CN105907697B - 一种小麦完整叶绿体的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及植物完整细胞器分离纯化技术领域，具体涉及一种简便快捷的小麦完整叶绿体的制备方法。步骤如下：（1）制备Percoll梯度；（2）小麦样品的预处理；（3）小麦样品的密度梯度离心；（4）完整叶绿体的提取。本发明以Percoll为介质进行梯度离心，不仅可以区分小麦完整及破损叶绿体，而且制备时间短，程序简便，获得充足的完整的叶绿体，进行定量测定后，可以精确的运用于叶绿体功能、膜蛋白、基质蛋白及叶绿体DNA的提取及各种后续研究。

Description

一种小麦完整叶绿体的制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及植物完整细胞器分离纯化技术领域，具体涉及一种简便快捷的小麦完整叶绿体的制备方法。
背景技术
叶绿体是植物细胞最重要的细胞器，是植物进行光合作用和氮素同化的场所，是大自然一切有机物的最初来源，与植物生长发育及作物产量密切相关，获得完整的叶绿体对于研究叶绿体功能、叶绿体可溶蛋白及膜蛋白、叶绿体基因等的必备条件。传统分离纯化叶绿体常采用蔗糖密度梯度离心及差速离心，不仅耗时长，仅密度梯度离心就需要5个小时以上，而且这种方法无法区分完整及破损叶绿体（图1B），无法获得充足的基质蛋白，可能导致叶绿体DNA流失，严重影响后续研究。本技术以Percoll为介质进行梯度离心，不仅可以区分小麦完整及破损叶绿体，而且制备时间短，密度梯度离心仅10分钟；程序简便，获得充足的完整叶绿体，进行定量测定后，可以精确的运用于各种后续研究。
发明内容
本发明介绍了一种从小麦叶片分离纯化完整叶绿体的方法，该方法简便、快捷、效果好, 完整叶绿体得率高。
为实现上述目的本发明采用以下技术方案：
一种小麦完整叶绿体的制备方法，步骤如下：
（1）制备 Percoll梯度；
（2）小麦样品的预处理；
（3）小麦样品的密度梯度离心；
（4）完整叶绿体的提取。
所述步骤（1）中Percoll梯度的制备方法为：称取异抗坏血酸和谷胱甘肽各称10mg，置于离心管中，加入15mL 2×GB缓冲液，加入15 mL Percoll混匀；于4℃、37,000g 离心30min（注意：brake on），离心完成后，小心取出离心管，置于冰上备用。
所述步骤（2）的操作为：取小麦新鲜叶片20-30克，剪碎后，于4℃条件下粉碎，加入150-180mL的1×GB缓冲液浸没小麦组织，以10,000-12,000rpm的速度粉碎1秒，接着间隔1秒的模式处理样品，重复该模式6-7次，粉碎样品；然后以4,000-6,000rpm的速度，连续粉碎4-6秒，制得组织匀浆；大田生长的小麦样品以1秒高速+1秒间隔模式重复7次粉碎样品，然后低速连续匀浆6秒，制得组织匀浆；将上述组织匀浆倒入医用纱布中，挤压过滤，滤液挤入预冷的50mL离心管中，于4℃、3000g条件下，离心5min；弃上清，向沉淀中加入700μL的1×GB缓冲液，用软毛笔将沉淀悬浮，合并到1个离心管中，制得叶绿体溶液。
所述步骤（3）的操作为：用胶头滴管将步骤（2）中的叶绿体溶液沿管壁缓慢加到步骤（1）制备的Percoll梯度上面；于4℃、8000g条件下，离心10min，小心取出离心管，得到两个绿色条带，下面的是完整的叶绿体。
所述步骤（4）的操作为：吸取步骤（3）得到的完整叶绿体条带，放入50mL离心管中，加满1×IB提取缓冲液，4℃、1500g条件下，离心5min；弃上清，用1×IB提取缓冲液悬浮沉淀，重复洗一次叶绿体，用400 μL的1×IB提取缓冲液悬浮沉淀，转移到1.5mL的EP管中，置于冰上，于黑暗中保存。
所述1×GB缓冲液的配方为：0.1M K-Hepes、0.66M山梨醇、2mM MgCl2、2mM MnCl2、4mM Na2EDTA和0.2% BSA，pH调至7.3，制得2×GB缓冲液的贮液，于4℃保存，稀释一倍即得1×GB缓冲液。
所述1×IB 提取缓冲液的配方为：0.1M K-tricine和0.66M山梨醇， pH调至8.0，制得2×IB提取缓冲液的贮液，稀释一倍即得1×IB提取缓冲液。
所述药品和溶液均于4℃下保存。
本发明的有益效果在于：本发明以Percoll为介质进行梯度离心，不仅可以区分小麦完整及破损叶绿体，而且制备时间短，程序简便，获得充足叶绿体，进行定量测定后，可以精确的运用于各种后续研究。
附图说明
图1为利用不同密度梯度技术分离纯化的小麦叶绿体条带示意图；其中A为利用Percoll梯度制备显示完整与破损叶绿体所处的位置；B为常规的蔗糖密度梯度显示的叶绿体条带位置。
具体实施方式
实施例1
1.制备Percoll梯度：
（1）异抗坏血酸和谷胱甘肽（4℃保存）各称10 mg 放入50mL圆底半透明聚乙烯离心管；
（2）加入15mL 2×GB（研磨缓冲液pH7.3，含0.1M K-Hepes、0.66M山梨醇、2mMMgCl2、2mM MnCl2、4mM Na2EDTA 和0.2% BSA，4℃保存）进行溶解；
（3）加入15 mL Percoll（4℃保存）混匀；
（4）于4℃、37,000g 离心30min（注意：brake on），离心完成后，小心取出离心管，置于冰上备用。
2.叶绿体制备（可以在步骤1离心时同步进行，所有操作低温进行）：
（1）器皿准备：取2个250mL 的三角瓶分别标注GB 和 IB、4个50mL圆底离心管、一个烧杯和1个塑料漏斗、1把剪刀置于冰上。将4层纱布用灭菌蒸馏水浸湿，置于漏斗上。
（2）试剂准备：利用4℃ dd H2O，由2×GB贮液制备200 mL的1×GB缓冲液，由2×IB贮液（提取缓冲液pH8.0，含0.1M K-tricine和0.66M山梨醇）制备100 mL的1×IB缓冲液。分别放入冰上相应的三角瓶中。
（3）取培养箱中生长的小麦新鲜叶片约30g，剪碎放入4℃保存的粉碎机中，加入约180mL的1×GB缓冲液浸没小麦组织，6x（1秒高速+1秒间隔），然后低速连续匀浆4秒。
（4）将上述组织匀浆倒入医用纱布中，轻轻将溶液挤进4个预冷的50mL离心管中，于4℃、3000g下，离心5min。
（5）弃上清，在沉淀中加入700μL的1×GB，用小的软毛笔将沉淀轻轻悬浮，合并到1个离心管，大约2-4mL。
（6）密度梯度离心：用胶头滴管小心的将上述叶绿体溶液沿管壁缓慢加到Percoll梯度的上面，于4℃、8000g离心10min。小心取出离心管，如图1所示可以看到两个绿色条带，下面的是完整的叶绿体。
（7）小心吸取下面的绿色条带，放入干净的50mL离心管中，加满1×IB提取缓冲液，4℃、1500g下，离心5min；弃上清，轻轻悬浮沉淀，重复洗一次叶绿体。用400 μL的1×IB悬浮沉淀，转移到1.5mL的EP管中，置于冰上，于黑暗中保存。
3.叶绿体定量测定
（1）取上述溶液2 μL加入1mL 80%的丙酮，摇匀后，于13,000g离心5min。
（2）以80%的丙酮溶液调零，用微量比色杯（100μL）分别测定波长720、663及645nm的光密度分别为0.01、0.24和0.09。
（3）叶绿体的浓度(mg/mL)=0.1×｛「40.2×(A663-A720)」+「101.4×(A645-A720)」｝=1.86 mg/mL。
4.叶绿体可溶蛋白及膜蛋白制备：将上述叶绿体溶液于500g下离心5min；沉淀用400μL可溶蛋白提取缓冲液（pH 7.6，100mM Tris-HCl、1mM EDTA、1mM MgCl2 和10 mM β巯基乙醇）悬浮，冰浴10min，裂解叶绿体。于12,000 g离心10min，上清为叶绿体基质可溶蛋白，可直接用于各种蛋白质分析；沉淀为叶绿体膜蛋白，用100μL膜蛋白溶解缓冲液（pH7.0，50mM NaCl、50mM 咪唑，2mM 6-氨基己酸和1mM EDTA）悬浮沉淀，加入5 μL 20% TritonX-100或10 μL 20% 毛地黄皂苷混匀后，水化10min；加入10μL 50%的甘油，可用于BNE或CNE进行膜蛋白分离等相关研究。
实施例2
1.制备Percoll梯度：
（1）异抗坏血酸和谷胱甘肽（4℃保存）各称10 mg 放入50mL圆底半透明聚乙烯离心管；
（2）加入15mL 2×GB（研磨缓冲液pH7.3，含0.1M K-Hepes、0.66M山梨醇、2mMMgCl2、2mM MnCl2、4mM Na2EDTA 和0.2% BSA，4℃保存）进行溶解；
（3）加入15 mL Percoll（4℃保存）混匀 ；
（4）于4℃、37,000g 离心30min（注意：brake on），离心完成后，小心取出离心管，置于冰上备用。
2.叶绿体制备（可以在步骤1离心时同步进行，所有操作低温进行）：
（1）器皿准备：取2个250mL 的三角瓶分别标注GB 和 IB、4个50mL圆底离心管、一个烧杯和1个塑料漏斗、1把剪刀置于冰上。将4层纱布用灭菌蒸馏水浸湿，置于漏斗上。
（2）试剂准备：利用4℃ dd H2O，由2×GB贮液制备200 mL的1×GB缓冲液，由2×IB贮液（提取缓冲液pH8.0，含0.1M K-tricine和0.66M山梨醇）制备100 mL的1×IB缓冲液。分别放入冰上相应的三角瓶中。
（3）取大田小麦新鲜叶片20g，剪碎放入4℃保存的粉碎机中，加入约180mL的1×GB缓冲液浸没小麦组织，培养箱样品7x（1秒高速+1秒间隔），然后低速连续匀浆6秒。
（4）将上述组织匀浆倒入医用纱布中，轻轻将溶液挤进4个预冷的50mL离心管中，于4℃、3000g下，离心5min。
（5）弃上清，在沉淀中加入700μL的1×GB，用小的软毛笔将沉淀轻轻悬浮，合并到1个离心管，大约2-4mL。
（6）密度梯度离心：用胶头滴管小心的将上述叶绿体溶液沿管壁缓慢加到Percoll梯度的上面，于4℃、8000g离心10min。小心取出离心管，如图1所示可以看到两个绿色条带，经显微观察得，下面的是完整的叶绿体。
（7）小心吸取下面的绿色条带，放入空的离心管中，加满1×IB提取缓冲液，4℃、1500g下，离心5min；弃上清，轻轻悬浮沉淀，重复洗一次叶绿体。用400 μL的1×IB悬浮沉淀，置于冰上，于黑暗中保存。
3.叶绿体定量测定
（1）取上述溶液2 μL加入1mL 80%的丙酮，摇匀后，于13,000g离心5min。
（2）以80%的丙酮溶液调零，用微量比色杯（100μL）分别测定波长720、663及645nm的光密度为-0.001、0.281和0.101。
（3）叶绿体的浓度(mg/mL)=0.1×｛「40.2×(A663-A720)」+「101.4×(A645-A720)」｝=2.17 mg/mL。
4.叶绿体可溶蛋白及膜蛋白制备：将上述叶绿体溶液于500g下离心5min；沉淀用400μL可溶蛋白提取缓冲液（pH 7.6，100mM Tris-HCl、1mM EDTA、1mM MgCl2 和10 mM β巯基乙醇）悬浮，冰浴10min，裂解叶绿体。于12,000 g离心10min，上清为叶绿体基质可溶蛋白，可直接用于各种蛋白质分析；沉淀为叶绿体膜蛋白，用100μL膜蛋白溶解缓冲液（pH7.0，50mM NaCl、50mM 咪唑，2mM 6-氨基己酸和1mM EDTA）悬浮沉淀，加入5 μL 20% TritonX-100或10 μL 20% 毛地黄皂苷混匀后，水化10min；加入10μL 50%的甘油，可用于BNE或CNE进行膜蛋白分离等相关研究。

Claims (1)

1.一种小麦完整叶绿体的制备方法，其特征在于：步骤如下：
（1）制备 Percoll梯度；
（2）小麦样品的预处理；
（3）小麦样品的密度梯度离心；
（4）完整叶绿体的提取；
所述步骤（1）中Percoll梯度的制备方法为：称取异抗坏血酸和谷胱甘肽各10 mg，置于离心管中，加入15mL 2×GB缓冲液，加入15 mL Percoll混匀；于4℃、37,000g 离心30min，离心完成后，小心取出离心管，置于冰上备用；
所述步骤（2）的操作为：取小麦新鲜叶片20-30克，剪碎后，于4℃条件下粉碎，加入150-180mL的1×GB缓冲液浸没小麦组织，以10,000-12,000rpm的速度粉碎1秒，接着间隔1秒的模式处理样品，重复该模式6-7次，粉碎样品；然后以4,000-6,000rpm的速度，连续粉碎4-6秒，制得组织匀浆；将上述组织匀浆倒入医用纱布中，挤压过滤，滤液挤入预冷的50mL离心管中，于4℃、3000g条件下，离心5min；弃上清，向沉淀中加入700μL的1×GB缓冲液，用软毛笔将沉淀悬浮，合并到1个离心管中，制得叶绿体溶液；
所述步骤（3）的操作为：用胶头滴管将步骤（2）中的叶绿体溶液沿管壁缓慢加到步骤（1）制备的Percoll梯度上面；于4℃、8000g条件下，离心10min，小心取出离心管，得到两个绿色条带，下面的是完整的叶绿体；
所述步骤（4）的操作为：吸取步骤（3）得到的完整叶绿体条带，放入50mL离心管中，加满1×IB提取缓冲液，4℃、1500g条件下，离心5min；弃上清，用1×IB提取缓冲液悬浮沉淀，重复洗一次叶绿体，用400 μL的1×IB提取缓冲液悬浮沉淀，转移到1.5mL的EP管中，置于冰上，于黑暗中保存；
所述1×GB缓冲液的配方为：0.1M K-Hepes、0.66M山梨醇、2mM MgCl2、2mM MnCl2、4mMNa2EDTA和0.2% BSA，pH调至7.3，制得2×GB缓冲液的贮液，于4℃保存，稀释一倍即得1×GB缓冲液；
所述1×IB 提取缓冲液的配方为：0.1M K-tricine和0.66M山梨醇，pH调至8.0，制得2×IB提取缓冲液的贮液，稀释一倍即得1×IB提取缓冲液；
所述药品和溶液均于4℃下保存。
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