CN105543160A - 一种分离大白菜不同发育阶段小孢子的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种分离大白菜不同发育阶段小孢子的方法，通过精确配制percoll分离液，将大白菜小孢子粗提液置于顶层，通过150rpm低速离心，分离到不同发育阶段小孢子。不同发育阶段的小孢子与空泡等细胞器的形成关系密切，往往表现在相对密度上的差异。故可通过percoll密度梯度离心法实现不同发育阶段小孢子的分离。本发明可高效、稳定地分离不同发育阶段的小孢子，克服了利用传统形态学指标：瓣药比、花蕾长度等在实验中的不易把握的缺点，解决了体外制备相近发育阶段小孢子细胞的问题，可为大白菜小孢子培养的机理研究提供材料及为基因枪介导的大白菜遗传转化提供受体。

Description

一种分离大白菜不同发育阶段小孢子的方法

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种分离大白菜不同发育阶段小孢子的方法。

背景技术

随着十字花科作物游离小孢子培养技术日渐成熟，小孢子胚胎发生机理研究正成为热点，但是分离处在特定发育阶段的小孢子的方法至今未能成功解决；目前随着功能基因组学的发展，遗传转化体系的构建越发重要，大白菜再生体系构建困难，目前研究者正开始采用小孢子培养与细胞渗透肽与基因枪结合转化，小孢子因其是单倍体，在胚胎发生和再生成苗过程中会自然加倍，所以转化后获得的是纯和的转基因植株，因此已经成为重要的转化受体细胞。然而，传统的小孢子分离流程中，对发育时期的选择依赖于瓣药比、花蕾长度、萼片颜色等形态指标，在具体实验中，通过形态指标判定，不同研究者经验标准不同，具体标准很难一致，所以重复性难以保障。

发明内容

本发明的目的在于提供一种分离出不同发育阶段大白菜小孢子的方法，替代传统的形态指标，可为小孢子胚胎发生机理研究及单倍体遗传转化制备受体细胞。

经研究发现，不同发育阶段的小孢子与空泡等细胞器的形成关系密切。而空泡的发育会表现在细胞相对密度上的差异。故可通过percoll密度梯度离心法实现不同发育阶段小孢子的分离。为下游转化实验提供更为一致的受体细胞，保障实验的重复性。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

制备28%(V/V)~75%(V/V)percoll分离液，将小孢子粗提液置于分离液顶层，150rpm低速离心后，不同发育阶段的小孢子分布在percoll的不同密度层中。

上述用于分离不同发育阶段大白菜小孢子的percoll密度梯度分离法，包括以下步骤：

（1）取percoll原液，配成含有13%(m/v)的蔗糖的percoll母液，再按照体积比将percoll母液与浓度为13%(m/v)的蔗糖溶液配制成28%(V/V)、50%(V/V))percoll分离液。

（2）取步骤（1）750uL的50%(V/V)percoll分离液，置于2ml离心管底部，再小心地添加28%(V/V)percoll分离液。

（3）将步骤（2）中制备的percoll分离液在4℃条件下静置3h，形成稳定的分离工作液。

（4）将20蕾对应的小孢子粗提液200uL加入步骤（3）的percoll分离工作液顶层，低速离心40min，离心结束后取出样品管。分布在50%(V/V)percoll分离液中与28%(V/V)percoll分离液中的小孢子发育时期分别为单核中期与单核早期。

（5）将步骤（4）所得的小孢子小心抽出，悬浮于13%(m/v)的NLN液体培养基中，在4℃迅速离心25min，离心机转数为150rpm，所得沉淀即为纯化后去除percoll的大白菜小孢子，可作为遗传转化试验受体。

附图说明

图1为分离液状态示意图；图1A中的标号1为28%(V/V)percoll分离液；图1A中的标号2为50%(V/V)percoll分离液；图1B中的标号3为稳定的分离工作液。

图2为小孢子提取液层示意图；图2A中的标号1为小孢子粗提液层；图2B中的标号2为分离到的单核中期的小孢子层；图2B中的标号3为分离到的单核早期的小孢子层。

具体实施方式

以下实施例中，大白菜小孢子采自沈阳农业大学园艺学院试验田；percoll原液购自sigma试剂公司。

实施事例1

试材准备

1.将大白菜种子催芽，露白后，2～4℃低温处理20天，在温室中将萌动种子播于穴盘，在开花期取材。

2.小孢子粗提液制备

选取花瓣长度/花药长度在0.5-0.75之间的花蕾，流水冲洗30min，放入灭过菌的小烧杯内，经70%乙醇溶液表面消毒30s后，用0.1%(m/v)HgCl₂溶液消毒8min，无菌水洗涤3次，每次5min。加8-10mL含13%(m/v)蔗糖的B5液体培养基,用无菌研棒挤压花蕾，挤出小孢子。含小孢子的悬浮液用400目孔径的尼龙网过滤，收集滤液于10mL离心管中，1000rpm离心3min。

3.不同时期小孢子分离

（1）取percoll原液，配成含有13%(m/v)的蔗糖的percoll母液，再按照体积比将percoll母液与浓度为13%(m/v)的蔗糖溶液配制成28%(V/V)、50%(V/V))percoll分离液。

（2）取步骤（1）750uL的50%(V/V)percoll分离液，置于2ml离心管底部（图1A中的标号2），再小心地添加28%(V/V)percoll分离液750uL（图1A中的标号1）。

（3）将步骤（2）中制备的percoll分离液在4℃条件下静置3h，形成稳定的分离工作液（图1B中的标号3)。

（4）将约20蕾对应的小孢子粗提液200uL(图2A中的标号1)加入步骤（3）的percoll分离工作液顶层，低速离心40min，离心结束后取出样品管。分布在50%(V/V)percoll分离液中与28%(V/V)percoll分离液中的小孢子发育时期分别为单核中期(图2B中的标号2)与单核早期(图2B中的标号3)。

（5）将步骤（4）所得的小孢子小心抽出，悬浮于13%(m/v)的NLN液体培养基中，在4℃迅速离心25min，离心机转数为150rpm，所得沉淀即为纯化后去除percoll的大白菜小孢子，可作为遗传转化试验受体。

Claims (2)

1.一种分离大白菜不同发育阶段小孢子的方法，其特征在于：制备28%(V/V)~50%(V/V)percoll分离液，将小孢子粗提液置于分离液顶层，150rpm低速离心后，不同发育阶段的小孢子分布在percoll的不同密度层中。

2.根据权利要求1所述的分离大白菜不同发育阶段小孢子的方法，其特征在于包括以下具体步骤：

（1）取percoll原液，配成含有13%(m/v)的蔗糖的percoll母液，再按照体积比将percoll母液与浓度为13%(m/v)的蔗糖溶液配制成28%(V/V)、50%(V/V))percoll分离液；

（2）取步骤（1）750uL的50%(V/V)percoll分离液，置于2ml离心管底部，再小心地添加28%(V/V)percoll分离液750uL；

（3）将步骤（2）中制备的percoll分离液在4℃条件下静置3h，形成稳定的分离工作液；

（4）将20蕾对应的小孢子粗提液200uL加入步骤（3）的percoll分离工作液顶层，低速离心40min，离心结束后取出样品管；

分布在50%(V/V)percoll分离液中与28%(V/V)percoll分离液中的小孢子发育时期分别为单核中期与单核早期；

（5）将步骤（4）所得的小孢子小心抽出，悬浮于13%(m/v)的NLN液体培养基中，在4℃迅速离心25min，离心机转数为150rpm，所得沉淀即为纯化后去除percoll的大白菜小孢子，可作为遗传转化试验受体。