CN103060266A - 人肺泡ii型上皮细胞的分离培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人肺泡II型上皮细胞的分离培养方法，采用胰酶联合弹性蛋白酶消化分离，经过滤、差速贴壁、密度梯度离心及Anti-CD14磁珠分选纯化获得人肺泡II型上皮细胞。本发明建立了一套分离、培养及鉴定人肺泡II型上皮细胞的方法，并对用该方法培养的细胞的生物学特性维持情况进行了评估，证实该培养方法能够获得纯度很高的人肺泡II型上皮细胞，并较持久地维持细胞生特学特性，从而为进一步深入研究肺泡II型上皮细胞的增殖、分化、液体转运、合成分泌及其在肺损伤、修复等病理生理情况下的功能变化提供了可能。

Description

人肺泡II型上皮细胞的分离培养方法

技术领域

本发明属于细胞的体外培养领域，更具体地，本发明涉及一种人肺泡II型上皮细胞的分离培养方法。

背景技术

肺泡II型上皮细胞(alveolar epithelial type II cells，ATII)作为一种组织干细胞，具有十分重要的功能，主要包括5个方面：①作为渗透性屏障阻止组织间隙的大分子物质流入肺泡腔；②具有一定组织干细胞功能，在肺损伤修复过程中，除可以自身增殖外，还可分化成为肺泡I型上皮细胞和成纤维细胞；③能分泌肺泡表面活性物质；④能分泌抗炎、抗菌物质，在免疫方面起作重要作用；⑤能进行跨上皮细胞的钠离子转运，有助于肺泡液体的清除。可见对其进行体外培养研究是十分必要的。

自Dobbs等首次报道对成年大鼠肺泡II型上皮细胞提取方法以来，有许多学者进行了这方面的研究，使得该分离培养技术也更加的完善，但体外培养的ATII细胞很快失去表达表面活性质的情况仍然存在，并很快会分化为I型肺泡上皮细胞。尽管分离培养大鼠和人ATII细胞的方法，在十九世纪八十年代已有报道，且在后来的培养方法中也有所完善，然而在维持ATII细胞表型方面仍存在明显不足，如体外培养的ATII细胞很快失去表面活性物质表达特性。而肺腺癌细胞系A549又不具有分化为肺泡I型上皮细胞和成纤维细胞的潜能，失去了ATII细胞的绝大部分特征。同时也有研究表明人和动物的ATII细胞的生物学特性是有差异的，如不同物种间水通道蛋白(AQPs)表达不同。

现有的人肺泡II型上皮细胞分离培养方法是取适量手术后肺组织，剪碎成约1mm³大小后，进入消化过滤步骤，然后进行差速贴壁培养，密度梯度离心及磁珠分选纯化获得人肺泡II型上皮细胞。现有的方法中，消化步骤采用的胰酶和弹性蛋白酶浓度过高，对ATII细胞损伤较大，而且成本较高昂。差速贴壁的时间较短，为1.5h，还包括应用磁珠分选去除成纤维细胞和巨噬细胞的步骤，整个实验操作时间过长，至少需要12h工作；提取肺泡II型细胞的肺组织量仍较多，未予以充分利用；实验花费成本高昂。

由此可见，人的肺组织作为提取ATII细胞的组织来源，一方面组织来源有限，另一方面体外培养表型维持时间较短，这极大地限制了ATII细胞的体外培养，以至于国内尚未见这方面研究的报道。因此，为了研究人的ATII细胞的功能，分离纯化、体外培养人ATII细胞是十分必要的。

发明内容

基于此，本发明提供了一种新的肺泡II型上皮细胞的分离培养方法。

一种人肺泡II型上皮细胞的分离培养方法，包括以下步骤：

(1)将手术切除边缘肺组织剪碎，BSS洗涤，经细胞筛过滤，留取筛网上组织；

(2)加入25-35ml组织消化液，36-38℃消化35-55min，在后10-20分钟加入1-2ml浓度为10⁴U/mL的Dnase I；每L所述组织消化液的组成为：浓度为10⁵U/mL的胰酶2-3ml，浓度为44.5mg protein/mL的弹性蛋白酶200-500ul；

(3)加入与组织消化液相等体积的抑制液终止消化，滴管吹打，得到细胞悬液；加入BSS稀释细胞悬液，经细胞筛过滤，收取滤液，离心收集细胞；每L所述抑制液的组成为：DMEM/F-1230-60ml，FBS10-20ml、浓度为10⁴U/ml的DNase I1-2ml；

(4)采用36-38℃预热的粘附培养基重悬细胞，置于36-38℃、3-5％CO₂、相对温度90-95％的环境下培养2-3h，轻柔收取未贴壁的细胞再次差速贴壁2-3h；每L所述粘附培养基的组成为：DMEM/F-1222.5-45ml、SAGM22.5-45ml、FBS5-10ml、浓度为10⁴U/ml的DNase I1-2ml；

(5)离心收集未贴壁细胞，用DMEM/F-12重悬细胞，并吹打均匀，缓慢加入轻、重分离液的顶部，密度梯度离心；所述轻、重分离液的体积比为1∶1；所述轻、重分离液的密度分别为1.040g/ml和1.089g/ml；

(6)滴管吸出轻、重分离液界面处的细胞层，BSS洗涤；Anti-CD14MicroBeads分选去除巨噬细胞，得到分选液；

(7)离心分选液收集细胞，用36-38℃预热的含1％FBS的SAGM重悬细胞，吹打均匀后加入SAGM完全培养基中，在36-38℃、3-5％CO₂、相对温度90-95％的环境中培养55-75h后换SAGM完全培养基，去除未贴壁细胞，以后隔天换液一次，直到上层没有悬浮细胞，即得人肺泡II型上皮细胞。

在其中一个实施例中，步骤(2)中，每L所述组织消化液的组成为：浓度为10⁵U/mL的胰酶2-3ml，浓度为44.5mg protein/mL的弹性蛋白酶300ul。本发明采用胰酶加弹性蛋白酶联合消化法，一方面减少高浓度胰酶对细胞的损伤，另一方面降低弹性蛋白酶的用量，同时也可获得较高的产量。

在其中一个实施例中，步骤(3)中，所述细胞筛为串联的100目、200目和325目细胞筛。最上面设置为100目可以过滤大部分的肺组织。

在其中一个实施例中，步骤(4)中，所述再次差速贴壁的时间为2.5h。每L所述粘附培养基的组成为：DMEM/F-1222.5ml、SAGM22.5ml、FBS5ml、浓度为10⁴U/ml的DNase I1ml。

在粘附培养基中加入了10％FBS，同时将差速贴壁时间延长至2.5小时，成功去除了成维细胞、绝大部分巨噬细胞和大部分红细胞，减少了磁珠分选去除成纤维细胞的成本。

在其中一个实施例中，步骤(5)中，在4℃下，300g密度梯度离心20min。

在其中一个实施例中，步骤(7)中，在37℃、5％CO₂、相对湿度95％的环境中培养60h后换液。

在其中一个实施例中，步骤(1)中，所述细胞筛为100目。

本发明的人肺泡II型上皮细胞的分离培养方法在已有方法上作了重要改进，以人肺组织作为细胞提取的组织来源，采用胰酶加弹性蛋白酶联合消化法，一方面减少高浓度胰酶对细胞的损伤，另一方面降低弹性蛋白酶的用量，同时也可获得较高的产量。仅应用磁珠分选去除巨噬细胞，但在粘附培养基中加入了10％FBS，同时将差速贴壁时间延长至2.5小时，成功去除了成维细胞、绝大部分巨噬细胞和大部分红细胞，省去了应用磁珠分选去除成纤维细胞的步骤，可进一步降低分离成本。成纤维细胞的去除是细胞纯化的关键，如果没能成功去除，在后面的培养过程中很容易形成优势细胞群，导致细胞分离培养失败。经密度梯度离心，Anti-CD14磁珠分选以及培养60h之后进一步去除上清中未贴壁的细胞，获得的细胞纯度在98％左右。

本发明建立了一套分离、培养及鉴定人ATII细胞的方法，并对用该方法培养的细胞的生物学特性维持情况进行了评估，证实该培养方法能够获得纯度很高的人ATII细胞，并较持久地维持细胞生特学特性，从而为进一步深入研究肺泡II型上皮细胞的增殖、分化、液体转运、合成分泌及其在肺损伤、修复等病理生理情况下的功能变化提供了可能。

附图说明

图1为采用pro-SP-C免疫荧光染色法在激光共聚焦显微镜(200×)下观察人肺泡II型上皮细胞图；

图2为人肺泡II型上皮细胞与分子探针

Green DND-26共培养后，在激光共聚焦显微镜(200×)下的观察图；

图3为透射电镜(4000×)鉴定人肺泡II型上皮细胞图；

图4为倒置相差显微镜(100×；200×)观察原代培养的人肺泡II型上皮细胞图；

图5为RT-PCR监测人肺泡II型上皮细胞4种表面活性物质表达情况图。

具体实施方式

以下实施例所使用的主要材料及来源分别如下：

手术切除边缘肺组织(广州医学院第一附属医院伦理委员会的批准)；

胰酶(威佳)；弹性蛋白酶(44.5mg protein/mL，Worthington)；DMEM/F-12(1∶1，Invitrogen)；SAGM(Lonza)；FBS(HyClone)；DNase I(鼎国)；Percoll(Pharmacia)；Anti-CD14MicroBeads(Miltenyi)；

BSS(2L，NaCl16.0g，KCL0.8g，Na₂HPO₄·7H₂O0.28g，HEPES4.76g，葡萄糖2.0g，双抗100×20ml，PH7.4)

组织消化液(1L，胰酶10万U/ml2-3ml，弹性蛋白酶300ul)；

抑制液(1L，DMEM/F-1230ml，FBS10ml，DNase I10000U/ml1ml)；

粘附培养基(1L，DMEM/F-1222.5ml，SAGM22.5ml，FBS5ml，DNase I10000U/ml，1ml)

轻、重分离液(轻：1.040g/ml，1L：10×PBS4ml，Percoll10.88ml，ddH₂O25.12ml；重：1.089g/ml，1L：10×PBS4ml，Percoll25.96ml，ddH₂O10.04ml)

pro-SP-C(Millipore)；Cy3AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG(H+L)(EarthOx)；

Green DND-26(Invitrogen)；TRIzol(Invitrogen)

以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。

实施例1人肺泡II型上皮细胞的分离培养方法

参照rEhhardt等(2005)编写的方案，具体包括以下步骤：

(1)将5-8g手术切除边缘肺组织在培养皿中剪碎成约1cm³大小，BSS反复冲洗至澄清；

(2)将肺组织剪成0.6mm大小，转移至100ml烧杯中，BSS洗涤至少3次，再经100目细胞筛过滤，留取筛网上组织；

(3)将其转移至装有15ml-20ml BSS的小三角瓶中，加入30-40ml组织消化液37℃消化45min，在后15分钟加入DNase I(10000U/ml)1ml-2ml；

(4)加入与组织液体积相等的抑制液终止消化，滴管吹打10min，得到细胞悬液；

(5)加入300ml BSS稀释细胞悬液，经串联的100目(150μm)、200目(75μm)、325目(40μm)细胞筛过滤，100ml烧杯收取滤液；

(6)将滤液转移至6个50ml离心管中，离心(300g，10min)收集细胞；

(7)每个离心管中各采用1ml37℃预热的粘附培养基重悬细胞，分别转入两个100mm细胞培养皿中，在37℃、5％CO₂、相对温度95％的培养箱中培养2.5h，轻柔收取未贴壁的细胞再次差速贴壁2.5h；

(8)离心收集未贴壁细胞(300g，10min)，用6ml DMEM/F-12(无血清)重悬细胞团，并吹打均匀，沿离心管壁缓慢加入两支装有轻重分离液的离心管(15ml)顶部，每个离心管加入3ml，梯度离心(300g，4℃，20min，提前关闭电源(由于离心机在到达离心时间需要结束离心时候会有个刹车(brake)的步骤以达到较快停止离心程序，如果不提前关闭电源刹车步骤可能会打乱轻重分离液的界面，故提前关闭电源的目的是防止离心机结束时的制动力打乱轻重分离液的界面，提高分离的肺泡II型细胞的纯度)；

(9)滴管吸出轻重分离液界面处的肺泡II型细胞层，并加入装有13ml BSS的离心管(15ml)中洗细胞两次；

(10)磁珠分选：用Anti-CD14MicroBeads按操作说明分选去除巨噬细胞，得到分选液；

(11)将分选液收集于1个15ml离心管中，离心(300g，10min)收集细胞，用37℃预热的培养基(SAGM+1％FBS)2ml重悬细胞，并吹打均匀后加入1-2个装有3ml SAGM完全培养基(LONZA公司的SAGM培养基(LOT number：CC-3118))的细胞培养皿(60mm)中，在37℃、5％CO₂、相对湿度95％的培养箱中培养60h后换完全培养基，去除未贴壁细胞，以后隔天换液一次，直到上层没有悬浮细胞，即得肺泡II型上皮细胞。

实施例2实施例1的肺泡II型上皮细胞的细胞鉴定及纯度与活力评估

1、细胞鉴定

①pro-SP-C免疫荧光染色鉴定

SP-C是肺泡II型上皮细胞特异表达的肺泡表面活性蛋白，而其他3种表面活性蛋白SP-A、SP-B、SP-D在其它细胞中也有表达，故选用表面活性蛋白中的SP-C才能用来鉴定ATII细胞。

主要参照Peter F等的方法，待ATII细胞在coverslips上爬片达理想密度，转入24孔板中，4％多聚甲醛固定样本10min；PBS洗5min，0.1％Triton X-100处理10min，增加细胞膜的通透性；山羊血清封闭1h；孵育一抗(pro-SP-C用含0.1％Triton X-100的PBS1∶1000稀释)稀释，4℃过夜；另外用PBS代替一抗作阴性对照；PBS洗3遍，每次10min，孵育二抗(Cy3AffiniPure Goat anti-RabbitIgG(H+L))(用含0.1％Triton X-100的PBS1∶200稀释)4℃过夜或37℃避光1h；PBS洗3次，10min/次。抗淬灭剂封片。-20℃避光保存，直到激光共聚焦显微镜观察成像。

免疫荧光细胞化学染色可见pro-SP-C经Cy3连接的二抗显色后，呈红色颗粒状分布于胞浆中(见图1.pro-SP-C)；同时在DIC(微分干涉相差显微镜)模式下观察细胞的形态(见图1.DIC)。

②

Green DND-26探针染色鉴定

板层小体是ATII细胞特有的结构，

Green DND-26是一种对ATII细胞中板层小体特异性着色的荧光染料，能够自由渗透进入活细胞，并在板层小体中聚集。采用它针对板层小体进行特异性的染色来鉴定该细胞，并运用它们来评估细胞的纯度。

纯化后的细胞在24孔板上爬片达理想密度，转入中，将原培养基(即完全培养基)换成37℃预温的含Green DND-26(150nmol/L)的荧光探针培养基(即含荧光探针的完全培养基)，细胞培养箱中培养30min后，用预温至25℃的BSS清洗3次。加入DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)室温3min-5min染核；用25℃的BSS洗涤2-3次，每次3min-5min，换成完全培养基。激光共聚焦显微镜下观察拍片。

Green DND-26荧光探针染色可见板层小体呈颗粒状的绿色荧光，定位于胞浆，细胞核被DAPI染成蓝色(见图2)。

③透射电镜观察细胞超微结构鉴定

电镜仍然是鉴定ATII细胞的最可靠的方法，因为它可以清晰直观地观察到特征性的板层小体。

在100mm培养皿中培养的ATII细胞，长满80％～90％(21天)后，用细胞刮刀将其轻轻刮下，置于1.5mlEP管中800rpm离心5min；去除上清，沿壁缓慢加入3％戊二醛固定20min，再次2000rpm离心10min。再经2％四氧化锇后固定、丙酮梯度脱水、环氧树脂包埋、超薄切片、锇酸染色后在透射电镜(飞利浦CM-10)下，80KV观察拍片。

透射电镜能够清晰地观察到肺胞II型上皮细胞特有的板层小体结构(呈同心圆、片层状分布)，同时也能观察到与表面活性物质分泌有关的绒毛结构，该方法是鉴定ATII细胞的金标准。透射电镜下见到了呈同心圆排列的板层小体(矩形框所示为部分板层小体所在位置)和微绒毛(箭头所示)，右侧为对部分板层小体进行2倍放大(见图3)(n＝3)。

2、ATII细胞纯度与活力评估

用pro-SP-C免疫荧光法和Green DND-26荧光分子探针染色法，随机多次计数五个不同视野中阳性着色细胞数评估细胞的纯度；

台盼蓝染色评估细胞的活力：取对数生长期细胞，调整细胞密度为10⁴/mL.接种于96孔培养板，每孔180μL，培养24h后加0.4％台盼蓝，每孔20μL。用血细胞计数板在光镜下计活细胞数，计数500个细胞，拒染的为活细胞，计算活细胞的百分比，以判断细胞存活状况。

AT II细胞产量为3×10⁵～7×10⁵/克肺组织(n＝25)，pro-SP-C、

GreenDND-26染色评估细胞纯度可达(97±2)％(n＝15)，评估结果的一致性较好。0.4％台盼蓝染色评估细胞的活力为(93±2)％(n＝25)。刚分离纯化得到的ATII细胞生长缓慢，在接种后48h才开始延展，60h能初步判断出呈圆形或立方形(ATII上皮细胞形态特征)，胞浆中可见大量颗粒状物质，且具有呈小岛状生长的特点(见图4)。细胞在培养到5天～6天时达对数生长期，平均传代周期为7天～10天(n＝25)。按1∶2进行传代，可传3代～4代(约35天)，第4代时细胞活力下降至(60±8)％(n＝25)，逐渐表现为生长停滞、失培养的状态。

3、RT-PCR检测细胞培养过程中表面活性物质表达

细胞原代培养生物学特性维持的好坏是决定该方法培养的细胞是否可用的关键。细胞生物学特性的维持取决于细胞的组织来源、分离纯化方法、培养基及辅助添加的细胞因子的选择。目前，有一些研究如何维持ATII细胞表型报道，

但是其结果也不理想，这也反映出体外培养的肺泡II型上皮细胞表达表面活性质的特征容易很快丧失的特点。鉴于此，本实施例以正常肺组织提取的RNA为对照、以GAPDH为内参，对实施例1培养得到的肺泡II型上皮细胞的表面活性物质表达(SP-A、SP-B、SP-C、SP-D)情况进行了监测。具体方法如下：

TRIzol试剂收集裂解不同培养时间的细胞样品，并提取细胞总RNA。经紫外分光光度仪(DU-800)测定计算其纯度和浓度后，取1μg mRNA按照TaKaRa逆转录试剂盒(DRR037A)操作说明配成20μL反应体系，逆转录合成cDNA。然后取20μL体系，以GAPDH为内参，分别以1μL cDNA模板，分别加入SP-A、SP-B、SP-C、SP-D、GAPDH引物(见表1)、寡核苷酸(dNTP)、Taq酶等进行产物扩增，反应条件为预变性94℃2min，94℃30s，55℃30s，72℃30s，40个循环，72℃延伸2min。扩增产物长度详见表1。按收取细胞时间先后顺序，对各基因扩增产物进行凝胶电泳、扫描成像并分析其表达的趋势。

表1人肺泡II型上皮细胞表面活性物质引物设计

注：SP：表面活性蛋白；GAPDH：磷酸甘油醛脱氢酶；所有引物均为跨外显子设计

相对于之前文献报道的体外培养几天(4天，5天，7天)就失去表面活性物质表达能力来说，本实施例经过多次分离纯化原代培养的肺泡II型上皮细胞重复检测发现，SP-A、SP-C表达时间平均可维持在24天左右，SP-B平均表达时间可持续在28天左右，SP-D平均表达时间可持续在30天左右(见图5)。

采用SAGM+1％FBS作为培养基，细胞表型之所以维持较好是因为SAGM中添加了近10种有利于细胞分裂、繁殖、维持表型的细胞因子，再配以浓度为1％的FBS，既可以提供一个适于ATII细胞生长营养条件，又可以防止其向肺泡I型分化，同时也可抑制成纤维细胞的生长。而其他文献报道的方法中多数采用的不是SAGM，且FBS浓度达10％，这可能是导致纯度不高、表型维持时间较短的原因。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种人肺泡II型上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将手术切除边缘肺组织剪碎，BSS洗涤，经细胞筛过滤，留取筛网上组织；

(2)加入25-35ml组织消化液，36-38℃消化35-55min，在后10-20分钟加入1-2ml浓度为10⁴U/mL的Dnase I；每L所述组织消化液的组成为：浓度为10⁵U/mL的胰酶2-3ml，浓度为44.5mg protein/mL的弹性蛋白酶200-500ul；

(3)加入与组织消化液相等体积的抑制液终止消化，滴管吹打，得到细胞悬液；加入BSS稀释细胞悬液，经细胞筛过滤，收取滤液，离心收集细胞；每L所述抑制液的组成为：DMEM/F-1230-60ml，FBS10-20ml、浓度为10⁴U/ml的DNase I1-2ml；

(4)采用36-38℃预热的粘附培养基重悬细胞，置于36-38℃、3-5％CO₂、相对温度90-95％的环境下培养2-3h，轻柔收取未贴壁的细胞再次差速贴壁2-3h；每L所述粘附培养基的组成为：DMEM/F-1222.5-45ml、SAGM22.5-45ml、FBS5-10ml、浓度为10⁴U/ml的DNase I1-2ml；

(5)离心收集未贴壁细胞，用DMEM/F-12重悬细胞，并吹打均匀，缓慢加入轻、重分离液的顶部，密度梯度离心；所述轻、重分离液的体积比为1∶1；所述轻、重分离液的密度分别为1.040g/ml和1.089g/ml；

(6)滴管吸出轻、重分离液界面处的细胞层，BSS洗涤；Anti-CD14MicroBeads分选去除巨噬细胞，得到分选液；

(7)离心分选液收集细胞，用36-38℃预热的含1％FBS的SAGM重悬细胞，吹打均匀后加入SAGM完全培养基中，在36-38℃、3-5％CO₂、相对温度90-95％的环境中培养55-75h后换SAGM完全培养基，去除未贴壁细胞，以后隔天换液一次，直到上层没有悬浮细胞，即得人肺泡II型上皮细胞。

2.根据权利要求1所述的人肺泡II型上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(2)中，每L所述组织消化液的组成为：浓度为10⁵U/mL的胰酶2-3ml，浓度为44.5mg protein/mL的弹性蛋白酶300ul。

3.根据权利要求1所述的人肺泡II型上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(3)中，所述细胞筛为串联的100目、200目和325目细胞筛。

4.根据权利要求1所述的人肺泡II型上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(4)中，所述再次差速贴壁的时间为2.5h。

5.根据权利要求1所述的人肺泡II型上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(4)中，每L所述粘附培养基的组成为：DMEM/F-1222.5ml、SAGM22.5ml、FBS5ml、浓度为10⁴U/ml的DNase I1ml。

6.根据权利要求1所述的人肺泡II型上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(5)中，在4℃下，300g密度梯度离心20min。

7.根据权利要求1所述的人肺泡II型上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(7)中，在37℃、5％CO₂、相对湿度95％的环境中培养60h后换SAGM完全培养基。

8.根据权利要求1-7任一项所述的人肺泡II型上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(1)中，所述细胞筛为100目。

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