KR20230011352A - 관류 배양 공정에 의한 아데노바이러스 벡터 백신의 제조 방법 - Google Patents

관류 배양 공정에 의한 아데노바이러스 벡터 백신의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

관류 배양 공정에 의한 아데노바이러스 벡터 백신의 제조 방법을 제공한다. 상기 방법은 아데노바이러스 숙주 세포를 배양하는 단계, 특히 세포 밀도에 따라 적어도 두 단계를 통해 관류 속도를 조절하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 아데노바이러스 숙주 세포의 고밀도 성장을 달성하면서 감염된 바이러스의 단세포 생산량 및 바이러스 수확액의 비활성을 향상시킨다.

Description

관류 배양 공정에 의한 아데노바이러스 벡터 백신의 제조 방법
본 발명은 생물학적 제품 기술분야에 관한 것으로, 구체적으로는 아데노바이러스 숙주 세포의 배양 방법, 아데노바이러스의 생산 방법 및 아데노바이러스 벡터 백신의 제조 방법, 특히 관류 배양 공정에 의한 아데노바이러스 벡터 백신의 제조 방법에 관한 것이다.
아데노바이러스는 감염에 대한 감수성, 넓은 숙주 범위, 낮은 독성, 사용 안전성, 대용량, 비통합, 인간에 대한 낮은 병원성, 발암성이 없는 특징을 가진 비외피 DNA 바이러스로, 아데노바이러스 벡터는 유전자 전이에서 가장 유망한 유전자 벡터 중 하나이다.
변형된 아데노바이러스는 E1/E3 유전자 발현 카세트가 제거되어 E1 영역 및 E3 영역에 의존하는 기능적 단백질의 전사와 바이러스 DNA의 후속 복제 및 바이러스 코트 단백질의 생성을 방지하고, E1/E3이 결실된 아데노바이러스는 E1/E3 영역의 유전자 단백질을 제공할 수 있는 세포에서 증식한다.
아데노바이러스는 숙주 범위가 넓고 이식유전자 발현능이 높은 특징을 갖고 있어 현재 임상 시험에 사용되는 인간 치료 또는 예방 재조합 아데노바이러스 약물은 최대 300종이 있으며, 널리 응용되는 아데노바이러스 벡터는 인간 혈청형 아데노바이러스 Ad5, Ad26형 및 침팬지 3, 68형 아데노바이러스이고; 아데노바이러스를 벡터로 사용하는 백신 중 여러 개가 임상 연구 중이다.
재조합 아데노바이러스 벡터 백신은 아데노바이러스를 벡터로 사용하여 보호 항원 유전자를 아데노바이러스 게놈에 재조합하는데, 아데노바이러스가 세포를 감염시킨 후, 아데노바이러스 게놈과 보호 항원 유전자를 함께 숙주 세포에 주입함으로써, 세포 내에서 보호 항원이 발현되어 체액성 및 세포성 면역을 유발한다. 인체 면역결핍 바이러스(HIV), 광견병 바이러스(RV), B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV), 뎅기열 바이러스(DEN), 헤르페스 바이러스(EB), 에볼라 및 신종 코로나 바이러스와 같은 여러 개의 아데노바이러스 벡터 백신이 현재 전임상 또는 임상 개발 중이다.
293 세포는 아데노바이러스 벡터 패키징 및 생산에 가장 일반적으로 사용되는 숙주 세포이다. 293 세포는 인간의 신장 상피 세포주로서, HEK293, 293T/17 등과 같은 다양한 유래 균주가 존재하며; 293 세포는 일반적으로 부착 성장하지만, 현탁 배양에 적합한 세포주도 존재한다. HEK293 세포는 아데노바이러스의 E1/E3 영역을 포함하므로, 복제-결핍형 아데노바이러스 벡터의 생산에 사용될 수 있다.
종래 기술에서, 293 세포에 의한 아데노바이러스 생산은 낮은 세포 밀도와 낮은 세포 독성 생성에 의해 제한되어 생산량이 적으며, 낮은 세포 밀도의 주된 원인은 세포 배양이 영양 공급, 산소 및 대사의 영향을 받기 때문이며, 따라서 293 세포를 고밀도로 배양하기 어렵다. 감염된 세포는 정상적인 세포 성장, 영양 물질과의 경쟁 및 감염된 세포의 상태 등으로 인해 독성 생성이 낮다. 영양 환경을 유지하기 위해 정기적으로 신선한 배지를 보충하면 세포 성장을 향상시킬 수 있지만 이러한 성장은 제한적이다.
종래 기술의 단점을 극복하기 위해 본 발명은 관류 배양하는 단계, 특히 세포 밀도에 따라 관류 속도를 조절(예를 들어 적어도 두 단계를 통해 관류 속도를 조절)하는 단계를 포함하는 아데노바이러스 숙주 세포의 배양 방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 방법은,
(1) 숙주 세포를 접종하여 세포 배양을 수행하는 단계;
(2) 세포 밀도가 1~5×106 세포/mL(구체적으로 예를 들어 1×106, 2×106, 3×106, 4×106, 5×106 세포/mL)에 도달한 후 관류를 시작하되, 관류 속도는 1-3VVD(용기 부피/일)(예를 들어 1, 1.5, 2, 2.5, 3VVD)인 단계; 및
(3) 세포 밀도가 5~10×106 세포/mL(구체적으로 예를 들어 5×106, 6×106, 7×106, 8×106, 9×106, 10×106 세포/mL)로 성장한 후, 관류 속도를 2-4VVD(예를 들어 2, 2.5, 3, 3.5, 4VVD)로 조절하는 단계를 포함한다.
구체적으로, 상기 세포 배양은 생물 반응기(예를 들어 일회용 교반 반응기 또는 급류 반응기)에서 수행된다.
구체적으로, 상기 관류는 연속 관류 장치를 이용하여 수행되고; 보다 구체적으로, 상기 연속 관류 장치는 중공 섬유 컬럼의 보유 기공 크기가 0.1~0.8μm(구체적으로 예를 들어 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8μm)인 교대 접선 유동 세포 보유 시스템을 사용한다.
구체적으로, 상기 관류의 액체 교환 속도는 1~12L/h(구체적으로 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12L/h)일 수 있다.
구체적으로, 상기 세포 배양 온도는 32-38℃(구체적으로 예를 들어 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38℃)일 수 있다.
구체적으로, 상기 세포 배양의 pH는 6.5-7.5(구체적으로 예를 들어 6.5, 6.6, 6.8, 7.0, 7.2, 7.4, 7.5)일 수 있다.
구체적으로, 상기 세포 배양의 용존 산소 농도는 30-80%(구체적으로 예를 들어 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%)일 수 있다.
구체적으로, 상기 세포 배양의 CO2 농도는 4-8%(구체적으로 예를 들어 4%, 5%, 6%, 7%, 8%)일 수 있다.
구체적으로, 상기 세포 배양의 교반 속도는 30-200rpm(구체적으로 예를 들어 30, 40, 50, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200rpm)일 수 있다.
구체적으로, 상기 세포 배양에 사용되는 배지는 숙주 세포의 성장에 적합한 것으로 알려진 임의의 배지일 수 있다.
구체적으로, 상기 방법은 세포 배양 과정에서 글루타민의 소모 상황을 지속적으로 추적하여 보충하는 단계를 더 포함한다.
구체적으로, 상기 세포 배양에서, 글루타민의 농도는 2mM(구체적으로 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30mM) 이상으로 유지된다.
구체적으로, 상기 방법은 단계 (1) 이전에 숙주 세포를 확대 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 확대 배양의 계대 밀도는 1~4×106 세포/mL(구체적으로 예를 들어 1×106, 2×106, 3×106, 4×106 세포/mL)이다.
구체적으로, 상기 확대 배양의 계대 시간은 48-90 시간(구체적으로 예를 들어 48, 60, 72, 84, 90 시간)이다.
구체적으로, 상기 확대 배양의 온도는 32-38℃(구체적으로 예를 들어 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38℃)일 수 있다.
구체적으로, 상기 세포 배양의 CO2 농도는 4-8%(구체적으로 예를 들어 4%, 5%, 6%, 7%, 8%)일 수 있다.
구체적으로, 상기 세포 배양의 교반 속도는 100-170rpm(구체적으로 예를 들어 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170rpm)일 수 있다.
구체적으로, 상기 숙주 세포는 아데노바이러스를 패키징할 수 있는 세포이다.
구체적으로, 상기 숙주 세포는 부착 배양 또는 현탁 배양, 특히 현탁 배양에 적합한 방식으로 성장할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에서, 상기 숙주 세포는 293 세포, 예를 들어 HEK293 세포, HEK293.CS 세포 등이지만 이에 한정되지 않는다.
구체적으로, 상기 아데노바이러스는 복제형 또는 복제-결핍형, 특히 복제-결핍형 아데노바이러스일 수 있다.
구체적으로, 상기 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스(예를 들어 인간 아데노바이러스 5형(AdHu5형), AdHu4, AdHu7, AdHu11, AdHu26, AdHu55형 등), 침팬지 아데노바이러스 벡터(예를 들어 침팬지 아데노바이러스 68형(AdC68), AdC3 등)과 같은 동물 아데노바이러스 벡터일 수 있고; 본 발명의 일 실시예에서, 상기 아데노바이러스는 AdHu5이다.
본 발명의 일 실시형태에서, 상기 아데노바이러스는 예를 들어 유전자 요법, 백신 등을 위해 암호화 외인성 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스이다.
구체적으로, 상기 아데노바이러스는 SARS-CoV-2의 구조 단백질(예를 들어 S 단백질, M 단백질, E 단백질, N 단백질 중 하나 이상) 유전자(전장 또는 부분 서열), 특히 S 단백질 유전자를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 아데노바이러스는 SARS-CoV-2의 S 단백질 유전자의 AdHu5형을 포함한다.
본 발명은 또한 아데노바이러스의 생산 방법을 제공한다. 상기 방법은,
(a) 아데노바이러스 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
(b) 바이러스를 접종하여 배양하는 단계를 포함한다.
구체적으로, 상기 단계 (a)는 본 발명에 따른 상기 아데노바이러스 숙주 세포의 배양 방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에서, 상기 아데노바이러스의 생산 방법은,
(1) 숙주 세포를 접종하여 세포 배양을 수행하는 단계;
(2) 세포 밀도가 1~5×106 세포/mL(구체적으로 예를 들어 1×106, 2×106, 3×106, 4×106, 5×106 세포/mL)에 도달한 후 관류를 시작하되, 관류 속도는 1-3VVD(예를 들어 1, 1.5, 2, 2.5, 3VVD)인 단계;
(3) 세포 밀도가 5~10×106 세포/mL(구체적으로 예를 들어 5×106, 6×106, 7×106, 8×106, 9×106, 10×106 세포/mL)로 성장한 후, 관류 속도를 2-4VVD(예를 들어 2, 2.5, 3, 3.5, 4VVD)로 조절하는 단계; 및
(4) 바이러스를 접종하여 배양하는 단계를 포함한다.
구체적으로, 상기 바이러스 접종은 단계 (3)의 숙주 세포 밀도가 10~50×106 세포/mL(구체적으로 예를 들어 10×106, 20×106, 30×106, 40×106, 50×106 세포/mL)에 도달한 후 수행된다.
구체적으로, 상기 단계 (4)에서, 배양 방식은 관류 배양, 회분식 배양, 유가식 배양 등, 특히 관류 배양을 포함하며; 보다 구체적으로, 관류 속도는 1-3VVD(구체적으로 예를 들어 1, 1.5, 2, 2.5, 3VVD)일 수 있다.
구체적으로, 상기 단계 (4)에서, 배양에 사용되는 배지는 CD293 배지, SFM4HEK293 배지, Ex-Cell293 배지 등과 같이 아데노바이러스의 증폭 및 생산에 적합한 것으로 알려진 임의의 배지일 수 있으며, 본 발명의 실시예에 사용된 배지는 모두 상기 배지에 적용된다.
구체적으로, 상기 단계 (4)에서 다른 배양 조건은 상기 아데노바이러스 숙주 세포의 배양 방법에서 상응하는 조건의 정의를 갖는다.
구체적으로, 상기 아데노바이러스의 생산 방법은 바이러스를 수확하는 단계 (5)를 더 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 아데노바이러스는 복제형 또는 복제-결핍형, 특히 복제-결핍형 아데노바이러스일 수 있다.
구체적으로, 상기 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스(예를 들어 인간 아데노바이러스 5형(AdHu5형), AdHu4, AdHu7, AdHu11, AdHu26, AdHu55형 등), 침팬지 아데노바이러스 벡터(예를 들어 침팬지 아데노바이러스 68형(AdC68), AdC3 등)과 같은 동물 아데노바이러스 벡터일 수 있고; 본 발명의 일 실시예에서, 상기 아데노바이러스는 AdHu5형이다.
본 발명의 일 실시형태에서, 상기 아데노바이러스는 예를 들어 유전자 요법, 백신 등을 위해 암호화 외인성 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스이다.
구체적으로, 상기 아데노바이러스는 SARS-CoV-2의 구조 단백질(예를 들어 S 단백질, M 단백질, E 단백질, N 단백질 중 하나 이상) 유전자(전장 또는 부분 서열), 특히 S 단백질 유전자를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 아데노바이러스는 SARS-CoV-2의 S 단백질 유전자의 AdHu5형을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 상기 아데노바이러스 숙주 세포의 배양 방법 또는 상기 아데노바이러스의 생산 방법의 단계를 포함하는 아데노바이러스 벡터 백신의 제조 방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 아데노바이러스 벡터는 SARS-CoV-2의 구조 단백질(예를 들어 S 단백질, M 단백질, E 단백질, N 단백질 중 하나 이상) 유전자(전장 또는 부분 서열), 특히 S 단백질 유전자를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 아데노바이러스 벡터는 SARS-CoV-2의 S 단백질 유전자의 AdHu5형을 포함하는 아데노바이러스 벡터이다.
구체적으로, 상기 아데노바이러스 벡터 백신의 제조 방법은 아데노바이러스를 적절한 제제로 제조하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에서, 상기 제제는 주사제이다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 상기 제제는 점막 투여용 제제, 예를 들어 점비제, 에어로졸, 스프레이, 분말 스프레이, 분제, 겔, 마이크로스피어, 리포솜, 막제, 현탁제 등이다.
본 발명은 하기와 같은 유익한 효과를 포함한다.
1． 본 발명에 의해 제공되는 기술적 해결수단은 관류 배양 공정을 통해 아데노바이러스 숙주 세포(예를 들어 293 세포)를 고밀도로 배양하는 기술적 방법이다. 선택된 배양 조건 및 관류 조건은 아데노바이러스 숙주 세포(예를 들어 293 세포)의 성장에 적합하고, 상기 기술적 방법을 통해 회분식 및 기존 관류 공정보다 더 높은 세포 밀도 및 바이러스 감염을 얻을 수 있으며, 관류 배양 및 보유 장치를 통해 신선한 배지를 반응기에 지속적으로 보충하여 실시간으로 대사 폐기물을 제거할 수 있으므로, 고밀도 세포 배양을 구현하고, 아데노바이러스 접종 후 바이러스 역가가 크게 향상되며;
2． 본 발명에 의해 제공되는 기술적 해결수단은 세포를 고밀도로 배양하여 고역가의 바이러스 수확액을 얻을 수 있고, 크래킹, 정화 및 컬럼 크로마토그래피를 결합하는 방식으로 상류 관류 배양 공급 용액을 정제하며, 다양한 불순물을 효과적으로 제거하여 고순도 원액을 얻고;
3． 본 발명에 의해 제공되는 기술적 해결수단은 아데노바이러스 숙주 세포(예를 들어 293 세포)의 고밀도 성장을 구현하는 동시에 감염된 바이러스의 단세포 생산량 및 바이러스 수확액의 비활성을 향상시킨다.
도 1은 관류 배양과 회분식 배양에서 293 세포의 최고 밀도 비교도이다.
도 2는 관류 공정 배양과 회분식 공정 배양에서 아데노바이러스 원액의 비활성 비교도이다.
달리 정의되지 않는 한, 본 발명에서 사용되는 모든 과학 및 기술 용어는 본 발명이 관련된 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
SARS-CoV-2의 유전자 및 각 구조 단백질은 당업계에 공지된 기술로 검색할 수 있다. 예를 들어, SARS-CoV-2의 유전자는 GenBank: MT419849.1에 표시된 바와 같을 수 있고, 각 구조 단백질: S 단백질, E 단백질, M 단백질 유전자는 GenBank: MT419849.1의 21387-25208, 26069-26296, 26347-27015로 표시될 수 있다.
본 명세서에 인용된 다양한 간행물, 특허 및 개시된 특허 명세서의 개시 내용은 그 전체가 참조로서 본 명세서에 병합된다.
이하, 본 발명의 실시예를 참조하여 본 발명의 기술적 해결수단을 명확하고 완전하게 설명하되, 상술한 실시예는 본 발명의 실시예의 전부가 아니라 일부에 불과함은 물론이다. 본 발명의 실시예에 기반하여 당업자가 창의적인 노동 없이 획득한 다른 모든 실시예는 모두 본 발명의 보호 범위에 속할 것이다.
실시예 1: 관류법에 의한 293 세포 배양을 위한 공정 파라미터 확인
관류 공정 1: 293 세포를 소생시킨 후, 증폭시켜 발효 탱크에 접종하고, 세포 밀도가 1×106 세포/mL에 도달한 후 관류를 시작하되, 관류 속도는 2VVD이다. 세포 밀도가 5×106 세포/mL로 성장할 때까지 계속 배양하여 관류 속도를 3VVD로 조절하였다.
관류 공정 2: 293 세포를 소생시킨 후, 증폭시켜 발효 탱크에 접종하고, 세포 밀도가 1×106 세포/mL 또는 5×106 세포/mL에 도달한 후 관류를 시작하였다. 전체 배양 과정에서, 관류 속도는 1VVD 또는 3VVD로 일정하게 유지되었다.
관류 공정 3: 293 세포를 소생시킨 후, 증폭시켜 발효 탱크에 접종하고, 세포 밀도가 1×106 세포/mL 또는 5×106 세포/mL에 도달한 후 관류를 시작하였다. 전체 배양 과정에서, 관류 속도는 2VVD 또는 4VVD로 일정하게 유지되었다.
위의 세가지 공정에서, 반응기 파라미터는 다음과 같다. 배양 온도는 37℃이고, pH는 6.5-7.5로 조절 가능하며, 용존 산소 농도는 30-80%이고, 교반 속도는 30-40rpm으로 조절 가능하다.
상이한 관류 공정에서 배양한 293 세포의 밀도 및 생존율을 검출하여 그 결과를 표 1-3에 나타내었다.
표 1: 관류 공정에 의해 배양된 293 세포의 밀도 및 생존율(관류 공정 1)
Figure pct00001
그 결과, 세포 밀도가 1×106 세포/mL에 도달한 후 관류를 시작하되, 관류 속도는 2VVD이다. 세포 밀도가 5×106 세포/mL로 성장할 때까지 계속 배양하여 관류 속도를 3VVD로 조절하면, 세포의 최고 성장 밀도는 11×107 세포/mL에 도달할 수 있음을 알 수 있다. 표 2: 관류 공정에 의해 배양된 293 세포의 밀도 및 생존율(관류 공정 2)
Figure pct00002
그 결과, 세포 밀도가 1×106 세포/mL 또는 5×106 세포/mL에 도달한 후 관류를 시작하되, 관류 속도는 전 과정에 걸쳐 1VVD 또는 3VVD이고, 세포의 최고 성장 밀도는 7×107 세포/mL에 도달할 수 있음을 알 수 있다. 표 3: 관류 공정에 의해 배양된 293 세포의 밀도 및 생존율(관류 공정 3)
Figure pct00003
그 결과: 세포 밀도가 1×106 세포/mL 또는 5×106 세포/mL에 도달한 후 관류를 시작하되, 관류 속도는 전 과정에 걸쳐 2VVD 또는 4VVD이고, 세포의 최고 성장 밀도는 70×106 세포/mL에 도달할 수 있음을 알 수 있다. 상기 결과를 종합하면, 관류 공정 1의 방식을 사용하여 보다 높은 세포 밀도를 얻을 수 있으며, 세포의 생존율도 공정 2 및 공정 3보다 높다.
실시예 2: 관류 배양 공정과 회분식 공정에 의해 배양된 세포 밀도 및 생존율 비교
시험 1: 배양은 당업계의 통상적인 회분식 배양 공정을 사용하여 수행하였다.
시험 2: 실시예 1의 관류 공정 1을 사용하였는 바, 즉 293 세포를 소생시킨 후, 증폭시켜 발효 탱크에 접종하고, 세포 밀도가 1×106 세포/mL에 도달한 후 관류를 시작하되, 관류 속도는 2VVD이다. 세포 밀도가 5×106 세포/mL로 성장할 때까지 계속 배양하여 관류 속도를 3VVD로 조절하였다.
시험 1 및 2에서, 배양 과정에서 다른 파라미터(예를 들어 배양 온도, pH용존 산소 농도, 교반 속도 등)는 기본적으로 동일하였고, 배양 종료 후 세포 밀도 및 생존율을 검출하여 그 결과를 표 4에 나타내었다.
표 4: 회분식 공정 및 관류 공정에 의해 배양된 293 세포의 생존율 및 밀도
Figure pct00004
그 결과, 관류 공정을 사용하여 보다 높은 세포 밀도를 얻을 수 있으며, 세포 밀도, 생존율은 회분식 공정보다 높음을 알 수 있다. 실시예 3: 관류 공정에서 세포 생산에 대한 글루타민의 영향
시험 1: 293 세포를 소생시킨 후, 증폭시켜 발효 탱크에 접종하고, 세포 밀도가 1×106 세포/mL에 도달한 후 관류를 시작하되, 관류 속도는 2VVD이다. 세포 밀도가 5×106 세포/mL로 성장할 때까지 계속 배양하여 관류 속도를 3VVD로 조절하였다. 관류 공정에서 글루타민의 농도는 보충되지 않았다.
시험 2: 293 세포를 소생시킨 후, 증폭시켜 발효 탱크에 접종하고, 세포 밀도가 1×106 세포/mL에 도달한 후 관류를 시작하되, 관류 속도는 2VVD이다. 세포 밀도가 5×106 세포/mL로 성장할 때까지 계속 배양하여 관류 속도를 3VVD로 조절하였다. 관류 공정에서 글루타민 농도를 모니터링하고, 글루타민을 보충하여 글루타민의 농도를 2mM로 유지하였다.
시험 3: 293 세포를 소생시킨 후, 증폭시켜 발효 탱크에 접종하고, 세포 밀도가 1×106 세포/mL에 도달한 후 관류를 시작하되, 관류 속도는 2VVD이다. 세포 밀도가 5×106 세포/mL로 성장할 때까지 계속 배양하여 관류 속도를 3VVD로 조절하였다. 관류 공정에서 글루타민 농도를 모니터링하고, 글루타민을 보충하여 글루타민의 농도를 10mM로 유지하였다.
시험 4: 293 세포를 소생시킨 후, 증폭시켜 발효 탱크에 접종하고, 세포 밀도가 1×106 세포/mL에 도달한 후 관류를 시작하되, 관류 속도는 2VVD이다. 세포 밀도가 5×106 세포/mL로 성장할 때까지 계속 배양하여 관류 속도를 3VVD로 조절하였다. 관류 공정에서 글루타민 농도를 모니터링하고, 글루타민을 보충하여 글루타민의 농도를 20mM로 유지하였다.
위의 시험 1-4에서 반응기 파라미터는 다음과 같다. 배양 온도는 37℃이고, pH는 6.5-7.5로 조절 가능하며, 용존 산소 농도는 30-80%로 조절 가능하고, 교반 속도는 30-40rpm로 조절 가능하다.
배양 종료 후 최고 세포 밀도 및 생존율을 검출하여 그 결과를 표 5에 나타내었다.
표 5: 상이한 관류 공정에서 배양한 293 세포의 밀도 및 생존율
Figure pct00005
그 결과, 관류 공정을 사용할 때 글루타민의 농도를 보충함으로써 보다 높은 세포 밀도를 얻을 수 있으며, 이 경우 세포 밀도, 생존율은 글루타민을 보충하지 않은 공정보다 더 높음을 알 수 있다. 실시예 4: 관류 배양과 회분식 배양에 의한 293 세포의 최고 밀도 비교
시험 1: 배양은 당업계의 통상적인 회분식 배양 공정을 사용하여 수행하였다.
시험 2: 실시예 3의 관류 공정 시험 2의 관류 배양 공정을 사용하였는 바, 즉 293 세포를 소생시킨 후, 증폭시켜 발효 탱크에 접종하고, 세포 밀도가 1×106 세포/mL에 도달한 후 관류를 시작하되, 관류 속도는 2VVD이다. 세포 밀도가 5×106 세포/mL로 성장할 때까지 계속 배양하여 관류 속도를 3VVD로 조절하였다. 관류 공정에서 글루타민 농도를 모니터링하고, 글루타민을 보충하여 글루타민의 농도를 2mM로 유지하였다.
배양 종료 후 최고 세포 밀도 및 생존율을 검출하여 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1의 결과로부터 회분식 배양의 최고 배양 밀도가 3.8×106 세포/mL임을 알 수 있다. 반면 관류 배양은 연속 관류 장치를 통해 반응기에 신선한 배지를 지속적으로 보충하여 반응기 내의 세포 대사 폐기물을 대체하고 세포에 충분한 영양을 유지할 수 있으며, 관류 공정 배양의 세포 밀도는 회분식 배양의 약 100배인 최대 33×107 세포/mL로, 명백한 우세가 있다.
실시예 5: 관류 배양 공정의 바이러스 생산량
시험 1: 관류 공정: 세포 밀도가 10×106 세포/mL에 도달할 때까지 관류 배양하고, 재조합 신종 코로나 바이러스(아데노바이러스 벡터) 종자(공지된 종래 기술에 따라 제조)를 접종하였으며, 배지 내 글루타민 농도를 모니터링하여 글루타민의 농도를 3mM 이상 보충하고, 관류 속도를 1VVD 또는 3VVD로 선택하였다. 배양 종료 후, 바이러스 수확액을 취하여 효소-결합 면역흡착 분석법으로 역가를 측정하였다.
시험 2: 회분식 공정: 회분식 배양 및 바이러스 접종을 수행하고, 글루타민을 보충하지 않았으며, 바이러스 접종 후 관류를 수행하지 않았다.
시험 1-2는 배양 과정에서 다른 파라미터가 기본적으로 동일하였다. 결과를 표 4에 나타내었다.
표 6: 관류 및 회분식 배양에 의한 293 세포의 독성 생성량 비교
Figure pct00006
관류 배양과 회분식 배양의 단세포 독성 생성량을 비교하면, 관류 배양 방식은 약 10배 더 높은 단세포 생산량을 얻을 수 있고, 단일 탱크 생산 능력은 거의 100배 증가할 수 있다. 실시예 6: 관류 배양 공정에서 보다 높은 바이러스 비활성에 관한 연구
관류 배양 및 회분식 배양의 아데노바이러스 수확액을 정제하고, 역가 및 바이러스 입자 수를 측정하였으며, 비활성을 계산하여 결과를 도 2에 나타내었다.
그 결과, 회분식 배양으로 얻은 아데노바이러스 원액의 비활성은 3.8%이고, 관류 배양으로 얻은 아데노바이러스 원액의 비활성은 7.1%인 바, 이는 아데노바이러스를 관류 배양하면 회분식 배양보다 더 많은 살아있는 바이러스 입자를 얻을 수 있음을 보여준다.
이상의 설명은 본 발명의 바람직한 실시예일 뿐, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니며, 본 발명의 사상 및 원칙 내에서 이루어진 모든 수정, 균등 대체 등은 모두 본 발명의 보호 범위에 포함되어야 한다.
본 발명에서 설명된 전술한 실시예 및 방법은 당업자의 능력, 경험 및 선호도에 따라 달라질 수 있다.
본 발명에서 방법의 단계를 일정 순서로만 나열하는 것은 방법 단계의 순서에 대한 어떠한 제한도 구성하지 않는다.

Claims (16)

  1. (1) 숙주 세포를 접종하여 세포 배양을 수행하는 단계;
    (2) 세포 밀도가 1×106 내지 5×106 세포/mL에 도달한 후 관류를 시작하되, 관류 속도는 1 내지 3VVD인, 단계; 및
    (3) 세포 밀도가 5×106 내지 10×106 세포/mL로 성장한 후, 관류 속도를 2 내지 4VVD로 조절하는 단계
    를 포함하는, 아데노바이러스 숙주 세포의 배양 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 관류는 연속 관류 장치를 이용하여 수행되고; 상기 연속 관류 장치는 중공 섬유 컬럼의 여과 기공 크기(filtration pore size)가 0.1 내지 0.8μm인 교대 접선 유동 여과 시스템(alternating tangential flow filtration system)을 사용하는 것을 특징으로 하는, 아데노바이러스 숙주 세포의 배양 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 세포 배양에서, 글루타민의 농도는 2mM 이상으로 유지되는 것을 특징으로 하는, 아데노바이러스 숙주 세포의 배양 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 숙주 세포는 293 세포인 것을 특징으로 하는, 아데노바이러스 숙주 세포의 배양 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 숙주 세포는 HEK293 세포 또는 HEK293.CS 세포인 것을 특징으로 하는, 아데노바이러스 숙주 세포의 배양 방법.
  6. (1) 숙주 세포를 접종하여 세포 배양을 수행하는 단계;
    (2) 세포 밀도가 1×106 내지 5×106 세포/mL에 도달한 후 관류를 시작하되, 관류 속도는 1 내지 3VVD인, 단계;
    (3) 세포 밀도가 5×106 내지 10×106 세포/mL로 성장한 후, 관류 속도를 2 내지 4VVD로 조절하는 단계; 및
    (4) 바이러스를 접종하여 배양하는 단계
    를 포함하는, 아데노바이러스의 생산 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    단계 (4)에서, 상기 배양은 관류 배양이고, 관류 속도는 1 내지 3VVD인 것을 특징으로 하는, 아데노바이러스의 생산 방법.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서,
    상기 관류는 연속 관류 장치를 이용하여 수행되고; 상기 연속 관류 장치는 중공 섬유 컬럼의 여과 기공 크기가 0.1 내지 0.8μm인 교대 접선 유동 여과 시스템을 사용하는 것을 특징으로 하는, 아데노바이러스의 생산 방법.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 배양에서, 글루타민의 농도는 2mM 이상으로 유지되는 것을 특징으로 하는, 아데노바이러스의 생산 방법.
  10. 제6항에 있어서,
    상기 숙주 세포는 293 세포인 것을 특징으로 하는, 아데노바이러스의 생산 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 숙주 세포는 HEK293 세포 또는 HEK293.CS 세포인 것을 특징으로 하는, 아데노바이러스의 생산 방법.
  12. 제6항에 있어서,
    상기 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스 또는 침팬지 아데노바이러스인 것을 특징으로 하는, 아데노바이러스의 생산 방법.
  13. 제6항에 있어서,
    상기 아데노바이러스는 AdHu5, AdHu4, AdHu7, AdHu11, AdHu26, AdHu55, AdC68 및 AdC3으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 아데노바이러스의 생산 방법.
  14. 제6항에 있어서,
    상기 아데노바이러스는, 암호화 외인성 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스인 것을 특징으로 하는, 아데노바이러스의 생산 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 아데노바이러스는 SARS-CoV-2의 구조 단백질 유전자를 포함하고, 상기 구조 단백질은 S 단백질, M 단백질, E 단백질 및 N 단백질 중 하나 이상으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 아데노바이러스의 생산 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 방법에서의 단계를 포함하는, 아데노바이러스 벡터 백신의 제조 방법.
KR1020227043727A 2020-11-09 2021-11-08 관류 배양 공정에 의한 아데노바이러스 벡터 백신의 제조 방법 KR20230011352A (ko)

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