CN117025741A - 一种羊膜来源间充质干细胞的有效性质量控制方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种羊膜来源间充质干细胞的有效性质量控制方法，从hAMMSCs中筛选用于鉴定hAMMSCs有效性的关键基因，通过单细胞转录组测序技术检测了脂肪、羊膜和脐带来源MSCs的基因表达，识别了hAMMSCs的特异性高表达基因，通过GeneCards数据库获取特异性高表达基因的相关功能，鉴定出PTX3可以作为hAMMSCs新的有效性检测指标，基于P5代hAMMSCs的常规安全性和有效性检测，通过酶联免疫吸附法检测PTX3基因表达量验证了结果，通过Pearson相关性分析PTX3与已知有效性指标的相关性，并计算符合已知标准时PTX3的含量，提出了hAMMSCs中PTX3的有效性质量控制标准。
Description
技术领域
本发明属于干细胞技术领域，具体涉及一种羊膜来源间充质干细胞的有效性质量控制方法。
背景技术
间充质干细胞(MSCs)具有多能性、自我更新能力、低免疫原性、免疫调节功能和损伤趋化性，已证实人羊膜衍生间充质干细胞(hAMMSCs)不仅具有MSCs的特征，而且还具有一些与胚胎干细胞相同的表型特征。羊膜位于胎盘的最内层，主要由来源于外胚层的上皮细胞和来源于中胚层的间充质细胞构成，不含血管，且细胞成分相对简单，在胎儿出生后即成为废弃品，从羊膜组织中获取hAMMSCs是安全、无创和符合伦理的，这些优点使hAMMSCs成为再生医学和组织工程的有前途的种子细胞。hAMMSCs在制作注射液前需要分别进行鉴别实验、细菌、真菌和病毒检查等安全性检测，以及免疫反应和分化能力等有限性检测，但这些都是基于MSCs整体来检测的，未针对hAMMSCs给出特异性的指标，对于hAMMSCs的安全性检测是足够的，但无法准确判断hAMMSCs的治疗有效性，因此迫切需要确定新的质量控制指标，以用于保证hAMMSCs的治疗有效性。
以往的微阵列杂交技术和被称为转录组测序技术(RNA sequencing，RNA-seq)的下一代测序(Next Generation Sequencing，NGS)技术已被广泛应用，基于组织的RNA-seq提供了大量的信息，这些信息推动了生物医学的发现和创新，但该技术通常在包含数千至数百万个细胞的样本上进行整体评估，并未从单个细胞的水平进行直接评估；而单细胞转录组测序技术(single-cell RNA sequencing，scRNA-seq)可以以高分辨率描述单个细胞中的RNA分子，为确定hAMMSCs的特异性基因提供了更准确、可靠的筛选方法。
根据中国食品药品检定研究院的要求，目前MSCs的有效性常规检测使用如下方法：
1、淋巴细胞增殖抑制试验：试验采用hAMMSCs与外周血单个核细胞(Peripheralblood mononuclear cell，PBMC)共培养后，使用酶化学发光法(Cell Viability Assay)检测淋巴细胞增殖抑制率。化学发光法主要是依据化学检测体系中待测物浓度与体系的化学发光强度在一定条件下呈线性定量关系的原理，利用仪器对体系化学发光强度的检测，而确定待测物含量的一种痕量分析方法。Cell Viability Assay是通过定量存在的腺嘌呤核苷三磷酸(Adenosine triphosphate，ATP)(它是新陈代谢活跃细胞存在的信号)，测定培养物中活细胞数量的均质方法，将培养的第5代hAMMSCs消化、洗涤、计数后，接种至96孔培养板，置入37℃5％CO2培养箱中；培养4h后，用丝裂霉素C处理后，用杜氏磷酸缓冲液(Dulbecco's Phosphate-Buffered Salin，D-PBS)清洗2遍，每孔加入新鲜培养基，置入37℃ 5％ CO2培养箱中培养过夜；次日上午采集外周血，分离单个核细胞；从培养箱中取出96孔培养板，去除培养基后在各组加入分离的单个核细胞悬液，在相应组加入聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates，PHA)；96孔板置于37℃ 5％ CO2培养箱中孵育72h，加入CellViability试剂，震荡混匀2min，继续孵育10min，检测发光读数。
2、特定淋巴细胞亚群检测：特定淋巴细胞亚群检测采用流式细胞仪技术进行检测。流式细胞仪是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。流式细胞仪技术是通过制备单细胞悬液，用特异性荧光染料标记的抗体进行染色，经染色后的待测细胞在一定气体压力下被压入流动室，在鞘液的包裹下细胞呈单行排列，依次通过检测区域，在激光束的照射下细胞会产生散射光和激发荧光；这两种信号会同时被光电倍增管接收。接收后可转换为电信号，通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号，进行分析，从而达到分选细胞亚群的功能；通过hAMMSCs与外周血单个核细胞共培养后，制备成单细胞悬液，使用淋巴细胞用试剂盒进行流式细胞仪技术检测，然后收集各组淋巴细胞用试剂盒检测Th1，Th17和Treg亚群的增殖抑制/促进率。
3、淋巴细胞分泌TNF-α抑制试验：淋巴细胞分泌肿瘤坏死因子α(Tumor NecrosisFactor-α，TNF-α)抑制试验采用酶联免疫吸附法检测淋巴细胞共培养后分泌的TNF-α含量。酶联免疫吸附法是把抗原--抗体的免疫反应与酶的催化反应相互结合而发展起来的一种综合性技术，它的灵敏度高，特异性强，因而是近年来病毒检测方法中发展最快、应用最广的一种方法。TNF-αELISA试剂盒是往预先包被人TNF-α捕获抗体的微孔中依次加入样品、不同浓度的标准品，经过孵育并彻底洗涤，加入辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)标记的检测抗体，用底物四甲基联苯胺(Tetramethylbenzidine，TMB)显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样本中的TNF-α浓度呈正相关。用酶标仪在450nm波长处测吸光度(optical density，OD)值，用公式计算出淋巴细胞分泌TNF-α的抑制率。抑制率＝1-[OD(PBMC+MSC+PHA)-OD(PBMC+MSC)]/[OD(PBMC+PHA)-OD(PBMC)]。
综上所述，间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是一类具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞，已从人类几乎所有组织中鉴定和分离出来，目前MSCs已在退行性疾病、炎性疾病和组织损伤等领域的医学研究和临床应用中扮演着重要的角色，其中羊膜来源的间充质干细胞(Human amniotic-derived mesenchymal stem cells，hAMMSCs)具有免疫原性极低、可无创获取的特点，表明hAMMSCs在治疗炎症和疾病上具有极高的潜力。因此对hAMMSCs的质量控制至关重要，根据中国食品药品检定研究院要求，hAMMSCs在制作注射液前需要分别进行鉴别实验、细菌、真菌和病毒检查等安全性检测，以及免疫反应作为有限性检测，但这些标准是基于MSCs整体来检测的，未针对hAMMSCs给出特异性的指标，对于hAMMSCs的安全性检测是足够的，但无法准确判断hAMMSCs的有效性。
目前，hAMMSCs同样使用上述方法进行有效性检测，但无法确保用于治疗疾病时的有效性。为进一步鉴定hAMMSCs治疗疾病的有效性，迫切需要确定新的质量控制指标，以用于保证hAMMSCs的治疗有效性。
发明内容
目前hAMMSCs是使用淋巴细胞增殖抑制试验、特定淋巴细胞亚群检测和淋巴细胞分泌TNF-α抑制试验进行有效性检测，但是这些方法仅评估了hAMMSCs的免疫调节能力，但大部分疾病的病因是复杂的，并非仅由炎症或免疫失调导致，且该方法未从hAMMSCs自身的因子水平评估，而是通过共培养的淋巴细胞间接判断，其准确性受淋巴细胞状态等多方面影响，无法确保用于治疗疾病时的有效性。针对这些问题，本发明提供了一种羊膜来源间充质干细胞的有效性质量控制方法，从hAMMSCs中筛选用于鉴定hAMMSCs有效性的关键基因，通过单细胞转录组测序技术检测了脂肪、羊膜和脐带来源MSCs的基因表达，并识别了hAMMSCs的特异性高表达基因，通过GeneCards数据库获取特异性高表达基因的相关功能，鉴定出PTX3可以作为hAMMSCs新的有效性检测指标，基于P5代hAMMSCs的常规安全性和有效性检测，通过酶联免疫吸附法检测PTX3基因表达量进一步验证了这一结果，通过Pearson相关性分析PTX3与已知有效性指标的相关性，并计算符合已知标准时PTX3的含量，从而提出了hAMMSCs中PTX3的有效性质量控制标准。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种羊膜来源间充质干细胞的有效性质量控制方法，包括以下步骤：
1)羊膜组织采集、运输和保存：羊膜采集前进行供者筛选，整个采集过程严格执行无菌操作，样本采集后放入专用运输箱中，运送至实验室进行接收和质量检测；
2)原代细胞培养：将上步骤得到的合格的采集物传入细胞制备区内，并放置于超净工作台上；将胎儿面的羊膜组织剥离下来，清洗干净羊膜组织后并剪成1×1cm2的组织块转移至离心管中；用胰酶代替物TrypLE消化；清洗后再用胶原酶NB6至约95％羊膜组织消化完全为止；消化结束后两次重悬离心后取上清液送检，倒去剩余上清，重悬细胞，接种细胞至T225培养瓶(以下简称培养瓶)，加入MSC-T4完全培养基，将培养瓶转至CO2培养箱内；
3)原代细胞换液：将培养3天后的原代细胞从CO2培养箱内取出，倒掉培养瓶内培养基，培养瓶添加35mL MSC-T4完全培养基，将培养瓶转移至CO2培养箱内；
4)原代细胞传代：原代细胞培养5-7天后，取出培养瓶用0.9wt％氯化钠注射液润洗培养瓶，然后吸取预热的TrypLE使液体铺满培养瓶细胞贴附面，放入消化，消化结束后向培养瓶内添加MSC-T4完全培养基，离心后倒去上清，吸取MSC-T4完全培养基至离心管中重悬细胞，将细胞悬液接种至T225 cm2培养瓶内，加入35mL MSC-T4完全培养基，摇匀后将细胞转至CO2培养箱内；
5)种子细胞库建立：从CO2培养箱中取出培养瓶，倒掉培养瓶内培养基，晃润洗培养瓶，然后吸取预热的TrypLE至培养瓶内，消化后吸取MSC-T4完全培养基，终止消化，将细胞悬液转入离心管中，并吸取0.9wt％氯化钠注射液依次润洗培养瓶，转入上述离心管中，离心两次后；按照5×106个/mL/管的细胞冻存密度加入细胞悬液中吹打混匀后转移至冻存盒中；按照冻存程序进行降温，降温结束后将冻存盒转入待检罐中暂存，于检测合格后再将冻存盒中的冻存细胞转入液氮罐中；
6)种子细胞复苏：从种子细胞库液氮罐中取出种子细胞，迅速置于37℃恒温水浴锅内轻轻摇晃至无明显冰晶为止，按照0.89×104cell/cm2的接种密度将细胞悬液加入培养瓶内，根据培养瓶每瓶补分别加35mL MSC-T4完全培养基，摇匀后将细胞转至CO2培养箱内；
7)第一代(P1)传第二代(P2)细胞换液：将培养1天后的种子细胞从CO2培养箱内取出，倒掉培养瓶内培养基，加入新的完全培养基，将培养瓶转移至CO2培养箱内；
8)次代细胞传代培养：将培养3d后的细胞从取出，倒掉培养瓶内培养基，晃润洗培养瓶，然后吸取5mL TrypLE至培养瓶内，消化，吸取MSC-T4完全培养基，终止消化再吸取10mL 0.9wt％氯化钠注射液依次润洗培养瓶转入离心管；离心后倒去上清并重悬细胞，将细胞悬液接种至培养瓶内，每瓶补加35mL MSC-T4完全培养基，摇匀后将细胞转至CO2培养箱内；
9)细胞原液制备：将培养3天后的第五代(P5)细胞取出，倒掉细胞培养室内培养基，并摇晃润洗培养瓶，然后加入5mL已预热的TrypLE至培养瓶内，消化之后添加MSC-T4完全培养基终止，并用吸取10mL 0.9％氯化钠注射液润洗细胞培养室，再将润洗后的细胞悬液转入离心管中；离心后倒去上清，剩下的细胞沉淀即为羊膜间充质干细胞原液；
10)间充质干细胞(MSCs)的三系分化检测：
成脂分化检测标准操作：准备24孔板和离心管，按照细胞计数标准操作规程进行计数后取2.0×105个MSC至离心管内，加入MSC-T4完全培养基至5mL，吹打混匀；吸取细胞悬液0.5mL至每个鉴定孔内，将细胞转至37℃、5％CO2培养箱内；
成脂分化培养基配制：10％成脂分化因子补充剂(Adipogenesis supplement)+90％成脂分化培养基(Adipogenesis Differentiation Basal medium)，充分混匀，4℃保存；待细胞汇合度达到70-80％开始诱导，记为Day 0，弃去实验孔上清液，添加0.5mL成脂分化培养基至实验孔内，将24孔板转至37℃、5％ CO2培养箱内；每3天实验孔更换1次成脂分化培养基，对照孔更换完全培养基；成脂分化培养至Day7-14时，在显微镜下可见明显的油滴，即进行油红O染色鉴定；弃除鉴定孔中上清液，加入0.5mL4wt％聚羟基脂肪酸酯(PFA)至鉴定孔内，固定20min；弃液后吸取0.5mL60％(v/v)异丙醇至鉴定孔内，润洗1次；加入0.5mL油红O染液至鉴定孔内，染色15min；弃液后吸取0.5mL超纯水至鉴定孔内，润洗2次；加入0.5mL超纯水至鉴定孔内，荧光显微镜下观察并拍照；
成骨分化检测：准备24孔板和离心管，按照细胞计数标准操作规程进行计数后取细胞2.0×105至离心管内，加入MSC-T4完全培养基至5mL，吹打混匀；吸取细胞悬液0.5mL至每个鉴定孔内；将24孔板转至37℃、5％CO2培养箱内；
成骨分化培养基配制：10％ Osteogenesis supplement+90％OsteogenesisDifferentiation Basal medium，充分混匀，4℃保存；待细胞汇合度达到60-70％开始诱导，记为Day0，弃去实验孔中上清液，添加0.5mL成骨分化培养基至实验孔内，将24孔板转至37℃、5％ CO2培养箱内；每3天实验孔更换1次成骨分化培养基，对照孔更换完全培养基；成骨分化培养至Day14-21时，在显微镜下可见钙结节，即进行0.2％茜素红染色鉴定；弃除鉴定孔中上清液，加入0.5mL 4wt％PFA至鉴定孔内，固定20min；弃液后吸取超纯水0.5mL清洗鉴定孔1次；加入0.5mL 0.2％茜素红溶液至鉴定孔内，染色30min；弃液后吸取超纯水0.5mL清洗鉴定孔2次；加入0.5mL超纯水至鉴定孔内，荧光显微镜下观察并拍照；
成软骨分化检测：准备24孔板和离心管，按照细胞计数标准操作规程进行计数后取干细胞2.0×105至离心管内，加入MSC-T4完全培养基至5mL，吹打混匀；吸取干细胞悬液0.5mL至每个鉴定孔内；吸取0.5mL D-PBS至鉴定孔周围的孔内；将24孔板转至37℃、5％CO2培养箱内；成软骨分化培养基配制：10％ Chondrogenesis supplement+90％Chondrogenesis Differentiation Basal medium，充分混匀，4℃保存；待细胞汇合度达到60-70％开始诱导，记为Day0，弃去实验孔中上清液，添加0.5mL成软骨分化培养基至实验孔内，将24孔板转至37℃、5％CO2培养箱内；每3天实验孔更换1次成软骨分化培养基，对照孔更换完全培养基；成软骨分化培养至Day14-21时，在显微镜下可见球状细胞团，即进行阿利新蓝染色鉴定；弃除鉴定孔中上清液，加入0.5mL D-PBS清洗2次，加入0.5mL 4wt％PFA至鉴定孔内，固定20min；弃液后吸取超纯水0.5mL清洗鉴定孔1次；加入0.5mL阿利新蓝酸化液，浸泡5min；加入0.5mL阿利新蓝染色液至鉴定孔内，染色30min；弃液后吸取超纯水0.5mL清洗鉴定孔2次；加入0.5mL超纯水至鉴定孔内，荧光显微镜下观察并拍照；
11)间充质干细胞(MSCs)单细胞悬液制备：在显微镜下观察，当培养的细胞在培养皿底出现90％-95％融合时；去除培养基，加入杜氏磷酸盐缓冲液(Dulbecco's PhosphateBuffered Saline，DPBS)连续漂洗2遍；加入5mL胰蛋白酶溶液(0.25wt％胰蛋白酶-乙二胺四乙酸)，置于37℃消化；加入T4完全培养基至终止消化，细胞悬液转入15mL离心管中，400g离心3min，去除上清液；加入1mL无钙镁(DPBS)重悬，检测细胞浓度；加入无钙镁(DPBS)稀释至细胞浓度为3.5×105cell/mL；
12)单细胞转录组测序及生物信息学分析：将样本制备为单细胞悬液后，利用GEXSCOPE微流控芯片捕获单细胞，并将数百万个携带独特细胞标签的Barcoding Beads加入到芯片微孔中；细胞裂解后，对细胞及mRNA进行标记；收集芯片中的Barcoding Beads，将Barcoding Beads捕获的mRNA反转录为cDNA并扩增；将cDNA经过片段化、连接接头步骤后构建适用于illumina测序平台的测序文库；随后使用Singleron MatrixTM平台对样本进行单细胞转录组上机测序和质量控制；Seurat R包(Version 4.0.3，https://satijalab.org/seurat)用于进一步分析scRNA-seq数据的生物信息学分析，其中的findAllmarker函数用于识别hAMMSCs的特异性高表达基因，GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)和已有文献的结果用于筛选hAMMSCs关键基因；
13)淋巴细胞增殖抑制试验：将培养的第5代hAMMSCs消化、洗涤、计数后，MEM-α培养基调整细胞浓度，接种于96孔培养板，每孔100μL，置入37℃ 5％ CO2培养箱中；hAMMSCs培养4h后，用丝裂霉素C处理，然后用D-PBS清洗2遍，每孔加入新鲜培养基100μL，置入37℃5％ CO2培养箱中培养过夜；次日上午采集10mL外周血，取50mL离心管，加入10mL外周血和10mL D-PBS，吹打混匀，取SepMate 50mL离心管，加入淋巴细胞分离液，然后沿管壁缓缓加入外周血和PBS混合液，1200g离心20min，取白膜层细胞，D-PBS洗涤，300g离心10min，分离收集人外周血单个核细胞，RPMI-1640培养基调节细胞密度；从培养箱中取出96孔培养板，去除培养基后在各组加入单个核细胞悬液100μL/孔，在相应组加入PHA；96孔板置于37℃5％CO2培养箱中孵育72h；加入Cell Viability试剂100μL/孔，震荡混匀2min，继续孵育10min，检测发光读数；待检细胞按照分组与PBMC以1:4比例共培养，分组：A.PBMC；B.PBMC+hAMMSCs；C.PBMC+MSC+PHA；D.PBMC+PHA；
以下公式用于计算淋巴细胞增殖抑制率：淋巴细胞增殖抑制率＝[1-(C-B)/(D-A)]*100％；
14)特定淋巴细胞亚群检测：将培养的第5代hAMMSCs消化、洗涤、计数后，MEM-α培养基调整细胞浓度，接种于6孔培养板，每孔3mL，置入37℃5％CO2培养箱中；hAMMSCs培养4h后，用丝裂霉素C处理，然后用D-PBS清洗两遍，每孔加入新鲜培养基3mL，置入37℃5％ CO2培养箱中培养过夜；次日上午采集30mL外周血，取50mL离心管2支，每支加入15mL外周血和15mL D-PBS，吹打混匀，取SepMate 50mL离心管2支，每支加入淋巴细胞分离液，然后沿管壁缓缓加入外周血和PBS混合液，1200g离心20min，取白膜层细胞，D-PBS洗涤，300g离心10min，分离收集人外周血单个核细胞，RPMI-1640培养基调节细胞密度；从培养箱中取出6孔培养板，弃液后在各组加入单个核细胞悬液3mL/孔，在相应组加入PHA，终浓度为10μg/mL；6孔板置于37℃5％ CO2培养箱中孵育72h；然后收集各组淋巴细胞用试剂盒检测Th1，Th17和Treg亚群的增殖抑制/促进率；
15)淋巴细胞分泌TNF-α抑制试验：将培养的hAMMSCs消化、洗涤、计数后，MSC-T4完全培养基调整细胞浓度，接种于96孔培养板，每孔100μl，置入37℃、5％ CO2培养箱中；hAMMSCs培养4h后，从培养箱中取出96孔板，用终浓度为丝裂霉素C处理，然后用D-PBS以200μl/孔清洗两遍；复苏人PBMC，300g离心10min，用RPMI-1640完全培养基调节细胞密度；在各组加入单个核细胞悬液100μl，并在相应组加入PHA，每组设置4个平行孔，置于37℃、5％CO2培养箱中继续培养72h，收集上清；将试剂盒取出恢复室温，并配置样本稀释液，编号，洗板3次，加样100μl/孔，室温孵育2h；洗板3次，加入检测抗体100μl/孔，室温孵育1h；洗板3次，加入显色液200μl/孔，室温孵育15min；加入终止液50μl/孔，20min内读取450nm处的光吸收值；
使用以下公式计算淋巴细胞分泌TNF-α抑制率：抑制率＝1-[OD(PBMC+MSC+PHA)-OD(PBMC+MSC)]/[OD(PBMC+PHA)-OD(PBMC)]；
16)酶联免疫吸附法检测PTX3含量：将hAMMSCs接种至T25培养瓶中，加入MSC-T4完全培养基，在37℃、5％ CO2条件下培养48h后收集上清作为样品；将试剂盒的所有组分和待检样品恢复到室温，分别配制浓度为1600pg/mL，1200pg/mL，800pg/mL，400pg/mL，200pg/mL，100pg/mL，50pg/mL的标准品，以样品稀释液作为空白对照；取酶标条，按序编号，每孔中加100μl的捕获抗体溶液(2μg/mL)，4℃包被过夜；洗板三次后，每孔加入300μl的封闭液，加样后用封板膜封板后室温孵育1h(10×封闭液浓缩液用前需要用蒸馏水稀释)；洗板三次后，每孔加样100μl后用封板膜封板室温孵育2h；洗板三次后，每孔加入预先配制的检测抗体100μl，封板膜封板后室温孵育1h；洗板三次后，取显色A液与显色B液等体积充分混合，每孔加入200μl混合显色液，封板膜封板后，室温避光孵育20min；每孔加入50μl终止液，用酶标仪震动30s至显色均匀；读取450nm处的吸光度；据标准曲线拟合公式及样本吸光度计算出样本中PTX3的浓度；
17)PTX3含量的标准鉴定：通过SPSS26计算PTX3含量与淋巴细胞增殖抑制率Pearson相关性，并拟合相关性直线，通过已知的淋巴细胞增殖抑制率标准，计算当淋巴细胞增殖抑制率符合标准时PTX3的含量，从而建立有效性中PTX3的检测标准；
18)hAMMSCs的有效性检测标准，将hAMMSCs的有效性检测标准如下：淋巴细胞增殖抑制率>10％；Th1、Th17抑制率与Treg促进率均不低于30％；淋巴细胞分泌TNF-α抑制率>10％；PTX3含量≥2000pg/mL。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明所述的一种羊膜来源间充质干细胞的有效性质量控制方法，基于单细胞转录组测序技术检测脂肪、羊膜和脐带来源MSCs的基因表达，从整个转录组水平挖掘出hAMMSCs的特异性高表达基因。
2、本发明所述的一种羊膜来源间充质干细胞的有效性质量控制方法，PTX3是hAMMSCs较其它组织来源的关键特异性基因，以酶联免疫吸附法检测PTX3表达量作为hAMMSCs产品有效性的一项新质量标准，PTX3>2000pg/mL是hAMMSCs产品有效性的一项新质量标准。
3、本发明所述的一种羊膜来源间充质干细胞的有效性质量控制方法，提出酶联免疫吸附法检测PTX3作为hAMMSCs有效性的新质量控制指标，增加该标准后有助于确保hAMMSCs的治疗有效性。
附图说明
图1为本发明实施例所述的一种羊膜来源间充质干细胞的有效性质量控制方法的P5代羊膜间充质干细胞的光学显微镜照片及三系分化结果的图(图1-A为40×光学显微镜照片；图1-B为成脂分化、成骨分化和成软骨分化试验结果)；
图2为本发明实施例所述的一种羊膜来源间充质干细胞的有效性质量控制方法的羊膜间充质干细胞(AMMSC)、脂肪间充质干细胞(ADMSC)和脐带间充质干细胞(UCMSC)的单细胞转录组测序结果的图(图2-A为各来源间充质干细胞的UMAP分布；图2-B为脂肪、羊膜和脐带的部分特异性高表达基因)；
图3为本发明实施例所述的一种羊膜来源间充质干细胞的有效性质量控制方法的羊膜间充质干细胞与PTX3的关联结果的图(图3-A为单细胞转录组测序中PTX3在脂肪、羊膜和脐带组织来源间充质干细胞的表达水平；图3-B为羊膜(hAMMSCs)和脐带(hUCMSCs)来源间充质干细胞的PTX3检测结果；图3-C为羊膜来源间充质干细胞的种子库(P1)和制剂(P5)两种代次的PTX3检测结果；图3-D为羊膜来源间充质干细胞的PTX3表达量与淋巴细胞增值抑制率的相关性分析结果)。
具体实施方式
通过应连同所附图式一起阅读的以下具体实施方式将更完整地理解本发明。本文中揭示本发明的详细实施例；然而，应理解，所揭示的实施例仅具本发明的示范性，本发明可以各种形式来体现。因此，本文中所揭示的特定功能细节不应解释为具有限制性，而是仅解释为权利要求书的基础且解释为用于教示所属领域的技术人员在事实上任何适当详细实施例中以不同方式采用本发明的代表性基础。
以下通过实施例进一步详细描述本发明，但这些实施例不应认为是对本发明的限制。
实施例：
一种羊膜来源间充质干细胞的有效性质量控制方法，包括以下步骤：
1)羊膜组织采集、运输和保存：羊膜采集前进行供者筛选，整个采集过程严格执行无菌操作，样本采集后放入专用运输箱中，运送至实验室进行接收和质量检测；
2)原代细胞培养：将上步骤得到的合格的采集物传入细胞制备区内，并放置于超净工作台上；将胎儿面的羊膜组织剥离下来，清洗干净羊膜组织后并剪成1×1cm2的组织块转移至离心管中；用胰酶代替物TrypLE消化；清洗后再用胶原酶NB6至约95％羊膜组织消化完全为止；消化结束后两次重悬离心后取上清液送检，倒去剩余上清，重悬细胞，接种细胞至T225培养瓶(以下简称培养瓶)，加入MSC-T4完全培养基，将培养瓶转至CO2培养箱内；
3)原代细胞换液：将培养3天后的原代细胞从CO2培养箱内取出，倒掉培养瓶内培养基，培养瓶添加35mL MSC-T4完全培养基，将培养瓶转移至CO2培养箱内；
4)原代细胞传代：原代细胞培养5-7天后，取出培养瓶用0.9wt％氯化钠注射液润洗培养瓶，然后吸取预热的TrypLE使液体铺满培养瓶细胞贴附面，放入消化，消化结束后向培养瓶内添加MSC-T4完全培养基，离心后倒去上清，吸取MSC-T4完全培养基至离心管中重悬细胞，将细胞悬液接种至T225 cm2培养瓶内，加入35mL MSC-T4完全培养基，摇匀后将细胞转至CO2培养箱内；
5)种子细胞库建立：从CO2培养箱中取出培养瓶，倒掉培养瓶内培养基，晃润洗培养瓶，然后吸取预热的TrypLE至培养瓶内，消化后吸取MSC-T4完全培养基，终止消化，将细胞悬液转入离心管中，并吸取0.9wt％氯化钠注射液依次润洗培养瓶，转入上述离心管中，离心两次后；按照5×106个/mL/管的细胞冻存密度加入细胞悬液中吹打混匀后转移至冻存盒中；按照冻存程序进行降温，降温结束后将冻存盒转入待检罐中暂存，于检测合格后再将冻存盒中的冻存细胞转入液氮罐中；
6)种子细胞复苏：从种子细胞库液氮罐中取出种子细胞，迅速置于37℃恒温水浴锅内轻轻摇晃至无明显冰晶为止，按照0.89×104cell/cm2的接种密度将细胞悬液加入培养瓶内，根据培养瓶每瓶补分别加35mL MSC-T4完全培养基，摇匀后将细胞转至CO2培养箱内；
7)第一代(P1)传第二代(P2)细胞换液：将培养1天后的种子细胞从CO2培养箱内取出，倒掉培养瓶内培养基，加入新的完全培养基，将培养瓶转移至CO2培养箱内；
8)次代细胞传代培养：将培养3d后的细胞从取出，倒掉培养瓶内培养基，晃润洗培养瓶，然后吸取5mL TrypLE至培养瓶内，消化，吸取MSC-T4完全培养基，终止消化再吸取10mL 0.9wt％氯化钠注射液依次润洗培养瓶转入离心管；离心后倒去上清并重悬细胞，将细胞悬液接种至培养瓶内，每瓶补加35mL MSC-T4完全培养基，摇匀后将细胞转至CO2培养箱内；
9)细胞原液制备：将培养3天后的第五代(P5)细胞取出，倒掉细胞培养室内培养基，并摇晃润洗培养瓶，然后加入5mL已预热的TrypLE至培养瓶内，消化之后添加MSC-T4完全培养基终止，并用吸取10mL 0.9％氯化钠注射液润洗细胞培养室，再将润洗后的细胞悬液转入离心管中；离心后倒去上清，剩下的细胞沉淀即为羊膜间充质干细胞原液；
10)间充质干细胞(MSCs)的三系分化检测：
成脂分化检测标准操作：准备24孔板和离心管，按照细胞计数标准操作规程进行计数后取2.0×105个MSC至离心管内，加入MSC-T4完全培养基至5mL，吹打混匀；吸取细胞悬液0.5mL至每个鉴定孔内，将细胞转至37℃、5％CO2培养箱内；
成脂分化培养基配制：10％ Adipogenesis supplement+90％AdipogenesisDifferentiation Basal medium，充分混匀，4℃保存；待细胞汇合度达到70-80％开始诱导，记为Day 0，弃去实验孔上清液，添加0.5mL成脂分化培养基至实验孔内，将24孔板转至37℃、5％ CO2培养箱内；每3天实验孔更换1次成脂分化培养基，对照孔更换完全培养基；成脂分化培养至Day7-14时，在显微镜下可见明显的油滴，即进行油红O染色鉴定；弃除鉴定孔中上清液，加入0.5mL 4wt％PFA至鉴定孔内，固定20min；弃液后吸取0.5mL 60％(v/v)异丙醇至鉴定孔内，润洗1次；加入0.5mL油红O染液至鉴定孔内，染色15min；弃液后吸取0.5mL超纯水至鉴定孔内，润洗2次；加入0.5mL超纯水至鉴定孔内，荧光显微镜下观察并拍照；
成骨分化检测：准备24孔板和离心管，按照细胞计数标准操作规程进行计数后取细胞2.0×105至离心管内，加入MSC-T4完全培养基至5mL，吹打混匀；吸取细胞悬液0.5mL至每个鉴定孔内；将24孔板转至37℃、5％CO2培养箱内；
成骨分化培养基配制：10％ Osteogenesis supplement+90％OsteogenesisDifferentiation Basal medium，充分混匀，4℃保存；待细胞汇合度达到60-70％开始诱导，记为Day0，弃去实验孔中上清液，添加0.5mL成骨分化培养基至实验孔内，将24孔板转至37℃、5％ CO2培养箱内；每3天实验孔更换1次成骨分化培养基，对照孔更换完全培养基；成骨分化培养至Day14-21时，在显微镜下可见钙结节，即进行0.2％茜素红染色鉴定；弃除鉴定孔中上清液，加入0.5mL 4wt％PFA至鉴定孔内，固定20min；弃液后吸取超纯水0.5mL清洗鉴定孔1次；加入0.5mL 0.2％茜素红溶液至鉴定孔内，染色30min；弃液后吸取超纯水0.5mL清洗鉴定孔2次；加入0.5mL超纯水至鉴定孔内，荧光显微镜下观察并拍照；
成软骨分化检测：准备24孔板和离心管，按照细胞计数标准操作规程进行计数后取干细胞2.0×105至离心管内，加入MSC-T4完全培养基至5mL，吹打混匀；吸取干细胞悬液0.5mL至每个鉴定孔内；吸取0.5mL D-PBS至鉴定孔周围的孔内；将24孔板转至37℃、5％CO2培养箱内；成软骨分化培养基配制：10％ Chondrogenesis supplement+90％Chondrogenesis Differentiation Basal medium，充分混匀，4℃保存；待细胞汇合度达到60-70％开始诱导，记为Day0，弃去实验孔中上清液，添加0.5mL成软骨分化培养基至实验孔内，将24孔板转至37℃、5％CO2培养箱内；每3天实验孔更换1次成软骨分化培养基，对照孔更换完全培养基；成软骨分化培养至Day14-21时，在显微镜下可见球状细胞团，即进行阿利新蓝染色鉴定；弃除鉴定孔中上清液，加入0.5mL D-PBS清洗2次，加入0.5mL 4wt％PFA至鉴定孔内，固定20min；弃液后吸取超纯水0.5mL清洗鉴定孔1次；加入0.5mL阿利新蓝酸化液，浸泡5min；加入0.5mL阿利新蓝染色液至鉴定孔内，染色30min；弃液后吸取超纯水0.5mL清洗鉴定孔2次；加入0.5mL超纯水至鉴定孔内，荧光显微镜下观察并拍照；
11)间充质干细胞(MSCs)单细胞悬液制备：在显微镜下观察，当培养的细胞在培养皿底出现90％-95％融合时；去除培养基，加入杜氏磷酸盐缓冲液(Dulbecco's PhosphateBuffered Saline，DPBS)连续漂洗2遍；加入5mL胰蛋白酶溶液(0.25wt％胰蛋白酶-乙二胺四乙酸)，置于37℃消化；加入T4完全培养基至终止消化，细胞悬液转入15mL离心管中，400g离心3min，去除上清液；加入1mL无钙镁(DPBS)重悬，检测细胞浓度；加入无钙镁(DPBS)稀释至细胞浓度为3.5×105cell/mL；
12)单细胞转录组测序及生物信息学分析：将样本制备为单细胞悬液后，利用GEXSCOPE微流控芯片捕获单细胞，并将数百万个携带独特细胞标签的Barcoding Beads加入到芯片微孔中；细胞裂解后，对细胞及mRNA进行标记；收集芯片中的Barcoding Beads，将Barcoding Beads捕获的mRNA反转录为cDNA并扩增；将cDNA经过片段化、连接接头步骤后构建适用于illumina测序平台的测序文库；随后使用Singleron MatrixTM平台对样本进行单细胞转录组上机测序和质量控制；Seurat R包(Version 4.0.3，https://satijalab.org/seurat)用于进一步分析scRNA-seq数据的生物信息学分析，其中的findAllmarker函数用于识别hAMMSCs的特异性高表达基因，GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)和已有文献的结果用于筛选hAMMSCs关键基因；
13)淋巴细胞增殖抑制试验：将培养的第5代hAMMSCs消化、洗涤、计数后，MEM-α培养基调整细胞浓度，接种于96孔培养板，每孔100μL，置入37℃5％ CO2培养箱中；hAMMSCs培养4h后，用丝裂霉素C处理，然后用D-PBS清洗2遍，每孔加入新鲜培养基100μL，置入37℃5％CO2培养箱中培养过夜；次日上午采集10mL外周血，取50mL离心管，加入10mL外周血和10mLD-PBS，吹打混匀，取SepMate 50mL离心管，加入淋巴细胞分离液，然后沿管壁缓缓加入外周血和PBS混合液，1200g离心20min，取白膜层细胞，D-PBS洗涤，300g离心10min，分离收集人外周血单个核细胞，RPMI-1640培养基调节细胞密度；从培养箱中取出96孔培养板，去除培养基后在各组加入单个核细胞悬液100μL/孔，在相应组加入PHA；96孔板置于37℃5％CO2培养箱中孵育72h；加入Cell Viability试剂100μL/孔，震荡混匀2min，继续孵育10min，检测发光读数；待检细胞按照分组与PBMC以1:4比例共培养，分组：A.PBMC；B.PBMC+hAMMSCs；C.PBMC+MSC+PHA；D.PBMC+PHA；
以下公式用于计算淋巴细胞增殖抑制率：淋巴细胞增殖抑制率＝[1-(C-B)/(D-A)]*100％；
14)特定淋巴细胞亚群检测：将培养的第5代hAMMSCs消化、洗涤、计数后，MEM-α培养基调整细胞浓度，接种于6孔培养板，每孔3mL，置入37℃5％CO2培养箱中；hAMMSCs培养4h后，用丝裂霉素C处理，然后用D-PBS清洗两遍，每孔加入新鲜培养基3mL，置入37℃5％ CO2培养箱中培养过夜；次日上午采集30mL外周血，取50mL离心管2支，每支加入15mL外周血和15mL D-PBS，吹打混匀，取SepMate 50mL离心管2支，每支加入淋巴细胞分离液，然后沿管壁缓缓加入外周血和PBS混合液，1200g离心20min，取白膜层细胞，D-PBS洗涤，300g离心10min，分离收集人外周血单个核细胞，RPMI-1640培养基调节细胞密度；从培养箱中取出6孔培养板，弃液后在各组加入单个核细胞悬液3mL/孔，在相应组加入PHA，终浓度为10μg/mL；6孔板置于37℃5％ CO2培养箱中孵育72h；然后收集各组淋巴细胞用试剂盒检测Th1，Th17和Treg亚群的增殖抑制/促进率；
15)淋巴细胞分泌TNF-α抑制试验：将培养的hAMMSCs消化、洗涤、计数后，MSC-T4完全培养基调整细胞浓度，接种于96孔培养板，每孔100μl，置入37℃、5％ CO2培养箱中；hAMMSCs培养4h后，从培养箱中取出96孔板，用终浓度为丝裂霉素C处理，然后用D-PBS以200μl/孔清洗两遍；复苏人PBMC，300g离心10min，用RPMI-1640完全培养基调节细胞密度；在各组加入单个核细胞悬液100μl，并在相应组加入PHA，每组设置4个平行孔，置于37℃、5％CO2培养箱中继续培养72h，收集上清；将试剂盒取出恢复室温，并配置样本稀释液，编号，洗板3次，加样100μl/孔，室温孵育2h；洗板3次，加入检测抗体100μl/孔，室温孵育1h；洗板3次，加入显色液200μl/孔，室温孵育15min；加入终止液50μl/孔，20min内读取450nm处的光吸收值；
使用以下公式计算淋巴细胞分泌TNF-α抑制率：抑制率＝1-[OD(PBMC+MSC+PHA)-OD(PBMC+MSC)]/[OD(PBMC+PHA)-OD(PBMC)]；
16)酶联免疫吸附法检测PTX3含量：将hAMMSCs接种至T25培养瓶中，加入MSC-T4完全培养基，在37℃、5％ CO2条件下培养48h后收集上清作为样品；将试剂盒的所有组分和待检样品恢复到室温，分别配制浓度为1600pg/mL，1200pg/mL，800pg/mL，400pg/mL，200pg/mL，100pg/mL，50pg/mL的标准品，以样品稀释液作为空白对照；取酶标条，按序编号，每孔中加100μl的捕获抗体溶液(2μg/mL)，4℃包被过夜；洗板三次后，每孔加入300μl的封闭液，加样后用封板膜封板后室温孵育1h(10×封闭液浓缩液用前需要用蒸馏水稀释)；洗板三次后，每孔加样100μl后用封板膜封板室温孵育2h；洗板三次后，每孔加入预先配制的检测抗体100μl，封板膜封板后室温孵育1h；洗板三次后，取显色A液与显色B液等体积充分混合，每孔加入200μl混合显色液，封板膜封板后，室温避光孵育20min；每孔加入50μl终止液，用酶标仪震动30s至显色均匀；读取450nm处的吸光度；据标准曲线拟合公式及样本吸光度计算出样本中PTX3的浓度；
17)PTX3含量的标准鉴定：通过SPSS26计算PTX3含量与淋巴细胞增殖抑制率Pearson相关性，并拟合相关性直线，通过已知的淋巴细胞增殖抑制率标准，计算当淋巴细胞增殖抑制率符合标准时PTX3的含量，从而建立有效性中PTX3的检测标准；
18)hAMMSCs的有效性检测标准，将hAMMSCs的有效性检测标准如下：淋巴细胞增殖抑制率>10％；Th1、Th17抑制率与Treg促进率均不低于30％；淋巴细胞分泌TNF-α抑制率>10％；PTX3含量≥2000pg/mL。
图1为实施例所述的一种羊膜来源间充质干细胞的有效性质量控制方法的P5代羊膜间充质干细胞的光学显微镜照片及三系分化结果的图(图1-A为40×光学显微镜照片；图1-B为成脂分化、成骨分化和成软骨分化试验结果)；
图2为实施例所述的一种羊膜来源间充质干细胞的有效性质量控制方法的羊膜间充质干细胞(AMMSC)、脂肪间充质干细胞(ADMSC)和脐带间充质干细胞(UCMSC)的单细胞转录组测序结果的图(图2-A为各来源间充质干细胞的UMAP分布；图2-B为脂肪、羊膜和脐带的部分特异性高表达基因)；
图3为实施例所述的一种羊膜来源间充质干细胞的有效性质量控制方法的羊膜间充质干细胞与PTX3的关联结果的图(图3-A为单细胞转录组测序中PTX3在脂肪、羊膜和脐带组织来源间充质干细胞的表达水平；图3-B为羊膜(hAMMSCs)和脐带(hUCMSCs)来源间充质干细胞的PTX3检测结果；图3-C为羊膜来源间充质干细胞的种子库(P1)和制剂(P5)两种代次的PTX3检测结果；图3-D为羊膜来源间充质干细胞的PTX3表达量与淋巴细胞增值抑制率的相关性分析结果)。
本申请中使用的缩写及英文含义：
结果与讨论：
1、本发明所述的一种羊膜来源间充质干细胞(图1A-B)的有效性质量控制方法，通过单细胞转录组测序技术检测了脂肪、羊膜和脐带来源MSCs(图2A)，并通过R语言的Seurat软件包进行生物信息学分析确定了hAMMSCs的特异性高表达基因(图2B)，进一步通过数据库GeneCards检索基因功能并结合已有文献确定了PTX3是其中的关键基因，单细胞测序技术通过以单个细胞分辨率探索基因表达谱，较原有整个细胞群体的分辨率有较大提升，得到的结果更可靠。GeneCards数据库显示PTX3参与调节炎症和补体激活，同时还参与血管生成和组织重塑，在女性生育能力方面起保护作用。已有文献表明PTX3在防御感染先天免疫系统发挥重要作用，分泌的PTX3与DNA、组蛋白、抗微生物蛋白形成一个捕获微生物、富含抗菌蛋白的微环境，PTX3可以与真菌、细菌、病毒结合，促进免疫细胞吞噬微生物。在卵巢排卵、以及受精过程中发挥重要作用，相比于野生型小鼠，在PTX3敲除小鼠中在建模过程中会表现出更加严重急性肺损伤，推测PTX3可提供机体整体免疫能力，增加面对微生物感染防御能力，有效减少微生物感染风险。PTX3是PTX蛋白家族的成员，作为卵丘细胞-卵母细胞复合体扩张的标志基因在排卵中发挥重要作用。PTX3通过抑制FGF2的作用，抑制PI3K/AKT/mTOR和Erk1/2信号通路，从而调控奶山羊卵巢颗粒细胞的增殖、凋亡。此外，PTX3通过促进颗粒细胞中类固醇合成关键酶CYP19A1和CYP11A1，从而升高雌二醇E2和孕酮P4的分泌水平，这些文献的结果都说明PTX3对于抗细菌感染、女性生育力恢复具有极其重要的作用，是hAMMSCs中调节免疫的关键基因。试验验证了PTX3是hAMMSCs的特异性高表达基因，并发现PTX3在不同代次的hAMMSCs中具有极高的稳定性。通过Pearson相关性分析发现PTX3的含量与淋巴细胞增殖抑制率显著正相关，通过计算得到PTX3在高于2000pg/mL时能较好的匹配已有指标，从而设定PTX3的标准，在MSCs常规的有效性检测基础上，增加ELISA检测PTX3的含量，能在hAMMSCs自身的表达水平上进一步评估hAMMSCs的有效性。
2、本发明所述的一种羊膜来源间充质干细胞的有效性质量控制方法，通过单细胞转录组测序技术对脂肪、羊膜、脐带来源的MSCs进行检测并完成生物信息学分析，PTX3在hAMMSCs中的表达显著高于脂肪和脐带组织来源的MSCs(图3A)，发现PTX3是羊膜较脂肪和脐带组织来源的MSCs关键特异性基因。为了验证这一结果我们通过ELISA检测了羊膜和脐带来源的MSCs中PTX3的含量，发现hAMMSCs中PTX3的表达量显著高于脐带来源MSCs(图3B)。我们还检测了不同hAMMSCs代次中PTX3的表达量，发现PTX3在种子库(P1)和制剂(P5)中表达无显著差异(图3C)，说明在不同代次hAMMSCs中PTX3的表达具有较高的稳定性。随后基于多个样本的PTX3表达量与淋巴细胞增殖抑制率的Pearson相关性分析(图3D)，我们发现PTX3与淋巴细胞增殖抑制率呈显著正相关关系，得到相关性R＝0.74，显著性为P＝0.024。拟合相关性后，得到直线：y＝0.0009788×A+8.32，当淋巴细胞增殖抑制率>10％时，得到结果PTX3>1716.387pg/mL，为提高有效性，我们将该标准向上取整，则可以得到PTX3的有效性标准为2000pg/mL。
相关资料(文献、专利)
[1].Ling,L.,et al.,Human amnion-derived mesenchymal stem cell(hAD-MSC)transplantation improves ovarian function in rats with premature ovarianinsufficiency(POI)at least partly through a paracrine mechanism.Stem cellresearch&therapy,2019.10(1):p.46.
[2].Daigo,K.,A.Mantovani and B.Bottazzi,The yin-yang of longpentraxin PTX3 in inflammation and immunity.Immunology letters,2014.161(1):p.38-43.
[3].王沛婕,PTX3调控奶山羊卵巢颗粒细胞功能及分子机理的研究,2021,西北农林科技大学.
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。
Claims (3)
1.一种羊膜来源间充质干细胞的有效性质量控制方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)羊膜组织采集、运输和保存：羊膜采集前进行供者筛选，整个采集过程严格执行无菌操作，样本采集后放入专用运输箱中，运送至实验室进行接收和质量检测；
2)原代细胞培养：将上步骤得到的合格的采集物传入细胞制备区内，并放置于超净工作台上；将胎儿面的羊膜组织剥离下来，清洗干净羊膜组织后并剪成1×1cm2的组织块转移至离心管中；用胰酶代替物TrypLE消化；清洗后再用胶原酶NB6至约95％羊膜组织消化完全为止；消化结束后两次重悬离心后取上清液送检，倒去剩余上清，重悬细胞，接种细胞至T225培养瓶，以下简称培养瓶，加入MSC-T4完全培养基，将培养瓶转至CO2培养箱内；
3)原代细胞换液：将培养3天后的原代细胞从CO2培养箱内取出，倒掉培养瓶内培养基，培养瓶添加35mL MSC-T4完全培养基，将培养瓶转移至CO2培养箱内；
4)原代细胞传代：原代细胞培养5-7天后，取出培养瓶用0.9wt％氯化钠注射液润洗培养瓶，然后吸取预热的TrypLE使液体铺满培养瓶细胞贴附面，放入消化，消化结束后向培养瓶内添加MSC-T4完全培养基，离心后倒去上清，吸取MSC-T4完全培养基至离心管中重悬细胞，将细胞悬液接种至T225 cm2培养瓶内，加入35mL MSC-T4完全培养基，摇匀后将细胞转至CO2培养箱内；
5)种子细胞库建立：从CO2培养箱中取出培养瓶，倒掉培养瓶内培养基，晃润洗培养瓶，然后吸取预热的TrypLE至培养瓶内，消化后吸取MSC-T4完全培养基，终止消化，将细胞悬液转入离心管中，并吸取0.9wt％氯化钠注射液依次润洗培养瓶，转入上述离心管中，离心两次后；按照5×106个/mL/管的细胞冻存密度加入细胞悬液中吹打混匀后转移至冻存盒中；按照冻存程序进行降温，降温结束后将冻存盒转入待检罐中暂存，于检测合格后再将冻存盒中的冻存细胞转入液氮罐中；
6)种子细胞复苏：从种子细胞库液氮罐中取出种子细胞，迅速置于37℃恒温水浴锅内轻轻摇晃至无明显冰晶为止，按照0.89×104cell/cm2的接种密度将细胞悬液加入培养瓶内，根据培养瓶每瓶补分别加35mL MSC-T4完全培养基，摇匀后将细胞转至CO2培养箱内；
7)第一代(P1)传第二代(P2)细胞换液：将培养1天后的种子细胞从CO2培养箱内取出，倒掉培养瓶内培养基，加入新的完全培养基，将培养瓶转移至CO2培养箱内；
8)次代细胞传代培养：将培养3d后的细胞从取出，倒掉培养瓶内培养基，晃润洗培养瓶，然后吸取5mL TrypLE至培养瓶内，消化，吸取MSC-T4完全培养基，终止消化再吸取10mL0.9wt％氯化钠注射液依次润洗培养瓶转入离心管；离心后倒去上清并重悬细胞，将细胞悬液接种至培养瓶内，每瓶补加35mL MSC-T4完全培养基，摇匀后将细胞转至CO2培养箱内；
9)细胞原液制备：将培养3天后的第五代(P5)细胞取出，倒掉细胞培养室内培养基，并摇晃润洗培养瓶，然后加入5mL已预热的TrypLE至培养瓶内，消化之后添加MSC-T4完全培养基终止，并用吸取10mL 0.9％氯化钠注射液润洗细胞培养室，再将润洗后的细胞悬液转入离心管中；离心后倒去上清，剩下的细胞沉淀即为羊膜间充质干细胞原液；
10)间充质干细胞的三系分化检测：
成脂分化检测标准操作：准备24孔板和离心管，按照细胞计数标准操作规程进行计数后取2.0×105个MSC至离心管内，加入MSC-T4完全培养基至5mL，吹打混匀；吸取细胞悬液0.5mL至每个鉴定孔内，将细胞转至37℃、5％CO2培养箱内；
成脂分化培养基配制：10％Adipogenesis supplement+90％AdipogenesisDifferentiation Basal medium，充分混匀，4℃保存；待细胞汇合度达到70-80％开始诱导，记为Day 0，弃去实验孔上清液，添加0.5mL成脂分化培养基至实验孔内，将24孔板转至37℃、5％CO2培养箱内；每3天实验孔更换1次成脂分化培养基，对照孔更换完全培养基；成脂分化培养至Day7-14时，在显微镜下可见明显的油滴，即进行油红O染色鉴定；弃除鉴定孔中上清液，加入0.5mL 4wt％聚羟基脂肪酸酯至鉴定孔内，固定20min；弃液后吸取0.5mL60％v/v异丙醇至鉴定孔内，润洗1次；加入0.5mL油红O染液至鉴定孔内，染色15min；弃液后吸取0.5mL超纯水至鉴定孔内，润洗2次；加入0.5mL超纯水至鉴定孔内，荧光显微镜下观察并拍照；
成骨分化检测：准备24孔板和离心管，按照细胞计数标准操作规程进行计数后取细胞2.0×105至离心管内，加入MSC-T4完全培养基至5mL，吹打混匀；吸取细胞悬液0.5mL至每个鉴定孔内；将24孔板转至37℃、5％CO2培养箱内；
成骨分化培养基配制：10％Osteogenesis supplement+90％OsteogenesisDifferentiation Basal medium，充分混匀，4℃保存；待细胞汇合度达到60-70％开始诱导，记为Day0，弃去实验孔中上清液，添加0.5mL成骨分化培养基至实验孔内，将24孔板转至37℃、5％CO2培养箱内；每3天实验孔更换1次成骨分化培养基，对照孔更换完全培养基；成骨分化培养至Day14-21时，在显微镜下可见钙结节，即进行0.2％茜素红染色鉴定；弃除鉴定孔中上清液，加入0.5mL 4wt％PFA至鉴定孔内，固定20min；弃液后吸取超纯水0.5mL清洗鉴定孔1次；加入0.5mL 0.2％茜素红溶液至鉴定孔内，染色30min；弃液后吸取超纯水0.5mL清洗鉴定孔2次；加入0.5mL超纯水至鉴定孔内，荧光显微镜下观察并拍照；
成软骨分化检测：准备24孔板和离心管，按照细胞计数标准操作规程进行计数后取干细胞2.0×105至离心管内，加入MSC-T4完全培养基至5mL，吹打混匀；吸取干细胞悬液0.5mL至每个鉴定孔内；吸取0.5mL D-PBS至鉴定孔周围的孔内；将24孔板转至37℃、5％CO2培养箱内；成软骨分化培养基配制：10％Chondrogenesis supplement+90％ChondrogenesisDifferentiation Basal medium，充分混匀，4℃保存；待细胞汇合度达到60-70％开始诱导，记为Day0，弃去实验孔中上清液，添加0.5mL成软骨分化培养基至实验孔内，将24孔板转至37℃、5％CO2培养箱内；每3天实验孔更换1次成软骨分化培养基，对照孔更换完全培养基；成软骨分化培养至Day14-21时，在显微镜下可见球状细胞团，即进行阿利新蓝染色鉴定；弃除鉴定孔中上清液，加入0.5mL D-PBS清洗2次，加入0.5mL 4wt％PFA至鉴定孔内，固定20min；弃液后吸取超纯水0.5mL清洗鉴定孔1次；加入0.5mL阿利新蓝酸化液，浸泡5min；加入0.5mL阿利新蓝染色液至鉴定孔内，染色30min；弃液后吸取超纯水0.5mL清洗鉴定孔2次；加入0.5mL超纯水至鉴定孔内，荧光显微镜下观察并拍照；
11)间充质干细胞单细胞悬液制备：在显微镜下观察，当培养的细胞在培养皿底出现90％-95％融合时；去除培养基，加入杜氏磷酸盐缓冲液连续漂洗2遍；加入5mL胰蛋白酶溶液，0.25wt％胰蛋白酶-乙二胺四乙酸，置于37℃消化；加入T4完全培养基至终止消化，细胞悬液转入15mL离心管中，400g离心3min，去除上清液；加入1mL无钙镁重悬，检测细胞浓度；加入无钙镁稀释至细胞浓度为3.5×105cell/mL；
12)单细胞转录组测序及生物信息学分析：将样本制备为单细胞悬液后，利用GEXSCOPE微流控芯片捕获单细胞，并将数百万个携带独特细胞标签的Barcoding Beads加入到芯片微孔中；细胞裂解后，对细胞及mRNA进行标记；收集芯片中的Barcoding Beads，将Barcoding Beads捕获的mRNA反转录为cDNA并扩增；将cDNA经过片段化、连接接头步骤后构建适用于illumina测序平台的测序文库；随后使用Singleron MatrixTM平台对样本进行单细胞转录组上机测序和质量控制；Seurat R包Version 4.0.3，https://satijalab.org/seurat用于进一步分析scRNA-seq数据的生物信息学分析，其中的findAllmarker函数用于识别hAMMSCs的特异性高表达基因，GeneCards数据库https://www.genecards.org/和已有文献的结果用于筛选hAMMSCs关键基因；
13)淋巴细胞增殖抑制试验：将培养的第5代hAMMSCs消化、洗涤、计数后，MEM-α培养基调整细胞浓度，接种于96孔培养板，每孔100μL，置入37℃5％CO2培养箱中；hAMMSCs培养4h后，用丝裂霉素C处理，然后用D-PBS清洗2遍，每孔加入新鲜培养基100μL，置入37℃5％CO2培养箱中培养过夜；次日上午采集10mL外周血，取50mL离心管，加入10mL外周血和10mL D-PBS，吹打混匀，取SepMate 50mL离心管，加入淋巴细胞分离液，然后沿管壁缓缓加入外周血和PBS混合液，1200g离心20min，取白膜层细胞，D-PBS洗涤，300g离心10min，分离收集人外周血单个核细胞，RPMI-1640培养基调节细胞密度；从培养箱中取出96孔培养板，去除培养基后在各组加入单个核细胞悬液100μL/孔，在相应组加入PHA；96孔板置于37℃5％CO2培养箱中孵育72h；加入CellViability试剂100μL/孔，震荡混匀2min，继续孵育10min，检测发光读数；待检细胞按照分组与PBMC以1:4比例共培养，分组：A.PBMC；B.PBMC+hAMMSCs；C.PBMC+MSC+PHA；D.PBMC+PHA；
以下公式用于计算淋巴细胞增殖抑制率：淋巴细胞增殖抑制率＝[1-(C-B)/(D-A)]*100％；
14)特定淋巴细胞亚群检测：将培养的第5代hAMMSCs消化、洗涤、计数后，MEM-α培养基调整细胞浓度，接种于6孔培养板，每孔3mL，置入37℃5％CO2培养箱中；hAMMSCs培养4h后，用丝裂霉素C处理，然后用D-PBS清洗两遍，每孔加入新鲜培养基3mL，置入37℃5％CO2培养箱中培养过夜；次日上午采集30mL外周血，取50mL离心管2支，每支加入15mL外周血和15mLD-PBS，吹打混匀，取SepMate 50mL离心管2支，每支加入淋巴细胞分离液，然后沿管壁缓缓加入外周血和PBS混合液，1200g离心20min，取白膜层细胞，D-PBS洗涤，300g离心10min，分离收集人外周血单个核细胞，RPMI-1640培养基调节细胞密度；从培养箱中取出6孔培养板，弃液后在各组加入单个核细胞悬液3mL/孔，在相应组加入PHA，终浓度为10μg/mL；6孔板置于37℃5％CO2培养箱中孵育72h；然后收集各组淋巴细胞用试剂盒检测Th1，Th17和Treg亚群的增殖抑制/促进率；
15)淋巴细胞分泌TNF-α抑制试验：将培养的hAMMSCs消化、洗涤、计数后，MSC-T4完全培养基调整细胞浓度，接种于96孔培养板，每孔100μl，置入37℃、5％CO2培养箱中；hAMMSCs培养4h后，从培养箱中取出96孔板，用终浓度为丝裂霉素C处理，然后用D-PBS以200μl/孔清洗两遍；复苏人PBMC，300g离心10min，用RPMI-1640完全培养基调节细胞密度；在各组加入单个核细胞悬液100μl，并在相应组加入PHA，每组设置4个平行孔，置于37℃、5％CO2培养箱中继续培养72h，收集上清；将试剂盒取出恢复室温，并配置样本稀释液，编号，洗板3次，加样100μl/孔，室温孵育2h；洗板3次，加入检测抗体100μl/孔，室温孵育1h；洗板3次，加入显色液200μl/孔，室温孵育15min；加入终止液50μl/孔，20min内读取450nm处的光吸收值；
使用以下公式计算淋巴细胞分泌TNF-α抑制率：抑制率＝1-[OD(PBMC+MSC+PHA)-OD(PBMC+MSC)]/[OD(PBMC+PHA)-OD(PBMC)]；
16)酶联免疫吸附法检测PTX3含量：将hAMMSCs接种至T25培养瓶中，加入MSC-T4完全培养基，在37℃、5％CO2条件下培养48h后收集上清作为样品；将试剂盒的所有组分和待检样品恢复到室温，分别配制浓度为1600pg/mL，1200pg/mL，800pg/mL，400pg/mL，200pg/mL，100pg/mL，50pg/mL的标准品，以样品稀释液作为空白对照；取酶标条，按序编号，每孔中加100μl的捕获抗体溶液，4℃包被过夜；洗板三次后，每孔加入300μl的封闭液，加样后用封板膜封板后室温孵育1h；洗板三次后，每孔加样100μl后用封板膜封板室温孵育2h；洗板三次后，每孔加入预先配制的检测抗体100μl，封板膜封板后室温孵育1h；洗板三次后，取显色A液与显色B液等体积充分混合，每孔加入200μl混合显色液，封板膜封板后，室温避光孵育20min；每孔加入50μl终止液，用酶标仪震动30s至显色均匀；读取450nm处的吸光度；据标准曲线拟合公式及样本吸光度计算出样本中PTX3的浓度；
17)PTX3含量的标准鉴定：通过SPSS26计算PTX3含量与淋巴细胞增殖抑制率Pearson相关性，并拟合相关性直线，通过已知的淋巴细胞增殖抑制率标准，计算当淋巴细胞增殖抑制率符合标准时PTX3的含量，从而建立有效性中PTX3的检测标准；
18)hAMMSCs的有效性检测标准，如下：淋巴细胞增殖抑制率>10％；Th1、Th17抑制率与Treg促进率均不低于30％；淋巴细胞分泌TNF-α抑制率>10％；PTX3含量≥2000pg/mL。
2.根据权利要求1所述的一种羊膜来源间充质干细胞的有效性质量控制方法，其特征在于：步骤16)所述的每孔中加100μl的捕获抗体溶液，其中捕获抗体溶液浓度是2μg/mL。
3.根据权利要求1所述的一种羊膜来源间充质干细胞的有效性质量控制方法，其特征在于：步骤16)所述的加样后用封板膜封板后室温孵育1h，其中使用的10×封闭液浓缩液用前需要用蒸馏水稀释。
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