CN109722409A - C4植物叶肉细胞、维管束鞘细胞的类囊体膜的分离提取方法 - Google Patents
C4植物叶肉细胞、维管束鞘细胞的类囊体膜的分离提取方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物技术领域，本发明提供了设计出了一种C4植物的叶肉细胞与维管束鞘细胞的类囊体膜的分离提取方法，通过破壁机的不同档位的机械作用，分别得到叶肉细胞及维管束鞘细胞的类囊体膜，该工艺简单，容易操作。采用本工艺提取类囊体膜，提取时间短，且与酶解法相比，本发明的工艺简单，提取时间短，且处理量大，最后通过本发明可以分别得到叶肉细胞的类囊体膜及维管束鞘细胞的类囊体膜，从而获得需要的蛋白等。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种C4植物的叶肉细胞与维管束鞘细胞的类囊体膜的分离提取方法。
背景技术
光合作用是地球上最大规模的能量和物质转换过程，是几乎一切生命生存和发展的物质基础。光合作用分成两个过程。第一个过程是在类囊体膜上，太阳光激发光合电子传递系统中的叶绿素吸收太阳光，把光能转化成化学能，生成能量分子ATP和NADPH，这个过程叫光反应。第二个过程叫暗反应，在酶的催化下，消耗ATP提供的能量和NADPH，将二氧化碳和水合成碳水化合物。
根据固碳方式的不同可以将植物分为碳三植物（C3植物），如小麦、大豆、水稻、烟草、棉花等；碳四植物（C4植物），例如玉米、甘蔗、高粱等。碳三植物固碳效率低，碳四植物中有一种特殊的花环结构，这种结构特征将光合作用反应分在两种不同类型的细胞内，叶肉细胞和维管束鞘细胞，维管束鞘细胞环绕维管组织，与此同时，一个外部的叶肉细胞环包绕维管束并与细胞间隙相邻。C4植物把用于碳固定和碳还原的细胞分开的类囊体膜结构对于二氧化碳的吸收和高效的进行光合作用是十分必要的。
叶绿体是植物及某些高等藻类进行光合作用的主要场所。植物叶绿体内部由基质和类囊体组成，基质是光合作用暗反应的场所，类囊体是光合作用光反应的场所，是光捕获、光合电子传递、质子易位及 ATP 合成的位点，因此大部分与光合作用有关的蛋白质和蛋白复合物均定位于类囊体膜及类囊体腔中，类囊体膜系统主要包括四种高丰度的多亚基膜蛋白复合体，即 PSI、PSII、Cytb6f及ATP合酶。叶绿体类囊体膜中的蛋白质复合体是植物进行光能吸收、传递和转换的关键部位，因而一直是光合作用研究的热点。随着膜蛋白提取分离效率的提高，在此基础上研究类囊体蛋白质的结构及功能将有助于我们更深入地了解叶绿体类囊体的功能及其代谢规律。
现阶段叶肉细胞与维管束鞘细胞的分离提取工艺大多为酶解法，该工艺耗时长、且费用消耗大。采用酶解法一般是将叶片小条放入含有纤维素酶、果胶酶的缓冲液，使细胞壁酶解。酶解下来的细胞再通过滤、涨破、离心等操作得到类囊体膜。但是酶解法通常需要较长的时间的酶解反应才能得到原生质体，而且随着需要得到类囊体膜的量的增加，酶的使用量也会随之增大，费用也会增大。酶解法对于一些成熟的叶片酶解的时候效果也不是很好。
发明内容
针对现阶段类囊体膜分离存在的问题，本发明提供了设计出了一种C4植物的叶肉细胞与维管束鞘细胞的类囊体膜的分离提取方法，该方法操作简单、成本低，且可大量快速纯化。
一种C4植物叶肉细胞和维管束鞘细胞的类囊体膜的分离提取方法，包括以下步骤：
（1）取C4植物的叶片，清洗后擦掉水分，去掉叶片中间的叶脉，将叶片剪成0.5-1cm小条；
（2）取剪碎的叶片放入在冰箱提前预冷的破壁机，加入预冷后的捣碎液，破碎至叶片外层的叶肉细胞80-90％掉落；
（3）低温过滤，捣碎液涮洗破壁机，再过滤，合并滤液，即为叶肉细胞；
（4）将步骤（3）的滤渣加入预冷后的捣碎液，继续破碎至叶肉细胞95%及以上掉落；过滤，留滤渣，弃滤液；
（5）将步骤（4）的滤渣加入预冷后的捣碎液，破碎至维管束鞘细胞90-99%及以上掉落，过滤，滤液即为维管束鞘细胞；
（6）将步骤（3）的叶肉细胞，离心，加入预冷后的涨破液，搅拌，离心，加贮存液，放入液氮迅速冷冻放-80℃冰箱保存，得到叶肉细胞的类囊体膜；
（7）将步骤（5）得到的维管束鞘细胞，离心，加入预冷后的涨破液，搅拌，离心，加贮存液，放入液氮迅速冷冻放-80℃冰箱保存，得到维管束鞘细胞的类囊体膜。
所述的步骤（2）-（5）中的捣碎液为蔗糖、NaCl、Tricine的混合液，所述的蔗糖的终浓度为0.3M；NaCl的终浓度为15mM；Tricine的终浓度为30 mM，NaOH调pH为8.0。
所述的步骤（2）中的捣碎液的用量为5-10ml/g叶片。
所述的步骤（6）、（7）中的涨破液为Tricine溶液，浓度为15mM，且用NaOH调整pH至8.0。
所述的步骤（6）、（7）中的涨破液的用量为2-5ml/g叶片。
所述的步骤（6）、（7）中的存贮液为蔗糖、Tricine的混合液，所述的蔗糖的终浓度为0.3M；Tricine的终浓度为20 mM；NaOH调pH为8.0。
采用上述方法制备得到的叶肉细胞的类囊体膜。
采用上述方法制备得到的维管束鞘细胞的类囊体膜。
叶绿体通过两种不同的功能单位---即两种不同的光系统（PSI 和 PSII）将光能转化为化学能。PSI主要位于类囊体膜的非垛叠区域，PSII则主要位于类囊体膜的垛叠区域。
维管束鞘细胞的叶绿体向心排列，含有大淀粉和非垛叠类囊体膜。叶肉细胞含有无规则排列的叶绿体，其中类囊体垛叠，几乎不含有淀粉。C4循环的CO2浓缩机制发生在维管束鞘细胞中。
C4植物维管束鞘细胞叶绿体的内膜系统主要由基质类囊体组成。PSI 仅存在于基质片层和基粒片层的非垛叠区。PSI 中的Fd可以参与线性电子传递和围绕PSI的环式电子传递，在只有PSI的基质片层中，环式电子传递只形成ATP，不产生氧气，也没有NADP+还原反应。由此我们得出结论，C4植物对维管束鞘细胞能进行光反应，但光反应包括PSI只参的光反应，该反应只产生ATP，不放氧气，也不产生NADPH。
本发明的有益效果：
（1）分别得到叶肉细胞及维管束鞘细胞的类囊体膜
叶肉细胞及维管束鞘细胞的类囊体膜的主要成分不同，通过本发明可以分别得到叶肉细胞的类囊体膜及维管束鞘细胞的类囊体膜，从而获得需要的蛋白等。
（2）工艺简单，容易操作
本发明通过破壁机的不同档位的机械作用，分别得到叶肉细胞及维管束鞘细胞的类囊体膜，该工艺简单，容易操作。
（3）提取时间短、处理量大
采用本工艺提取类囊体膜，提取时间短，且与酶解法相比，本发明的工艺简单，提取时间短，且处理量大。
具体实施方式
本实施例所用破壁机为 PHILIPS (飞利浦) 型号为ProBlend 6。
实施例1
一种C4植物玉米的叶肉细胞类囊体膜与维管束鞘细胞类囊体膜的提取方法，包括以下步骤：
（1）取成熟玉米叶片(第三片叶片及以上)，清洗后擦掉水分，去掉叶片中间的叶脉，将叶片剪成0.5-1cm小条；
（2）提前放进冰箱预冷飞利浦破壁机杯体部分、捣碎液、涨破液、类囊体膜贮存液；取剪碎的叶片50g放入预冷的破壁机，加入500ml的捣碎液，用最小档破碎。期间取样并显微镜下观察，直至叶片外层的叶肉细胞85％掉落（保证维管束鞘细胞的完整）。
（3）烧杯置于冰上预冷，用35目的网筛对玉米叶片混合液进行过滤，网筛放在2L的烧杯上，用100ml捣碎液涮洗破壁机，再过滤。得到的烧杯中的滤液即为叶肉细胞（如果无合适的网筛用4层以上纱布过滤也可以）。
（4）上一步得到的滤渣加入400 ml捣碎液中档继续破碎，显微镜下镜检直至叶肉细胞95％掉落（可能会有部分维管束鞘细胞掉落，为了保持样品纯度，无大影响）。
（5）用180目网筛过滤样品混合液，留滤渣（维管束及一些纤维网）弃滤液。
用最大档位破碎加入500ml捣碎液的滤渣，显微镜镜检直至维管束鞘细胞99％掉落，再用180目网筛过滤，弃滤渣留滤液（维管束鞘细胞）。
（6）将得到的叶肉细胞 4℃ 5000 g离心10min，用小毛刷蘸取涨破液将沉淀刷匀无块状沉淀，加入200 ml涨破液200 rpm/min冰浴搅拌15min，对叶肉细胞叶绿体进行涨破。获得叶肉细胞类囊体膜后，20000 g 4℃离心15min，加少量的类囊体膜贮存液用小毛刷刷匀沉淀，放入液氮迅速冷冻后放-80℃冰箱保存。
（7）将得到的维管束鞘细胞20000 g 4℃离心10min，加入少量涨破液用小毛刷将沉淀刷匀，加入200 ml涨破液250 rpm/min冰浴搅拌30min，对维管束鞘细胞叶绿体进行涨破。获得维管束鞘细胞类囊体膜后，20000 g 4℃离心15min，加少量的类囊体膜贮存液用小毛刷将沉淀刷匀，放入液氮迅速冷冻，放-80℃冰箱保存。
本实施例采用剪碎的叶片50g，也可以把处理量调整到更多，根据破壁机的大小而定。而酶解法分离提取类囊体膜，同样的处理量则需要一个特别大的酶体系且分离效果慢。
实施例2
以玉米叶肉细胞类囊体膜为材料，提取光系统II捕光天线复合体LHCII，包括以下操作：
将实施例1步骤（6）得到的叶肉细胞的类囊体膜，取5ul加入到5ml 80％丙酮中，充分抽提叶绿素后7000g离心5min，吸取上清。用日本岛津UV-2600分光光度计测吸光度，计算chla+b总浓度，用20mM Tcine-Tirs作为缓冲液buffer将类囊体膜chla+b终浓度调成chl a+b=1mg/mL， 1.0 % β-DDM，冰浴搅拌200 rpm/min增溶30min，贝克曼高速离心机JA 25.5转头20000g离心4℃，10min。
取上清过蛋白纯化系统，收集合并对应LHCII样品峰位的多只收集管。
手动灌制蔗糖密度梯度混合液，0.3—0.9 M 蔗糖（0.05% β-DDM）浓度。
取合并样品1ml每只开口管超速离心，贝克曼超速离心机SW40Ti转头，37000rpm/min, 离心16h，4℃。
取出离心管，在蔗糖密度梯度离心管中分层，可纯化LHCII样品，也可分别得到LHCII样品单体以及三聚体。
实施例3
以玉米维管束鞘细胞类囊体膜为材料，提取色素蛋白复合体PSI-LHCI，包括以下操作：
将实施例1步骤（7）得到的维管束鞘细胞类囊体膜，取5ul加入到5ml 80％丙酮中，充分抽提叶绿素后7000g离心5min，吸取上清。用日本岛津UV-2600分光光度计测吸光度，计算chl a+b总浓度，用20mM Tcine-Tirs作为缓冲液buffer将类囊体膜chla+b终浓度调成chla+b=1mg/mL，0.6% β-DDM，冰浴搅拌200rpm/min增溶30min，贝克曼高速离心机JA 25.5转头20000g离心4℃，10min。
取上清过蛋白纯化仪收集对应PSI-LHCI为主要蛋白峰位的收集管。
手动灌制蔗糖密度梯度混合液，0.3—1.2 M蔗糖（0.03% β-DDM）浓度。
取合并的样品上样，每只开口管1ml样品严格配平后超速离心，贝克曼超速离心机SW40Ti转头，37000rpm/min， 离心16h，4℃。
取出离心管，样品在蔗糖密度梯度离心管中分层，可得到纯度高的PSI-LHCI样品。
Claims (8)
1.一种C4植物叶肉细胞和维管束鞘细胞的类囊体膜的分离提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取C4植物的叶片，清洗后擦掉水分，去掉叶片中间的叶脉，将叶片剪成0.5-1cm小条；
（2）取剪碎的叶片放入在冰箱提前预冷的破壁机中，加入预冷后的捣碎液，破碎至叶片外层的叶肉细胞80-90％掉落；
（3）低温过滤，捣碎液涮洗破壁机，再过滤，合并滤液，即为叶肉细胞；
（4）将步骤（3）的滤渣加入预冷后的捣碎液，继续破碎至叶肉细胞90-99%及以上掉落；过滤，留滤渣，弃滤液；
（5）将步骤（4）的滤渣加入预冷后的捣碎液，破碎至维管束鞘细胞80-95%及以上掉落，过滤，滤液即为维管束鞘细胞；
（6）将步骤（3）的叶肉细胞，离心，加入预冷后的涨破液，搅拌，离心，加贮存液，放入液氮迅速冷冻放-80℃冰箱保存，得到叶肉细胞的类囊体膜；
（7）将步骤（5）得到的维管束鞘细胞，离心，加入预冷后的涨破液，搅拌，离心，加贮存液，放入液氮迅速冷冻放-80℃冰箱保存，得到维管束鞘细胞的类囊体膜。
2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（2）-（5）中的捣碎液为蔗糖、NaCl、Tricine的混合液，所述的蔗糖的终浓度为0.3M；NaCl的终浓度为15mM；Tricine的终浓度为30 mM，NaOH调pH为8.0。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（2）中的捣碎液的用量为5-10ml/g叶片。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（6）、（7）中的涨破液为Tricine溶液，浓度为15mM，且用NaOH调整pH至8.0。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（6）、（7）中的涨破液的用量为2-5ml/g叶片。
6. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（6）、（7）中的存贮液为蔗糖、Tricine的混合液，所述的蔗糖的终浓度为0.3M；Tricine的终浓度为20 mM；NaOH调pH为8.0。
7.采用权利要求1的方法制备得到的叶肉细胞的类囊体膜。
8.采用权利要求1的方法制备得到的维管束鞘细胞的类囊体膜。
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