CN117512050A - 一种利用timp1筛选有效治疗骨关节炎的间充质干细胞的方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种利用TIMP1筛选有效治疗骨关节炎的间充质干细胞的方法及应用，属于生物药物技术领域。本发明基于符合质量检测和有效性常规检测标准的人脐带间充质干细胞培养上清与白介素‑1β(IL‑1β)刺激正常人软骨细胞建立的软骨细胞炎症模型进行共培养，通过CCK‑8细胞增殖检测试剂盒检测共培养48h后软骨细胞活率、实时荧光定量PCR(qPCR)检测金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP1)表达情况，并补充检测基质金属蛋白酶13(MMP13)表达进行验证，从而建立一种人脐带来源间充质干细胞治疗骨关节炎的有效性指标，有助于确保间充质干细胞治疗骨关节炎的有效性。

Description

一种利用TIMP1筛选有效治疗骨关节炎的间充质干细胞的方 法及应用
技术领域
本发明属于生物药物技术领域，具体涉及一种利用TIMP1筛选有效治疗骨关节炎的间充质干细胞的方法及应用。
背景技术
骨性关节炎是一种退行性骨关节病，系由于增龄、肥胖、劳损创伤、关节先天性异常、关节畸形等诸多因素引起的关节软骨退化损伤、关节边缘和软骨下骨反应性增生。临床表现为缓慢发展的关节疼痛、压痛、僵硬、关节肿胀、活动受限和关节畸形等。现有临床治疗手段有限，效果不佳。早期研究发现，MSCs通过旁分泌功能可改善关节炎症调节酶活性进而减少软骨基质流失，降低关节软骨细胞的调亡。
基质金属蛋白酶(MMPs)由于其消化胶原纤维和蛋白多糖的能力，被认为是与膝关节骨性关节炎(Osteoarthritis，OA)发病机制相关的最重要的分解代谢酶。MMP13是MMP家族中与胶原基质重组相关的主要胶原酶。现有文献涉及MMP13表达量的变化均为下调有效，主要是由于MMP13的本质特性决定的，它是一种胶原酶。利用检测MMP13的表达量的方法判断膝关节骨性关节炎是否实现有效治疗是公知的判断标准。
间充质干细胞(MSCs)可以从骨髓、脂肪组织和脐带等组织中分离出来,特别是hUC-MSCs，其来源于废弃脐带组织，具有增殖能力强、低免疫源性等优势，疾病治疗效果明显，被认为是治疗各种退行性和炎症性疾病的理想细胞来源。尽管目前常利用间充质干细胞进行炎症性疾病的治疗在现有技术中报道，但由于不同批次的间充质干细胞品质不一致，而MSCs的质量控制常规检测(细胞形态及活率检测、细胞表面标志物检测、间充质干细胞(MSCs)的三系分化检测)和有效性常规检测(淋巴细胞增殖抑制试验、特定淋巴细胞亚群检测、淋巴细胞分泌TNF-α抑制试验)无法筛选得到有效治疗膝关节骨性关节炎的间充质干细胞。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种利用TIMP1筛选有效治疗骨关节炎的间充质干细胞的方法，本发明以金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP1)表达量为有效性指标，根据间充质干细胞共培养的炎症软骨细胞中TIMP1是否存在差异性表达，从而判断间充质干细胞的疾病治疗的有效性。
本发明提供的一种利用TIMP1筛选有效治疗骨关节炎的间充质干细胞的方法，包括以下步骤：
将间充质干细胞或间充质干细胞的外泌体和炎症软骨细胞共培养，分离共培养的炎症软骨细胞，检测TIMP1的表达水平，根据所述TIMP1的表达水平判断间充质干细胞的疾病治疗有效性：
当共培养的炎症软骨细胞中TIMP1的表达水平与炎症软骨细胞相比显著性上调时，表明间充质干细胞为有效治疗骨关节炎。
优选的，所述间充质干细胞包括以下至少一种：人脐带来源的间充质干细胞、人羊膜来源的间充质干细胞和人脂肪来源的间充质干细胞。
优选的，所述炎症软骨细胞是利用白介素-1β刺激正常人软骨细胞得到。
优选的，所述白细胞介素1β的终浓度为10～20ng/ml。
优选的，所述人软骨细胞的培养时间为45～50h。
优选的，所述共培养的时间为45～50h。
优选的，还包括对判断结果进行验证；
所述验证的方法为检测共培养的炎症软骨细胞中MMP13的表达水平，根据共培养的炎症软骨细胞中MMP13的表达水平判断检测结果的有效性：
当共培养的炎症软骨细胞中MMP13的表达水平与炎症软骨细胞相比显著性下调时，表明所述方法筛选的间充质干细胞为有效治疗骨关节炎的细胞。
优选的，所述间充质干细胞还包括质量控制检测和/或有效性常规检测；
所述质量控制检测包括以下至少一种项目：细胞形态及活率检测、细胞表面标志物检测、间充质干细胞的三系分化检测；
所述有效性常规检测包括以下至少一种项目：淋巴细胞增殖抑制试验、特定淋巴细胞亚群检测和淋巴细胞分泌TNF-α抑制试验。
本发明所述方法筛选的间充质干细胞在制备预防和/或治疗骨关节炎的药物中的应用。
本发明提供的一种利用TIMP1筛选有效治疗骨关节炎的间充质干细胞的方法，包括以下步骤：将间充质干细胞或间充质干细胞的外泌体和炎症软骨细胞共培养，分离共培养的炎症软骨细胞，检测TIMP1的表达水平，根据所述TIMP1的表达水平判断间充质干细胞的疾病治疗有效性：当共培养的炎症软骨细胞中TIMP1的表达水平与炎症软骨细胞相比显著性上调时，表明间充质干细胞为有效治疗骨关节炎。实验表明，与对照组和单独IL-1β处理组相比，脐带间充质干细胞培养上清与IL-1β共同处理的人软骨细胞中TIMP1的mRNA表达明显上调。同时由于基质金属蛋白酶(MMPs)具有消化胶原纤维和蛋白多糖的能力，被认为是与OA发病机制相关的最重要的分解代谢酶，MMP13是MMP家族中与胶原基质重组相关的主要胶原酶，因此以MMP13作为验证的筛选方法成立与否的检测指标。验证实验表明，单独IL-1β处理组中软骨细胞中MMP13的mRNA表达显著上调，而间充质干细胞培养上清与IL-1β共同处理的人软骨细胞中的MMP13的mRNA表达降低，MMP13低表达结果说明间充质干细胞具有有效治疗骨关节炎的效果，与TIMP1的高表达一致。因此，本发明从细胞层面进行药效检测，说服力强，同时补充相关基因检测试验，使人脐带来源间充质干细胞治疗骨关节炎的有效性得到有力支撑，同时有助于确保间充质干细胞治疗骨关节炎有效性。
附图说明
图1为三批次人脐带间充质干细胞的形态观察图；
图2为三批次人脐带间充质干细胞的成脂分化结果；
图3为三批次人脐带间充质干细胞的成骨分化结果；
图4为三批次人脐带间充质干细胞的成软骨分化结果；
图5为IL-1β刺激人软骨细胞48h后CCK-8检测结果；
图6为培养上清对IL-1β刺激下人软骨细胞中TIMP1的mRNA表达结果；
图7为I培养上清对IL-1β刺激下人软骨细胞中MMP13的mRNA表达结果；
图8为对比例1中IL-1β刺激人软骨细胞48h后CCK-8检测结果；
图9为对比例1中培养上清对IL-1β刺激下人软骨细胞中TIMP1和MMP13的mRNA表达结果。
具体实施方式
本发明提供的一种利用TIMP1筛选有效治疗骨关节炎的间充质干细胞的方法，包括以下步骤：
将间充质干细胞或间充质干细胞的外泌体和炎症软骨细胞共培养，分离共培养的炎症软骨细胞，检测TIMP1的表达水平，根据所述TIMP1的表达水平判断间充质干细胞的疾病治疗有效性：
当共培养的炎症软骨细胞中TIMP1的表达水平与炎症软骨细胞相比显著性上调时，表明间充质干细胞为有效治疗骨关节炎。
在本发明中，所述间充质干细胞优选包括以下至少一种：人脐带来源的间充质干细胞、人羊膜来源的间充质干细胞和人脂肪来源的间充质干细胞。本发明实施例中，以人脐带来源的间充质干细胞来说明筛选有效治疗骨关节炎的方法。人脐带来源的间充质干细胞的来源购自湖南源品细胞生物科技有限公司。
在本发明中，所述炎症软骨细胞优选是利用白介素1β刺激正常人软骨细胞得到。所述白细胞介素1β的终浓度优选为10～20ng/ml。所述人软骨细胞的培养时间优选为45～50h，更优选为48h。本发明确定一种人脐带来源间充质干细胞治疗骨关节炎的有效性指标。IL-1β可通过激发人软骨细胞炎症诱导细胞衰老凋亡。在体外采用IL-1β诱导人软骨细胞损伤，模拟骨关节炎患者软骨细胞在炎症环境下炎症模型。
在本发明中，所述炎症软骨细胞在含外泌体的间充质干细胞培养上清中的终密度优选为(1～1.5)×105/ml、更优选为1.2×105/ml。本发明对所述间充质干细胞的外泌体溶液的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的外泌体制备方法即可。在本发明实施例中，所述间充质干细胞的外泌体溶液的制备方法是将间充质干细胞进行培养，离心收集上清即可。所述间充质干细胞的接种密度优选为0.89×104/cm2。所述培养的时间优选为3天。所述离心的转速优选为2500rpm，所述离心的时间优选为10min。所述共培养时，所用的培养基优选为MSC-T4完全培养基。所述共培养的时间优选为45～50h，更优选为48h。
在本发明中，优选还包括对判断结果进行验证；
所述验证的方法优选为检测共培养的炎症软骨细胞中MMP13的表达水平，根据共培养的炎症软骨细胞中MMP13的表达水平判断检测结果的有效性：
当共培养的炎症软骨细胞中MMP13的表达水平与炎症软骨细胞相比显著性下调时，表明所述方法筛选的间充质干细胞为有效治疗骨关节炎的细胞。
在本发明中，由于基质金属蛋白酶(MMPs)具有消化胶原纤维和蛋白多糖的能力，被认为是与OA发病机制相关的最重要的分解代谢酶。金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMPs)可以抑制MMP的活性”，MMP13是MMP家族中与胶原基质重组相关的主要胶原酶，是本领域公知的有效治疗标准。当共培养的炎症软骨细胞中TIMP1上调，MMP13下调表达，说明TIMP1是MMP13的抑制剂，因此TIMP1上调则MMP13下调。
在本发明中，所述间充质干细胞优选还包括质量控制检测和/或有效性常规检测。所述质量控制检测优选包括以下至少一种项目：细胞形态及活率检测、细胞表面标志物检测、间充质干细胞的三系分化检测。所述有效性常规检测优选包括以下至少一种项目：淋巴细胞增殖抑制试验、特定淋巴细胞亚群检测和淋巴细胞分泌TNF-α抑制试验。
鉴于本发明筛选的间充质干细胞为有效治疗骨关节炎的细胞，因此本发明提供了所述方法筛选的间充质干细胞在制备预防和/或治疗骨关节炎的药物中的应用。
下面结合实施例对本发明提供的一种利用TIMP1筛选有效治疗骨关节炎的间充质干细胞的方法及应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一、根据中国食品药品检定研究院的要求，目前MSCs的质量控制常规检测使用如下方法：
1.细胞形态及活率检测：
1.1试验使用显微镜观察显微镜观察，使用细胞计数仪进行活细胞计数、细胞活率和细胞直径。细胞形态检测：从种子库取一支冻存管置37℃恒温水浴箱中浸泡2min复苏，将冻存管内容物全部转移到15ml离心管，向里加入4ml MSC-T4完全培养基(MSC-T4+5％UltraGRO+1％L-glutamine)重悬，300g离心5min，去上清液，再用1ml MSC-T4完全培养基重悬，取备用细胞1×106接种于T25细胞培养瓶，添加3ml MSC-T4完全培养基后于37℃、5％CO2培养箱中培养。待培养48h后，从培养箱中取出培养瓶置于显微镜置物台上以10倍物镜观察细胞形态并拍照记录。
1.2细胞活率检测：从种子库取一支冻存管置37℃恒温水浴箱中浸泡2min复苏，混匀。打开计数仪：按下计数仪上的ON/OFF按钮，指纹处亮蓝色表示仪器已打开。从混匀的细胞悬液中吸取30μl。吸取AO/PI染料30μl，与细胞悬液充分混匀。用移液枪吸取混匀后的细胞悬液加入样品板，每槽20μl，共两个槽。选择“AO/PI细胞活率”。插入计数板。自动计算计数结果。
2.细胞表面标志物检测：试验使用流式细胞仪进行细胞表面标志物检测。
准备相应数量的EP管，每管标记样品名称和测定项目，分别在各管中加入相应对照抗体、阳性标志物抗体与阴性标志物抗体。在上述EP管中分别加入细胞悬液100μl，细胞数约5×105，吹打混匀，室温避光孵育30min。孵育结束后各加1ml D-PBS，混匀后300g离心5min。弃上清，各管中再分别加入1ml D-PBS，混匀后300g离心5min。弃上清，各管中分别加入0.5ml D-PBS，混匀，过滤后转移至流式管后上机测定。
3.间充质干细胞(MSCs)的三系分化检测：
成脂分化检测标准操作：准备24孔板和离心管，按照细胞计数标准操作规程进行计数后取2×105个细胞至离心管内，加入MSC-T4完全培养基至5ml，吹打混匀；吸取细胞悬液0.5ml至每个鉴定孔内，将细胞转至37℃、5％CO2培养箱内；
成脂分化培养基配制：10％成脂分化因子补充剂(Adipogenesis supplement)+90％成脂分化培养基(Adipogenesis Differentiation Basal medium)，充分混匀，4℃保存；待细胞汇合度达到70％～80％开始诱导，记为Day 0，弃去实验孔上清液，添加0.5ml成脂分化培养基至实验孔内，将24孔板转至37℃、5％CO2培养箱内；每3天实验孔更换1次成脂分化培养基，对照孔更换完全培养基；成脂分化培养至Day7-14时，在显微镜下可见明显的油滴，即进行油红O染色鉴定；弃除鉴定孔中上清液，加入0.5ml 4wt％聚羟基脂肪酸酯(PFA)至鉴定孔内，固定20min；弃液后吸取0.5ml 60％(v/v)异丙醇至鉴定孔内，润洗1次；加入0.5ml油红O染液至鉴定孔内，染色15min；弃液后吸取0.5ml超纯水至鉴定孔内，润洗2次；加入0.5ml超纯水至鉴定孔内，荧光显微镜下观察并拍照。
成骨分化检测：准备24孔板和离心管，按照细胞计数标准操作规程进行计数后取细胞2×105至离心管内，加入MSC-T4完全培养基至5ml，吹打混匀；吸取细胞悬液0.5ml至每个鉴定孔内；将24孔板转至37℃、5％CO2培养箱内；
成骨分化培养基配制：10％Osteogenesis supplement+90％OsteogenesisDifferentiation Basal medium，充分混匀，4℃保存；待细胞汇合度达到60-70％开始诱导，记为Day0，弃去实验孔中上清液，添加0.5ml成骨分化培养基至实验孔内，将24孔板转至37℃、5％CO2培养箱内；每3天实验孔更换1次成骨分化培养基，对照孔更换完全培养基；成骨分化培养至Day14-21时，在显微镜下可见钙结节，即进行0.2％茜素红染色鉴定；弃除鉴定孔中上清液，加入0.5mL4wt％PFA至鉴定孔内，固定20min；弃液后吸取超纯水0.5ml清洗鉴定孔1次；加入0.5ml 0.2％茜素红溶液至鉴定孔内，染色30min；弃液后吸取超纯水0.5mL清洗鉴定孔2次；加入0.5ml超纯水至鉴定孔内，荧光显微镜下观察并拍照。
成软骨分化检测：准备24孔板和离心管，按照细胞计数标准操作规程进行计数后取干细胞2×105至离心管内，加入MSC-T4完全培养基至5ml，吹打混匀；吸取干细胞悬液0.5ml至每个鉴定孔内；吸取0.5ml D-PBS至鉴定孔周围的孔内；将24孔板转至37℃、5％CO2培养箱内；
成软骨分化培养基配制：10％Chondrogenesis supplement+90％ChondrogenesisDifferentiation Basal medium，充分混匀，4℃保存；待细胞汇合度达到60-70％开始诱导，记为Day0，弃去实验孔中上清液，添加0.5ml成软骨分化培养基至实验孔内，将24孔板转至37℃、5％CO2培养箱内；每3天实验孔更换1次成软骨分化培养基，对照孔更换完全培养基；成软骨分化培养至Day14-21时，在显微镜下可见球状细胞团，即进行阿利新蓝染色鉴定；弃除鉴定孔中上清液，加入0.5ml D-PBS清洗2次，加入0.5ml 4wt％PFA至鉴定孔内，固定20min；弃液后吸取超纯水0.5ml清洗鉴定孔1次；加入0.5ml阿利新蓝酸化液，浸泡5min；加入0.5ml阿利新蓝染色液至鉴定孔内，染色30min；弃液后吸取超纯水0.5ml清洗鉴定孔2次；加入0.5ml超纯水至鉴定孔内，荧光显微镜下观察并拍照。
二、根据中国食品药品检定研究院的要求，目前MSCs的有效性常规检测使用如下方法：
1、淋巴细胞增殖抑制试验：试验采用hUC-MSC与外周血单个核细胞(Peripheralblood mononuclear cell，PBMC)共培养后，使用酶化学发光法(Cell ViabilityAssay)检测淋巴细胞增殖抑制率。化学发光法主要是依据化学检测体系中待测物浓度与体系的化学发光强度在一定条件下呈线性定量关系的原理，利用仪器对体系化学发光强度的检测，而确定待测物含量的一种痕量分析方法。Cell Viability Assay是通过定量存在的腺嘌呤核苷三磷酸(Adenosine triphosphate，ATP)(它是新陈代谢活跃细胞存在的信号)，测定培养物中活细胞数量的均质方法，将培养的第5代hUC-MSC消化、洗涤、计数后，接种至96孔培养板，置入37℃5％CO2培养箱中；培养4h后，用丝裂霉素C处理后，用杜氏磷酸缓冲液(Dulbecco's Phosphate-Buffered Salin，D-PBS)清洗2遍，每孔加入新鲜培养基，置入37℃5％CO2培养箱中培养过夜；次日上午采集外周血，分离单个核细胞；从培养箱中取出96孔培养板，去除培养基后在各组加入分离的单个核细胞悬液，在相应组加入聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates，PHA)；96孔板置于37℃5％CO2培养箱中孵育72h，加入CellViability试剂，震荡混匀2min，继续孵育10min，检测发光读数。
2、特定淋巴细胞亚群检测：特定淋巴细胞亚群检测采用流式细胞仪技术进行检测。流式细胞仪是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。流式细胞仪技术是通过制备单细胞悬液，用特异性荧光染料标记的抗体进行染色，经染色后的待测细胞在一定气体压力下被压入流动室，在鞘液的包裹下细胞呈单行排列，依次通过检测区域，在激光束的照射下细胞会产生散射光和激发荧光；这两种信号会同时被光电倍增管接收。接收后可转换为电信号，通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号，进行分析，从而达到分选细胞亚群的功能；通过hUC-MSC与外周血单个核细胞共培养后，制备成单细胞悬液，使用淋巴细胞用试剂盒进行流式细胞仪技术检测，然后收集各组淋巴细胞用试剂盒检测Th1，Th17和Treg亚群的增殖抑制率见公式I。
抑制率＝1-[RLUs(PBMC+MSC+PHA)-RLUs(PBMC+MSC)]/[RLUs(PBMC+PHA)-RLUs(PBMC)]公式I。
3、淋巴细胞分泌TNF-α抑制试验：淋巴细胞分泌肿瘤坏死因子α(Tumor NecrosisFactor-α，TNF-α)抑制试验采用酶联免疫吸附法检测淋巴细胞共培养后分泌的TNF-α含量。酶联免疫吸附法是把抗原--抗体的免疫反应与酶的催化反应相互结合而发展起来的一种综合性技术，它的灵敏度高，特异性强，因而是近年来病毒检测方法中发展最快、应用最广的一种方法。TNF-αELISA试剂盒是往预先包被人TNF-α捕获抗体的微孔中依次加入样品、不同浓度的标准品，经过孵育并彻底洗涤，加入辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)标记的检测抗体，用底物四甲基联苯胺(Tetramethylbenzidine，TMB)显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样本中的TNF-α浓度呈正相关。用酶标仪在450nm波长处测吸光度(optical density，OD)值，用公式II计算出淋巴细胞分泌TNF-α的抑制率。
TNF-α抑制率＝1-[OD(PBMC+MSC+PHA)-OD(PBMC+MSC)]/[OD(PBMC+PHA)-OD(PBMC)]公式II。
三批次间充质干细胞检测结果见表1。
表1质量检测和有效性常规检测结果
实施例2
hUC-MSC体外药效学研究、基因检测：
1.hUC-MSC体外药效学研究
(1)细胞模型建立：
IL-1β通过激发人软骨细胞氧化应激诱导细胞衰老凋亡。采用IL-1β刺激人软骨细胞，模拟骨关节炎患者软骨细胞氧化应激环境下炎症模型。按照0.89×104/cm2的接种密度将软骨细胞接种到96孔板中，培养基为软骨细胞专用完全培养基，待细胞长至70-80％，去除旧培养基，D-PBS润洗后，分别使用不同浓度的IL-1β(0ng/ml、10ng/ml、20ng/ml)的MSC-T4完全培养基孵育48h建立软骨细胞炎症模型。
(2)人脐带间充质干细胞培养上清(EXMSC)制备：
1)人脐带间充质干细胞复苏
从细胞库液氮罐中取出细胞，迅速置于37℃恒温水浴锅内轻轻摇晃至无明显冰晶为止。
2)人脐带间充质干细胞培养
按照0.89×104/cm2的接种密度将细胞悬液加入培养瓶内，每瓶补加适量MSC-T4完全培养基，摇匀后将细胞转至CO2培养箱内培养。
3)人脐带间充质干细胞培养上清制备
培养3天后，将培养瓶中的培养基取出，置于50ml离心管中，2500rpm，离心10min，即可得到人脐带间充质干细胞培养上清。
4)试验分组
根据模型，可分为：
对照组1：无IL-1β处理的人软骨细胞；
对照组2：人脐带间充质干细胞培养上清单独处理的人软骨细胞；
实验组1：10ng/ml IL-1β处理的人软骨细胞；
实验组2：10ng/ml IL-1β处理的人软骨细胞(1×105/ml)+人脐带间充质干细胞培养上清；
实验组3：20ng/ml IL-1β处理的人软骨细胞；
实验组4：20ng/ml IL-1β处理的人软骨细胞(1×105/ml)+人脐带间充质干细胞培养上清；
(3)人软骨细胞共培养及活率
按照试验分组，将人软骨细胞与人脐带间充质干细胞培养上清共培养，在处理后48小时，使用CCK-8试剂盒进行细胞活率测定，根据酶标仪测定实验样本OD值，OD值与细胞活率成正比。
结果见图5和表2。
表2人软骨细胞的活率
(4)qPCR检测MMP13和TIMP1的表达结果
1)RNA提取方法
CCK-8检测完成后，去除上清，D-PBS润洗2次，再用0.25％胰蛋白酶将细胞从培养板中消化下来，300g离心5min，用预冷PBS洗一次。每1.0×107细胞加入1ml TRIzol试剂。将细胞裂解液转移到1.5毫升无RNA酶EP管中，静置5min。每管加入200ul氯仿，充分混合后室温静置10min，使核蛋白复合物完全解离。4℃，12000g离心15min。离心后，将上层水相转移到该新的EP管中。加入0.5ml异丙醇，室温放置10min。4℃，12000g离心10min，去除上清液。用1ml 75％乙醇洗涤RNA沉淀一次。4℃，12000g离心5min，去掉上清。用1ml无水乙醇洗涤RNA沉淀一次。4℃，12000g离心5min，去掉上清。风干或真空干燥RNA沉淀5-10min。将RNA溶解在30ul DEPC处理过的去离子水中。进行分光光度分析以确定样品浓度和纯度。
2)RNA逆转录
从逆转录试剂盒中取出gDNA remover、10×gDNA remover Buffer、RNase-freewater，置于冰上融化，瞬时离心数秒后使用。取qPCR八连管，按下表3配制逆转录反应体：
表3逆转录反应体
组分 RNA模板 gDNA remover 10×gDNA remover缓冲液 无RNA酶水 总体积
用量 ×μL 1μL 1μL 补充至10μL 10μL
再用枪头轻轻混匀，短暂离心，42℃孵育2min，随后60℃孵育5min。混合物迅速置于冰上冷却，短暂离心后按表4的体积加入以下组分：
表4反转录体系
最后用枪头轻轻混匀，短暂离心，反应混合物25℃温浴10min，然后55℃加热15min，85℃加热5min使酶失活，4℃保存。获得的cDNA反应液可直接作为模板进行荧光定量检测。
3)荧光定量PCR：
设计TIMP1和MMP13 qPCR引物，具体序列见表5。
表5 TIMP1和MMP13 qPCR引物序列
在冰浴的PCR管中加入如下反应混合物：5μl 2×Master qPCR Mix(SYBR Green I withUDG)，0.4μl正向PCR引物，0.4μl反向PCR引物，1μl cDNA反应液，3.2μlddH2O。轻轻混匀后离心3～5s，反应混合物放入qPCR仪器中，反应程序为：50℃2min；95℃2min；95℃15s，60℃30s，40个循环；反应结束拿出PCR管，根据GAPDH和TIMP1或MMP13组CT值计算2-ΔΔCt，得出处理组TIMP1或MMP13相对表达量。
表6 TIMP1和MMP13相对表达量结果一览表
柱状图结果见图6和图7。
与对照组和单独IL-1β处理组相比，脐带间充质干细胞培养上清与IL-1β共同处理的人软骨细胞中TIMP1的mRNA表达明显上调。单独IL-1β处理组中软骨细胞中MMP13的mRNA表达显著上调，而脐带间充质干细胞培养上清与IL-1β共同处理的人软骨细胞中的MMP13的mRNA表达降低。由于基质金属蛋白酶(MMPs)由于其消化胶原纤维和蛋白多糖的能力，被认为是与OA发病机制相关的最重要的分解代谢酶，MMP13是MMP家族中与胶原基质重组相关的主要胶原酶，是本领域公知的有效治疗标准。金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)可以抑制MMP的活性。基于此，本发明通过检测人软骨细胞中金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP1)能够有效实现脐带间充质干细胞在治疗骨关节炎的有效性中诊断标准，同时实验证明，经3批次不同的间充质干细胞共培养的软骨细胞中TIMP1上调表达与MMP13的下调表达一致，基于MMP13是OA的有效指标标准，本领域的筛选方法结果准确可靠。
对比例1
使用增殖速率不合格的人脐带间充质干细胞培养上清与IL-1β处理的人软骨细胞共培养48h后，提取细胞RNA并进行TIMP1与MMP13的mRNA表达水平的检测。
试验分组
根据模型，可分为：
对照组1：无IL-1β处理的人软骨细胞；
对照组2：不合格的人脐带间充质干细胞培养上清单独处理的人软骨细胞；
实验组1：10ng/ml IL-1β处理的人软骨细胞；
实验组2：10ng/ml IL-1β处理的人软骨细胞+增殖速率不合格的人脐带间充质干细胞培养上清。
实验组3：20ng/ml IL-1β处理的人软骨细胞；
实验组4：20ng/ml IL-1β处理的人软骨细胞+增殖速率不合格的人脐带间充质干细胞培养上清。
CCK-8检测细胞活率见表7。
表7炎症软骨细胞活率结果一览表
结果表明：增殖不合格的人脐带间充质干细胞培养上清对于IL-1β刺激的炎症软骨细胞无恢复作用。
收集细胞提取RNA并使用qPCR检测TIMP1和MMP13的mRNA表达水平，结果如见表8。
表8 TIMP1与MMP13的mRNA表达水平
结果发现，10ng/ml IL-1β与EXMSC+10ng/ml IL-1β组对比，20ng/ml IL-1β与EXMSC+20ng/ml IL-1β组对比，TIMP1与MMP13均无显著性差异，表明增殖不合格的人脐带间充质干细胞培养上清对于IL-1β刺激的炎症软骨细胞无明显的治疗效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种利用TIMP1筛选有效治疗骨关节炎的间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将间充质干细胞或间充质干细胞的外泌体和炎症软骨细胞共培养，分离共培养的炎症软骨细胞，检测TIMP1的表达水平，根据所述TIMP1的表达水平判断间充质干细胞的疾病治疗有效性：
当共培养的炎症软骨细胞中TIMP1的表达水平与炎症软骨细胞相比显著性上调时，表明间充质干细胞为有效治疗骨关节炎。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述间充质干细胞包括以下至少一种：人脐带来源的间充质干细胞、人羊膜来源的间充质干细胞和人脂肪来源的间充质干细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述炎症软骨细胞是利用白介素-1β刺激正常人软骨细胞得到。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述白细胞介素1β的终浓度为10～20ng/ml。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述人软骨细胞的培养时间为45～50h。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述共培养的时间为45～50h。
7.根据权利要求1～6中任意一项所述的方法，其特征在于，还包括对判断结果进行验证；
所述验证的方法为检测共培养的炎症软骨细胞中MMP13的表达水平，根据共培养的炎症软骨细胞中MMP13的表达水平判断检测结果的有效性：
当共培养的炎症软骨细胞中MMP13的表达水平与炎症软骨细胞相比显著性下调时，表明所述方法筛选的间充质干细胞为有效治疗骨关节炎的细胞。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述间充质干细胞还包括质量控制检测和/或有效性常规检测；
所述质量控制检测包括以下至少一种项目：细胞形态及活率检测、细胞表面标志物检测、间充质干细胞的三系分化检测；
所述有效性常规检测包括以下至少一种项目：淋巴细胞增殖抑制试验、特定淋巴细胞亚群检测和淋巴细胞分泌TNF-α抑制试验。
9.权利要求1～8中任意一项所述方法筛选的间充质干细胞在制备预防和/或治疗骨关节炎的药物中的应用。
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