CN112608881A - 一种小鼠肺ii型上皮细胞的快速分离方法 - Google Patents

一种小鼠肺ii型上皮细胞的快速分离方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种小鼠肺II型上皮细胞的快速分离方法。包括以下步骤：用D‑PBS进行肺部灌流，直至肺组织颜色变白；向肺内注入中性蛋白酶，然后立即用1g/100mL LMP琼脂糖封闭，肺组织上覆碎冰使琼脂糖凝固以防止液体流出；待琼脂糖凝固后分离取下整个肺组织，放入中性蛋白酶管中，孵育后获得细胞悬液；将上述细胞悬液过滤；离心，弃上清，获得细胞沉淀；之后用免疫磁珠法纯化细胞沉淀，获得肺II型上皮细胞。本发明的分离方法快速有效，较现有技术大鼠或者人肺组织分离方法用时缩短；细胞纯度较高，经过鉴定后，肺II型上皮细胞纯度>90％，分离出的细胞可开展后续细胞培养或分子实验等研究。

Description

一种小鼠肺II型上皮细胞的快速分离方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种小鼠肺II型上皮细胞的快速分离方法。
背景技术
肺泡上皮由肺I型和肺II型上皮细胞共同组成，虽然肺II型上皮细胞只占肺组织细胞14％-16％，但作为肺内干细胞，肺II型上皮细胞在肺组织受到外界刺激损伤时可分化为肺I型上皮细胞以维持正常肺部功能，同时也有研究表明肺II型上皮细胞也可转化为成纤维细胞，导致肺纤维化的发生。这意味着肺II型上皮细胞在多种肺部疾病的发生发展过程中起着重要作用。但目前尚无技术方法可以快速获得大量且纯度较高的肺II型上皮细胞，并且在体外培养时，II型上皮细胞表型难以维持。这些因素严重阻碍了开展肺部相关疾病的发生发展机制研究的大力开展。因此，在体外实验中，多用A549等细胞系代替肺II型上皮细胞开展相关机制研究。然而A549等细胞系已失去肺II型上皮细胞大部分表型，不能真正代表肺II型上皮细胞，导致研究结果失真。
关于大鼠和人肺II型上皮细胞的分离培养方法早已有报道，且在逐渐完善。但人肺组织较为珍贵，样本来源有限。大鼠模型，无论是从经济学角度还是基因相似性，都不如小鼠。因此，研发小鼠肺II型上皮细胞的高纯度分离方法对于人肺II型上皮细胞功能机制的研究具有重要意义。然而现有技术未见小鼠肺II型上皮细胞的高纯度分离方法。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种小鼠肺II型上皮细胞的快速分离方法。
本发明的目的是提供一种小鼠肺II型上皮细胞的快速分离方法，包括以下步骤：
步骤1.以死亡小鼠肺组织或者离体的小鼠肺组织为样本，死亡时间或者离体时间不超过5min；
步骤2.用D-PBS进行肺部灌流，直至肺组织颜色变白；
步骤3.向肺内注入2-3ml中性蛋白酶，然后立即用1-2mL 1g/100mL LMP琼脂糖封闭，肺组织上覆碎冰使琼脂糖凝固以防止液体流出；
步骤4.待琼脂糖凝固后分离取下整个肺组织，放入2-3mL中性蛋白酶管中，孵育后获得细胞悬液；
步骤5.将步骤4的细胞悬液依次通过70μm、40μm过滤孔径的滤器，收集最后一次过滤的滤液，每次过滤后再用完全培养基清洗滤器；
步骤6.将步骤5最后一次过滤的滤液离心，弃上清，获得细胞沉淀；之后用免疫磁珠法纯化细胞沉淀，获得肺II型上皮细胞。
优选的，上述小鼠肺II型上皮细胞的快速分离方法，如果采用的是死亡小鼠，则D-PBS是从右心房处朝肺的方向灌入。
优选的，上述小鼠肺II型上皮细胞的快速分离方法，D-PBS的浓度为杜氏磷酸盐缓冲液，pH7.2-7.4。
优选的，上述小鼠肺II型上皮细胞的快速分离方法，中性蛋白酶的浓度为50U/ml，溶剂为D-PBS。
优选的，上述小鼠肺II型上皮细胞的快速分离方法，步骤4中，孵育的条件为：室温震荡孵育15min或置于Gentle MACS Dissociator仪器上运行mlung1.01程序。
优选的，上述小鼠肺II型上皮细胞的快速分离方法，步骤6中，离心的条件为800g离心10min。
优选的，上述小鼠肺II型上皮细胞的快速分离方法，步骤6中，免疫磁珠法纯化细胞沉淀时采用的磁珠为CD45磁珠，用于重悬细胞的溶液为MACS buffer。
优选的，上述小鼠肺II型上皮细胞的快速分离方法，每107细胞加入10μl CD45磁珠。
优选的，上述小鼠肺II型上皮细胞的快速分离方法，每107-108细胞加入1-2mLMACS buffer。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明为了更好研究肺II型上皮细胞在肺部相关疾病的发生发展过程中的重要作用，从小鼠肺组织中分离出肺II型上皮细胞，为研究肺部疾病中肺II型上皮细胞的作用提供了快速而且纯度较高的分离方法。本发明的分离方法快速有效，较大鼠或者人肺组织分离方法用时缩短(参考文献1：郑金旭,黄振杰,汤艳,et al.构建原代分离培养与鉴定小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的方法及模型[J].中国组织工程研究,2010,14(015):2761-2764.参考文献2：程涵蓉,吴本清,何少茹.大小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞分离培养方法[J].医学综述,2017,023(013):2653-2657.)；本发明的方法分离的细胞纯度较高，经过鉴定后，肺II型上皮细胞纯度>90％，分离出的细胞可开展后续细胞培养或分子实验等研究。相比大鼠模型，从小鼠肺组织分离II型上皮细胞更经济实用，操作简单，实验成本低。
附图说明
图1为实施例1的S20获得的肺II型上皮细胞进行透射电子显微镜鉴定；
A是5000×视野图，B是15000×视野图；
图2为S9的细胞和S20的细胞免疫荧光染色鉴定结果；
A是S9的细胞，B是S20的细胞，C是DAPI染核后计数10个视野内被标记的细胞数目。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。
下述实施例中，所述D-PBS为杜氏磷酸盐缓冲液，pH7.2-7.4，品牌：索莱宝，货号：D1040。所述中性蛋白酶品牌Roche，货号：4942078001，中性蛋白酶的工作浓度为50U/ml，溶剂为D-PBS。
实施例1
一种小鼠肺II型上皮细胞的快速分离方法，包括以下步骤：
S1.小鼠麻醉后，四肢伸展，腹面朝上固定于小动物解剖台上；
S2.依次剪开腹部皮肤，腹膜，翻转肠位，找出腹主动脉剪断放血；
S3.延伸切口直至嘴部，剪开横膈膜和胸腔，暴露心脏和肺；
S4.在右心房处朝肺的方向插入用装满D-PBS的10mL注射器进行肺部灌流，直至肺组织颜色变白；
S5.用10G静脉留置针做小鼠气管插管，并大头钉固定于台面；
S6.通过上述气管插管，向肺内注入2ml中性蛋白酶，立即用1mL 1g/100mL LMP琼脂糖封闭，肺组织上覆碎冰使琼脂糖凝固以防止液体流出；
S7.待琼脂糖凝固后(约2min)小心分离取下整个肺组织，收集3个肺组织，放入2mL中性蛋白酶管中；室温震荡孵育15min，可获得细胞悬液；
S8.将上述细胞悬液依次通过70μm、40μm过滤孔径的滤器，收集40μm过滤孔径的滤器过滤的滤液，每次过滤后再用另外2ml完全培养基清洗滤器；
S9.将S8中40μm过滤孔径的滤器过滤的滤液800g离心10min，弃上清，获得细胞沉淀；
之后用以下的免疫磁珠法纯化获得肺II型上皮细胞，以下步骤中离心温度为4℃，添加试剂的步骤于冰上进行：
S10.适量MACS buffer(德国美天旎)重悬细胞，计数，300g离心10min，收集细胞沉淀；
S11.每107细胞加入90μl MACS buffer重悬细胞，之后每107细胞加入10μl CD45磁珠(德国美天旎)，冰上孵育15min；
S12.每107细胞加入1-2mL MACS buffer，300g离心10min；
S13.每108细胞加入500μl MACS buffer重悬；
S14.准备好磁力架和柱子(德国美天旎)，先用3mL MACS buffer排气泡，弃废液，然后将重悬的细胞液加入柱子中，收集过滤液，并再用500μl MACS buffer洗柱子，洗3次；
S15.细胞计数，800g离心10min；
S16.每107细胞加入90μl MACS buffer重悬细胞，加入10μl FCR blockingregent(德国美天旎)，冰上孵育10min。每107细胞加入10μl CD326磁珠(德国美天旎)，冰上孵育15min；
S17.每107细胞加入1-2mL MACS buffer，800g离心10min。每108细胞加入500μlMACS buffer重悬；
S18.准备好磁力架和柱子，先用3ml MACS buffer排气泡，弃废液，然后将重悬的细胞液加入柱子中，不收集过滤液，并再用1ml MACS buffer洗柱子，洗3次；
S19.加入5ml MACS buffer，挤活塞，收集液体至离心管内；
S20.800g离心10min，所得细胞沉淀即为肺II型上皮细胞。
上述步骤中，每107、108细胞指的是以该数量级计，添加合适的试剂体积。相应数量级范围内的细胞数均适用于该数量级的试剂添加量。
S20获得的肺II型上皮细胞进行透射电子显微镜鉴定，结果参见图1，图1A是5000×视野图，图1B是15000×视野图，图1中细线箭头所指浅灰色三角形为细胞膜上微绒毛，粗线箭头所指深灰色三角形为细胞内板层小体。电镜下大部分细胞内可见板层小体，部分细胞膜上可见微绒毛，这些都是肺Ⅱ型上皮细胞特异性标志物。
图2是S9的细胞(分选前)和S20的细胞(分选后)免疫荧光染色鉴定结果。用ProSP-C(肺Ⅱ型上皮细胞特异性表达)抗体标记肺Ⅱ型上皮细胞，DAPI染核后计数10个视野内被标记的细胞数目，统计如图C。
实施例2
一种小鼠肺II型上皮细胞的快速分离方法，包括以下步骤：
S1.取刚离体的连接有心组织的小鼠肺组织，死亡时间1min；
S2.在右心房处朝肺的方向插入用装满D-PBS的10mL注射器进行肺部灌流，直至肺组织颜色变白；
S3.用10G静脉留置针做小鼠气管插管，并大头钉固定于台面；
S4.通过上述气管插管，向肺内注入3ml中性蛋白酶，立即用2mL 1g/100mL LMP琼脂糖封闭，肺组织上覆碎冰使琼脂糖凝固以防止液体流出；
S5.待琼脂糖凝固后(约2min)小心分离取下整个肺组织，收集3个肺组织，放入3mL中性蛋白酶管中；置于Gentle MACS Dissociator仪器上，运行mlung 1.01程序，可获得细胞悬液；
S6.将上述细胞悬液依次通过70μm、40μm过滤孔径的滤器，收集40μm过滤孔径的滤器过滤的滤液，每次过滤后再用另外2ml完全培养基清洗滤器；
S7.将S6中40μm过滤孔径的滤器过滤的滤液800g离心10min，弃上清，获得细胞沉淀；
之后用免疫磁珠法纯化获得肺II型上皮细胞，具体步骤参照实施例1。
需要说明的是，本发明中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与实施例相同，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (9)

1.一种小鼠肺II型上皮细胞的快速分离方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1.以死亡小鼠肺组织或者离体的小鼠肺组织为样本，死亡时间或者离体时间不超过5min；
步骤2.用D-PBS进行肺部灌流，直至肺组织颜色变白；
步骤3.向肺内注入2-3ml中性蛋白酶，然后立即用1-2mL 1g/100mL LMP琼脂糖封闭，肺组织上覆碎冰使琼脂糖凝固以防止液体流出；
步骤4.待琼脂糖凝固后分离取下整个肺组织，放入2-3mL中性蛋白酶管中，孵育后获得细胞悬液；
步骤5.将步骤4的细胞悬液依次通过70μm、40μm过滤孔径的滤器，收集最后一次过滤的滤液，每次过滤后再用完全培养基清洗滤器；
步骤6.将步骤5最后一次过滤的滤液离心，弃上清，获得细胞沉淀；之后用免疫磁珠法纯化细胞沉淀，获得肺II型上皮细胞。
2.根据权利要求1所述的小鼠肺II型上皮细胞的快速分离方法，其特征在于，如果采用的是死亡小鼠，则D-PBS是从右心房处朝肺的方向灌入。
3.根据权利要求1所述的小鼠肺II型上皮细胞的快速分离方法，其特征在于，D-PBS的浓度为杜氏磷酸盐缓冲液，pH7.2-7.4。
4.根据权利要求3所述的小鼠肺II型上皮细胞的快速分离方法，其特征在于，中性蛋白酶的浓度为50U/ml，溶剂为D-PBS。
5.根据权利要求4所述的小鼠肺II型上皮细胞的快速分离方法，其特征在于，步骤4中，孵育的条件为：室温震荡孵育15min或置于Gentle MACS Dissociator仪器上运行mlung1.01程序。
6.根据权利要求5所述的小鼠肺II型上皮细胞的快速分离方法，其特征在于，步骤6中，离心的条件为800g离心10min。
7.根据权利要求6所述的小鼠肺II型上皮细胞的快速分离方法，其特征在于，步骤6中，免疫磁珠法纯化细胞沉淀时采用的磁珠为CD45磁珠，用于重悬细胞的溶液为MACS buffer。
8.根据权利要求7所述的小鼠肺II型上皮细胞的快速分离方法，其特征在于，每107细胞加入10μlCD45磁珠。
9.根据权利要求1所述的小鼠肺II型上皮细胞的快速分离方法，其特征在于，每107-108细胞加入1-2mL MACS buffer。
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