CN104277974A - 一种分离产氢衣藻叶绿体的方法 - Google Patents

一种分离产氢衣藻叶绿体的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种分离产氢衣藻叶绿体的方法。该方法包括如下步骤：1）将衣藻悬于裂解液中，加入皂素至其终浓度为0.25g/100mL；2）将步骤1）溶液置于冰上1-2min裂解衣藻细胞；3）将步骤2）溶液4℃2300g离心1min；4）用裂解液漂洗步骤3）沉淀，4℃1000-2300g离心1min，得叶绿体粗提物；5）将叶绿体粗提物悬于裂解液中；6）在离心管底层加入75%体积的Percoll，上层加入45%体积的Percoll，再在最上层加入步骤5）溶液，形成梯度，4℃4600g离心20min，在两不同体积分数的Percoll之间形成墨绿色条带；7）取出墨绿色条带，用裂解液稀释，4℃890-1000g离心2min，收集沉淀，获得所述叶绿体。实验证明，本发明方法操作简单，叶绿体产率高，用时短。

Description

一种分离产氢衣藻叶绿体的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种分离产氢衣藻叶绿体的方法。
背景技术
藻类光合制氢是微藻利用太阳能裂解水释放氢气的生物过程，具有可再生、制氢过程清洁等明显优点，有潜在的应用价值，是实现氢能可持续生产的重要途径之一。衣藻是光合产氢的模式藻种，产氢效率高，易培养。叶绿体是光合产氢发生的细胞器，从分离纯化的叶绿体入手分析光合产氢的过程与调控，对研究和开发光合产氢的人工模拟体系非常重要。
目前正常状态的衣藻细胞的叶绿体已被成功分离。但产氢的衣藻细胞发生了一些代谢及结构变化使人们在用压力法分离缺硫产氢衣藻细胞的叶绿体时有一定困难。
发明内容
本发明的目的是提供一种分离产氢衣藻叶绿体的方法。
本发明所提供的分离产氢衣藻叶绿体的方法，具体可包括如下步骤：
（1）将待分离的产氢衣藻细胞悬浮于裂解缓冲液（Breaking buffer）中，向其中加入皂素（saponin），得到悬浮液1；
所述皂素在所述悬浮液1中的含量为每100mL所述悬浮液1中含有0.25g所述皂素；
（2）将所述悬浮液1置于冰上搅拌1-2min（如1min），使所述产氢衣藻细胞裂解，得到悬浮液2；
（3）将所述悬浮液2于4℃2300g离心1min，收集沉淀；
（4）用所述裂解缓冲液对步骤（3）所得沉淀进行漂洗，4℃1000-2300g（如1600g）离心1min，收集沉淀，为叶绿体粗提物；
（5）将所述叶绿体粗提物悬浮于所述裂解缓冲液中，得到悬浮液3；
（6）在离心管底层加入体积分数为75%的Percoll缓冲液，在所述体积分数为75%的Percoll缓冲液上，缓慢加入体积分数为45%的Percoll缓冲液，使两者形成明显的Percoll梯度，再在所述体积分数为45%的Percoll缓冲液上方缓慢加入所述悬浮液3，4℃4600g离心20min，离心后可见位于所述体积分数为45%的Percoll缓冲液和所述体积分数为75%的Percoll缓冲液之间的界面上有墨绿色条带；
（7）取出所述墨绿色条带，用所述裂解缓冲液（所述裂解缓冲液的体积可为取出的所述墨绿色条带体积的3倍）稀释，4℃890-1000g（如1000g）离心2min，收集沉淀，获得叶绿体；
在上述方法中，在步骤（7）中所述收集沉淀后，还可包括如下步骤：
（8）用所述裂解缓冲液对步骤（7）所得沉淀进行漂洗，4℃890-1000g（如900g）离心2min，所得沉淀即为叶绿体。
在上述方法中，所述裂解缓冲液的pH为7.8，溶剂为水，溶质及浓度如下：0.3M山梨醇（sorbitol）、50mM HEPES-KOH、5mM MgCl2。
所述50mM HEPES-KOH是指HEPES在所述裂解缓冲液中的终浓度为50mM，KOH的量为调节所述裂解缓冲液的pH为7.8所需的用量。
更加具体的，所述裂解缓冲液的溶剂为水，溶质及浓度如下：0.3M山梨醇（sorbitol）、50mM HEPES、5mM MgCl2；用KOH（固体）调节溶液pH为7.8。
在上述方法中，步骤（1）中，所述将待分离的产氢衣藻细胞悬浮于裂解缓冲液中，为将所述待分离的产氢衣藻细胞悬浮于所述裂解缓冲液中至所述待分离的产氢衣藻细胞含量为5×107个/mL。
在上述方法中，所述体积分数为75%的Percoll缓冲液的pH为7.8，组成如下：体积分数为75%的Percoll、终浓度为0.33M的山梨醇、终浓度为50mM的HEPES-KOH、终浓度为5mM的MgCl2，余量为水；
所述体积分数为45%的Percoll缓冲液的pH为7.8，组成如下：体积分数为45%的Percoll、终浓度为0.33M的山梨醇、终浓度为50mM的HEPES-KOH、终浓度为5mM的MgCl2，余量为水。
在所述体积分数为75%的Percoll缓冲液，以及所述体积分数为45%的Percoll缓冲液中，所述终浓度为50mM的HEPES-KOH均指HEPES在所述Percoll缓冲液中的终浓度为50mM，KOH的量为调节所述Percoll缓冲液的pH为7.8所需的用量。
更加具体的，所述体积分数为75%的Percoll缓冲液的pH为7.8，组成如下：体积分数为75%的Percoll、终浓度为0.33M的山梨醇、终浓度为50mM的HEPES、终浓度为5mM的MgCl2，调节溶液pH为7.8时所需用量的KOH，余量为水；
所述体积分数为45%的Percoll缓冲液的pH为7.8，组成如下：体积分数为45%的Percoll、终浓度为0.33M的山梨醇、终浓度为50mM的HEPES、终浓度为5mM的MgCl2，调节溶液pH为7.8时所需用量的KOH，余量为水。
在上述方法中，步骤（6）中，所述体积分数为75%的Percoll缓冲液、所述体积分数为45%的Percoll缓冲液，以及所述悬浮液3的体积配比为4：5：1。
在本发明中，所述产氢衣藻为：将衣藻在缺硫条件下进行培养，得到的处于产氢状态的衣藻。
所述将衣藻在缺硫条件下进行培养的培养时间为24h以上，如24-48h，具体如24h或48h。
所述将衣藻在缺硫条件下进行培养的培养液为缺硫TAP培养液，所述缺硫TAP培养液为将正常TAP培养液中的硫化物以等摩尔换成相应的氯化物。所述正常TAP培养液的pH为7.0，组成如下：NH4Cl0.4g/L；MgSO4·7H2O 0.1g/L；CaC12·2H2O 0.05g/L；K2HPO4 0.108g/L；KH2PO4 0.056g/L；Trisbase2.423g/L；亨特微量元素（Hunter’strace elements）1ml/L，冰乙酸1ml/L，余量为水。所述亨特微量元素的pH为7.0，组成如下：H3BO4 11.4g/L，ZnSO4·7H2O 22.0g/L，MnCl2·4H2O 5.06g/L，CoCl2·6H2O 1.61g/L，CuSO4·5H2O 1.57g/L，(NH4)6Mo7O24·4H2O 1.10g/L，FeSO4·7H2O 4.99g/L，余量为水。
所述将衣藻在缺硫条件下进行培养时，所述衣藻在所述缺硫TAP培养液中的含量为每mL所述缺硫TAP培养液中含有叶绿素总量为25μg的所述衣藻。
所述将衣藻在缺硫条件下进行培养的培养温度为25℃，光强为120μE·m-2·s-1，持续光照，密封培养。
在本发明的一个实施例中，所述衣藻具体为莱茵衣藻（Chlamydomonasreinhardtii）。更加具体的，所述莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）为莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）CC400。
实验证明，本发明所提供的分离产氢衣藻叶绿体的方法具有如下优点：
1、简便：此方法步骤简单，涉及仪器常规，普通的生物实验室即可完成。
2、节省时间：本方法45分钟左右可完成叶绿体的分离。
3、产率高：传统针压法几乎很难分离到产氢衣藻的叶绿体，而本法所得叶绿体产率最高可达32.72%。
附图说明
图1为莱茵衣藻CC400缺硫密闭培养细胞放氢量气相色谱图。其中，1表示缺硫密闭培养后24小时；2表示缺硫密闭培养后48小时。
图2为密度梯度离心纯化莱茵衣藻CC400放氢细胞叶绿体的percoll梯度照片。其中，A为传统针压法分离产氢细胞叶绿体的密度梯度离心效果；B为本发明所提供方法分离产氢细胞叶绿体的密度梯度离心效果。
图3为本发明所提供方法分离的莱茵衣藻CC400放氢细胞叶绿体的电子显微镜照片。其中，A和B为缺硫密闭培养24h细胞的叶绿体；C和D为缺硫密闭培养48h细胞的叶绿体。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）CC400购自美国杜克大学莱茵衣藻藻种库（Chlamy center，http://www.chlamy.org/），其Strain#：CC-400cw15mt+（详见如下网址：http://chlamycollection.org/strain/cc-400-cw15-mt/）。
培养基：
1、正常TAP培养液：NH4Cl0.4g/L；MgSO4·7H2O 0.1g/L；CaC12·2H2O 0.05g/L；K2HPO4 0.108g/L；KH2PO4 0.056g/L；Trisbase2.423g/L；亨特微量元素（Hunter’s traceelements）1ml/L，冰乙酸1ml/L，余量为水，pH为7.0。
2、缺硫TAP培养液：将正常TAP培养液中的硫化物以等摩尔换成相应的氯化物。
3、固体TAP培养基：在正常TAP培养液中加1.5%（1.5g/100mL）的琼脂粉。
4、亨特微量元素（Hunter’s trace elements）：H3BO4 11.4g/L，ZnSO4·7H2O 22.0g/L，MnCl2·4H2O 5.06g/L，CoCl2·6H2O 1.61g/L，CuSO4·5H2O 1.57g/L，(NH4)6Mo7O24·4H2O1.10g/L，FeSO4·7H2O 4.99g/L，余量为水，pH为7.0。
试剂：
1、裂解缓冲液（Breaking buffer）：0.3M山梨醇（sorbitol），50mM HEPES-KOH，5mM MgCl2，余量为水，pH7.8。
配制方法如下：将5.4655g山梨醇（sorbitol）、1.1916g HEPES和0.1016gMgCl2·6H2O一同用水溶解后，向上述溶液中不断加入KOH固体，调节pH值为7.8，再加水定容至100ml，得到所述裂解缓冲液（Breaking buffer）。
2、5×Gradient buffer：混合以下组分，溶解后加水定容至100ml。
配制方法如下：将30.06g山梨醇（sorbitol）、5.958g HEPES和0.508g MgCl2·6H2O一同用水溶解后，向上述溶液中不断加入KOH固体，调节pH值为7.8，再加水定容至100ml，得到所述5×Gradient buffer。
3、不同体积分数的Percoll缓冲液
其中，Percoll是经过聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrolidone，PVP）处理的硅胶颗粒混悬液，对细胞无毒性和刺激性。本发明中所采用的Percoll为GE Healthcare（原pharmacia）公司产品，其产品目录号为17-0891-01。
实施例1、产氢衣藻叶绿体的分离
一、衣藻细胞的培养
将莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）CC400接种到含有30ml正常TAP培养液的100ml三角瓶中，在温度为25℃，光强为200μE·m-2·s-1的连续光照下60rpm摇床培养24-36h。收集预培养的衣藻细胞，接种至900ml正常TAP培养液中，起始浓度4×104个/ml（OD750约为0.02）；在温度为25℃，光强为120μE·m-2·s-1条件下，进行“12h光照：12h黑暗”的同步化培养，共培养3个光周期，在第4个光周期的4-6h收集衣藻细胞。
二、缺硫处理诱导产氢反应
1、25℃，2500rpm离心4min收集步骤一中培养至第4个光周期的4-6h的衣藻细胞。用缺硫TAP培养液洗细胞一次，用30ml缺硫TAP培养液悬浮沉淀，得到细胞悬液。
2、叶绿素浓度测定：取20μl步骤1的细胞悬液，加入980μl缺硫TAP培养液，再加入4ml丙酮，混匀，5000rpm离心5分钟，取离心后的上清，测定663nm和645nm处的吸光值，根据下面的公式计算衣藻中的总叶绿素含量（mg/L）：Chl（a+b）=8.02×OD663+20.21×OD645。实验设三个平行重复，结果取平均值。
3、根据步骤2的计算结果，取适量步骤1的细胞悬液，加入到新鲜灭菌的缺硫TAP培养液中，使最终叶绿素浓度达到25μg/mL。
4、将步骤3得到的调好叶绿素浓度的衣藻细胞液分装入100ml放氢瓶中，每瓶中100mL，盖上胶塞，石腊封边后将培养瓶置于25℃，光强为120μE·m-2·s-1的培养箱中磁力搅拌器上连续光照培养，缺硫培养24h时向每瓶中充入100μl甲烷。
5、在缺硫培养的第24h时和第48小时各取出一瓶，采用SHIMADZU GC-2014气相色谱测定氢气含量，载气为氮气。测定时用250μl注射器吸取放氢瓶气体部分100μl，注入进样孔，利用甲烷外标法计算气体体积。测定时气相色谱参数设置为：检测器：TCD检测器；氮气流速：60ml·min-1；检测器温度：100℃；柱温：60℃；进样口温度：100℃。
气相色谱检测衣藻放氢量的结果如图1所示，从图中可以看出，缺硫密闭培养后24小时衣藻细胞已处于放氢状态（图1中如果确定横坐标为1min处对应的峰即为氢气的检测峰），缺硫密闭培养后48小时衣藻细胞放氢显著。
三、分离产氢衣藻细胞的叶绿体
（一）从产氢衣藻细胞中分离叶绿体
以经上述步骤二鉴定证实处于放氢状态的缺硫密闭培养后24小时和48小时的莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）CC400分别为实验材料，按照如下方法从两份实验材料中分离得到叶绿体：
1、实验开始前铺好45%-75%Percoll梯度。即首先在离心管底层加入4mL体积分数为75%的Percoll缓冲液，再在所述体积分数为75%的Percoll缓冲液上缓慢加入5mL体积分数为45%的Percoll缓冲液，使两者形成明显Percoll梯度，光下肉眼可见两者分界面。
2、25℃3000rpm离心3min收集细胞（经上述步骤二鉴定证实处于放氢状态的缺硫密闭培养后24小时或48小时的莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）CC400）。用裂解缓冲液（Breaking buffer）重悬至5×107Cells/ml。
3、向步骤2的细胞悬浮液中加入皂素（saponin）至其终浓度为0.25%（0.25g/100mL），冰上搅拌裂解1min，从这步开始所有操作保持在4℃条件下。
4、4℃2300g离心1min，收集沉淀。
5、用裂解缓冲液（Breaking buffer）漂洗步骤4所得沉淀两到三次，4℃1600g离心1min，收集沉淀，为叶绿体粗提物。
6、轻柔地将步骤5所得沉淀（叶绿体粗提物）重悬在1ml裂解缓冲液（Breakingbuffer）里。
7、将步骤6所得重悬液（1mL）轻轻的加在步骤1准备好的“45%-75%Percoll梯度”中的体积分数为45%的Percoll缓冲液上方，4℃4600g离心20min后，可见位于所述体积分数为45%的Percoll缓冲液和所述体积分数为75%的Percoll缓冲液之间的界面上有墨绿色条带，吸取该墨绿色条带，用3倍体积的裂解缓冲液（Breaking buffer）稀释，4℃1000g离心2min，弃上清，收集沉淀。
8、用10ml裂解缓冲液（Breaking buffer）轻柔清洗步骤7所得沉淀两次，4℃900g离心2min，弃上清，收集沉淀，即得叶绿体。
整个叶绿体分离过程用时约为45分钟。
实验同时设置以传统针压法分离产氢衣藻（经上述步骤二鉴定证实处于放氢状态的缺硫密闭培养后24小时和48小时的莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）CC400）叶绿体的对照。对照分离过程中衣藻细胞的用量与以上本发明所提供的分离方法中衣藻细胞的用量相等。传统针压法具体操作参见“Mason C B,Bricker T M,Moroney J V.Arapid method for chloroplast isolation from the green alga Chlamydomonas reinhardtii[J].Nature Protocols,2006,1(5):2227-2230”一文。采用传统针压法分离产氢衣藻叶绿体整个分离过程用时约为两个小时45分钟。
图2中B显示了利用本发明所提供的产氢衣藻叶绿体分离方法，通过密度梯度离心纯化莱茵衣藻CC400放氢细胞叶绿体的percoll梯度照片。图2中A显示了利用传统针压法（对照方法）分离纯化莱茵衣藻CC400放氢细胞叶绿体的密度梯度离心效果。从图中可以看出，釆用针压法分离产氢细胞的叶绿体在45%与75%的percoll梯度界面间只有一条淡绿的条带，说明得到的叶绿体量极少；釆用本发明方法分离产氢细胞叶绿体在45%与75%的percoll梯度界面之间可以看到非常明显的墨绿色叶绿体产物层，说明得到的叶绿体量较多。
（二）叶绿体产率计算
1、以上步骤（一）本发明方法分离所得叶绿体中叶绿素总量的测定
用1ml裂解缓冲液（Breaking buffer）轻柔重悬以上步骤（一）本发明方法所得叶绿体，准确量取重悬液体积，测定叶绿素浓度，方法如下：取20μl重悬液，加入980μl缺硫TAP培养液，再加入4ml丙酮，混匀，5000rpm离心5分钟，取离心后的上清，测定663nm和645nm处的吸光值，根据下面的公式计算叶绿素浓度（mg/L）：Chl（a+b）=8.02×OD663+20.21×OD645。
2、叶绿体产率计算
计算公式：
叶绿体产率=分离所得叶绿体中叶绿素总量/待分离衣藻细胞中叶绿素总量
其中，“分离所得叶绿体中叶绿素总量（从待分离衣藻细胞中分离所得叶绿体中的叶绿素总量）”由步骤1测定得到；“待分离衣藻细胞中叶绿素总量”由步骤二2中测定得到。
实验设三个平行重复，结果取平均值。
结果显示，采用叶绿素总量为3.4g的经上述步骤二鉴定证实处于放氢状态的缺硫密闭培养后24小时的莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）CC400作为待分离衣藻细胞，按照上述步骤（一）的方法进行叶绿体分离，所得叶绿体中叶绿素总量为1.112mg，计算其叶绿体产率为32.71%。采用叶绿素总量为5.261g的经上述步骤二鉴定证实处于放氢状态的缺硫密闭培养后48小时的莱茵衣藻（Chlamydomonasreinhardtii）CC400作为待分离衣藻细胞，按照上述步骤（一）的方法进行叶绿体分离，所得叶绿体中叶绿素总量为0.687mg，计算其叶绿体产率为13.06%。具体如表1所示。可见本发明方法从产氢衣藻细胞中分离得到叶绿体的产率高，容易满足下游实验需求。
表1利用本发明方法分离产氢衣藻叶绿体的产率
注：表中“起始叶绿素总量”即为待分离衣藻细胞中叶绿素总量；叶绿体叶绿素总量即为分离所得叶绿体中叶绿素总量。
（三）叶绿体完整性检测
将步骤（一）中利用本发明所提供方法分离得到的叶绿体，用扫描电子显微镜观测其完整性。具体操作如下：
1、用裂解缓冲液（Breaking buffer）洗涤样品（步骤（一）中利用本发明所提供方法分离得到的叶绿体）一次。
2、用体积含量为2.5%的戊二醛水溶液于室温固定4小时，用裂解缓冲液（Breaking buffer）洗三次，每次10min，3000rpm离心3min，收集沉淀。
3、用体积含量为1%的饿酸水溶液固定过夜（4℃），用裂解缓冲液（Breaking buffer）洗三次，每次10min，3000rpm离心3min，收集沉淀。
4、脱水：用30%—50%—70%—80%—95%—100%乙醇梯度脱水，每梯度15min，3000rpm离心3min，收集沉淀。
100%乙酸异戊酯
以上各百分含量为体积百分含量。
6、二氧化碳临界点干燥。
7、冷场发射扫描电子显微镜观察。
结果如图3所示，在扫描电子显微镜下显示步骤（一）中利用本发明所提供方法分离得到的产氢衣藻叶绿体呈现明显的杯状结构。从图中可以看出通过本发明所提供的方法分离得到了处于产氢状态下的衣藻细胞完整的叶绿体。

Claims (7)

1.一种分离产氢衣藻叶绿体的方法，包括如下步骤：
（1）将待分离的产氢衣藻细胞悬浮于裂解缓冲液中，向其中加入皂素，得到悬浮液1；
所述皂素在所述悬浮液1中的含量为每100mL所述悬浮液1中含有0.25g所述皂素；
（2）将所述悬浮液1置于冰上1-2min，使所述产氢衣藻细胞裂解，得到悬浮液2；
（3）将所述悬浮液2于4℃2300g离心1min，收集沉淀；
（4）用所述裂解缓冲液对步骤（3）所得沉淀进行漂洗，4℃1000-2300g离心1min，收集沉淀，得到叶绿体粗提物；
（5）将所述叶绿体粗提物悬浮于所述裂解缓冲液中，得到悬浮液3；
（6）在离心管底层加入体积分数为75%的Percoll缓冲液，上层加入体积分数为45%的Percoll缓冲液，形成Percoll梯度，在所述体积分数为45%的Percoll缓冲液上方加入所述悬浮液3，4℃4600g离心20min，离心后可见位于所述体积分数为45%的Percoll缓冲液和所述体积分数为75%的Percoll缓冲液之间的界面上有墨绿色条带；
（7）取出所述墨绿色条带，用所述裂解缓冲液稀释，4℃890-1000g离心2min，收集沉淀，获得所述叶绿体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述裂解缓冲液的pH为7.8，溶剂为水，溶质及浓度如下：0.3M山梨醇、50mM HEPES-KOH、5mM MgCl2。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述将待分离的产氢衣藻细胞悬浮于裂解缓冲液中，为将所述待分离的产氢衣藻细胞悬浮于所述裂解缓冲液中至所述待分离的产氢衣藻细胞含量为5×107个/mL。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述体积分数为75%的Percoll缓冲液的pH为7.8，组成如下：体积分数为75%的Percoll、终浓度为0.33M的山梨醇、终浓度为50mM的HEPES-KOH、终浓度为5mM的MgCl2，余量为水；
所述体积分数为45%的Percoll缓冲液的pH为7.8，组成如下：体积分数为45%的Percoll、终浓度为0.33M的山梨醇、终浓度为50mM的HEPES-KOH、终浓度为5mM的MgCl2，余量为水。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：步骤（6）中，所述体积分数为75%的Percoll缓冲液、所述体积分数为45%的Percoll缓冲液，以及所述悬浮液3的体积配比为4：5：1。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述衣藻为莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述莱茵衣藻（Chlamydomonasreinhardtii）为莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）CC400。
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