CN107254437A - 一种人工诱导多能干细胞分化为红细胞的方法 - Google Patents

一种人工诱导多能干细胞分化为红细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人工诱导多能干细胞分化为红细胞的方法，该方法具体步骤如下：取胚胎干细胞接种在小鼠胚胎成纤维细胞培养层上；胚胎干细胞的常规培养；胚胎干细胞预诱导形成胚胎体；胚胎干细胞定向分化形成造血干细胞；将消化后的干细胞加入至脱核诱导培养基重悬细胞，接种于培养皿中，培养20d后得到定向分化的红细胞。本发明通过在胚胎干细胞向造血干细胞定向转化过程中加入干细胞因子(SCF)，采用分阶诱导的方式促使细胞分化，诱导使用的干细胞来源于胚胎干细胞，易于体外扩增，取材方便，提供了一种经济安全，行之有效的新的红细胞来源。

Description

一种人工诱导多能干细胞分化为红细胞的方法
技术领域
本发明属于生物医学领域，特别是涉及一种人工诱导多能干细胞分化为红细胞的方法。
背景技术
目前，人红细胞是血液中数量最多的一种血细胞，红细胞是血液运送氧气的最主要的媒介。当人失血时，需要快速的补充红细胞，而目前红细胞来源主要是人体血液，而输注的人血主要来源于志愿献血者或是职业卖血者，不但血源奇缺，且价格昂贵，此外，血液中还可能携带病毒等，给需要输送血液的人的生命造成额外的威胁。因此，目前的红细胞来源非常单一，且产量极其有限，不能满足需要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人工诱导多能干细胞分化为红细胞的方法，，诱导使用的干细胞来源于胚胎干细胞，易于体外扩增，取材方便，提供了一种经济安全，行之有效的新的红细胞来源。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种人工诱导多能干细胞分化为红细胞的方法，该方法具体步骤如下：
S1、取胚胎干细胞接种在小鼠胚胎成纤维细胞培养层上；
S2、胚胎干细胞的常规培养；
S3、胚胎干细胞预诱导形成胚胎体；
S4、胚胎干细胞定向分化形成造血干细胞；
S5、将消化后的干细胞加入至脱核诱导培养基重悬细胞，接种于培养皿中，培养20d后得到定向分化的红细胞；
进一步地，所述S1中培养液成分为，85％DMEM培养基中加入15％Knockout SerumReplacement、4ng/mL bFGF、1-1.5mmol谷氨酰胺、0.1-0.15mol/Lβ-巯基乙醇、1mmol/L非必需氨基酸、50μg/mL链霉素、50μg/mL青霉素。
进一步地，所述S2中的具体步骤为，将S1中的培养基置于37℃，5％CO2培养箱中培养，每天更换培养液，细胞培养至汇合状态后，37℃条件下加入1mg/ml胶原酶Ⅳ进行消化传代，接种于新的饲养层细胞上，传代比例1:5-6。
进一步地，所述S3中的具体步骤为，将S2中的胚胎干细胞继续培养5-6d后取上清液,离心去细胞碎片,上清液过0.22μm滤膜,过滤后接种于含15％FCS，0.9％甲基纤维素的IMDM液中，并加入30-50ng/mL SCF，置于六孔培养板上悬浮3-4d形成胚胎体。
进一步地，所述S4中的具体步骤为，用PBS液吹打所述胚胎体，离心沉淀后加入胰蛋白酶消化，并吹打成单个小细胞团，以lx105mL-1的细胞密度接种于骨髓基质细胞饲养层，并加入50ng/mL SCF，37℃，5％CO2培养箱中培养，每5-6d换液一次，培养20-22d形成造血干细胞。
进一步地，所述脱核诱导培养基为Stem Span无血清培养基为基础培养基中加入10-12U/ml EPO和40-50ng/ml IGF-1。
本发明具有以下有益效果：
本发明通过在胚胎干细胞向造血干细胞定向转化过程中加入干细胞因子
(SCF)，采用分阶诱导的方式促使细胞分化，诱导使用的干细胞来源于胚胎干细胞，易于体外扩增，取材方便，提供了一种经济安全，行之有效的新的红细胞来源。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
具体实施方式
本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明为一种人工诱导多能干细胞分化为红细胞的方法，该方法具体步骤如下：
实施例1
S1、取人体胚胎干细胞接种在小鼠胚胎成纤维细胞培养层上，其中培养液成分为：85％DMEM培养基中加入15％Knockout Serum Replacement、4ng/mL bFGF、1-1.5mmol谷氨酰胺、0.1-0.15mol/Lβ-巯基乙醇、1mmol/L非必需氨基酸、50μg/mL链霉素、50μg/mL青霉素；
S2、培养基置于37℃，5％CO2培养箱中培养，每天更换培养液，细胞培养至汇合状态后，37℃条件下加入1mg/ml胶原酶Ⅳ进行消化传代，接种于新的饲养层细胞上，传代比例1:5-6；
S3、将S2中的胚胎干细胞继续培养5-6d后取上清液,离心去细胞碎片,上清液过0.22μm滤膜,过滤后接种于含15％FCS，0.9％甲基纤维素的IMDM液中，并加入30-50ng/mLSCF，置于六孔培养板上悬浮3-4d形成胚胎体；
S4、用PBS液吹打所述胚胎体，离心沉淀后加入胰蛋白酶消化，并吹打成单个小细胞团，以lx105mL-1的细胞密度接种于骨髓基质细胞饲养层，并加入50ng/mL SCF，37℃，5％CO2培养箱中培养，每5-6d换液一次，培养20-22d形成造血干细胞；
S5、将S4中培养形成的造血干细胞加入胰蛋白酶-EDTA消化，之后加入胎牛血清停止消化；
将消化后的干细胞加入至脱核诱导培养基重悬细胞，接种于培养皿中，置于37℃，5％CO2培养箱中培养，每6-8d换液一次，20d后得到定向分化的红细胞；
其中，所述脱核诱导培养基为
Stem Span无血清培养基为基础培养基中加入10-12U/ml EPO和40-50ng/ml IGF-1。
实施例2
S1、取人体胚胎干细胞接种在小鼠胚胎成纤维细胞培养层上，其中培养液成分为：85％DMEM培养基中加入15％Knockout Serum Replacement、4ng/mL bFGF、1-1.5mmol谷氨酰胺、0.1-0.15mol/Lβ-巯基乙醇、1mmol/L非必需氨基酸、50μg/mL链霉素、50μg/mL青霉素；
S2、培养基置于37℃，5％CO2培养箱中培养，每天更换培养液，细胞培养至汇合状态后，37℃条件下加入1mg/ml胶原酶Ⅳ进行消化传代，接种于新的饲养层细胞上，传代比例1:5-6；
S3、将S2中的胚胎干细胞继续培养5-6d后取上清液,离心去细胞碎片,上清液过0.22μm滤膜,过滤后接种于含15％FCS，0.9％甲基纤维素的IMDM液中，并加入30-50ng/mLSCF，置于六孔培养板上悬浮3-4d形成胚胎体；
S4、用PBS液吹打所述胚胎体，离心沉淀后加入胰蛋白酶消化，并吹打成单个小细胞团，以lx105mL-1的细胞密度接种于骨髓基质细胞饲养层，并加入50ng/mL SCF，37℃，5％CO2培养箱中培养，每5-6d换液一次，培养20-22d形成造血干细胞；
S5、将S4中培养形成的造血干细胞加入胰蛋白酶-EDTA消化，之后加入胎牛血清停止消化；
将消化后的干细胞加入至脱核诱导培养基重悬细胞，接种于培养皿中，置于37℃，5％CO2培养箱中培养，每6-8d换液一次，20d后得到定向分化的红细胞；
其中，所述脱核诱导培养基为
Stem Span无血清培养基为基础培养基中加入10-12U/ml EPO和40-50ng/ml IGF-1。
实施例3
S1、取人体胚胎干细胞接种在小鼠胚胎成纤维细胞培养层上，其中培养液成分为：85％DMEM培养基中加入15％Knockout Serum Replacement、4ng/mL bFGF、1-1.5mmol谷氨酰胺、0.1-0.15mol/Lβ-巯基乙醇、1mmol/L非必需氨基酸、50μg/mL链霉素、50μg/mL青霉素；
S2、培养基置于37℃，5％CO2培养箱中培养，每天更换培养液，细胞培养至汇合状态后，37℃条件下加入1mg/ml胶原酶Ⅳ进行消化传代，接种于新的饲养层细胞上，传代比例1:5-6；
S3、将S2中的胚胎干细胞继续培养5-6d后取上清液,离心去细胞碎片,上清液过0.22μm滤膜,过滤后接种于含15％FCS，0.9％甲基纤维素的IMDM液中，并加入30-50ng/mLSCF，置于六孔培养板上悬浮3-4d形成胚胎体；
S4、用PBS液吹打所述胚胎体，离心沉淀后加入胰蛋白酶消化，并吹打成单个小细胞团，以lx105mL-1的细胞密度接种于骨髓基质细胞饲养层，并加入50ng/mL SCF，37℃，5％CO2培养箱中培养，每5-6d换液一次，培养20-22d形成造血干细胞；
S5、将S4中培养形成的造血干细胞加入胰蛋白酶-EDTA消化，之后加入胎牛血清停止消化；
将消化后的干细胞加入至脱核诱导培养基重悬细胞，接种于培养皿中，置于37℃，5％CO2培养箱中培养，每6-8d换液一次，20d后得到定向分化的红细胞；
其中，所述脱核诱导培养基为
Stem Span无血清培养基为基础培养基中加入10-12U/ml EPO和40-50ng/ml IGF-1。
以上内容仅仅是对本发明所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种人工诱导多能干细胞分化为红细胞的方法，其特征在于，该方法具体步骤如下：
S1、取胚胎干细胞接种在小鼠胚胎成纤维细胞培养层上；
S2、胚胎干细胞的常规培养；
S3、胚胎干细胞预诱导形成胚胎体；
S4、胚胎干细胞定向分化形成造血干细胞；
S5、将消化后的干细胞加入至脱核诱导培养基重悬细胞，接种于培养皿中，培养20d后得到定向分化的红细胞。
2.根据权利要求1所述的一种人工诱导多能干细胞分化为红细胞的方法，其特征在于：所述S1中培养液成分为，85％DMEM培养基中加入15％Knockout Serum Replacement、4ng/mL bFGF、1-1.5mmol谷氨酰胺、0.1-0.15mol/Lβ-巯基乙醇、1mmol/L非必需氨基酸、50μg/mL链霉素、50μg/mL青霉素。
3.根据权利要求1所述的一种人工诱导多能干细胞分化为红细胞的方法，其特征在于：所述S2中的具体步骤为，将S1中的培养基置于37℃，5％CO2培养箱中培养，每天更换培养液，细胞培养至汇合状态后，37℃条件下加入1mg/ml胶原酶Ⅳ进行消化传代，接种于新的饲养层细胞上，传代比例1:5-6。
4.根据权利要求1所述的一种人工诱导多能干细胞分化为红细胞的方法，其特征在于：所述S3中的具体步骤为，将S2中的胚胎干细胞继续培养5-6d后取上清液,离心去细胞碎片,上清液过0.22μm滤膜,过滤后接种于含15％FCS，0.9％甲基纤维素的IMDM液中，并加入30-50ng/mL SCF，置于六孔培养板上悬浮3-4d形成胚胎体。
5.根据权利要求1所述的一种人工诱导多能干细胞分化为红细胞的方法，其特征在于：所述S4中的具体步骤为，用PBS液吹打所述胚胎体，离心沉淀后加入胰蛋白酶消化，并吹打成单个小细胞团，以lx105mL-1的细胞密度接种于骨髓基质细胞饲养层，并加入50ng/mLSCF，37℃，5％CO2培养箱中培养，每5-6d换液一次，培养20-22d形成造血干细胞。
6.根据权利要求1所述的一种人工诱导多能干细胞分化为红细胞的方法，其特征在于：所述脱核诱导培养基为Stem Span无血清培养基为基础培养基中加入10-12U/ml EPO和40-50ng/ml IGF-1。
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