JP2016529914A - ポリＡ−キャリヤーにより誘導される高分子量ＰＣＲ生成物の生成を避けるためのオリゴ−ｄＴ分子の適用 - Google Patents

ポリＡ−キャリヤーにより誘導される高分子量ＰＣＲ生成物の生成を避けるためのオリゴ−ｄＴ分子の適用 Download PDF

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Abstract

ＲＮＡ単離に際して、単離ＲＮＡの収率を高めるためにポリＡ−ＲＮＡなどのキャリヤー核酸を使用する。キャリヤー核酸は、後続工程、たとえば逆転写、ＰＣＲおよびゲル電気泳動を妨害する可能性のある高分子量生成物を生じる可能性がある。したがって本発明は、逆転写のための方法およびキット、ならびにキャリヤーであるポリＡ−ＲＮＡをブロッキングするためのブロッキング核酸分子の使用に関する。【選択図】図１

Description

ＲＮＡ単離に際して、単離ＲＮＡの収率を高めるためにポリＡ−ＲＮＡなどのキャリヤー核酸を使用する。キャリヤー核酸は、後続工程、たとえば逆転写、ＰＣＲおよびゲル電気泳動を妨害する可能性のある高分子量生成物を生じる可能性がある。したがって本発明は、逆転写のための方法およびキット、ならびにキャリヤーであるポリＡ−ＲＮＡをブロッキングするためのブロッキング核酸分子の使用に関する。
少量のウイルスＲＮＡを血漿から単離するには、ウイルスゲノムのさらなる分析のために必要な低いＲＮＡ損失率を保証する方法が要求される。ウイルスＲＮＡは種々の方法を用いて単離できる。最も一般的な方法の１つは手動によるＲＮＡ単離である。大部分がカラムベースの方法により実施される手動による血漿からのＲＮＡ単離には、ターゲットＲＮＡがカラム材料に不可逆的に結合するのを阻害するためにポリＡ、ＭＳ２ ＲＮＡまたはｔＲＮＡのようなキャリヤーＲＮＡが用いられる。さらに、合成ポリＡ キャリヤーＲＮＡは単離カラム内のシリカ表面へのＲＮＡの可逆的な結合を促進し、その結果、ＲＮＡ収率も増大することが示された(DN. Hengen et al., Trends of Biochemical Sciences 1996, 21, 224-225; ML. Gallagher et al. Biochemical and Biophysical Research Communications 1987, 144, 271-276)。キャリヤーＲＮＡはカラム材料をブロックし、それによりターゲットＲＮＡを血漿試料から定量的に単離できる。キャリヤーＲＮＡの使用は、ターゲットＲＮＡの安定性の改善などさらに他の有益な効果をもつ可能性もある(D. Andreasen et al., Methods 2010, 50, S6-S9; R. Kishore et al., J. Forensic. Sci. 2006, 51(5), 1055-1061)。
単離後にＲＮＡの逆転写を実施して、以後のＰＣＲ反応に使用するためのｃＤＮＡを作製する。ポリＡ−ＲＮＡを単離工程のためのＲＮＡキャリヤーとして使用し、ランダムヘキサマープライマーを逆転写工程のために使用すると、ポリＡ−ＲＮＡ分子とポリＡ−ＲＮＡに結合できるランダムヘキサマープライマーの一部とのハイブリダイゼーションから生じる目的外の非特異的な高分子量生成物がＰＣＲ反応に際して生成する。この高分子量ハイブリダイゼーション生成物は次いでＰＣＲに際して増幅し、それは高分子量(high molecular weight)（ＨＭＷ）スミア(smear)としてアガロースゲル上に目視できる。このＨＭＷ生成物の生成により、最終的に増幅ターゲットＤＮＡの量がより少ない結果となる。
DN. Hengen et al., Trends of Biochemical Sciences 1996, 21, 224-225 ML. Gallagher et al. Biochemical and Biophysical Research Communications 1987, 144, 271-276 D. Andreasen et al., Methods 2010, 50, S6-S9 R. Kishore et al., J. Forensic. Sci. 2006, 51(5), 1055-1061
したがって本発明の目的は、前記の欠点を示さない方法を提供することである。
キャリヤーとして用いるポリＡ−ＲＮＡを３’−末端がブロックされたオリゴ−ｄＴ分子によりブロックすれば、逆転写後の操作に負の影響を及ぼす前記ＨＭＷ生成物を阻止できることが見出された。
したがって本記載は、逆転写の方法であって、下記の工程を含む方法に関する：ａ）ＲＮＡを含む試料を用意する；ｂ）試料をキャリヤー核酸と接触させ、それにより混合物を調製する；ｃ）混合物を、マトリックスへのＲＮＡおよびキャリヤー核酸の結合が起きる条件下で、マトリックスに適用する；ｄ）マトリックスに結合したＲＮＡおよびキャリヤー核酸を含むマトリックスを、混合物から分離する；ｅ）ＲＮＡおよびキャリヤー核酸をマトリックスから溶出し、それにより溶出物を調製する；ｆ）溶出物に、キャリヤー核酸へのブロッキング核酸のハイブリダイゼーションが起きる条件下で、ブロッキング核酸を添加する；ｇ）工程ｆ）からの溶出物に、ＲＮＡへのプライマーのハイブリダイゼーションが起きる条件下で、プライマーを添加する；そしてｈ）ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡにする。
特定の態様において、キャリヤー核酸はＲＮＡキャリヤーである。より特定の態様において、ＲＮＡキャリヤーはポリＡ−ＲＮＡである。
特定の態様において、ブロッキング核酸はオリゴ−ｄＴ分子である。より特定の態様において、オリゴ−ｄＴ分子は５’−（ｄＴ）ｎ−Ｘ−３’であり、その際、（ｄＴ）ｎはｎ−ｍｅｒ ホモ−２’−デオキシ−チミジンオリゴヌクレオチドであり、ｎは１８、１９、２０、２１または２２であり、Ｘはｐ、ｐＣ３、ｐＣ３ｐ、ｐＣ３ｐＣ３およびｐＣ３ｐＣ３ｐからなる群から選択され、Ｘは（ｄＴ）ｎの３’−末端ヒドロキシル基に結合しており、ｐはホスフェートであり、Ｃ３は１，３−プロパンジオールスペーサーである。よりさらに特定の態様において、ｎは２０であり、ＸはｐＣ３ｐＣ３ｐである。特定の態様において、プライマーはランダムプライマーである。より特定の態様において、ランダムプライマーはランダムヘキサマープライマーである。
特定の態様において、マトリックスはグラスファイバーフリースを含む。
特定の態様において、試料は、血清、血液、血漿、涙液、細胞培養上清、尿、および母乳、唾液、脳脊髄液および精液からなる群から選択される。
本明細書は、さらに逆転写に際してキャリヤーポリＡ−ＲＮＡをブロッキングするためのブロッキング核酸分子の使用に関するものであって、ブロッキング核酸分子は５’−（ｄＴ）ｎ−Ｘ−３’であり、その際、（ｄＴ）ｎはｎ−ｍｅｒ ホモ−２’−デオキシ−チミジンオリゴヌクレオチドであり、ｎは１８、１９、２０、２１または２２であり、Ｘはｐ、ｐＣ３、ｐＣ３ｐ、ｐＣ３ｐＣ３およびｐＣ３ｐＣ３ｐからなる群から選択され、Ｘは（ｄＴ）ｎの３’−末端ヒドロキシル基に結合しており、ｐはホスフェートであり、Ｃ３は１，３−プロパンジオールスペーサーである。特定の態様において、ｎは２０であり、ＸはｐＣ３ｐＣ３ｐである。
本明細書はさらに、逆転写を実施するためのキットであって、下記のものを含むキットに関する：ａ）キャリヤーとしてのポリＡ−ＲＮＡ、およびｂ）前記のブロッキング核酸。
図１は、逆転写前にオリゴ−ｄＴ前処理した、および前処理しない、ＨＣＶ遺伝子型１ａに対するＨＣＶ特異的プライマーセットを用いたＰＣＲ生成物の比較を示す。異なる濃度のオリゴ−ｄＴおよび異なる濃度のＨＣＶ ｃＤＮＡを比較している。 図１は、逆転写前にオリゴ−ｄＴ前処理した、および前処理しない、ＨＣＶ遺伝子型１ａに対するＨＣＶ特異的プライマーセットを用いたＰＣＲ生成物の比較を示す。異なる濃度のオリゴ−ｄＴを特定濃度のＨＣＶ ｃＤＮＡで比較している。
以下の定義は、本明細書中で用いる種々の用語を説明し、その意味および範囲を定義するために記載される。
用語“a”、“an”および“the”は、状況からそうではないことが明らかに示されない限り、一般に複数表記を含む。
本明細書中で数値と併せて用いる用語“約”は、その数値の上方および下方へ境界を広げることによりその数値を修飾する。一般に、用語“約”は記載した数値の上方および下方へ５％高いまたは低い分散によりその数値を修飾する。たとえば、“約１００”の数値は“９５〜１０５”の範囲を意味する。
用語“増幅”は、一般にターゲット核酸から複数の核酸分子が生成することを表わし、その際、ポリメラーゼによる伸長の開始部位を提供するためにプライマーがターゲット核酸の特異的部位にハイブリダイズする。増幅は当技術分野で一般に知られているいずれかの方法、たとえば下記により実施できるが、これらに限定されない：標準ＰＣＲ、ロングＰＣＲ(long PCR)、ホットスタート(hot start PCR)、ｑＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲおよび等温増幅。
用語“３’ブロックされたプライマー”は、本明細書中で、当業者に知られているように用いられ、それらの３’−ヒドロキシル基が、ポリメラーゼ反応によるプライマー伸長を阻止できるブロッキング基により修飾されたオリゴヌクレオチドを表わす。適切なブロッキング基は、特に２’−デオキシリボース部分を含まないいずれかの基である。そのようなブロッキング基は、たとえばホスフェート、置換ホスフェート、たとえばアルキルもしくはアリール置換ホスフェート、エーテル基、たとえばアルキル（たとえばメチル、エチルもしくはベンジル）エーテル、３’−デオキシリボース誘導体、たとえば２’，３’−ジデオキシヌクレオシド、または増幅条件下で安定な他のヒドロキシル保護基、たとえばエステル、たとえばベンゾエートもしくはナイトレートであるが、これらに限定されない。ジオール、たとえばアルカンジオール、たとえば１，３−プロパンジオール（本明細書中でＣ３−スペーサーまたはＣ３と呼ぶ）の使用により、置換ホスフェートを多重に３’−末端ヒドロキシル基に取り込ませることができる。そのような３’−ホスフェートまたは置換ホスフェートブロックされたプライマーの合成を容易にするために、市販の３’−ホスフェート−ＣＰＧもしくは３’−スペーサー Ｃ３ ＣＰＧを、または３’−ホスフェート−ＣＰＧをスペーサーＣ３ ホスホルアミダイト（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，バージニア州スターリング）と一緒に使用できる。特に適切なものは、３’−ヒドロキシル修飾、たとえばホスフェート（ｐ）、ホスフェート−１，３−プロパンジオール（ｐＣ３）、ホスフェート−１，３−プロパンジオール−ホスフェート（ｐＣ３ｐ）、ホスフェート−１，３−プロパンジオール−ホスフェート−１，３−プロパンジオール（ｐＣ３ｐＣ３）またはホスフェート−１，３−プロパンジオール−ホスフェート−１，３−プロパンジオール−ホスフェート（ｐＣ３ｐＣ３ｐ）である。
用語“キャリヤー核酸”は、本明細書中で、当業者に知られているように用いられ、種々のタイプのＲＮＡ、たとえばポリＡ−ＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびＭＳ２ ＲＮＡを表わす。通常、そのような種々のキャリヤーＲＮＡはバクテリオファージに由来する。キャリヤー核酸は、核酸単離操作に際して、少量のターゲット核酸、たとえばターゲットＲＮＡの回収率を高めるために用いられる。そのような単離は、たとえば固相の使用による試料からのターゲット核酸の分離を意味する。一般に、ターゲット核酸を含む試料にキャリヤー核酸を多量添加する。キャリヤー核酸の量は、ターゲット核酸と比較して不釣合いに多い。キャリヤー核酸とターゲット核酸は、たとえば変性プロセス（酵素的、物理的、化学的）に対して競合し、それによりターゲット核酸を保護する。キャリヤー核酸は多量であるため、それに比例してそのようなプロセスによる影響をターゲット核酸より強く受ける。その結果、ターゲット核酸が受ける影響ははるかに低くなり、それによってターゲット核酸の収率が向上する。キャリヤー核酸は当技術分野で周知であり、市販されている。
本明細書中で用いる用語“ハイブリダイゼーション”は、相補的核酸の対合に関して用いられる。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション強度（すなわち、核酸間の会合の強度）は、核酸間の相補度、関与する条件のストリンジェンシー、形成されたハイブリッドのＴｍ、および核酸内のＧ：Ｃ比などの要因により影響を受ける。本発明は特定のセットのハイブリダイゼーション条件に限定されないが、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件を用いるのが好ましい。ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は配列依存性であり、環境パラメーター（たとえば、塩濃度、および有機物の存在）の変動に伴なって異なるであろう。一般に、“ストリンジェント”条件は、一定のイオン強度およびｐＨにおけるその特定の核酸配列の熱融解点（Ｔｍ）より約５℃〜２０℃低くなるように選択される。好ましくは、ストリンジェント条件は相補的核酸に結合した特定の核酸の熱融解点より約５℃〜１０℃低い。Ｔｍは、５０％の核酸（たとえば、タグ核酸）が完全対合プローブにハイブリダイズする温度（一定のイオン強度およびｐＨ下で）である。
本明細書中で用いる用語“マトリックス”は、核酸が特異的に結合し、一方で混在物は結合しない表面を表わす。より具体的には、マトリックスは核酸単離カラムに収容できるグラスファイバーフリースのシリカ表面である。核酸を含む試料をそのようなマトリックスに接触させることにより、核酸はカオトロピック塩の存在下でグラスファイバーフリースの表面に結合する。これによりマトリックスは核酸を特異的に固定化する。ＲＮＡをマトリックスに結合させるために、結合条件をそれに応じて最適化してＲＮＡの固定化を確実に高めることができる。核酸の単離は、核酸を特異的にグラスファイバーフリース結合させ、一方で混在物（たとえば、塩類、タンパク質、または他の組織混在物）をそれに結合させないことにより行なわれる。ＤＮＡをマトリックスから除去するためには、マトリックスに結合した核酸にＤＮａｓｅを直接作用させて消化することができる。消化したＤＮＡフラグメントおよび他の組織混在物を除去した後（たとえば、洗浄により）、残留する単離ＲＮＡを続いて小体積の水または低い塩濃度の緩衝液で溶出することができる。
用語“核酸”は、一般に、それが増幅生成物、合成により作製したもの、ＲＮＡの逆転写生成物、または天然に存在するもののいずれであるかにかかわらず、ＤＮＡまたはＲＮＡを表わす。一般に、核酸は一本鎖または二本鎖分子であり、天然ヌクレオチドから構成される。二本鎖核酸分子は３’または５’オーバーハングをもつことができ、したがってそれらの全長にわたって完全二本鎖であることは要求または想定されない。さらに、核酸という用語は非天然ヌクレオチドおよび／または天然ヌクレオチドの修飾体から構成できる。例をここに挙げるが、それらに限定されない：それぞれライゲーションを可能にし、またはオキソヌクレアーゼ分解／ポリメラーゼ伸長の阻止を可能にする、５’または３’ヌクレオチドのリン酸化；共有結合および共有結合に近似する結合のためのアミノ、チオール、アルキン、またはビオチニル修飾；発蛍光団およびクエンチャー；分解を阻止するためのヌクレオチド間のホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホルアミデートおよびホスホトリエステル結合；メチル化；ならびに修飾された塩基またはヌクレオチド、たとえば２’−デオキシイノシン、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン、２’−デオキシウリジン、２−アミノプリン、２’，３’−ジデオキシシチジン、５−メチル−２’−デオキシシチジン、ロックト核酸(locked nucleic acid)（ＬＮＡ）、イソ−ｄＣおよび−ｄＧ塩基、２’−Ｏ−メチル ＲＮＡ塩基、およびフッ素修飾塩基。
本明細書中で用いる用語“オリゴ−ｄＴ”または“オリゴ−ｄＴ分子”は、チミジンのみから構成されるホモポリマーを表わす。オリゴ−ｄＴ分子の好ましい長さは１０〜１００塩基であり、より好ましいのは１０〜３０塩基の長さであり、最も好ましいのは２０塩基の長さである。オリゴ−ｄＴ分子は、ポリメラーゼ反応による伸長を阻止するために、好ましくはそれの３’−ヒドロキシル基においてブロッキング基によりブロックされている。オリゴ−ｄＴ分子をその分子がなおポリＡ−ＲＮＡにハイブリダイズしうる限り修飾できることも当業者に知られている。修飾はすべてのタイプのチミジンアナログ、たとえば、２’−デオキシウリジン、２’−Ｏ−メチル−ウリジン、ＬＮＡ（ロックト核酸）チミジンまたはウリジン誘導体、ＰＮＡ（ペプチド核酸）チミンまたはウラシル誘導体、ＨＮＡ（ヘキシトール核酸）チミジンまたはウリジン誘導体、または塩基修飾ウラシル誘導体、たとえば５−プロピオニル−ウラシルであるが、これらに限定されず、蛍光標識もしくはハプテンなどの標識による修飾、またはチミジンおよびウリジン以外のヌクレオチドもしくはヌクレオチド配列による修飾も含まれる。
本明細書中で用いる用語“オリゴヌクレオチド”は、２以上、好ましくは３より多い、通常は１０より多いデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドからなる分子を表わす。厳密なサイズは多数の要因に依存し、それはまたオリゴヌクレオチドの最終的機能または用途に依存する。オリゴヌクレオチドは、化学合成、ＤＮＡ複製、逆転写、またはその組合わせを含むいずれかの方法で作製できる。オリゴヌクレオチドという用語は用語“ポリヌクレオチド”と互換性をもって用いることもできる。
用語“ポリメラーゼ連鎖反応”(または“ＰＣＲ”）は、クローニングまたは精製せずにゲノムＤＮＡ中のターゲット配列のセグメントの濃度を高める方法を表わす。ターゲット配列を増幅するためのこの方法は、目的ターゲット配列を含有するＤＮＡ混合物に大過剰の２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを導入し、続いてＤＮＡポリメラーゼの存在下で厳密な一連のサーマルサイクリングを行なうことからなる。２種類のプライマーは、二本鎖ターゲット配列の個々の鎖に対して相補的である。増幅を行なうために、混合物を変性させ、次いでプライマーをターゲット分子内のそれらの相補配列にアニールさせる。アニーリングに続いて、新たな１対の相補鎖を形成するようにプライマーをポリメラーゼで伸長させる。この変性、プライマーアニーリング、およびポリメラーゼ伸長の工程を多数回反復して（すなわち、変性、アニーリングおよび伸長が１“サイクル”を構成する；多数“サイクル”が可能である）、目的ターゲット配列の高濃度の増幅セグメントを得ることができる。目的ターゲット配列の増幅セグメントの長さはプライマー相互の相対位置により決定され、したがってこの長さは制御可能なパラメーターである。ＰＣＲを用いると、ゲノムＤＮＡ中の１コピーの特定ターゲット配列を当業者に既知の幾つかの異なる方法により検出できるレベルにまで増幅することができる。ゲノムＤＮＡのほかに、いかなるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列も適切なプライマー分子のセットを用いて増幅することができる。特に、ＰＣＲ法そのものにより作製された増幅セグメントは、それら自体が後続のＰＣＲ増幅のための有効な鋳型である。ライゲーション仲介ＰＣＲは、ＤＮＡ末端にライゲートしたリンカー（たとえば、ＤＮＡフラグメント）に対してプライマー類が相同（たとえば、相補的）である場合に行なわれるＰＣＲを表わす。
用語“ｑＰＣＲ”は、一般にリアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応、定量ポリメラーゼ連鎖反応または動力学的ポリメラーゼ連鎖反応として知られるＰＣＲ手法を表わす。この手法はＰＣＲを用いてターゲット核酸を同時に増幅および定量し、その際、定量はインターカレーション性の蛍光色素、またはターゲット核酸にハイブリダイズした時点でのみ検出できる蛍光性レポーター分子を含む配列特異的プローブによる。
本明細書中で用いる用語“プライマー”は、精製された制限消化物のような天然のもの、または合成により製造されたもののいずれであっても、ある核酸鎖に対して相補的であるプライマー伸長生成物の合成を誘導する条件下に置かれた際に（すなわち、ヌクレオチド、および誘導剤、たとえばＤＮＡポリメラーゼの存在下で、適切な温度およびｐＨにおいて）合成の開始点として作用できるオリゴヌクレオチドを表わす。プライマーは増幅における最大効率のためには好ましくは一本鎖であるが、あるいは二本鎖であってもよい。二本鎖の場合、プライマーは伸長生成物の作製に用いる前にまずそれの鎖に分離するために処理される。好ましくは、プライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、誘導剤の存在下で伸長生成物の合成をプライミングするのに十分な長さでなければならない。プライマーの厳密な長さは、温度、プライマー源、およびその方法の使用を含めた多数の要因に依存するであろう。
本明細書中で用いる用語“ランダムヘキサマープライマー”は、カップリング工程毎に４種類の塩基Ａ、Ｇ、ＣおよびＴの混合物を用いて多数範囲の可能なすべての６−ｍｅｒ配列（４０９６の配列）を得ることによって完全にランダムに合成された長さ６塩基のオリゴヌクレオチド配列を表わし、それらは核酸配列上の複数の相補配列にアニールする効力をもち、第１鎖ｃＤＮＡ合成を行なうプライマーとして作用する。
用語“ＲＮＡ”は、本明細書中で、当業者に知られているように用いられ、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ転写産物、ｍＲＮＡ、転写産物プロセシング中間体、ｍｉＲＮＡ、非コーディングＲＮＡ、翻訳に使われる成熟ｍＲＮＡ、および遺伝子もしくは遺伝子類からの転写産物、またはそれらに由来する核酸を表わす。転写産物プロセシングにはスプライシング、編集(editing)、修飾および分解などのプロセスが含まれる。ｍＲＮＡ含有試料には下記のものが含まれるが、それらに限定されない：ｍＲＮＡ、遺伝子もしくは遺伝子類のｍＲＮＡ転写産物、逆転写を用いたｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡ、増幅ＤＮＡから転写されたＲＮＡ、ｃＤＮＡから転写されたｃＲＮＡ、遺伝子類から増幅されたＤＮＡなど。さらに、本明細書の範囲において、用語“ＲＮＡ”はｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびキャリヤーＲＮＡをも表わすことができる。
本明細書中で用いる用語“試料”は、それの最も広い意味で用いられる。１つの意味において、それはいずれかの供給源から得られた核酸検体を含むものとする。生体核酸試料は動物（ヒトを含む）から得ることができ、流体、固体、組織などから単離した核酸を含む。生体核酸試料は非ヒト動物に由来するものであってもよく、それには脊椎動物、たとえばげっ歯類、非ヒト霊長類、ヒツジ、ウシ、反芻動物、ウサギ、ブタ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、鳥類が含まれるが、これらに限定されない。生体核酸は、原核生物、たとえば細菌、および他の非動物真核生物、たとえば植物からも得ることができる。本発明は核酸試料の供給源によって限定されず、いかなる生物界からのいかなる核酸も本明細書に記載する方法に使用できるものとする。
ＲＮＡを複雑な試料からマトリックスにより単離する場合、単離ＲＮＡの収率を増大させるために通常はキャリヤー核酸を使用する。特に目的ＲＮＡが複雑な試料中にきわめて少量含有されている場合、たとえば血漿中のウイルスＲＮＡの場合、そのような増大は必須である。そのような収率増大は後続操作、たとえば逆転写に続くＰＣＲにおける成功の機会を増大させる。ポリＡ−ＲＮＡを単離工程のためのキャリヤー核酸として使用し、さらにランダムヘキサマーを逆転写工程のために使用すると、目的外の非特異的な高分子量（ＨＭＷ）生成物がＰＣＲ反応に際して生じる。そのようなＨＭＷ生成物は、ポリＡ−ＲＮＡ分子がランダムヘキサマープライマーの一部にハイブリダイズし、それによりポリＡ−ＲＮＡ分子とランダムヘキサマープライマーとの多重エレメントの配列が生じることから生成する。そのようなＨＭＷ生成物はＰＣＲに際して増幅し、それはアガロースゲル上のＨＭＷ範囲にスミアとして現れる。このＨＭＷ生成物の生成により、最終的に増幅ターゲットＤＮＡの量がより少ない結果となる。
したがって本記載の目的は、ポリＡ−ＲＮＡおよびランダムヘキサマープライマーを逆転写によるｃＤＮＡ作製のために使用する際の上記に説明したＨＭＷ生成物の生成を阻止することであった。したがって、ポリＡ−ＲＮＡがランダムヘキサマーにハイブリダイズしてＨＭＷ生成物を生成するのを避けるために、ポリＡ−ＲＮＡにハイブリダイズすることができ、それらの分子をブロックできるオリゴ−ｄＴ分子を合成した。オリゴ−ｄＴ分子がオリゴ−ｄＴ分子の３’末端伸長を生じないことを確実にするために、オリゴ−ｄＴ分子はブロッキング基を含む。
本記載の１観点は、逆転写の方法であって、下記の工程を含む方法に関する：ａ）ＲＮＡを含む試料を用意する；ｂ）試料をキャリヤー核酸と接触させ、それにより混合物を調製する；ｃ）混合物を、マトリックスへのＲＮＡおよびキャリヤー核酸の結合が起きる条件下で、マトリックスに適用する；ｄ）マトリックスに結合したＲＮＡおよびキャリヤー核酸を含むマトリックスを、混合物から分離する；ｅ）ＲＮＡおよびキャリヤー核酸をマトリックスから溶出し、それにより溶出物を調製する；ｆ）溶出物に、キャリヤー核酸へのブロッキング核酸のハイブリダイゼーションが起きる条件下で、ブロッキング核酸を添加する；ｇ）工程ｆ）からの溶出物に、ＲＮＡへのプライマーのハイブリダイゼーションが起きる条件下で、プライマーを添加する；そしてｈ）ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡにする。
特定の態様において、キャリヤー核酸はＲＮＡキャリヤーである。より特定の態様において、ＲＮＡキャリヤーはポリＡ−ＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびＭＳ２ ＲＮＡからなる群から選択される。より特定の態様において、ＲＮＡキャリヤーはポリＡ−ＲＮＡである。よりさらに特定の態様において、ポリＡ−ＲＮＡはバクテリオファージに由来する。前記に詳細に記載したように、キャリヤー核酸は核酸単離操作に際して少量のターゲット核酸、たとえばターゲットＲＮＡの回収率を増大させるために用いられる。ポリＡ−ＲＮＡは約１００〜約５００ｋＤａの分子量をもち、一連のアデノシンヌクレオチドからなる。
特定の態様において、ブロッキング核酸はオリゴ−ｄＴ分子である。より特定の態様において、オリゴ−ｄＴ分子は１０から３０個までのヌクレオチドを含む。よりさらに特定の態様において、オリゴ−ｄＴ分子は１５から２５個までのヌクレオチドを含む。よりさらに特定の態様において、オリゴ−ｄＴ分子は１８から２２個までのヌクレオチドを含む。よりさらに特定の態様において、オリゴ−ｄＴ分子は２０個のヌクレオチドを含む。
特定の態様において、オリゴ−ｄＴ分子は３’−末端においてブロックされている。より特定の態様において、オリゴ−ｄＴ分子は３’−ヒドロキシル基において置換ホスフェートによりブロックされている。よりさらに特定の態様において、置換ホスフェートはＣ３を含む。よりさらに特定の態様において、Ｃ３は１，３−プロパンジオールスペーサーである。
特定の態様において、オリゴ−ｄＴ分子は５’−（ｄＴ）ｎ−Ｘ−３’であり、その際、（ｄＴ）ｎはｎ−ｍｅｒ ホモ−２’−デオキシ−チミジンオリゴヌクレオチドであり、ｎは１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０であり、Ｘはｐ、ｐＣ３、ｐＣ３ｐ、ｐＣ３ｐＣ３およびｐＣ３ｐＣ３ｐからなる群から選択され、Ｘは（ｄＴ）ｎの３’−末端ヒドロキシル基に結合しており、ｐはホスフェートであり、Ｃ３は１，３−プロパンジオールスペーサーである。
より特定の態様において、オリゴ−ｄＴ分子は５’−（ｄＴ）ｎ−Ｘ−３’であり、その際、（ｄＴ）ｎはｎ−ｍｅｒ ホモ−２’−デオキシ−チミジンオリゴヌクレオチドであり、ｎは１８、１９、２０、２１または２２であり、Ｘはｐ、ｐＣ３、ｐＣ３ｐ、ｐＣ３ｐＣ３およびｐＣ３ｐＣ３ｐからなる群から選択され、Ｘは（ｄＴ）ｎの３’−末端ヒドロキシル基に結合しており、ｐはホスフェートであり、Ｃ３は１，３−プロパンジオールスペーサーである。好ましい態様において、ｎは２０であり、ＸはｐＣ３ｐＣ３ｐである。
より特定の態様において、オリゴ−ｄＴ分子は５’−（ｄＴ）２０−Ｘ−３’であり、その際、（ｄＴ）２０は２０−ｍｅｒ ホモ−２’−デオキシ−チミジンオリゴヌクレオチドであり、Ｘはｐ、ｐＣ３、ｐＣ３ｐ、ｐＣ３ｐＣ３およびｐＣ３ｐＣ３ｐからなる群から選択され、Ｘは（ｄＴ）２０の３’−末端ヒドロキシル基に結合しており、ｐはホスフェートであり、Ｃ３は１，３−プロパンジオールスペーサーである。好ましい態様において、ＸはｐＣ３ｐＣ３ｐである。
したがって、好ましい態様において、オリゴ−ｄＴ分子は５’−（ｄＴ）２０−ｐＣ３ｐＣ３ｐ−３’であり、その際、（ｄＴ）２０は２０−ｍｅｒ ホモ−２’−デオキシ−チミジンオリゴヌクレオチドであり、ｐはホスフェートであり、Ｃ３は１，３−プロパンジオールスペーサーである。
特定の態様において、プライマーはランダムプライマーである。より特定の態様において、ランダムプライマーは５〜７個のヌクレオチドを含む。より特定の態様において、ランダムプライマーは６個のヌクレオチドを含み、すなわちランダムプライマーはランダムヘキサマープライマーである。ランダムヘキサマープライマーは、カップリング工程毎に４種類の塩基Ａ、Ｇ、ＣおよびＴの混合物を用いて多数範囲の可能なすべての６−ｍｅｒ配列（４０９６の配列）を得ることによって完全にランダムに合成される。得られた複数のランダムヘキサマープライマーは核酸配列上の複数のランダム配列にアニールし、第１鎖ｃＤＮＡ合成を行なうプライマーとして作用する。
特定の態様において、マトリックスはシリカ表面を含む。特定の態様において、マトリックスはグラスファイバーフリースのシリカ表面を含む。より特定の態様において、マトリックスはグラスファイバーフリースを含む。核酸を含む試料をそのようなマトリックスと接触させると、核酸はグラスファイバーフリースのシリカ表面に結合する。マトリックスへのＲＮＡの結合は、結合条件をそれに応じて最適化することによって増大させることができる。混在物はマトリックスに結合せず、洗浄により除去することができる。
特定の態様において、試料は第１生物から得られる。より特定の態様において、第１生物は動物、たとえばヒトである。特定の態様において、試料は動物から得られる。より特定の態様において、試料はヒトから得られる。よりさらに特定の態様において、試料は血清、血液、血漿、涙液、細胞培養上清、尿、および母乳、唾液、脳脊髄液、および精液からなる群から選択される。
特定の態様において、ＲＮＡは第２生物に由来する。より特定の態様において、第２生物はウイルスである。よりさらに特定の態様において、第２生物はＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）である。特定の態様において、ＲＮＡはウイルスＲＮＡである。より特定の態様において、ＲＮＡはＨＣＶからのＲＮＡである。特定の態様において、第１生物からの試料は第２生物からのＲＮＡを含む。より特定の態様において、試料は血清、血液、血漿、涙液、細胞培養上清、尿、および母乳、唾液、脳脊髄液、および精液からなる群から選択される。よりさらに特定の態様において、試料は血漿である。より特定の態様において、ヒト血漿はＨＣＶからのＲＮＡを含む。
本記載の他の観点は、キャリヤーであるポリＡ−ＲＮＡをブロックするためのブロッキング核酸分子の使用であり、その際、ブロッキング核酸分子は５’−（ｄＴ）ｎ−Ｘ−３’であり、その際、（ｄＴ）ｎはｎ−ｍｅｒ ホモ−２’−デオキシ−チミジンオリゴヌクレオチドであり、ｎは１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０であり、Ｘはｐ、ｐＣ３、ｐＣ３ｐ、ｐＣ３ｐＣ３およびｐＣ３ｐＣ３ｐからなる群から選択され、Ｘは（ｄＴ）ｎの３’−末端ヒドロキシル基に結合しており、ｐはホスフェートであり、Ｃ３は１，３−プロパンジオールスペーサーである。
より特定の態様において、オリゴ−ｄＴ分子は５’−（ｄＴ）ｎ−Ｘ−３’であり、その際、（ｄＴ）ｎはｎ−ｍｅｒ ホモ−２’−デオキシ−チミジンオリゴヌクレオチドであり、ｎは１８、１９、２０、２１または２２であり、Ｘはｐ、ｐＣ３、ｐＣ３ｐ、ｐＣ３ｐＣ３およびｐＣ３ｐＣ３ｐからなる群から選択され、Ｘは（ｄＴ）ｎの３’−末端ヒドロキシル基に結合しており、ｐはホスフェートであり、Ｃ３は１，３−プロパンジオールスペーサーである。好ましい態様において、ｎは２０であり、ＸはｐＣ３ｐＣ３ｐである。
よりさらに特定の態様において、ブロッキング核酸分子は５’−（ｄＴ）２０−Ｘ−３’であり、その際、（ｄＴ）２０は２０−ｍｅｒ ホモ−２’−デオキシ−チミジンオリゴヌクレオチドであり、Ｘはｐ、ｐＣ３、ｐＣ３ｐ、ｐＣ３ｐＣ３およびｐＣ３ｐＣ３ｐからなる群から選択され、Ｘは（ｄＴ）２０の３’−末端ヒドロキシル基に結合しており、ｐはホスフェートであり、Ｃ３は１，３−プロパンジオールスペーサーである。好ましい態様において、ＸはｐＣ３ｐＣ３ｐである。
したがって、好ましい態様において、オリゴ−ｄＴ分子は５’−（ｄＴ）２０−ｐＣ３ｐＣ３ｐ−３’であり、その際、（ｄＴ）２０は２０−ｍｅｒ ホモ−２’−デオキシ−チミジンオリゴヌクレオチドであり、ｐはホスフェートであり、Ｃ３は１，３−プロパンジオールスペーサーである。
本記載の他の観点は、逆転写を実施するためのキットであって、ａ）キャリヤーとしてのポリＡ−ＲＮＡ、およびｂ）本明細書に記載するブロッキング核酸を含むキットである。
特定の態様において、ブロッキング核酸はオリゴ−ｄＴ分子である。より特定の態様において、オリゴ−ｄＴ分子は１０から３０個までのヌクレオチドを含む。よりさらに特定の態様において、オリゴ−ｄＴ分子は１５から２５個までのヌクレオチドを含む。よりさらに特定の態様において、オリゴ−ｄＴ分子は１８から２２個までのヌクレオチドを含む。よりさらに特定の態様において、オリゴ−ｄＴ分子は２０個のヌクレオチドを含む。
特定の態様において、オリゴ−ｄＴ分子３’−末端においてブロックされている。より特定の態様において、オリゴ−ｄＴ分子はは３’−ヒドロキシル基において置換ホスフェートによりブロックされている。よりさらに特定の態様において、置換ホスフェートはＣ３を含む。よりさらに特定の態様において、Ｃ３は１，３−プロパンジオールスペーサーである。
特定の態様において、オリゴ−ｄＴ分子は５’−（ｄＴ）ｎ−Ｘ−３’であり、その際、（ｄＴ）ｎはｎ−ｍｅｒ ホモ−２’−デオキシ−チミジンオリゴヌクレオチドであり、ｎは１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０であり、Ｘはｐ、ｐＣ３、ｐＣ３ｐ、ｐＣ３ｐＣ３およびｐＣ３ｐＣ３ｐからなる群から選択され、Ｘは（ｄＴ）ｎの３’−末端ヒドロキシル基に結合しており、ｐはホスフェートであり、Ｃ３は１，３−プロパンジオールスペーサーである。
より特定の態様において、オリゴ−ｄＴ分子は５’−（ｄＴ）ｎ−Ｘ−３’であり、その際、（ｄＴ）ｎはｎ−ｍｅｒ ホモ−２’−デオキシ−チミジンオリゴヌクレオチドであり、ｎは１８、１９、２０、２１または２２であり、Ｘはｐ、ｐＣ３、ｐＣ３ｐ、ｐＣ３ｐＣ３およびｐＣ３ｐＣ３ｐからなる群から選択され、Ｘは（ｄＴ）ｎの３’−末端ヒドロキシル基に結合しており、ｐはホスフェートであり、Ｃ３は１，３−プロパンジオールスペーサーである。好ましい態様において、ｎは２０であり、ＸはｐＣ３ｐＣ３ｐである。
より特定の態様において、オリゴ−ｄＴ分子は５’−（ｄＴ）２０−Ｘ−３’であり、その際、（ｄＴ）２０は２０−ｍｅｒ ホモ−２’−デオキシ−チミジンオリゴヌクレオチドであり、Ｘはｐ、ｐＣ３、ｐＣ３ｐ、ｐＣ３ｐＣ３およびｐＣ３ｐＣ３ｐからなる群から選択され、Ｘは（ｄＴ）２０の３’−末端ヒドロキシル基に結合しており、ｐはホスフェートであり、Ｃ３は１，３−プロパンジオールスペーサーである。好ましい態様において、ＸはｐＣ３ｐＣ３ｐである。
したがって、好ましい態様において、オリゴ−ｄＴ分子は５’−（ｄＴ）２０−ｐＣ３ｐＣ３ｐ−３’であり、その際、（ｄＴ）２０は２０−ｍｅｒ ホモ−２’−デオキシ−チミジンオリゴヌクレオチドであり、ｐはホスフェートであり、Ｃ３は１，３−プロパンジオールスペーサーである。
以下の実施例１〜６は本発明の理解を補助するために提示され、本発明の真の範囲は特許請求の範囲に述べられている。提示した方法を本発明の精神から逸脱することなく改変できることは理解される。
実施例１：
ウイルス希釈液の調製
一定数のＨＣＶウイルスコピーを含むＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）陽性試料（ＥＤＴＡ血漿ＧＴ１Ａ，Ｔｒｉｎａ，,カタログＮｏ．ＤＨ１３０２，ロット１３ＢＤＨ ２８７２５，ＨＣＶ：８７６４８７ＩＵ／ｍｌ＝２，３６４×１０ｅ６コピー／ｍｌ）を用いて、ウイルス負荷５，０００、２５，０００および１００，０００コピー／ｍｌを含有するＨＣＶ試料を調製した。ＨＣＶ陽性試料を希釈するために、ＨＣＶ陰性血漿材料を用いた（Ｐｌａｓｍａ−Ｋ３ＥＤＴＡ Ｈｕｍ．Ｐｏｏｌ ＰＣＲ−ＮＥＧ，Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，Ｍａｔ．：０３３５７１６３００１，ロット：１０９４２０００）。ＨＣＶ陽性血漿およびＨＣＶ陰性血漿材料を融解し、１，８９８×ｇで１０分間遠心して、後続ＰＣＲを阻害する可能性のある固体不純物を分離した。遠心工程の後、希釈液を調製した。
実施例２：
ＲＮＡ単離
ウイルスＲＮＡを、ハイピュアウイルス核酸ラージボリュームキット(High Pure Viral Nucleic Acid Large Volume Kit)（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，Ｍａｔ．：０５１１４４０３００１）を用いて単離する。このキットの原理はスピンカラム法に基づく。カオトロピック塩である塩酸グアニジン、非イオン界面活性剤およびプロテイナーゼＫを含有する緩衝液中でウイルスを溶解する。放出された核酸はそれらの構造がカオトロピック塩の存在下で破壊される。したがって、それらはスピンカラム内に組み込まれたグラスファイバーフリースに結合できる。結合した核酸をＰＣＲインヒビター、タンパク質、塩類および他の化合物から精製する。その後、それらを水で溶出し、それによりそれらの構造が再生される。このキットを、核酸の回収率を増大させるためのキャリヤーとしてのポリＡ−ＲＮＡと共に適用する。
ＲＮＡ単離を製造業者の指示に従って実施した。１ｍｌの希釈ＨＣＶ陽性血漿試料を１５ｍｌチューブに添加した。１５μｌのポリＡ−ＲＮＡおよび２５０μｌのプロテイナーゼＫを補充した結合緩衝液１ｍｌを添加し、７０℃で１５分間インキュベートした。その後、４００μｌの結合緩衝液を添加し、混合した。次に試料をハイピュアエキステンダーアッセンブリ(High Pure Extender Assembly)へ移した。したがって、試料全体をハイピュアエキステンダーアッセンブリの上部リザバー内へピペッティングした。ハイピュアフィルターチューブアッセンブリ(High Pure Filter Tube Assembly)全体を、次いでスイングバケットローターを備えた標準的なテーブルトップ遠心機に入れ、４，０００×ｇで５分間遠心した。遠心後、フィルターチューブをハイピュアエキステンダーアッセンブリから取り出し、フロースルーを廃棄した。フィルターチューブを新たなコレクションチューブと連結し、５００μｌのインヒビター除去緩衝液をフィルターチューブの上部リザバーに添加し、８，０００×ｇで１分間遠心した。遠心後、フィルターチューブをコレクションチューブから分離し、フィルターチューブを新たなコレクションチューブと連結した。フロースルーを再び廃棄した。その後、４５０μｌの洗浄緩衝液をフィルターチューブの上部リザバーに添加し、８，０００×ｇで１分間遠心し、フロースルーを再び廃棄した。この洗浄工程を繰り返した。その後、フィルターチューブ コレクションチューブ アッセンブリを遠心機内に残し、最大速度で３０秒間遠心して、残留する洗浄緩衝液を除去した。コレクションチューブを廃棄し、フィルターチューブをヌクレアーゼフリー(nuclease-free)無菌１．５ｍｌミクロ遠心チューブに入れた。５０μｌの溶出緩衝液を用いて、ウイルスＲＮＡをフィルターチューブの上部リザバーへ溶出し、室温で１分間インキュベートし、チューブアッセンブリを次いで８，０００×ｇで１分間遠心した。ＲＮＡ単離の後、抽出されたＲＮＡを濃縮して、以後の工程のためにより小さな体積を得る。この方法のために、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ａｍｐｕｒｅ ＲＮＡ Ｃｌｅａｎ ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いた。この磁性ビーズは核酸を結合し、プレートをＳＰＲＩ Ｐｌａｔｅ ９６ Ｓｕｐｅｒ Ｍａｇｎｅｔ Ｐｌａｔｅ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）に乗せることによりビーズは溶液から分離された。この方法で混在物を洗浄除去し、その後、核酸をビーズから溶出した。ＲＮＡ濃度を製造業者の指示に従って測定した。
実施例３：
５’−（ｄＴ）２０−ｐＣ３ｐＣ３ｐ−３’の合成
ブロッキングオリゴヌクレオチド５’−（ｄＴ）２０−ｐＣ３ｐＣ３ｐ−３’を１μｍｏｌｅスケールの合成において、ＡＢＩ ３９４ ＤＮＡシンセサイザーで標準的な自動固相ＤＮＡ合成方法を用い、ホスホルアミダイト化学を適用して合成した。３’−ホスフェートＣＰＧ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，カタログｎｏ．２０−２９００−４１）およびｄＴ ホスホルアミダイト（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，カタログｎｏ．Ｔ１１１０３１）ならびにスペーサーであるホスホルアミダイトＣ３（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，カタログｎｏ．１０−１９１３）を構築ブロックとして用いた。両方のホスホルアミダイトをＤＮＡグレードのアセトニトリル中０，１Ｍの濃度で適用した。標準的なＤＮＡサイクルおよび試薬をオリゴヌクレオチドのアッセンブリーに用いた。次いで、濃アンモニアにより５’−ＤＭＴ保護オリゴヌクレオチドを支持体から開裂するために、標準的な開裂プログラムを適用した。残りの保護基は濃アンモニアによる処理（５６℃で４時間）により開裂した。粗製のＤＭＴ保護オリゴヌクレオチドを蒸発させ、ＲＰ ＨＰＬＣ（カラム：ＰＲＰ１（Ｈａｍｉｌｔｏｎ パーツｎｏ．７９３５２））により０，１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム ｐＨ７／アセトニトリル勾配を用いて精製した。生成物画分を合わせて、水に対する３日間の透析（ＭＷＣＯ １０００，ＳｐｅｃｔｒａＰｏｒ ６，パーツｎｏ．１３２６３８）により脱塩し、それによりＤＭＴ基も開裂した。最後にオリゴヌクレオチドを凍結乾燥した。
収量：３６０ｎｍｏｌｅ。
実施例４：
キャリヤーＲＮＡのブロッキング
高分子量生成物の生成を阻止するために、５μｇ、２．５μｇおよび１．２５μｇのオリゴ−ｄＴ（５’−（ｄＴ）２０−ｐＣ３ｐＣ３ｐ−３’）を単離ＲＮＡに添加した。下記の濃度の種々のＨＣＶウイルス負荷血漿試料を用いた：５，０００コピー／ｍｌ；２５，０００コピー／ｍｌ；５０，０００コピー／ｍｌ（図１を参照）；
高分子量生成物の生成を阻止するために、２．５μｇ、１．２５μｇおよび０．６２５μｇのオリゴ−ｄＴを単離ＲＮＡに添加した。ＨＣＶウイルス負荷血漿試料濃度は５，０００コピー／ｍｌであった（図２を参照）。
実施例５：
逆転写
逆転写の前に、実施例４に記載したように種々の量のオリゴ−ｄＴを濃ＲＮＡ試料に添加した。次いで、トランスクリプターファーストストランドｃＤＮＡ合成キット(Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit)（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ， Ｍａｔ．：０４８９７０３００１）をプライミングのためのランダムヘキサマープライマー（ＲＨ）と組み合わせて用いて逆転写を実施した。１３．５μｌの試料を４μｌの４００μＭ ＲＨと混合し、続いて６５℃で１０分間、変性工程を実施した。その後、試料を直ちに氷に乗せ、８μｌの試薬マスターミックスを添加した。反応当たり、マスターミックスは５μｌのトランスクリプターゼ反応緩衝液（５×）、０．５μｌのＲＮａｓｅ阻害剤（４０Ｕ／μｌ）、２μｌのｄＮＴＰミックス（各１０ｍＭ）および０．５μｌの逆転写酵素（４０Ｕ／μｌ）からなっていた。反応物を２５℃で２５分間（インキュベーション工程）、続いて５０℃で６０分間（逆転写）、最後に８５℃で５分間（逆転写酵素の不活性化）、インキュベートした。その後、１ｍｌのＲＮａｓｅ（１Ｕ／ｍｌ）を添加した後に３７℃で２０分間インキュベートした。生成したｃＤＮＡを後続ＰＣＲ反応の鋳型として用いた。
実施例６：
ＰＣＲ
ＨＣＶ遺伝子型１ａに対するＨＣＶ特異的プライマーセットを増幅に用いた。アンプリコンＰＣＲのために、ファストスタートハイフィディリティＰＣＲシステム(Fast Start High Fidelity PCR System)（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ， Ｍａｔ．：０４７３８２８４００１）およびＰＣＲヌクレオチドミックス（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，Ｍａｔ．：１１５８１４９５００１）を用いた。マスターミックスは１２．７５μｌのＨ２Ｏ（ＰＣＲグレード）、２．５μｌの１０× ファストスタート(Fast Start)ＰＣＲ反応緩衝液（１８ｍＭのＭｇＣｌ２を含有）、１μｌのＤＭＳＯ、１μｌのｄＮＴＰ（各１０ｍＭ）および０．７５μｌのファストスタートハイフィディリティ酵素(Fast Start High Fidelity Enzyme)（５Ｕ／μｌ）からなっていた。２μｌのフォワードおよびリバースプライマー（各１０ｍＭ）ならびに３μｌのｃＤＮＡを添加した。プレートをシールし、短時間遠心し、表１に示したようにインキュベートした（増幅プログラム）。
実施例７：
ゲル電気泳動
生成したＰＣＲ生成物を分析するために、１％アガロースゲルを用いてゲル電気泳動を実施した。そのために、１％のアガロースを１×ＴＢＥ（Ｔｒｉｓ−ホウ酸−ＥＤＴＡ）緩衝液に溶解した。この溶液をすべてのアガロース結晶が溶解するまで加熱した。冷却した溶液に、１ｍｌの１×ＴＢＥ緩衝液当たり０．０６μｌの臭化エチジウムを慎重に添加した。その後、アガロース溶液を適切なゲルカセットに流し込んだ。試料を装填する前に、１部の１０×Ｂｌｕｅ Ｊｕｉｃｅ装填緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｍａｔ．：１０８１６０１５）を４部の試料に適用した。さらに、６μｌのＤＮＡ分子量マーカーＸＩＩＩ ５０塩基対ラダー(DNA Molecular Weight Marker XIII 50 base pair ladder)（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，Ｍａｔ．：１１７２１９２５００１）をもうひとつのゲルポケットに充填した。１２０Ｖで３５分間、電気泳動を実施し、その後、紫外線ボックスを用いてＤＮＡバンドを視覚化した。アガロースゲルに下記のように装填した：
図１に示すアガロースゲルは下記のように装填された：右レーン：６μｌ分子量マーカー。Ｎ：対照，試薬ミックス無しの水対照。オリゴ−ｄＴ有り：ＮＣ：陰性対照，レーンＮＣ １，ＮＣ ２，ＮＣ ３ −試料材料を含まない，ＨＣＶ特異的プライマーをＰＣＲ試薬ミックスに添加し、ＨＣＶ ｃＤＮＡの代わりに水を用いた；異なる前処理濃度のオリゴ−ｄＴを陰性対照に添加した；ＮＣ ３ ＝ １．２５μｇのオリゴ−ｄＴ，ＮＣ ２ ＝ ２．５μｇのオリゴ−ｄＴ，ＮＣ １ ＝ ５μｇのオリゴ−ｄＴ。オリゴ−ｄＴ試料５： ＨＣＶ試料−５，０００コピー／ｍｌ： ５，０００コピー／ｍｌの濃度のＨＣＶ ｃＤＮＡを逆転写前に種々のオリゴ−ｄＴ濃度のオリゴ−ｄＴで前処理して増幅した，レーン５−３ ＝ １．２５μｇのオリゴ−ｄＴ，レーン５−２ ＝ ２．５μｇのオリゴ−ｄＴ，レーン５−３ ＝ ５μｇのオリゴ−ｄＴ。オリゴ−ｄＴ試料２５： ＨＣＶ試料２５，０００コピー／ｍｌ： ２５，０００コピー／ｍｌの濃度のＨＣＶ ｃＤＮＡを逆転写前に種々のオリゴ−ｄＴ濃度のオリゴ−ｄＴで前処理して増幅した，レーン５−３ ＝ １．２５μｇのオリゴ−ｄＴ，レーン５−２ ＝ ２．５μｇのオリゴ−ｄＴ，レーン５−３ ＝ ５μｇのオリゴ−ｄＴ。オリゴ−ｄＴ試料１００： ＨＣＶ試料１００，０００コピー／ｍｌ： １００，０００コピー／ｍｌの濃度のＨＣＶ ｃＤＮＡを逆転写前に種々のオリゴ−ｄＴ濃度のオリゴ−ｄＴで前処理して増幅する，レーン５−３ ＝ １．２５μｇのオリゴ−ｄＴ，レーン５−２ ＝ ２．５μｇのオリゴ−ｄＴ，レーン５−３ ＝ ５μｇのオリゴ−ｄＴ。オリゴ−ｄＴ無し（ｗ／ｏ）：試料２５： ＨＣＶ試料２５，０００コピー／ｍｌ： ２５，０００コピー／ｍｌの濃度のＨＣＶ ｃＤＮＡを逆転写前のオリゴ−ｄＴ前処理無しで増幅した。
図２に示すアガロースゲルは下記のように装填された：右レーン：６μｌ分子量マーカー。Ｎ：対照，試薬ミックス無しの水対照。オリゴ−ｄＴ有り：ＮＣ：陰性対照（試料材料を含まない），ＨＣＶ特異的プライマーをＰＣＲ試薬ミックスに添加し、ＨＣＶ ｃＤＮＡの代わりに水を用い、０．６２５μｇ オリゴ−ｄＴ濃度のオリゴ−ｄＴで前処理した。オリゴ−ｄＴ試料０．６２５μｇ： ５，０００コピー／ｍｌの濃度のＨＣＶ ｃＤＮＡ試料を逆転写前に０．６２５μｇのオリゴ−ｄＴで前処理して増幅した。オリゴ−ｄＴ試料１．２５μｇ： ５，０００コピー／ｍｌの濃度のＨＣＶ ｃＤＮＡ試料を逆転写前に１．２５μｇのオリゴ−ｄＴで前処理して増幅した。オリゴ−ｄＴ試料２．５μｇ： ５，０００コピー／ｍｌの濃度のＨＣＶ ｃＤＮＡ試料を逆転写前に２．５μｇのオリゴ−ｄＴのオリゴ−ｄＴで前処理して増幅した。オリゴ−ｄＴ試料無し（ｗ／ｏ）：５，０００コピー／ｍｌの濃度のＨＣＶ ｃＤＮＡ試料を逆転写前のオリゴ−ｄＴ前処理無しで増幅した。
観察結果：
図１から分かるように、特異的な３９２ｂｐのＰＣＲ生成物がすべてのＨＣＶ ｃＤＮＡ試料について生成した。逆転写前にオリゴ−ｄＴ前処理した試料中には高分子量生成物が生成しなかった（オリゴ−ｄＴ有り：それぞれ試料５、２５および１００についてのレーン１、２および３）。しかし、逆転写前にオリゴ−ｄＴ前処理しなかった試料中には高分子量生成物が生成した（オリゴ−ｄＴ無し：試料２５，両レーン）。
図２から分かるように、特異的な３９２ｂｐのＰＣＲ生成物が、２．５μｇオリゴ−ｄＴ試料の１複製産物およびオリゴ−ｄＴ無し試料の１複製産物を除くすべてのＨＣＶ ｃＤＮＡ試料について生成した。逆転写前にオリゴ−ｄＴ前処理した試料中には高分子量生成物が生成しなかった（オリゴ−ｄＴ有り：試料０．６２５μｇ、１．２５μｇおよび２．５μｇ）。０．６２５μｇオリゴ−ｄＴは高分子量生成物生成を完全に阻止することが示され、使用すべきオリゴ−ｄＴ量と判定される。オリゴ−ｄＴ無しの試料中には高分子量生成物が存在した。

Claims (13)

  1. 逆転写の方法であって、下記の工程を含む方法：
    ａ）ＲＮＡを含む試料を用意する；
    ｂ）試料をキャリヤー核酸と接触させ、それにより混合物を調製する；
    ｃ）混合物を、マトリックスへのＲＮＡおよびキャリヤー核酸の結合が起きる条件下で、マトリックスに適用する；
    ｄ）マトリックスに結合したＲＮＡおよびキャリヤー核酸を含むマトリックスを、混合物から分離する；
    ｅ）ＲＮＡおよびキャリヤー核酸をマトリックスから溶出し、それにより溶出物を調製する；
    ｆ）溶出物に、キャリヤー核酸へのブロッキング核酸のハイブリダイゼーションが起きる条件下で、ブロッキング核酸を添加する；
    ｇ）工程ｆ）からの溶出物に、ＲＮＡへのプライマーのハイブリダイゼーションが起きる条件下で、プライマーを添加する；そして
    ｈ）ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡにする。
  2. キャリヤー核酸がＲＮＡキャリヤーである、請求項１に記載の方法。
  3. ＲＮＡキャリヤーがポリＡ−ＲＮＡである、請求項２に記載の方法。
  4. ブロッキング核酸がオリゴ−ｄＴ分子である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. オリゴ−ｄＴ分子が５’−（ｄＴ）ｎ−Ｘ−３’であり、その際、（ｄＴ）ｎはｎ−ｍｅｒ ホモ−２’−デオキシ−チミジンオリゴヌクレオチドであり、ｎは１８、１９、２０、２１または２２であり、Ｘはｐ、ｐＣ３、ｐＣ３ｐ、ｐＣ３ｐＣ３およびｐＣ３ｐＣ３ｐからなる群から選択され、Ｘは（ｄＴ）ｎの３’−末端ヒドロキシル基に結合しており、ｐはホスフェートであり、Ｃ３は１，３−プロパンジオールスペーサーである、請求項４に記載の方法。
  6. ｎが２０であり、ＸがｐＣ３ｐＣ３ｐである、請求項５に記載の方法。
  7. プライマーがランダムプライマーである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. ランダムプライマーがランダムヘキサマープライマーである、請求項７に記載の方法。
  9. マトリックスがグラスファイバーフリースを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 試料が、血清、血液、血漿、涙液、細胞培養上清、尿、および母乳、唾液、脳脊髄液、および精液からなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 逆転写に際してキャリヤーポリＡ−ＲＮＡをブロッキングするためのブロッキング核酸分子の使用であって、ブロッキング核酸分子が５’−（ｄＴ）ｎ−Ｘ−３’であり、その際、（ｄＴ）ｎはｎ−ｍｅｒ ホモ−２’−デオキシ−チミジンオリゴヌクレオチドであり、ｎは１８、１９、２０、２１または２２であり、Ｘはｐ、ｐＣ３、ｐＣ３ｐ、ｐＣ３ｐＣ３およびｐＣ３ｐＣ３ｐからなる群から選択され、Ｘは（ｄＴ）ｎの３’−末端ヒドロキシル基に結合しており、ｐはホスフェートであり、Ｃ３は１，３−プロパンジオールスペーサーである使用。
  12. ｎが２０であり、ＸがｐＣ３ｐＣ３ｐである、請求項１１に記載の使用。
  13. 逆転写を実施するためのキットであって、下記のものを含むキット：
    ａ）キャリヤーとしてのポリＡ−ＲＮＡ、および
    ｂ）請求項１１および１２に記載のブロッキング核酸。
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