JP2005027579A - 分別マーカーを用いた間葉系幹細胞の識別・分離方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 該ビタミンD受容体の遺伝子又はそのタンパク質、或いは、オステオカルシン及びオステオポンチンの遺伝子のようなビタミンD受容体関連遺伝子又はそのタンパク質を間葉系幹細胞と繊維芽細胞との分別マーカーとして用い、被検細胞における該遺伝子及びタンパク質の発現を検出することにより、間葉系幹細胞と繊維芽細胞との識別・分離を行う。また、ビタミンD受容体の標的遺伝子が、1,25水酸化ビタミンDのような遺伝子の発現活性化物質の添加により、間葉系幹細胞中において、その発現が亢進されることから、該亢進した遺伝子の発現を検出することにより、効果的に間葉系幹細胞の識別・分離を行う。
Description
[材料及び方法]
この実施例では、どの系列にも分化が決定されていない増殖期(70−80%コンフルエント)でのヒト骨髄間葉系細胞とヒト繊維芽細胞の骨、軟骨、脂肪関連遺伝子の発現レベルを比較した。
ヒト骨髄間葉系細胞(human mesenchymal stem cell)は、腸骨或いは歯槽骨より分離した。或いは購入した。ヒト繊維芽細胞(human fibloblast)は、購入或いは、歯肉組織より分離培養した。
これらの細胞はいずれも、1ng/mlのbFGF及び10%ウシ胎児血清(FCS)を含む培地を用いて37℃、5%炭酸ガス存在下にて培養した(Biochemical and Biophysical Research Communication, 288, 413-419, 2001)。本実施例では、3〜7回継代したものを用いた。骨分化はコンフルエントに達した骨分化誘導培地(10%FBS含有αMEMに、100nMデキサメタゾン、10mM β−グリセロールリン酸、50μg/mL アスコルビン酸−2−リン酸を加えた培地)を用いて、37℃、5%炭酸ガス存在下にて28日培養して誘導した(Science 284, 2, 1999)。この条件でヒト骨髄間葉系細胞の培養系は広範囲に一様にアリザリン赤によって染色されたことから、骨分化と石灰化が起こっていたことが示された。
各細胞からTrizol Reagent(Invitrogen社製)を用いて全RNAを抽出後、各全RNAを1μgを鋳型としてSuperScrit first-strand system or RT-PCR(Invitrogen社製)を用いて、42℃、50分間の逆転写反応を行ってcDNAを合成した。合成されたcDNAを鋳型としてAdvantage 2 PCR enzyme system(Clontech社製)を用いて各遺伝子マーカーを増幅した。94℃30分間で変性、68℃1分間でアニールを30サイクル行った。増幅に用いた各遺伝子のプライマー配列を表1にまとめた。増幅した遺伝子を1%アガロースゲルを用いた電気泳動にて分離し、エチジウムブロマイド染色によって染色した。
増殖用培地で培養した増殖期(70〜80% コンフルエント)での未分化骨髄間葉系細胞は、これまでの研究から予想されたように、増殖が停止していないのでまた骨誘導培地を添加していないので骨分化していなかった。つまりアリザリン赤染色で染まらず石灰化していなかった。しかし7個体から分離したヒト未分化骨髄間葉系細胞の全てで(個体によって発現に強弱があるものの)、最も代表的な骨マーカー遺伝子であるオステオカルシン mRNAの発現が観察された。一方、4個体から分離したヒト繊維芽細胞はいずれもオステオカルシン mRNAを発現していなかった(図1)。
軟骨マーカーであるtype II collagen, aggrecanの発現については、検討したほとんどの未分化骨髄間葉系細胞で低レベルのaggrecan mRNAが検出されたが、最も重要な軟骨マーカーtype II collagen mRNAは一例も検出できなかった(図1)。一方、これらの軟骨マーカーは(2個体由来の細胞できわめて低レベルのaggrecan mRNAが検出された以外)、検討した全てのヒト繊維芽細胞で発現していなかった(図1)。
これらの結果は、骨髄間葉系細胞が、未分化であるものの、各分化系列の遺伝子群の全体でなくその一部だけ既に発現していることを示している。
3個体由来の骨髄間葉系細胞において、増殖期と骨分化誘導後の骨マーカーの発現レベルを比較した。オステオカルシンの発現レベルは分化前と分化後でほとんど同等であったのに対して、他の骨マーカーの発現はいずれも骨分化誘導後に上昇したが、増殖期では著しく低レベルであったか、検出できなかった(図2)。骨マーカーの発現が部分的であるため骨髄間葉系幹細胞は増殖期で、骨芽細胞とはならないことが示唆された。
3個体由来の骨髄間葉系細胞の増殖期で、10-8M 1,25水酸化ビタミンD3(1,25-(OH)2 vitamin D3)を添加すると、48時間以内にオステオカルシンとオステオポンチンの発現が著しく亢進した(図3)。一方、bone sialoprotein, alkaline phosphataseは、1,25水酸化ビタミンD3には応答しなかった。ヒト繊維芽細胞では、いずれの遺伝子も1,25水酸化ビタミンD3には応答しなかった。
表2は、ヒト未分化骨髄間葉系細胞(MSC)とヒト繊維芽細胞での、骨マーカー、軟骨マーカー、脂肪マーカー及びビタミンD応答について、多くの個体由来細胞を用いて検討した結果を示す。
まず表面抗原を認識する一次抗体と5×105個の細胞を混合し、室温で30分間インキュベーションをする。一次抗体が蛍光で認識されている場合には、洗浄後フローサイトメーターで測定した。一次抗体が蛍光標識されていない場合には、洗浄後一次抗体に対して結合活性を有する蛍光標識された二次抗体と一次抗体が反応した細胞とを混合し、再び室温で30分間インキュベーションした。洗浄後、一次抗体と二次抗体で染色された細胞をフローサイトメーターで測定した。
図4及び図5は、オステオカルシンに対する抗体を用いて、FACS分析をした結果を示す。ビタミンDの添加によって、80%以上の増殖期のヒト未分化骨髄間葉系細胞が発現したのに対して、繊維芽細胞ではビタミンDを添加してもオステオカルシンを産生する細胞は検出できなかった。
Claims (17)
- ビタミンD受容体遺伝子及び/又はその関連遺伝子を分別マーカーとし、該遺伝子の間葉系幹細胞と繊維芽細胞とにおける発現の差を検出して、間葉系幹細胞と繊維芽細胞とを識別・分離することを特徴とする間葉系幹細胞の識別・分離方法。
- ビタミンD受容体遺伝子及び/又はその関連遺伝子の分別マーカーの発現の差の検出が、ビタミンD受容体遺伝子及び/又はその関連遺伝子の発現の検出、或いは該遺伝子がコードするタンパク質の検出であることを特徴とする請求項1記載の間葉系幹細胞識別・分離方法。
- ビタミンD受容体の関連遺伝子及び/又は該遺伝子がコードするタンパク質が、ビタミン蛍光容体の標的遺伝子及び/又は該遺伝子がコードするタンパク質であることを特徴とする請求項2記載の間葉系幹細胞の識別・分離方法。
- ビタミンD受容体の標的遺伝子又は該遺伝子がコードするタンパク質が、オステオカルシンの遺伝子又はオステオカルシンであることを特徴とする請求項3記載の間葉系幹細胞の繊維芽細胞からの識別・分離方法。
- 間葉系幹細胞と繊維芽細胞とにおける分別マーカー遺伝子の発現の差の検出が、間葉系幹細胞及び繊維芽細胞において、遺伝子の発現活性化物質を添加して活性化した遺伝子の発現及び/又は該遺伝子がコードするタンパク質を検出するものであることを特徴とする請求項1〜4のいずれか記載の間葉系幹細胞の識別・分離方法。
- 遺伝子の発現活性化物質の添加により活性化された遺伝子の発現及び/又は該遺伝子がコードするタンパク質の検出が、オステオカルシンの遺伝子及び/又はオステオポンチンの遺伝子の発現の検出、或いはオステオカルシン及び/又はオステオポンチンタンパク質の検出であることを特徴とする請求項5記載の間葉系幹細胞の識別・分離方法。
- 遺伝子の発現活性化物質の添加による発現の活性化が、1,25水酸化ビタミンDの添加による発現の活性化であることを特徴とする請求項5又は6記載の間葉系幹細胞の識別・分離方法。
- 分別マーカー遺伝子の検出が、定量的又は半定量的PCRの使用を含んでいることを特徴とする請求項1〜7のいずれか記載の間葉系幹細胞の識別・分離方法。
- 定量的又は半定量的PCRの使用が、RT−PCR法であることを特徴とする請求項8記載の間葉系幹細胞の識別・分離方法。
- 分別マーカー遺伝子の検出が、該遺伝子の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA配列からなる遺伝子検出用プローブを用いて行われることを特徴とする請求項1〜9のいずれか記載の間葉系幹細胞の識別・分離方法。
- 遺伝子検出用プローブが、該遺伝子の塩基配列のアンチセンス鎖の全部又は一部からなる請求項10記載の間葉系幹細胞の識別・分離方法。
- 分別マーカー遺伝子がコードするタンパク質の検出が、該タンパク質によって誘導され、該タンパク質に特異的に結合する抗体を用いて行われることを特徴とする請求項1〜7のいずれか記載の間葉系幹細胞の識別・分離方法。
- 抗体が、モノクロナール抗体であることを特徴とする請求項12記載の間葉系幹細胞の識別・分離方法。
- 抗体が、ポリクロナール抗体であることを特徴とする請求項12記載の間葉系幹細胞の識別・分離方法。
- 被検細胞中における間葉系幹細胞を、分別マーカー遺伝子がコードするタンパク質に特異的に結合する抗体を用いた蛍光抗体法により標識化し、該標識化した間葉系幹細胞を分離することを特徴とする請求項12〜14のいずれか記載の間葉系幹細胞の識別・分離方法。
- ビタミンD受容体遺伝子及び/又はその関連遺伝子を分別マーカーとし、該遺伝子の間葉系幹細胞と繊維芽細胞とにおける発現の差を検出して、間葉系幹細胞と繊維芽細胞とを識別・分離することを特徴とする間葉系幹細胞の識別・分離方法。
- ビタミンD受容体遺伝子及び/又はその関連遺伝子の分別マーカー遺伝子検出用のプローブ、及び/又はビタミンD受容体遺伝子及び/又はその関連遺伝子がコードするタンパク質検出用の抗体を装備してなる間葉系幹細胞識別・分離用キット。
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