ES2326485T3 - Procedimiento para producir etanol. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para producir etanol a partir de una materia prima lignocelulósica fibrosa, que comprende a) la conversión de la materia prima en una fracción lignocelulósica sólida con una mayor concentración de celulosa y una fracción líquida que contiene principalmente hemicelulosas solubilizadas; b) la hidrólisis del material lignocelulósico fibroso con alta consistencia con una enzima celulasa para proporcionar un material lignocelulósico modificado con mayor fluidez; c) el sometimiento simultáneo del material lignocelulósico modificado a una hidrólisis continúa con una celulasa y a una fermentación para obtener etanol en una mezcla de fermentación; d) la continuación de la fermentación para convertir una gran parte de los carbohidratos disponibles en etanol; e) la adición de la fracción líquida que contiene las hemicelulosas solubilizadas a la mezcla de fermentación y la continuación de la fermentación; y f) la recuperación del etanol de la mezcla de fermentación.
Description
Procedimiento para producir etanol.
La presente invención se refiere a la producción
de etanol. En concreto, la presente invención se refiere a un nuevo
procedimiento para la conversión de material lignocelulósico fibroso
en etanol mediante fermentación.
La conversión de biomasa en energía combustible
ha recibido una creciente atención como un medio de sustituir la
energía derivada de combustibles fósiles. De los biocombustibles
líquidos (etanol, metanol, metiléster de ácidos grasos), el etanol
tiene un largo historial probado y ventajas medioambientales. Se
puede producir a partir diversas materias primas. Tradicionalmente,
el etanol se ha producido a partir de almidón o de productos
agrícolas de base azúcares, pero hoy en día la atención se centra en
diferentes residuos agrícolas y forestales o en flujos secundarios
de la industria forestal. Una ventaja ambiental muy importante de la
producción del etanol es que se genera poco CO_{2}, siempre y
cuando la materia prima provenga de residuos de desecho renovables
o madera. Actualmente, el coste del etanol producido a partir de
materias primas que contienen lignocelulosa es todavía demasiado
elevado por diversos motivos. Entre las barreras están los elevados
costes de las tecnologías de conversión de la lignocelulosa, una
concentración y rendimiento de etanol bajos, así como los bajos
porcentajes de producción, todo lo cual aumenta los costes del
etanol producido a partir de lignocelulósicos, en comparación con
el etanol producido a partir de materias primas basadas en almidón o
azúcar.
La conversión de madera o materiales
lignocelulósicos derivados de la agricultura en azúcares y después
en etanol es un procedimiento complejo que implica varias etapas
(pretratamiento, potencial separación de sólidos, hidrólisis de la
celulosa, producción de etanol a partir de celulosa y hemicelulosa y
destilación del etanol). Dependiendo de la materia prima, son
necesarios diferentes tipos de técnicas de pretratamiento.
Generalmente es necesaria una etapa de pretratamiento para mejorar
la hidrolizabilidad de la parte celulósica. El objetivo del
pretratamiento es hacer que los materiales de la biomasa sean más
accesibles a una hidrólisis bien química o bien enzimática para una
producción eficaz de azúcares a partir de celulosa y hemicelulosa.
Los objetivos del pretratamiento son extraer y separar la
hemicelulosa de la celulosa, romper y extraer el recubrimiento de
lignina, disminuir la cristalinidad de la celulosa, aumentar el área
superficial accesible de la celulosa y aumentar el tamaño de poro
de la celulosa para facilitar la penetración de los agentes
hidrolizantes (Chang y Holtzapple, 2000).
Hay disponibles descripciones detalladas de
diversas tecnologías de pretratamiento (recogidas, por ejemplo, por
Hsu y col., 1996). De las diversas opciones de pretratamiento, la
explosión por vapor (con impregnación de ácido sulfúrico y con
dióxido de azufre) es uno de los procedimientos más ampliamente
estudiados (Chandrakant y Bisaria, 1998).
La digestibilidad máxima de la celulosa
generalmente coincide con la extracción completa de la hemicelulosa.
Por tanto, en los procedimientos de pretratamiento eficaces, la
mayor parte de la hemicelulosa se solubiliza y forma una fracción
soluble que contiene principalmente azúcares derivados de la
hemicelulosa (denominada "filtrado de hemicelulosa"). El
filtrado crudo de hemicelulosa del pretratamiento generalmente
contiene varios productos de la degradación de la lignocelulosa.
Éstos pueden ser productos de la descomposición de azúcares y
lignina, incluyendo furfural, hidroximetilfurfural y ácidos fórmico
y acético. La mayoría de estos componentes son tóxicos para las
enzimas y microorganismos, ralentizando el procedimiento posterior
de hidrólisis y fermentación. Se han investigado diversos
procedimientos diferentes de destoxificación (Gong y col., 1999).
Entre los procedimientos estudiados se encuentran la neutralización
con cal, el tratamiento con carbón y diferentes resinas de
adsorción. Inhibidores en el filtrado de hemicelulosa han mostrado
una fuerte disminución de los porcentajes tanto de la hidrólisis
como de la fermentación.
Los procedimientos de hidrólisis de la parte
celulósica se pueden basar bien en ácidos o bien en enzimas. Las
desventajas principales de la hidrólisis enzimática son que el
procedimiento es bastante lento y que los costes de las enzimas son
todavía demasiado elevados (Kaylen y col., 2000). Generalmente, el
rendimiento de la hidrólisis depende del tipo de pretatamiento del
sustrato, del tipo y dosis de la enzima y del tiempo de hidrólisis.
La mayoría de los experimentos se han llevado a cabo con bajas
consistencias de las materias primas debido a la cantidad de
compuestos inhibidores en el sustrato derivado de la fase de
pretratamiento.
Hay básicamente dos tipos diferentes de
procedimientos que se pueden usar para convertir la celulosa (y la
hemicelulosa) en etanol. Éstos son
hidrólisis-fermentación independientes (SHF) y
sacarificación-fermentación simultáneas (SSF). Este
último procedimiento también se ha ampliado para abarcar
sacarificación-fermentación de hemicelulosa
simultáneas (SSHF) y también se denomina
sacarificación-cofermentación (SSCF). Entre los
diversos esquemas de bioconversión de celulosa, el SSF parece ser
el enfoque más prometedor para la conversión bioquímica de celulosa
en etanol. La producción industrial de etanol tradicionalmente se
lleva a cabo con levaduras, que son organismos resistentes muy
conocidos. Se han creado por ingeniería genética nuevas cepas (bien
de levaduras o bien de bacterias) para utilizar de forma eficaz
todos los azúcares derivados de la materia prima lignocelulósica.
La utilización de todos los azúcares, incluyendo las pentosas y
todas las hexosas derivadas de la hemicelulosa, es esencial para
una producción económica de etanol.
Las condiciones de la hidrólisis usadas en un
procedimiento de hidrólisis independiente (SHF) vienen determinadas
por las condiciones óptimas para las enzimas (principalmente
celulasas de hongos que tienen una actividad máxima a 50ºC y a un
pH en el intervalo de 4 a 5). La principal ventaja de una etapa de
hidrólisis independiente es que la hidrólisis se lleva a cabo a la
temperatura óptima para las enzimas y la fermentación independiente
a la óptima para las levaduras, aproximadamente 30ºC. La principal
desventaja es que los azúcares liberados en la hidrólisis inhiben
mucho la actividad de las celulasas durante la hidrólisis. Esto se
puede solucionar al menos parcialmente aumentando la actividad de
la beta-glucosidasa en la preparación usada
(añadiendo una enzima separada o usando una cepa sobreproductora).
Las cargas de celulasas habitualmente varían de 10 a 20 FPU/g de
sustrato (o celulosa) y se complementan con betaglucosidasa.
Habitualmente, las concentraciones de azúcares producidos son
bastante bajas debido a la poca cantidad de materia seca en la
hidrólisis. Los rendimientos (a partir de los azúcares)
habitualmente son mayores en sistemas más diluidos, en los que la
inhibición del producto final se minimiza. Los tiempos de reacción
prolongados también hacen posible un rendimiento y concentración de
etanol mayores.
En el procedimiento de
sacarificación-fermentación simultáneas (SSF) la
sacarificación de la celulosa en glucosa con celulasas y la
posterior fermentación de la glucosa (y pentosas) para obtener
etanol tienen lugar en los mismos reactores. Según los actuales
esquemas del procedimiento, todos los reactivos (celulosa, enzimas y
organismos fermentadores) se añaden al mismo tiempo. Uno de los
requisitos más importantes del procedimiento SSF es la
compatibilidad de los sistemas de sacarificación y fermentación
respecto a la temperatura (inferior a 37ºC), al pH y a la
concentración de sustrato. Las principales ventajas ofrecidas por el
SSF incluyen un mayor porcentaje de hidrólisis de la celulosa
debido a la extracción (mediante levaduras) de los azúcares que
inhiben la actividad de la celulasa y a un menor requisito de
condiciones asépticas. Las desventajas son las diferencias en las
condiciones óptimas para la hidrólisis y la fermentación. El uso de
todo el material, tanto la celulosa sólida como el filtrado de
hemicelulosa, simultáneamente para la fermentación en vez de solo
el filtrado ha mostrado ventajas; por ejemplo, disminuye la
formación de ácido láctico (Stenberg y col. 2000).
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Un objetivo de la presente invención es mejorar
el ahorro y la eficacia (en términos de utilización de materias
primas) de la técnica conocida y proporcionar un nuevo procedimiento
para convertir materiales lignocelulósicos en etanol. En concreto,
un objetivo de la presente invención es aumentar la concentración
final de etanol del procedimiento de fermentación y mejorar el
porcentaje y el rendimiento de la producción.
La invención se basa en la idea de realizar la
hidrólisis y la fermentación con una alta concentración de
sustratos y, evitando los efectos inhibidores del filtrado de
hemicelulosa, disminuir la cantidad de enzimas necesarias y,
finalmente, disminuir los costes globales de producción de etanol.
Las pocas configuraciones de procedimientos publicadas (tales como
el procedimiento del NREL) no han alcanzado estas metas.
La presente invención se basa en una combinación
de tres etapas principales del procedimiento, concretamente en una
primera etapa en la que el material lignocelulósico pretratado, que
tiene una mayor concentración de material celulósico o
lignocelulósico capaz de ser fermentado para obtener etanol, es
sometido a una etapa preliminar de hidrólisis a alta consistencia.
A continuación, la hidrólisis continúa durante una segunda etapa de
la invención simultánea con la fermentación. Finalmente, las
hemicelulosas solubilizadas, separadas durante el pretratamiento de
la materia prima, se añaden - potencialmente después de la
extracción de los inhibidores de la fermentación - a la mezcla de
fermentación y la fermentación de los sustratos combinados continúa
para proporcionar mayor rendimiento del producto.
Más específicamente, la invención está
caracterizada principalmente por lo que se expone en la parte
caracterizadora de la reivindicación 1.
La presente invención, que comprende las
características esenciales de una tecnología de hidrólisis y
fermentación mejorada, proporciona las siguientes ventajas:
Se obtienen un porcentaje de hidrólisis alto y
una concentración alta al comenzar la hidrólisis con una alta
consistencia de materias primas en las condiciones óptimas para las
enzimas pre-hidrolizantes. La inhibición del
producto final se evita continuando la etapa principal de hidrólisis
simultáneamente con la producción de etanol a partir de los
azúcares hidrolizados por las levaduras, lo que consume los azúcares
potencialmente provocando la inhibición del producto final de las
enzimas.
La cantidad de enzimas necesarios disminuye
debido a la menor inhibición del producto final y a la menor
necesidad de beta-glucosidasa. La concentración y
la destoxificación opcional de la fracción de hemicelulosa mejoran
el porcentaje de producción de etanol y conduce a una elevada
concentración final de etanol. La adición de la fracción de
hemicelulosa en una fase posterior disminuye la inhibición de
enzimas y microorganismos por cualquier compuesto inhibidor. La
minimización de los efectos inhibidores y el aumento de la
consistencia de la materia prima (carbohidratos) conducen a mayores
porcentajes de fermentación, mayores concentraciones finales de
etanol y menores costes de producción de etanol.
A continuación se describirá la invención con
más detalle en referencia al dibujo adjunto.
la fig. 1 muestra de forma esquemática el
diagrama de un procedimiento nuevo de tres etapas según la invención
para convertir lignocelulosa en etanol.
El procedimiento total para producir etanol a
partir de una materia prima lignocelulósica fibrosa, que contiene
carbohidratos, generalmente comprende las etapas de
- Prehidrólisis enzimática a alta consistencia,
típicamente con el 10% en peso en seco o más, a la temperatura
óptima para las enzimas. La composición de enzimas se puede diseñar
específicamente para la prehidrólisis o puede ser la misma durante
la prehidrólisis y la etapa de hidrólisis principal;
- Hidrólisis principal enzimática y fermentación
simultáneas secundarias de los azúcares hexosas a una temperatura
adecuada para los organismos fermentadores; y
- Adición de la fracción de hemicelulosa
concentrada y opcionalmente detoxificada después de que la mayor
parte de los azúcares hexosa hayan fermentado; este procedimiento
también permite el uso de un filtrado de hemicelulosa no
detoxificado.
En concreto, el procedimiento comprende
a) la conversión de la materia prima en una
fracción lignocelulósica sólida con una concentración aumentada de
celulosa y una fracción líquida que contiene principalmente
hemicelulosas solubilizadas;
b) la hidrólisis del material lignocelulósico
fibroso con alta consistencia con una enzima celulasa para
proporcionar un material lignocelulósico modificado con mayor
fluidez (lo que significa, por ejemplo, características de mezclado
y bombeo mejoradas),
c) el sometimiento simultáneo del material
lignocelulósico modificado a una hidrólisis continua con una
celulasa y a una fermentación para obtener etanol en una mezcla de
fermentación,
d) la continuación de la fermentación para
convertir una gran parte de los carbohidratos disponibles en
etanol,
e) la adición de la fracción líquida que
contiene hemicelulosas solubilizadas a la mezcla de fermentación y
la continuación de la fermentación, y
f) la recuperación del etanol de la mezcla de
fermentación.
En el presente procedimiento, como materia
prima, se puede usar cualquier material lignocelulósico,
generalmente lignocelulósico fibroso, que contenga cantidades
importantes de celulosa y hemicelulosa para la fermentación para
obtener etanol susceptible de una hidrólisis del material
hidrocarbonado para obtener azúcares monoméricos, hexosas y
pentosas.
Típicamente, la materia prima se selecciona de
entre residuos de madera blanda y madera dura, cultivos dedicados,
desechos agrícolas, papel usado o un flujo secundario de la
industria forestal.
En referencia ahora al dibujo, se puede observar
que los siguientes números de referencia se usan para designar las
diversas etapas del procedimiento:
- 1.
- Pretratamiento
- 2.
- Filtración y lavado
- 3.
- Prehidrólisis
- 4.
- Hidrólisis y fermentación de las hexosas
- 5.
- Concentración
- 6.
- Destoxificación
- 7.
- Hidrólisis y fermentación de la hemicelulosa
- 8.
- Destilación
Estas etapas se examinarán a continuación:
La materia prima se trata previamente con un
procedimiento de pretratamiento, tal como la explosión por vapor,
con el objetivo de liberar la hemicelulosa de la matriz fibrosa
lignocelulósica. Como técnica, la explosión por vapor es descrita
con más detalle por Saddler y col. (1993), y un equipo y un
procedimiento para el pretratamiento son descritos por Palmqvist y
col., (1996).
(Saddler, J., Ramos, L. y Breuil, C. (1993)
Steam pre-treatment of lignocellulosic residues. En:
Bioconversion of Forest and Agricultural plant Residues. Saddler,
J.N. (ed.) CAB International, Wallingford, UK, capítulo 3,
73-92; Palmqvist, E., Hahn-Hagerdal,
B., Galbe, M., Larsson, M., Stenberg, K., Szengyel, Z., Tengborg,
C. y Zacchi, G., 1996, Design and operation of a
bench-scale process development unit for the
production of ethanol from lignocellulosics. Bioresource Technology
58:171-179)
La materia prima comprende materiales
lignocelulósicos tales como madera (madera blanda, madera dura y
mezclas de las mismas) y materiales lignocelulósicos derivados
agrícolas, tales como plantas perennes o caducas.
En la siguiente etapa, la suspensión se somete a
filtración y lavado. El material fibroso así obtenido tienen una
mayor concentración de celulosa en comparación con la materia prima,
puesto que una parte importante de las hemicelulosas
(aproximadamente del 5% en peso al 30% en peso de la materia prima
total) se ha disuelto en la fase líquida (fase acuosa). El objetivo
es separar una parte importante, al menos el 40% en peso, en
concreto al menos el 50% en peso, de las hemicelulosas presentes en
la materia prima e incorporarlas en la fase líquida principalmente
en forma monomérica u oligomérica. Típicamente, la cantidad de
hemicelulosas/sacáridos en la fracción líquida es al menos 2 veces
superior, preferiblemente de 2,5 a 15 veces superior (calculado en
peso), que en el material fibroso.
La filtración se lleva a cabo usando, por
ejemplo, filtros prensa u otros procedimientos de separación
convencionales para la separación y el lavado de la fracción de
sólidos, que contiene principalmente celulosa. La separación
conduce a una torta de filtración (a alta temperatura) con un alto
contenido de sólidos y a una fracción líquida que contiene
hemicelulosas solubilizadas y también los compuestos
inhibidores.
La hidrólisis de la etapa b se lleva a cabo a
una temperatura de 30-90ºC, o de
40-90ºC, durante de 0,5 a 24 horas, típicamente de
aproximadamente 1 a 12 horas. La consistencia es elevada,
generalmente de aproximadamente el 5 al 40% en peso en seco,
preferiblemente aproximadamente el 10-25% en peso en
seco, o el 10-40% de peso en seco. La hidrólisis se
lleva a cabo en condiciones ligeramente ácidas, preferiblemente con
un pH en el intervalo de 4 a 6.
Como se analizará con más detalle a
continuación, la hidrólisis de la etapa b se lleva a cabo con una
primera preparación de celulasas y la hidrólisis de la etapa c
(número de referencia 5 en la figura 1) se lleva a cabo con una
segunda preparación de celulasas, siendo las celulasas bien las
mismas o, preferiblemente, diferentes. Usando diferentes celulasas
es posible emplear enzimas, que se optimizan para sus diferentes
tareas. Por tanto, la primera enzima se puede optimizar
específicamente para mejorar la tratabilidad (tal como el mezclado y
el bombeo - generalmente "fluidez") a alta consistencia,
disminuyendo la viscosidad, produciendo azúcares fermentables y
siendo activa a temperaturas de 30-90ºC en la etapa
b. Durante la prehidrólisis, al menos parte de la celulosa y otros
carbohidratos se hidrolizarán para obtener azúcares (monosacáridos,
tales como hexosas y pentosas). Típicamente, al menos el 5%,
preferiblemente aproximadamente el 10%-90%, en concreto
aproximadamente el 20%-80%, de los carbohidratos se hidrolizan en
esta fase para producir monosacáridos fermentables. En los ejemplos
posteriores el grado de hidrólisis es de aproximadamente el
20-70%.
Preferiblemente, la enzima usada en la etapa b
tiene un amplio espectro de celulasas. En concreto, la enzima tiene
el menos dos actividades seleccionadas del grupo constituido por
actividades celobiohidrolasa, actividades endoglucanasa,
actividades beta-glucosidasa y actividades
hemicelulasa (véase a continuación para una explicación más
detallada de las enzimas).
La etapa de hidrólisis y fermentación
simultáneas (etapa c) se lleva a cabo preferiblemente a una
temperatura en el intervalo de 30 a 70ºC. (La hidrólisis de la
etapa b se lleva a cabo preferiblemente a una temperatura mayor que
la hidrólisis y fermentación de la etapa c). La hidrólisis continúa
con una segunda enzima, que es activa a esta temperatura para un
tiempo de reacción de 6 a 96 horas.
La enzima usada en la etapa c tiene un amplio
espectro de celulasas y es activa a temperaturas de 30 a 90ºC. La
enzima tiene preferiblemente al menos dos actividades seleccionadas
del grupo constituido por actividades celobiohidrolasa, actividades
endoglucanasa, actividades beta-glucosidasa y
actividades hemicelulasa. Se optimiza específicamente para llevar a
cabo la hidrólisis del material lignocelulósico restante en las
etapas c a e.
Las dos enzimas tienen preferiblemente el mismo
origen y están diseñadas para una hidrólisis eficaz del material
lignocelulósico en todo el procedimiento constituido por las etapas
b a e.
A continuación, se proporciona una descripción
más completa de las enzimas.
Durante la hidrólisis, las porciones restantes
de celulosa y otros carbohidratos del material celulósico y
lignocelulósico se convierten en azúcares.
La etapa de fermentación se lleva a cabo en
presencia de un organismo fermentador, capaz de fermentar los
principales carbohidratos derivados de la lignocelulosa (azúcares),
es decir, monosacáridos, tales como hexosas y pentosas. El
organismo fermentador es capaz de producir etanol a partir de los
principales azúcares derivados de la lignocelulosa a una
temperatura de 30-70ºC.
Ejemplos de organismos adecuados son los
siguientes:
Levaduras:
Saccharomyces cerevisiae, incluyendo
organismos genéticamente modificados (GMO), tales como la cepa VTT
B-03339
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Bacteria:
E. coli (GMO -kanta/kantoja)
Klebsiella oxytoca (GMO -kanta)
Hongos:
Corynebacterium sp.
\vskip1.000000\baselineskip
En concreto, el organismo fermentador es una
levadura, capaz de producir etanol a partir de los principales
azúcares derivados de la lignocelulosa.
La concentración de la fracción líquida obtenida
de la etapa de filtración aumenta después antes de la adición de
líquido a la mezcla de fermentación. Por tanto, es preferible
aumentar la concentración de la fracción de hemicelulosa hasta una
concentración en peso en seco del 5-60%.
La concentración se puede llevar a cabo por
evaporación o mediante diferentes técnicas de membrana. Durante la
concentración por evaporación, algunos compuestos inhibidores de
organismos fermentadores también se pueden eliminar del filtrado de
hemicelulosa.
La fracción líquida puede ser sometida -
dependiendo de las condiciones del pretratamiento - a una operación
de destoxificación para liberar la fracción de hemicelulosa de
sustancias que pueden inhibir la fermentación. Se pueden eliminar
los inhibidores, por ejemplo, mediante separación, evaporación,
exclusión iónica, resinas o el procedimiento de tratamiento con
carbón.
La fracción líquida se añade cuando una gran
parte del sustrato de carbohidratos disponible para la fermentación
durante la etapa c se ha fermentado para obtener etanol.
Preferiblemente al menos el 50% en peso, en concreto al menos el
55% en peso o al menos el 60% en peso, de los monosacáridos
disponibles, en concreto hexosas y pentosas, formados durante la
hidrólisis se fermentan para obtener etanol antes de la adición de
la fracción líquida. La fracción concentrada de hemicelulosa se
añade entonces durante un periodo de tiempo de 10 minutos a 48
horas, preferiblemente de aproximadamente 15 min. a 24 horas, tiempo
después del cual continúa la fermentación durante de 6 a 72 horas
más, preferiblemente de 8 a 48 horas, a una temperatura de
30-70ºC y a un pH de 4 a 6.
Como resultado del procedimiento anterior, se
obtiene una mezcla de fermentación que generalmente contiene
aproximadamente del 0,5 al 10%, en concreto aproximadamente del 1,5
al 8%, en peso de etanol. El rendimiento (calculado a partir de los
carbohidratos disponibles) es del 80% en peso o más, en concreto del
85% en peso o más.
La destilación y deshidratación del etanol se
lleva a cabo con técnicas convencionales o nuevas.
Las etapas de hidrólisis enzimática
anteriormente mencionadas se llevan a cabo con mezclas de enzimas
celulasas. Las mezclas están compuestas, en concreto, por los tres
principales tipos de enzimas: celobiohidrolasas (CBH),
endoglucanasas (EG) y a-glucosidasas. Además, las
mezclas pueden contener otras enzimas hidrolíticas, tales como las
hemicelulasas. La composición de las mezclas de enzimas se optimiza
para hidrolizar los carbohidratos, especialmente la celulosa, de
forma eficaz para obtener azúcares monoméricos. Por esto, las
celobiohidrolasas son necesarias para actuar en la parte cristalina
de la celulosa, las endoglucanasas principalmente en la parte
amorfa de la celulosa y las beta-glucosidasas para
eliminar la celobiosa de las mezclas de hidrólisis, porque la
celobiosa inhibe la acción de las enzimas CBH debido a la inhibición
del producto final. Los mecanismos de hidrólisis son muy conocidos
y son descritos con más detalle, por ejemplo, por Teeri (1997). Las
actuales preparaciones enzimáticas comerciales de celulasas se
obtienen principalmente a partir de hongos (por ejemplo,
Trichoderma, Aspergillus). Las propiedades de las mezclas se pueden
mejorar o adecuar a condiciones específicas usando procedimientos
biotecnológicos. Las mezclas se pueden modificar para contener
nuevas proteínas celulasas derivadas de otros organismos usando
procedimientos de ingeniería genética, o se pueden mejorar las
propiedades de las actuales proteínas celulasas mediante ingeniería
de proteínas.
(Teeri, T. (1997) Crystalline cellulose
degradation: new insight into the function of cellobiohydrolases.
TIBTECH 15 (Mayo 1997), pág. 161-167).
Los siguientes ejemplos no limitativos ilustran
adicionalmente la invención:
\vskip1.000000\baselineskip
Se pretrató con vapor madera blanda y se dividió
en dos fracciones: una fracción sólida que contenía principalmente
celulosa y una fracción soluble que contenía principalmente los
azúcares de la hemicelulosa y los compuestos inhibidores. La
fracción sólida se filtró, se lavó y se suspendió para formar una
suspensión de fibras con el 14,4% de materia seca. La fibra se pre
hidrolizó usando preparaciones enzimáticas comerciales (Celluclast
1,5 L FG, 20 FPU/g en peso en seco y Novozym 188, dosis de
beta-glucosidasa de 200 nkat/g en peso en seco) a
50ºC durante de 2 a 20 horas.
Durante la hidrólisis, se hidrolizó el 74% de la
celulosa de la fibra para obtener glucosa que estaba presente en la
fracción líquida en una concentración de 46 g/l. Además, la parte
líquida contenía pequeñas cantidades de otros azúcares
fermentables: 0,1 g/l de manosa, 0,03 g/l de galactosa y 0,04 g/l de
xilosa. La viscosidad de la fracción sólida disminuyó rápidamente
durante la hidrólisis y las propiedades de mezclado mejoraron
claramente ya en las primeras 2 horas de hidrólisis, creando
características de procesado más favorables de la suspensión de
fibras.
La madera blanda pretratada con vapor también se
trató directamente con enzimas, de forma similar a como se
describió anteriormente, pero sin separación de la fracción de
azúcares de hemicelulosa y sin lavado. En este caso el porcentaje
de hidrólisis fue solo del 11% del obtenido con fibra lavada (se
hidrolizó el 8% de celulosa de la fibra), indicando que la fase de
prehidrólisis es claramente más eficaz en el caso de que la fracción
de hemicelulosa se separe de la fibra antes de la
prehidrólisis.
Cuando se llevó a cabo el correspondiente
experimento de hidrólisis con menor contenido de fibra (el 2% de
materia seca), el porcentaje de hidrólisis con fibra no lavada fue
mejor: el 66% del porcentaje de la hidrólisis con fibra lavada.
Esto indica que la inhibición de enzimas por el filtrado de
hemicelulosa se vuelve claramente más fuerte cuando se aumenta el
contenido de fibra. Por tanto, la separación del filtrado de
hemicelulosa de la fibra es muy importante para una hidrólisis
eficaz en la fase de prehidrólisis en procedimientos a alta
consistencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Se pretrató con vapor madera blanda y se dividió
en dos fracciones: una fracción sólida que contenía principalmente
celulosa y una fracción soluble que contenía principalmente los
azúcares de la hemicelulosa. La fracción sólida se filtró, se lavó
y se suspendió para formar una suspensión de fibras con el 14,5% de
materia seca. La fibra se prehidrolizó usando preparaciones
enzimáticas comerciales a 50ºC. Las condiciones de hidrólisis
fueron: 13,3% de sólidos en peso en seco en un tampón acetato, pH
5; las preparaciones enzimáticas usadas fueron Celluclast 1,5 L FG,
20 FPU/g en peso en seco y Novozym 188, con una dosis de
beta-glucosidasa de 200 nkat/g en peso en seco.
Después de 20 horas, el prehidrolizado se enfrió hasta 30ºC y se
inoculó con la levadura (cepa
VTT-B-03339) suspendida con
nutrientes antes de la inoculación al 10% en volumen (de
prehidrolizado) respecto al agua. El tratamiento de referencia se
llevó a cabo en las mismas condiciones, pero la levadura se inoculó
al principio del procedimiento inmediatamente después de la adición
de las enzimas.
El experimento con prehidrólisis y el
tratamiento de referencia produjeron una concentración de etanol de
25 g/l,
correspondiente a un rendimiento de etanol del 81% del teórico. Por tanto, la prehidrólisis fue tan buena como la hidrólisis independiente en términos de producción de etanol en el procedimiento y, además, produjo mejores propiedades de mezclado con menor demanda de energía.
correspondiente a un rendimiento de etanol del 81% del teórico. Por tanto, la prehidrólisis fue tan buena como la hidrólisis independiente en términos de producción de etanol en el procedimiento y, además, produjo mejores propiedades de mezclado con menor demanda de energía.
Se pretrató con vapor madera blanda y se dividió
en dos fracciones: una fracción sólida que contenía principalmente
celulosa y una fracción soluble que contenía principalmente los
azúcares de la hemicelulosa. La fracción sólida se filtró, se lavó
y se suspendió para formar una suspensión de fibras con el 18% de
materia seca. La fibra se prehidrolizó usando preparaciones
enzimáticas comerciales a 50ºC. Las condiciones de hidrólisis
fueron: 16,2% de sólidos en peso en seco en un tampón acetato, pH
5; las preparaciones enzimáticas usadas fueron Celluclast 1,5 L FG,
20 FPU/g en peso en seco y Novozym 188, con una dosis de
beta-glucosidasa de 200 nkat/g en peso en seco.
Después de la prehidrólisis se había hidrolizado aproximadamente el
20% de la celulosa en la fracción de fibra para obtener
glucosa.
Después de 20 horas, el prehidrolizado se enfrió
hasta 30ºC y se inoculó con la levadura (cepa
VTT-B-03339) suspendida con
nutrientes antes de la inoculación a aproximadamente el 10% en
volumen (de prehidrolizado) respecto al agua.
El filtrado de hemicelulosa que contenía
compuestos inhibidores y tóxicos para la levadura se añadió:
a) bien al principio de la hidrólisis
(produciendo un 13,3% de sólidos en peso en seco en la
hidrólisis).
b) o bien al principio de la fermentación al
mismo tiempo que la levadura, o
c) mediante dos adiciones consecutivas después
del principio de la fermentación.
El tratamiento de referencia se llevó a cabo
usando el material pretratado con vapor no lavado que contenía la
fracción de hemicelulosa, es decir, el material sin separación de la
fracción de hemicelulosa y sin lavado.
Las concentraciones de etanol producido en la
fermentación con levadura fueron, en los diferentes casos: a) 0,2%,
b) 2,6% y c) 3,2%. El tratamiento de referencia produjo solo el
0,15% de etanol. Los azúcares del filtrado añadido solo se
utilizaron parcialmente en el caso b), mientras que la mayor parte
de los mismos se consumió en el caso c). Los resultados indican que
la adición gradual del filtrado tóxico en la etapa anterior de la
fermentación mejoró los rendimientos y los porcentajes de
producción. Debido a la toxicidad del filtrado, disminuyeron los
porcentajes tanto de la hidrólisis como de la fermentación.
\vskip1.000000\baselineskip
El filtrado de hemicelulosa se separó de la
fibra de abeto y se concentró 4,8 veces mediante evaporación al
vacío a 60-65ºC. El filtrado se analizó antes y
después de la concentración por HPLC para monosacáridos y diversos
compuestos inhibidores: ácido acético, furfural y
5-hidroximetilfurfural (5-HMF).
Durante la evaporación el furfural se extrajo
del filtrado (siendo la cantidad inferior al límite de detección de
la HPLC en el concentrado). En la concentración por evaporación, la
cantidad de ácido acético se redujo en un 67% y la cantidad de
5-HMF se redujo en un 12%. Por tanto, la cantidad de
diversos compuestos inhibidores se puede reducir o se pueden
eliminar del filtrado de hemicelulosa por evaporación, llevada a
cabo para concentrar el filtrado de hemicelulosa antes de su
adición al procedimiento de fermentación.
\vskip1.000000\baselineskip
Todo el procedimiento se ensayó en condiciones
de elevada consistencia de sólidos en peso en seco (13% en peso en
la fase de prehidrólisis) con la adición de la fracción concentrada
de hemicelulosa (concentración de azúcares del 27%) durante la fase
de SSF. El experimento se llevó a cabo en un fermentador de
laboratorio con control de pH y temperatura y un mezclado eficaz de
la suspensión. El experimento comenzó con una consistencia del 13%,
con la etapa de prehidrólisis a 50ºC (adición de enzima como se
describió en el ejemplo 2) y continuó durante 24 horas. Después de
la prehidrólisis se había hidrolizado el 60% de la celulosa en la
fracción de fibra para obtener glucosa.
La temperatura del fermentador se disminuyó
entonces hasta 30ºC, se añadieron nutrientes adecuados y el
fermentador se inoculó con la levadura fermentadora de pentosas
(cepa VTT-B-03339). Los azúcares
producidos en la hidrólisis se consumieron rápidamente y la
hidrólisis y fermentación simultáneas continuaron. Después de 24
horas desde la inoculación de levadura comenzó la adición de la
fracción concentrada de hemicelulosa, la destoxificación y la
concentración por evaporación (hasta aproximadamente el 20% del
volumen original) y continuó durante aproximadamente 25 horas.
Cuando se completó la fermentación, la
concentración de etanol era del 4,5% correspondiente a un
rendimiento teórico de aproximadamente el 90% de los carbohidratos
en la materia prima. La mayor parte de los azúcares del filtrado
también se utilizó: por ejemplo, el uso total de manosa y glucosa
fue del 92% y el 95%, respectivamente, de toda la manosa o glucosa
presente en las materias primas. El procedimiento produjo así una
concentración y un rendimiento elevados de etanol y facilitó la
utilización de los azúcares de la fracción de hemicelulosa.
Claims (27)
1. Un procedimiento para producir etanol a
partir de una materia prima lignocelulósica fibrosa, que
comprende
a) la conversión de la materia prima en una
fracción lignocelulósica sólida con una mayor concentración de
celulosa y una fracción líquida que contiene principalmente
hemicelulosas solubilizadas;
b) la hidrólisis del material lignocelulósico
fibroso con alta consistencia con una enzima celulasa para
proporcionar un material lignocelulósico modificado con mayor
fluidez;
c) el sometimiento simultáneo del material
lignocelulósico modificado a una hidrólisis continúa con una
celulasa y a una fermentación para obtener etanol en una mezcla de
fermentación;
d) la continuación de la fermentación para
convertir una gran parte de los carbohidratos disponibles en
etanol;
e) la adición de la fracción líquida que
contiene las hemicelulosas solubilizadas a la mezcla de fermentación
y la continuación de la fermentación; y
f) la recuperación del etanol de la mezcla de
fermentación.
2. El procedimiento según la reivindicación 1,
en el que la materia prima se somete a una explosión por vapor en
la etapa a.
3. El procedimiento según la reivindicación 1 ó
2, en el que la hidrólisis de la etapa b se lleva a cabo a una
temperatura de 40-90ºC durante de 0,5 a 24
horas.
4. El procedimiento según la reivindicación 3,
en el que la hidrólisis de la etapa b se lleva a cabo con una
consistencia de 10-25% en peso en seco.
5. El procedimiento según la reivindicación 3 ó
4, en el que la hidrólisis de la etapa b se lleva a cabo a un pH en
el intervalo de 4 a 6.
6. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 5, en el que la hidrólisis de la etapa b se
lleva a cabo con una primera preparación de celulasas y la
hidrólisis de la etapa c se lleva a cabo con una segunda
preparación de celulasas, siendo dichas celulasas primera y segunda
diferentes.
7. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la enzima usada en la etapa
b tiene un amplio espectro de celulasas y es activa a temperaturas
en el intervalo de 30 a 90ºC.
8. El procedimiento según la reivindicación 7,
en el que la enzima tiene al menos dos actividades seleccionadas
del grupo constituido por actividades celobiohidrolasa, actividades
endoglucanasa, actividades beta-glucosidasa y
actividades hemicelulasa.
9. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la hidrólisis de la etapa b
se lleva a cabo a una temperatura mayor que la hidrólisis y
fermentación de la etapa c.
10. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que la etapa c se lleva a cabo a una
temperatura en el intervalo de 30 a 70ºC.
11. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la enzima usada en la etapa
c tiene un amplio espectro de celulasas y es activa a temperaturas
de 30 a 90ºC.
12. El procedimiento según la reivindicación 11,
en el que la enzima tiene al menos dos actividades seleccionadas
del grupo constituido por actividades celobiohidrolasa, actividades
endoglucanasa, actividades beta-glucosidasa y
actividades hemicelulasa.
13. El procedimiento según la reivindicación 11
ó 12, en el que la enzima usada en de la etapa c es capaz de
hidrolizar el material lignocelulósico presente en las etapas c a
e.
14. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la etapa de fermentación se
lleva a cabo en presencia de un organismo fermentador, capaz de
fermentar los principales azúcares derivados de la lignocelulosa,
es decir, hexosas y pentosas.
15. El procedimiento según la reivindicación 14,
en el que el organismo fermentador es capaz de producir etanol a
partir de los principales azúcares derivados de la lignocelulosa a
una temperatura de 30-70ºC.
\newpage
16. El procedimiento según la reivindicación 14
ó 15, en el que el organismo fermentador es una levadura, capaz de
producir etanol a partir de los principales azúcares derivados de la
lignocelulosa.
17. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la fermentación se lleva a
cabo a una temperatura de 30-70ºC y la hidrólisis
continúa con una segunda enzima, que es activa a esta temperatura
durante un tiempo de reacción de 6 a 96 horas.
18. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la fracción líquida que
contiene hemicelulosas disueltas se añade a la mezcla de
fermentación cuando al menos el 50% en peso de las hexosas y
pentosas disponibles se han fermentado para obtener etanol.
19. El procedimiento según la reivindicación 18,
en el que la concentración de la fracción líquida aumenta después
de la etapa a y antes de la etapa d.
20. El procedimiento según la reivindicación 19,
en el que se añade la fracción de hemicelulosa con una concentración
en peso en seco del 5-60%.
21. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la fracción líquida se
somete a una operación de destoxificación para liberar la fracción
de hemicelulosa de sustancias que pueden inhibir la
fermentación.
22. El procedimiento según la reivindicación 21,
en el que los inhibidores se eliminan mediante separación,
evaporación, exclusión iónica, resinas o el procedimiento de
tratamiento con carbón.
23. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 18 a 22, en el que la fracción concentrada de
hemicelulosa se añade durante un periodo de tiempo de 10 minutos a
48 horas, tiempo después del cual continúa la fermentación durante
de 6 a 72 horas más a una temperatura de 30-70ºC y a
un pH de 4 a 6.
24. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que las enzimas primera y
segunda tienen el mismo origen y están diseñadas para una hidrólisis
eficaz del material lignocelulósico en todo el procedimiento
constituido por las etapas b a e.
25. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la materia prima
lignocelulósica proviene de madera blanda, madera dura, cultivos
dedicados, desechos agrícolas, papel usado o un flujo secundario de
la industria forestal.
26. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, que comprende
- la hidrólisis del material lignocelulósico
fibroso con una consistencia del 10 al 40% en peso en seco con una
enzima celulasa para hidrolizar aproximadamente del 20 al 80% de los
carbohidratos para proporcionar un material lignocelulósico
modificado que contiene hexosas y pentosas, teniendo dicho material
mayor fluidez;
- el sometimiento simultáneo del material
lignocelulósico modificado a una hidrólisis continua con una
celulasa y a una fermentación de las hexosas y pentosas para
obtener etanol en una mezcla de fermentación;
- la adición de la fracción líquida que contiene
hemicelulosas solubilizadas a la mezcla de fermentación cuando al
menos el 50% en peso de las hexosas y pentosas disponibles se hayan
fermentado para obtener etanol y la continuación de la
fermentación; y
- la recuperación del etanol de la mezcla de
fermentación.
27. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 26, en el que la materia prima lignocelulósica
fibrosa contiene carbohidratos.
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