CN105907697B - 一种小麦完整叶绿体的制备方法 - Google Patents

一种小麦完整叶绿体的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105907697B
CN105907697B CN201610414277.8A CN201610414277A CN105907697B CN 105907697 B CN105907697 B CN 105907697B CN 201610414277 A CN201610414277 A CN 201610414277A CN 105907697 B CN105907697 B CN 105907697B
Authority
CN
China
Prior art keywords
buffer
chloroplaset
wheat
follows
added
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201610414277.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105907697A (zh
Inventor
王小纯
张浩然
韦一昊
熊淑萍
马新明
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Henan Agricultural University
Original Assignee
Henan Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Henan Agricultural University filed Critical Henan Agricultural University
Priority to CN201610414277.8A priority Critical patent/CN105907697B/zh
Publication of CN105907697A publication Critical patent/CN105907697A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105907697B publication Critical patent/CN105907697B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/04—Plant cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及植物完整细胞器分离纯化技术领域，具体涉及一种简便快捷的小麦完整叶绿体的制备方法。步骤如下：（1）制备Percoll梯度；（2）小麦样品的预处理；（3）小麦样品的密度梯度离心；（4）完整叶绿体的提取。本发明以Percoll为介质进行梯度离心，不仅可以区分小麦完整及破损叶绿体，而且制备时间短，程序简便，获得充足的完整的叶绿体，进行定量测定后，可以精确的运用于叶绿体功能、膜蛋白、基质蛋白及叶绿体DNA的提取及各种后续研究。

Description

一种小麦完整叶绿体的制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及植物完整细胞器分离纯化技术领域，具体涉及一种简便快捷的小麦完整叶绿体的制备方法。
背景技术
叶绿体是植物细胞最重要的细胞器，是植物进行光合作用和氮素同化的场所，是大自然一切有机物的最初来源，与植物生长发育及作物产量密切相关，获得完整的叶绿体对于研究叶绿体功能、叶绿体可溶蛋白及膜蛋白、叶绿体基因等的必备条件。传统分离纯化叶绿体常采用蔗糖密度梯度离心及差速离心，不仅耗时长，仅密度梯度离心就需要5个小时以上，而且这种方法无法区分完整及破损叶绿体（图1B），无法获得充足的基质蛋白，可能导致叶绿体DNA流失，严重影响后续研究。本技术以Percoll为介质进行梯度离心，不仅可以区分小麦完整及破损叶绿体，而且制备时间短，密度梯度离心仅10分钟；程序简便，获得充足的完整叶绿体，进行定量测定后，可以精确的运用于各种后续研究。
发明内容
本发明介绍了一种从小麦叶片分离纯化完整叶绿体的方法，该方法简便、快捷、效果好, 完整叶绿体得率高。
为实现上述目的本发明采用以下技术方案：
一种小麦完整叶绿体的制备方法，步骤如下：
（1）制备 Percoll梯度；
（2）小麦样品的预处理；
（3）小麦样品的密度梯度离心；
（4）完整叶绿体的提取。
所述步骤（1）中Percoll梯度的制备方法为：称取异抗坏血酸和谷胱甘肽各称10mg，置于离心管中，加入15mL 2×GB缓冲液，加入15 mL Percoll混匀；于4℃、37,000g 离心30min（注意：brake on），离心完成后，小心取出离心管，置于冰上备用。
所述步骤（2）的操作为：取小麦新鲜叶片20-30克，剪碎后，于4℃条件下粉碎，加入150-180mL的1×GB缓冲液浸没小麦组织，以10,000-12,000rpm的速度粉碎1秒，接着间隔1秒的模式处理样品，重复该模式6-7次，粉碎样品；然后以4,000-6,000rpm的速度，连续粉碎4-6秒，制得组织匀浆；大田生长的小麦样品以1秒高速+1秒间隔模式重复7次粉碎样品，然后低速连续匀浆6秒，制得组织匀浆；将上述组织匀浆倒入医用纱布中，挤压过滤，滤液挤入预冷的50mL离心管中，于4℃、3000g条件下，离心5min；弃上清，向沉淀中加入700μL的1×GB缓冲液，用软毛笔将沉淀悬浮，合并到1个离心管中，制得叶绿体溶液。
所述步骤（3）的操作为：用胶头滴管将步骤（2）中的叶绿体溶液沿管壁缓慢加到步骤（1）制备的Percoll梯度上面；于4℃、8000g条件下，离心10min，小心取出离心管，得到两个绿色条带，下面的是完整的叶绿体。
所述步骤（4）的操作为：吸取步骤（3）得到的完整叶绿体条带，放入50mL离心管中，加满1×IB提取缓冲液，4℃、1500g条件下，离心5min；弃上清，用1×IB提取缓冲液悬浮沉淀，重复洗一次叶绿体，用400 μL的1×IB提取缓冲液悬浮沉淀，转移到1.5mL的EP管中，置于冰上，于黑暗中保存。
所述1×GB缓冲液的配方为：0.1M K-Hepes、0.66M山梨醇、2mM MgCl2、2mM MnCl2、4mM Na2EDTA和0.2% BSA，pH调至7.3，制得2×GB缓冲液的贮液，于4℃保存，稀释一倍即得1×GB缓冲液。
所述1×IB 提取缓冲液的配方为：0.1M K-tricine和0.66M山梨醇， pH调至8.0，制得2×IB提取缓冲液的贮液，稀释一倍即得1×IB提取缓冲液。
所述药品和溶液均于4℃下保存。
本发明的有益效果在于：本发明以Percoll为介质进行梯度离心，不仅可以区分小麦完整及破损叶绿体，而且制备时间短，程序简便，获得充足叶绿体，进行定量测定后，可以精确的运用于各种后续研究。
附图说明
图1为利用不同密度梯度技术分离纯化的小麦叶绿体条带示意图；其中A为利用Percoll梯度制备显示完整与破损叶绿体所处的位置；B为常规的蔗糖密度梯度显示的叶绿体条带位置。
具体实施方式
实施例1
1.制备Percoll梯度：
（1）异抗坏血酸和谷胱甘肽（4℃保存）各称10 mg 放入50mL圆底半透明聚乙烯离心管；
（2）加入15mL 2×GB（研磨缓冲液pH7.3，含0.1M K-Hepes、0.66M山梨醇、2mMMgCl2、2mM MnCl2、4mM Na2EDTA 和0.2% BSA，4℃保存）进行溶解；
（3）加入15 mL Percoll（4℃保存）混匀；
（4）于4℃、37,000g 离心30min（注意：brake on），离心完成后，小心取出离心管，置于冰上备用。
2.叶绿体制备（可以在步骤1离心时同步进行，所有操作低温进行）：
（1）器皿准备：取2个250mL 的三角瓶分别标注GB 和 IB、4个50mL圆底离心管、一个烧杯和1个塑料漏斗、1把剪刀置于冰上。将4层纱布用灭菌蒸馏水浸湿，置于漏斗上。
（2）试剂准备：利用4℃ dd H2O，由2×GB贮液制备200 mL的1×GB缓冲液，由2×IB贮液（提取缓冲液pH8.0，含0.1M K-tricine和0.66M山梨醇）制备100 mL的1×IB缓冲液。分别放入冰上相应的三角瓶中。
（3）取培养箱中生长的小麦新鲜叶片约30g，剪碎放入4℃保存的粉碎机中，加入约180mL的1×GB缓冲液浸没小麦组织，6x（1秒高速+1秒间隔），然后低速连续匀浆4秒。
（4）将上述组织匀浆倒入医用纱布中，轻轻将溶液挤进4个预冷的50mL离心管中，于4℃、3000g下，离心5min。
（5）弃上清，在沉淀中加入700μL的1×GB，用小的软毛笔将沉淀轻轻悬浮，合并到1个离心管，大约2-4mL。
（6）密度梯度离心：用胶头滴管小心的将上述叶绿体溶液沿管壁缓慢加到Percoll梯度的上面，于4℃、8000g离心10min。小心取出离心管，如图1所示可以看到两个绿色条带，下面的是完整的叶绿体。
（7）小心吸取下面的绿色条带，放入干净的50mL离心管中，加满1×IB提取缓冲液，4℃、1500g下，离心5min；弃上清，轻轻悬浮沉淀，重复洗一次叶绿体。用400 μL的1×IB悬浮沉淀，转移到1.5mL的EP管中，置于冰上，于黑暗中保存。
3.叶绿体定量测定
（1）取上述溶液2 μL加入1mL 80%的丙酮，摇匀后，于13,000g离心5min。
（2）以80%的丙酮溶液调零，用微量比色杯（100μL）分别测定波长720、663及645nm的光密度分别为0.01、0.24和0.09。
（3）叶绿体的浓度(mg/mL)=0.1×｛「40.2×(A663-A720)」+「101.4×(A645-A720)」｝=1.86 mg/mL。
4.叶绿体可溶蛋白及膜蛋白制备：将上述叶绿体溶液于500g下离心5min；沉淀用400μL可溶蛋白提取缓冲液（pH 7.6，100mM Tris-HCl、1mM EDTA、1mM MgCl2 和10 mM β巯基乙醇）悬浮，冰浴10min，裂解叶绿体。于12,000 g离心10min，上清为叶绿体基质可溶蛋白，可直接用于各种蛋白质分析；沉淀为叶绿体膜蛋白，用100μL膜蛋白溶解缓冲液（pH7.0，50mM NaCl、50mM 咪唑，2mM 6-氨基己酸和1mM EDTA）悬浮沉淀，加入5 μL 20% TritonX-100或10 μL 20% 毛地黄皂苷混匀后，水化10min；加入10μL 50%的甘油，可用于BNE或CNE进行膜蛋白分离等相关研究。
实施例2
1.制备Percoll梯度：
（1）异抗坏血酸和谷胱甘肽（4℃保存）各称10 mg 放入50mL圆底半透明聚乙烯离心管；
（2）加入15mL 2×GB（研磨缓冲液pH7.3，含0.1M K-Hepes、0.66M山梨醇、2mMMgCl2、2mM MnCl2、4mM Na2EDTA 和0.2% BSA，4℃保存）进行溶解；
（3）加入15 mL Percoll（4℃保存）混匀 ；
（4）于4℃、37,000g 离心30min（注意：brake on），离心完成后，小心取出离心管，置于冰上备用。
2.叶绿体制备（可以在步骤1离心时同步进行，所有操作低温进行）：
（1）器皿准备：取2个250mL 的三角瓶分别标注GB 和 IB、4个50mL圆底离心管、一个烧杯和1个塑料漏斗、1把剪刀置于冰上。将4层纱布用灭菌蒸馏水浸湿，置于漏斗上。
（2）试剂准备：利用4℃ dd H2O，由2×GB贮液制备200 mL的1×GB缓冲液，由2×IB贮液（提取缓冲液pH8.0，含0.1M K-tricine和0.66M山梨醇）制备100 mL的1×IB缓冲液。分别放入冰上相应的三角瓶中。
（3）取大田小麦新鲜叶片20g，剪碎放入4℃保存的粉碎机中，加入约180mL的1×GB缓冲液浸没小麦组织，培养箱样品7x（1秒高速+1秒间隔），然后低速连续匀浆6秒。
（4）将上述组织匀浆倒入医用纱布中，轻轻将溶液挤进4个预冷的50mL离心管中，于4℃、3000g下，离心5min。
（5）弃上清，在沉淀中加入700μL的1×GB，用小的软毛笔将沉淀轻轻悬浮，合并到1个离心管，大约2-4mL。
（6）密度梯度离心：用胶头滴管小心的将上述叶绿体溶液沿管壁缓慢加到Percoll梯度的上面，于4℃、8000g离心10min。小心取出离心管，如图1所示可以看到两个绿色条带，经显微观察得，下面的是完整的叶绿体。
（7）小心吸取下面的绿色条带，放入空的离心管中，加满1×IB提取缓冲液，4℃、1500g下，离心5min；弃上清，轻轻悬浮沉淀，重复洗一次叶绿体。用400 μL的1×IB悬浮沉淀，置于冰上，于黑暗中保存。
3.叶绿体定量测定
（1）取上述溶液2 μL加入1mL 80%的丙酮，摇匀后，于13,000g离心5min。
（2）以80%的丙酮溶液调零，用微量比色杯（100μL）分别测定波长720、663及645nm的光密度为-0.001、0.281和0.101。
（3）叶绿体的浓度(mg/mL)=0.1×｛「40.2×(A663-A720)」+「101.4×(A645-A720)」｝=2.17 mg/mL。
4.叶绿体可溶蛋白及膜蛋白制备：将上述叶绿体溶液于500g下离心5min；沉淀用400μL可溶蛋白提取缓冲液（pH 7.6，100mM Tris-HCl、1mM EDTA、1mM MgCl2 和10 mM β巯基乙醇）悬浮，冰浴10min，裂解叶绿体。于12,000 g离心10min，上清为叶绿体基质可溶蛋白，可直接用于各种蛋白质分析；沉淀为叶绿体膜蛋白，用100μL膜蛋白溶解缓冲液（pH7.0，50mM NaCl、50mM 咪唑，2mM 6-氨基己酸和1mM EDTA）悬浮沉淀，加入5 μL 20% TritonX-100或10 μL 20% 毛地黄皂苷混匀后，水化10min；加入10μL 50%的甘油，可用于BNE或CNE进行膜蛋白分离等相关研究。

Claims (1)

1.一种小麦完整叶绿体的制备方法，其特征在于：步骤如下：
（1）制备 Percoll梯度；
（2）小麦样品的预处理；
（3）小麦样品的密度梯度离心；
（4）完整叶绿体的提取；
所述步骤（1）中Percoll梯度的制备方法为：称取异抗坏血酸和谷胱甘肽各10 mg，置于离心管中，加入15mL 2×GB缓冲液，加入15 mL Percoll混匀；于4℃、37,000g 离心30min，离心完成后，小心取出离心管，置于冰上备用；
所述步骤（2）的操作为：取小麦新鲜叶片20-30克，剪碎后，于4℃条件下粉碎，加入150-180mL的1×GB缓冲液浸没小麦组织，以10,000-12,000rpm的速度粉碎1秒，接着间隔1秒的模式处理样品，重复该模式6-7次，粉碎样品；然后以4,000-6,000rpm的速度，连续粉碎4-6秒，制得组织匀浆；将上述组织匀浆倒入医用纱布中，挤压过滤，滤液挤入预冷的50mL离心管中，于4℃、3000g条件下，离心5min；弃上清，向沉淀中加入700μL的1×GB缓冲液，用软毛笔将沉淀悬浮，合并到1个离心管中，制得叶绿体溶液；
所述步骤（3）的操作为：用胶头滴管将步骤（2）中的叶绿体溶液沿管壁缓慢加到步骤（1）制备的Percoll梯度上面；于4℃、8000g条件下，离心10min，小心取出离心管，得到两个绿色条带，下面的是完整的叶绿体；
所述步骤（4）的操作为：吸取步骤（3）得到的完整叶绿体条带，放入50mL离心管中，加满1×IB提取缓冲液，4℃、1500g条件下，离心5min；弃上清，用1×IB提取缓冲液悬浮沉淀，重复洗一次叶绿体，用400 μL的1×IB提取缓冲液悬浮沉淀，转移到1.5mL的EP管中，置于冰上，于黑暗中保存；
所述1×GB缓冲液的配方为：0.1M K-Hepes、0.66M山梨醇、2mM MgCl2、2mM MnCl2、4mMNa2EDTA和0.2% BSA，pH调至7.3，制得2×GB缓冲液的贮液，于4℃保存，稀释一倍即得1×GB缓冲液；
所述1×IB 提取缓冲液的配方为：0.1M K-tricine和0.66M山梨醇，pH调至8.0，制得2×IB提取缓冲液的贮液，稀释一倍即得1×IB提取缓冲液；
所述药品和溶液均于4℃下保存。
CN201610414277.8A 2016-06-15 2016-06-15 一种小麦完整叶绿体的制备方法 Expired - Fee Related CN105907697B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610414277.8A CN105907697B (zh) 2016-06-15 2016-06-15 一种小麦完整叶绿体的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610414277.8A CN105907697B (zh) 2016-06-15 2016-06-15 一种小麦完整叶绿体的制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105907697A CN105907697A (zh) 2016-08-31
CN105907697B true CN105907697B (zh) 2019-07-26

Family

ID=56750199

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610414277.8A Expired - Fee Related CN105907697B (zh) 2016-06-15 2016-06-15 一种小麦完整叶绿体的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105907697B (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108179131A (zh) * 2016-12-08 2018-06-19 中国林业科学研究院林业研究所 一种旱柳叶片完整叶绿体的制备方法
CN107389390A (zh) * 2017-03-08 2017-11-24 中国林业科学研究院林业研究所 一种旱柳枝条皮层叶绿体的制备方法
CN109722409A (zh) * 2019-03-11 2019-05-07 济南大学 C4植物叶肉细胞、维管束鞘细胞的类囊体膜的分离提取方法
CN111117943A (zh) * 2020-01-10 2020-05-08 北京林业大学 一种叶绿体膜质分离方法
CN113293102B (zh) * 2021-04-26 2023-07-14 深圳大学 一种衣藻叶绿体以及叶绿体rna提取的方法
CN113025556B (zh) * 2021-04-26 2023-08-29 东北师范大学 一种小麦原生质体、细胞质和叶绿体的分离方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101117634A (zh) * 2007-07-09 2008-02-06 华中农业大学 一种分离棉花叶绿体dna的方法
CN102021150A (zh) * 2010-11-24 2011-04-20 南京师范大学 银杏叶片完整叶绿体的提取方法
CN102174464A (zh) * 2011-02-16 2011-09-07 南开大学 完整叶绿体长时间离体培养方法
CN103013984A (zh) * 2013-01-11 2013-04-03 湖南农业大学 从木本植物材料中提取叶绿体总rna及同时提取总蛋白质的方法、叶绿体总蛋白质的应用
CN104277974A (zh) * 2013-07-03 2015-01-14 中国科学院植物研究所 一种分离产氢衣藻叶绿体的方法
CN104592346A (zh) * 2015-01-30 2015-05-06 南京林业大学 一种银杏叶片叶绿体蛋白质的提取方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101117634A (zh) * 2007-07-09 2008-02-06 华中农业大学 一种分离棉花叶绿体dna的方法
CN102021150A (zh) * 2010-11-24 2011-04-20 南京师范大学 银杏叶片完整叶绿体的提取方法
CN102174464A (zh) * 2011-02-16 2011-09-07 南开大学 完整叶绿体长时间离体培养方法
CN103013984A (zh) * 2013-01-11 2013-04-03 湖南农业大学 从木本植物材料中提取叶绿体总rna及同时提取总蛋白质的方法、叶绿体总蛋白质的应用
CN104277974A (zh) * 2013-07-03 2015-01-14 中国科学院植物研究所 一种分离产氢衣藻叶绿体的方法
CN104592346A (zh) * 2015-01-30 2015-05-06 南京林业大学 一种银杏叶片叶绿体蛋白质的提取方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
甘蔗叶绿体分离及其蛋白质提取方法研究;孙富等;《南方农业学报》;20111231;第42卷(第5期);463-467
苹果叶片叶绿体分离及其蛋白提取、双向电泳方法的优化;肖龙等;《果树学报》;20160321;第33卷(第6期);752-761
青岛浒苔完整叶绿体分离及其蛋白质提取方法的初步建立;杜智欣等;《植物检疫》;20131231;第27卷(第2期);44-47

Also Published As

Publication number Publication date
CN105907697A (zh) 2016-08-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105907697B (zh) 一种小麦完整叶绿体的制备方法
Bergman et al. Phycomyces
Larkin Purification and viability determinations of plant protoplasts
CN109112093B (zh) 一种青蒿原生质体高效分离及瞬时转化的方法
CN101638637B (zh) 人类骨髓、脐带血、外周血干细胞分离试剂盒及干细胞分离方法
CN106244516A (zh) 一种稗草原生质体的提取方法
CN103710377B (zh) 一种快速高效的水稻原生质体制备和转化方法
CN104004708A (zh) 一种绵羊精原干细胞分离纯化、传代长期培养、冻存及复苏的方法
CN108004206A (zh) 一种来源于人嗅黏膜间充质干细胞外泌体的制备方法及外泌体的应用
CN104988121A (zh) 一种神经元、星形胶质细胞共培养体的建立方法
CN107034186A (zh) 一种从人脐带血中分离纯化干细胞的方法
CN110229784A (zh) 一种去除死肝细胞的分离液及利用其去除死肝细胞的方法
Aguado et al. Isolation of lysosomes from mammalian tissues and cultured cells
CN109929802A (zh) 一种基于Transwell孔板上室培养细胞下室吸附分离外泌体的方法和应用
CN103421764A (zh) 一种真菌病毒双链rna快速提取试剂盒及其应用
CN114002432B (zh) 一种松材线虫快速检测试纸卡及其制备和使用方法
CN105670991A (zh) 人类骨髓细胞处理试剂盒及细胞处理方法
CN101831383B (zh) 一种分离精子的方法及装置
CN103305418A (zh) 一种干细胞分离培养装置
CN100410368C (zh) 染色体核型分析淋巴细胞培养标本预处理方法
CN107372463A (zh) 杂交瘤细胞冻存保种的新方法
WO2005094563A1 (ja) 非成熟性単藻培養株
CN105314739A (zh) 一种微生物溶藻制剂同步脱氮、脱有机物的方法
CN105543160A (zh) 一种分离大白菜不同发育阶段小孢子的方法
JP5804319B2 (ja) シフォナキサンチンおよび／またはシフォネインの製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20190726

Termination date: 20200615