CN105314739A - 一种微生物溶藻制剂同步脱氮、脱有机物的方法 - Google Patents

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程凯
刘君艳
赵以军
田小方
李祝
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Abstract

本发明公开了一种微生物溶藻制剂同步脱氮、脱有机物的方法。本发明方法包括如下步骤：（1）将溶藻微生物进行发酵培养，离心收集发酵液；（2）去除发酵液中的水分；（3）用有机溶剂萃取去除水分的发酵产物，用超纯水溶解萃取物；（4）将超纯水溶解的萃取物加到硅胶柱中，用有机溶剂收集馏分，将收集的馏分干燥后再用超纯水溶解；所述的溶藻微生物为赤潮异弯藻溶藻细菌假单胞菌F5-2。本发明可以有效去除溶藻微生物发酵液中的氮和有机物（去除率超过98%），同时对溶藻活性无负面影响；经过本发明处理的微生物溶藻制剂由于氮、有机物含量极低，从而不会加重水体富营养化。

Description

一种微生物溶藻制剂同步脱氮、脱有机物的方法
技术领域
本发明涉及微生物溶藻技术，具体涉及一种微生物溶藻制剂同步脱氮、脱有机物的方法。
背景技术
微生物溶藻技术代表了未来溶藻技术的发展方向。但由于微生物发酵的培养基富含氮、有机物营养物质，如果直接向水体中投加，势必会大幅度增加水体的营养物质含量，甚至可能加重富营养化。因此，采用发酵法生产的微生物溶藻制剂必须有效去除这些营养物质后才能在自然水体中使用，同时还要满足去除营养物质的工艺措施对溶藻效果不会带来影响。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种微生物溶藻制剂同步脱氮、脱有机物的方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种微生物溶藻制剂同步脱氮、脱有机物的方法，包括如下步骤：
(1)将溶藻微生物进行发酵培养，离心收集发酵液。
(2)去除发酵液中的水分。
(3)用有机溶剂萃取去除水分的发酵产物，用超纯水溶解萃取物。
(4)将超纯水溶解的萃取物加到硅胶柱中，用有机溶剂收集馏分，将收集的馏分干燥后再用超纯水溶解。
步骤(1)中所述的溶藻微生物优选为赤潮异弯藻溶藻细菌假单胞菌F5-2(赤潮异弯藻溶藻细菌假单胞菌F5-2已在文献“徐玲玲，一株赤潮异弯藻溶藻细菌的分离与溶藻特性研究，华中师范大学硕士学位论文2010”中公开)，F5-2发酵培养的条件优选为：在30℃恒温，170rpm转速，接种比5％的条件下于牛肉膏蛋白胨液体培养基中振荡培养24h；牛肉膏蛋白胨液体培养基配方为：蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl5g，加单蒸水至1L。
步骤(2)去除发酵液中的水分的方法只要不影响发酵产物溶藻活性即可，如冷冻干燥、喷雾干燥、减压蒸发等。
步骤(3)中的有机溶剂为能够萃取出溶藻活性物质的极性小的有机溶剂，如乙醇、甲醇、丙酮、氯仿、石油醚等。
步骤(4)中所述的硅胶柱优选为通过湿法装柱得到；所述的硅胶的粒度优选为200～300目。
步骤(4)中所述的有机溶剂优选为无水乙醇。
更优选的，一种微生物溶藻制剂同步脱氮、脱有机物的方法，包括如下步骤：
(1)将溶藻微生物进行发酵培养，离心收集发酵液。
(2)将发酵液冷冻干燥得到干粉。
(3)往干粉中加入无水乙醇，充分搅拌，离心收集上清液；重复数次，合并上清液旋干后用超纯水溶解。
(4)将(3)中超纯水溶解的溶液加到硅胶柱中，用无水乙醇收集馏分，将收集的馏分旋蒸蒸干后再用超纯水溶解。
步骤(3)中所述的干粉与无水乙醇的质量体积比优选为1:10(g/mL)；所述的旋干优选为于40℃旋干；所述的干粉与超纯水的质量体积比优选为2:1(g/mL)。
步骤(4)优选为：取200～300目硅胶，加入适量无水乙醇，搅拌排气泡；先在柱内加适量乙醇，然后将硅胶乙醇混合物加入柱内，待沉降完全后加(3)中超纯水溶解的溶液，以无水乙醇做为流动相进行洗脱，将收集的馏分旋蒸蒸干再用超纯水溶解。
本发明相对于现有技术具有如下优点和效果：发酵得到的溶藻微生物发酵液由于其主要成分为微生物发酵培养基，因此氮、有机物含量极高，直接向水体中投加将增加水中的营养物浓度，从而加重水体富营养化，本发明可以有效去除溶藻微生物发酵液中的氮和有机物(去除率超过98％)，同时对溶藻活性无负面影响。
附图说明
图1是实施例1发酵液的溶藻效果图。
图2是实施例2干粉的溶藻效果图。
图3是实施例3固相萃取后样液的溶藻效果图。
图4是实施例4馏分的溶藻效果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述。应理解，下面的实施例仅用于说明本发明而不用于限制本本发明的范围。
下述实施例中所用到的菌种及藻种：
菌种是从武汉东湖湖岸土壤中分离得到赤潮异弯藻溶藻细菌假单胞菌F5-2(赤潮异弯藻溶藻细菌假单胞菌F5-2已在文献“徐玲玲，一株赤潮异弯藻溶藻细菌的分离与溶藻特性研究，华中师范大学硕士学位论文2010”中公开，申请人保证自该专利的申请日起在公众向国家管理部门申请获得批准后，可在二十年内要申请人提供该生物材料)。培养条件：在30℃恒温，170rpm转速，接种比例5％(发酵液体积100mL，置于500mL三角瓶中)条件下于牛肉膏蛋白胨液体培养基中振荡培养24h；牛肉膏蛋白胨液体培养基配方为：蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl5g，加单蒸水至1L。
藻种是海洋异弯藻(Heterosigmaakashiwo)，由中国海洋大学微藻库提供。培养条件：20℃恒温，2000lux光照强度下用f/2液体培养基培养，光暗比12h:12h，接种比例5％(藻液体积100mL，置于250mL三角瓶中)，该条件下培养10天后进行溶藻试验。
实施例1F5-2发酵液的制备及其溶藻效果
取培养1天的F5-2发酵液10000rpm离心10min收集发酵液上清。再按照体积比(V/V)1:10和1:20将发酵液加入装有5mL海洋异弯藻藻液(藻细胞密度为4×106/mL)的试管中，每组设置3个平行，同时设置CK组(空白对照组)，于20℃恒温光照(2000lux)培养箱培养，光暗比12h:12h，5天后观察溶藻效果，并通过对藻细胞进行计数测定溶藻活性，结果见图1和表2。
实施例2F5-2发酵液干粉的制备及其溶藻效果
取培养1天的F5-2发酵液约10L，然后冷冻干燥得到干粉约100g。
取干粉0.1g，加1mL水溶解，然后按1:100、1:200分别加入装有5mL海洋异弯藻藻液(藻细胞密度为4×106/mL)的试管中(相当于F5-2发酵液与海洋异弯藻藻液的体积比为1:10、1:20)，每组设置3个平行，同时设置CK组(空白对照组)，于20℃恒温光照(2000lux)培养，光暗比12h:12h，在第5天观察溶藻效果，并通过对藻细胞进行计数测定溶藻活性，结果见图2和表2。
实施例3F5-2发酵液干粉的固相萃取及溶藻实验
取实施例2的F5-2发酵液干粉16g，加入160mL无水乙醇，用玻璃棒搅拌，搅拌一定时间后倒出溶液然后进行离心，再次加入160mL的无水乙醇，重复上述步骤，最后将三次收集得到的样液于40℃旋干，用超纯水定容至8mL得到溶藻粗提物。
粗提物的溶藻实验：将溶藻粗提取物按照体积比1:2000、1:4000分别加入装有5mL海洋异弯藻藻液(藻细胞密度为4×106/mL)的试管中(相当于F5-2发酵液与海洋异弯藻藻液的体积比为1:10、1:20)，每组设置三个平行，同时设置CK组(空白对照组)，于20℃恒温光照(2000lux)培养，光暗比12h:12h，5天后观察溶藻效果，并通过对藻细胞进行计数测定溶藻活性，结果见图3和表2。
实施例4固相萃取后样液进柱层析及馏分的溶藻实验
湿法装柱：准确称取80g200～300目硅胶，加入适量无水乙醇，搅拌排气泡；先在柱内加适量乙醇，然后将硅胶乙醇混合物加入柱内，待沉降完全后加实施例3的溶藻粗提物5mL，以无水乙醇做为流动相进行洗脱，所得洗脱液每30mL收集一馏分，共收集10馏分，然后将馏分旋蒸蒸干，用超纯水定容至5mL。
馏分的溶藻实验：将定容后的样液按照体积比1:2000、1:4000分别加入装有5mL海洋异弯藻藻液(藻细胞密度为4×106/mL)的试管中(相当于F5-2发酵液与海洋异弯藻藻液的体积比为1:10、1:20)，每组设置三个平行，同时设置CK组(空白对照组)，用F5-2发酵液与海洋异弯藻藻液按体积比为1:10、1:20混合作为阳性对照，于20℃恒温光照(2000lux)培养，光暗比12h:12h，5天后观察溶藻效果，并通过对藻细胞进行计数测定溶藻活性。因为只有C5号馏分及阳性对照组有溶藻效果，故其余的没有计数，结果见图4和表2。
实施例5发酵液、固相萃取、进柱层析后样液的TN(总氮)和TOC(总有机碳)的测定
经过换算，取0.5mL的固相萃取样液和进柱层析后的馏分，稀释至与发酵液上清相当的体积，测定各样品中的TN与TOC含量，结果见表1。
表1.各样液的TN和TOC
进一步比较各阶段产物的溶藻效率及TOC、TN残留率，结果见表2。
表2.各阶段产物的溶藻效率及TOC、TN残留率
由上述的溶藻效果及TN、TOC结果可以看出，溶藻活性物质在本发明脱氮、脱有机物的工艺下，TN及TOC大幅度减少(去除率超过98％)，且溶藻活性略微升高。

Claims (10)

1.一种微生物溶藻制剂同步脱氮、脱有机物的方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）将溶藻微生物进行发酵培养，离心收集发酵液；
（2）去除发酵液中的水分；
（3）用有机溶剂萃取去除水分的发酵产物，用超纯水溶解萃取物；
（4）将超纯水溶解的萃取物加到硅胶柱中，用有机溶剂收集馏分，将收集的馏分干燥后再用超纯水溶解。
2.根据权利要求1所述的微生物溶藻制剂同步脱氮、脱有机物的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的溶藻微生物为赤潮异弯藻溶藻细菌假单胞菌F5-2。
3.根据权利要求2所述的微生物溶藻制剂同步脱氮、脱有机物的方法，其特征在于：所述的假单胞菌F5-2发酵培养的条件为：在30℃恒温，170rpm转速，接种比5%的条件下于牛肉膏蛋白胨液体培养基中振荡培养24h；所述的牛肉膏蛋白胨液体培养基的配方为：蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl5g，加单蒸水至1L。
4.根据权利要求1所述的微生物溶藻制剂同步脱氮、脱有机物的方法，其特征在于：步骤（2）去除发酵液中的水分的方法为冷冻干燥、喷雾干燥或减压蒸发。
5.根据权利要求1所述的微生物溶藻制剂同步脱氮、脱有机物的方法，其特征在于：步骤（3）中的有机溶剂为乙醇、甲醇、丙酮、氯仿或石油醚。
6.根据权利要求1所述的微生物溶藻制剂同步脱氮、脱有机物的方法，其特征在于：步骤（4）中所述的硅胶的粒度为200～300目。
7.根据权利要求1所述的微生物溶藻制剂同步脱氮、脱有机物的方法，其特征在于：步骤（4）中所述的有机溶剂为无水乙醇。
8.根据权利要求1所述的微生物溶藻制剂同步脱氮、脱有机物的方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）将溶藻微生物进行发酵培养，离心收集发酵液；
（2）将发酵液冷冻干燥得到干粉；
（3）往干粉中加入无水乙醇，充分搅拌，离心收集上清液；重复数次，合并上清液旋干后用超纯水溶解；
（4）将（3）中超纯水溶解的溶液加到硅胶柱中，用无水乙醇收集馏分，将收集的馏分旋蒸蒸干后再用超纯水溶解。
9.根据权利要求8所述的微生物溶藻制剂同步脱氮、脱有机物的方法，其特征在于：步骤（3）中所述的干粉与无水乙醇的质量体积比为1:10（g/mL）；所述的旋干为于40℃旋干；所述的干粉与超纯水的质量体积比为2:1（g/mL）。
10.根据权利要求8所述的微生物溶藻制剂同步脱氮、脱有机物的方法，其特征在于：步骤（4）为：取200～300目硅胶，加入适量无水乙醇，搅拌排气泡；先在柱内加适量乙醇，然后将硅胶乙醇混合物加入柱内，待沉降完全后加（3）中超纯水溶解的溶液，以无水乙醇做为流动相进行洗脱，将收集的馏分旋蒸蒸干再用超纯水溶解。
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