dT的样品中的一个重复以外的所有样品中。在逆转录前有寡聚体dT预处理的样品中没有生成高分子量产物(有寡聚体dT：样品0.625μg、1.25μg和2.5μg)。显示0.625μg寡聚体dT完全阻止高分子量产物生产且限定为要使用的寡聚体dT的量。在无寡聚体dT的样品中，存在高分子量产物。

Claims

1.一种逆转录方法，其中该方法包括以下步骤：

a)提供包含RNA的样品，

b)使所述样品与载运体核酸接触，由此生成混合物，其中所述载运体核酸是多聚A-RNA，

c)在如下条件下将该混合物施加到基质，该条件使得发生所述RNA和所述载运体核酸对所述基质的结合，

d)将所述基质与所述混合物分离，所述基质具有结合于该基质的所述RNA和所述载运体核酸，

e)从所述基质洗脱所述RNA和所述载运体核酸，由此产生洗脱物，

f)在如下条件下向所述洗脱物添加封闭性核酸，该条件使得发生所述封闭性核酸对所述载运体核酸的杂交，其中所述封闭性核酸是寡聚体dT分子，它在3’端修饰以阻止通过聚合酶反应对寡聚体dT分子的延伸，

g)在如下条件下向来自步骤f)的洗脱物添加引物，该条件使得发生所述引物对所述RNA的杂交，和

h)将所述RNA逆转录成cDNA。

2.权利要求1的方法，其中所述寡聚体dT分子是5’-(dT)n-X-3’，其中所述(dT)n是n聚体同型2’-脱氧胸苷寡核苷酸，其中所述n是18、19、20、21或22，其中所述X选自下组：p、pC3、pC3p、pC3pC3和pC3pC3p，且其中X结合于(dT)n的3’末端羟基基团且其中p是磷酸根和C3是1,3-丙二醇间隔物。

3.权利要求2的方法，其中所述n是20且X是pC3pC3p。

4.权利要求1-3的方法，其中所述引物是随机引物。

5.权利要求4的方法，其中所述随机引物是随机六聚体引物。

6.权利要求1-5的方法，其中所述基质包含玻璃纤维绒。

7.权利要求1-6的方法，其中所述样品选自下组：血清、血液、血浆、泪、细胞培养上清、尿和母乳、唾液、脑脊髓液和精液。

8.封闭性核酸分子用于在逆转录期间封闭载运体多聚A-RNA的用途，其中所述封闭性核酸分子是5’-(dT)n-X-3’，其中所述(dT)n是n聚体同型2’-脱氧-胸苷寡核苷酸，其中所述n是18、19、20、21或22，其中所述X选自下组：p、pC3，pC3p、pC3pC3和pC3pC3p，且其中X结合于(dT)n的3’末端羟基基团和其中p是磷酸根和C3是1,3-丙二醇间隔物。

9.权利要求8的用途，其中所述n是20和X是pC3pC3p。

10.用于实施逆转录的试剂盒，所述试剂盒包含：

a)作为载运体的多聚A-RNA，和

b)根据权利要求8和9的封闭性核酸。