KR102655748B1 - 고포도당 조건에서의 중간엽 줄기세포의 생존율을 증가시키는 방법 - Google Patents
고포도당 조건에서의 중간엽 줄기세포의 생존율을 증가시키는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 고포도당 환경에서의 줄기세포 생존율을 향상시키는 방법에 관한 것으로, 줄기세포가 고포도당 환경에 노출되면 줄기세포의 생존율이 감소한다. 이러한 과정에는 줄기세포 내 칼슘 이온의 농도가 증가하고 미토콘드리아의 산화 스트레스가 증가하며, 미토콘드리아의 분열이 증가하여 미토콘드리아에 의한 세포 사멸이 증가하는 현상을 확인할 수 있었다. 이를 통해 칼슘 신호전달계가 줄기세포의 사멸에 기여한다는 것을 확인하였고 이를 조절할 수 있는 타크로리무스를 포함하는 칼시뉴린 억제제 또는 미토콘드리아의 분열을 억제하는 미토콘드리아 역학 조절제를 통하여 고포도당 환경에 의해 감소하는 줄기세포의 생존율을 향상시킬 수 있음을 밝혔다.
Description
본 발명은 고포도당 조건에서 중간엽 줄기세포의 생존율을 증가시키는 방법에 관한 것으로서, 칼슘 신호 저해제 및 미토콘드리아 역학 조절제를 이용하여 중간엽 줄기세포의 생존율을 증가시키는 방법 및 이를 통하여 제조된 중간엽 줄기세포에 관한 것이다.
당뇨병 환자의 치료를 위해 줄기세포 조성물을 투여하는 방법에 관한 연구는 지속적으로 진행되고 있으나(대한민국 공개 특허 10-2014-0068936호, 대한민국 공개 특허 10-2022-0094194호 및 Exp. Eye. Res., 2020, 190:107865), 줄기세포가 고포도당 조건에 노출되면 줄기세포의 생존율이 감소할 수 있다고 알려져 있다(Stem Cells Dev., 2010, 10(12):1875-1884). 하지만 줄기세포의 생존율이 감소하는 원인이 명확하게 밝혀지지 않았다.
칼슘(Ca2+)은 다양한 생물학적 기능을 조절하는 중요한 신호전달 물질이고, 과거 연구에서 인슐린은 칼슘-의존적인 방식으로 분비되기 때문에 건강한 사람에 비해 당뇨 환자에게서 칼슘 분비가 증가한다는 것이 밝혀져 있다. 그리고 당뇨성 뇌질환(diabetic encephalopathy) 환자의 뇌에서 세포 내 칼슘 수준이 증가하고 칼슘의 항상성을 유지하는 기능에 이상이 발생한다는 것이 밝혀졌다.
또한, 칼슘 농도와 미토콘드리아의 기능은 연관되어 있다. 과도한 칼슘 농도는 신경모세포종인 SH-SY5Y에서의 미토콘드리아 기능 및 막 전하(membrane potential)을 저해한다는 것이 밝혀졌고, 이는 미토콘드리아에 의한 세포 사멸로 이어질 수 있다(Onphachanh, et al., J Pineal Res., 63(3), 2017). 지속적인 세포 내 칼슘 농도의 증가는 미토콘드리아의 막 전하를 망가뜨려 세포의 에너지 공급을 저해할 수 있어 미토콘드리아의 기능 저해 및 세포 사멸이 유도될 수 있다(Duchen, J Physiol., 15;529, 2000).
타크로리무스(tacrolimus, FK506)는 FKBPB12에 결합하는 면역억제제로서, FK506-FKBPB12 복합체는 칼시뉴린(calcineurin)과 결합하여 이의 인산분해효소 활성을 저해한다. 그리고 인산분해효소의 활성이 저해됨에 따라 T세포 수용체에 의한 신호 전달에 중요한 전사인자인 NFATC1이 핵으로 이동하는 것이 저해된다. 세포 내 칼슘 신호의 비정상적인 활성은 칼슘-칼시뉴린-NFATC1 경로를 활성시켜 비정상적인 면역 활성을 유도할 수 있다. 타크로리무스는 NFATC1의 활성을 저해하여 비정상적인 면역을 저해하는 약물로 면역억제제 용도로 잘 알려져 있으나 본 발명에서는 칼시뉴린 억제제이자 NFATC1 저해제로서 이용하고자 한다.
고포도당 조건에서 줄기세포의 사멸이 증가하는 원인이 밝혀지지 않았기에 본 발명에서는 이를 밝히고 사멸을 유도하는 기작을 저해하여 고포도당 조건에서의 줄기세포 생존율을 향상시키고자 한다.
본 발명의 목적은 고포도당 환경에서 중간엽 줄기세포의 생존을 향상시키는 방법과 그 방법에 의해 제조된 중간엽 줄기세포를 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 고포도당 환경에서 증가하는 줄기세포의 생존율을 향상시키는 방법으로서, 줄기세포에 칼슘 신호 조절제 또는 미토콘드리아 역학 조절제를 처리하는 단계를 포함하는 줄기세포의 생존율을 향상시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 칼슘 신호 조절제 또는 미토콘드리아 역학 조절제를 처리하는 단계를 포함하는 줄기세포의 생존율을 향상시키는 방법을 통해 제조된 줄기세포를 제공한다.
본 발명은 고포도당 조건에서 줄기세포의 생존율을 향상시키는 방법에 관한 것으로, 고포도당 조건에 의해 세포 내 칼슘 이온의 농도가 증가하고 그에 따라 칼슘 신호 전달계 및 NFATC1의 활성이 증가하고 미토콘드리아의 분열이 증가하여 줄기세포의 사멸이 증가하는 것을 확인하였다. 이를 저해하기 위한 칼슘 신호 전달 저해제 또는 미토콘드리아 역학 조절제를 처리하면 고포도당 조건에서 증가하는 줄기세포의 사멸이 회복되어 고포도당 조건에서의 줄기세포의 생존율을 향상시킬 수 있음을 확인하였다.
도 1은 고포도당 조건에서의 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(UBC-derived MSC)의 생존율을 확인한 결과이다.
도 1a는 다양한 농도의 D-글루코스를 포함하는 조건(0, 25, 50 및 100 mM의 D-글루코스)에서 줄기세포의 생존율을 확인한 결과이다.
도 1b는 50 mM의 D-글루코스를 포함하는 배지에서 다양한 시간(0, 24, 48 및 72 시간)동안 배양된 줄기세포의 생존율을 확인한 결과이다.
도 2는 동일한 농도의 D-글루코스와 L-글루코스를 포함하는 배지에서 배양된 줄기세포의 생존율을 비교한 결과이다.
도 3은 고포도당 조건에서 배양된 줄기세포 내 미토콘드리아 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 생성의 변화를 확인한 결과이다.
도 3a는 50 mM 글루코스를 포함하는 고포도당 조건에서 다양한 시간(0, 24, 48 및 72 시간)동안 배양된 줄기세포의 미토콘드리아 산화 스트레스를 확인한 결과이다.
도 3b는 고포도당 조건에서 다양한 시간(0, 24, 48 및 72 시간)동안 배양된 줄기세포 내 미토콘드리아의 막 전하를 확인한 결과이다.
도 4는 고포도당 조건에 미토콘드리아의 ROS 저해제인 mitoTEMPO 처리하였을 때의 줄기세포 생존율을 확인한 결과이다.
도 4a는 웨스턴블롯을 통하여 고포도당 조건 및 미토콘드리아 ROS 저해제인 mitoTEMPO 처리 조건에서의 세포 사멸 단백질인 Bax 및 cleaved caspase 9와 세포 사멸 저해 단백질인 Bcl-2의 양을 비교한 결과이다.
도 4b는 LDH 분비량을 측정하여 고포도당 조건에서는 미토콘드리아 ROS 저해제인 mitoTEMPO를 처리하였을 때 세포 사멸 정도를 확인한 결과이다.
도 5는 고포도당 조건에서 배양하는 시간에 따른 줄기세포 내 칼슘 이온의 양을 확인한 결과이다.
도 6은 고포도당 조건에서 세포 외 칼슘 이온 유입을 억제하는 EGTA 및 세포 내 칼슘 이온 유리를 억제하는 BAPTA-AM을 처리하여 칼슘 이온 축적 변화를 확인하는 결과이다.
도 7은 고포도당 조건에서 배양함에 따라 줄기세포 내 NFATC1의 발현 및 활성을 비교한 결과이다.
도 8은 고포도당 조건에서 세포 내 NFATC1의 위치를 확인한 결과이다.
도 8a는 NFATC1에 대한 항체를 이용하여 형광 염색한 결과이다.
도 8b는 도 8a의 결과를 분석하여 정리한 그래프이다.
도 9는 고포도당 조건에서 O-GlcNAc화를 확인하기 위해 O-GlcNAc 전이효소(O-GlcNAc transferase, OGT) 및 O-GlcNAc 제거 효소(O-GlcNAcase, OGA)의 양 및 O-GlcNAc의 양을 확인한 결과와 이의 분석 그래프이다.
도 10은 고포도당 조건에 OGT 억제제(ST045849)를 처리하여 O-GlcNAc 변화에 따른 NFATC1 활성도 변화를 확인한 결과이다.
도 11은 고포도당 조건 및 고포도당 조건에 OGT 억제제(ST045849)를 처리한 조건에서 NFATC1의 줄기세포 내 위치 변화를 확인한 결과이다.
도 11a는 NFATC1에 대한 형광 염색을 통하여 줄기세포 내 NFATC1의 위치를 확인한 결과이다.
도 11b는 도 11a의 결과를 분석하여 그래프로 정리한 결과이다.
도 12는 미토콘드리아를 염색하는 미토트래커(Mitotracker)를 이용하여 고포도당 조건에 의한 미토콘드리아 역학 변화를 확인한 결과이다.
도 12a는 미토트래커로 염색하여 미토콘드리아의 모양을 시각화한 결과이다.
도 12b는 도 12a의 결과를 분석하여 그래프로 정리한 결과이다.
도 12c는 웨스턴 블롯을 통하여 고포도당 조건의 배양 시간에 따라 미토콘드리아 분열을 유도하는 DRP1의 발현 및 활성 정도를 비교한 결과와 이의 분석 그래프이다.
도 13은 고포도당 조건에서 칼시뉴린 억제제인 타크로리무스를 처리함에 따른 미토콘드리아의 변화를 확인한 결과이다.
도 13a는 고포도당 조건에서 타크로리무스를 처리함에 따른 줄기세포 내 미토콘드리아의 활성산소종 생성을 비교한 결과이다.
도 13b는 고포도당 조건에서 타크로리무스를 처리함에 따른 줄기세포 내 미토콘드리아의 막 전하를 비교한 결과이다.
도 14는 고포도당 조건에서 타크로리무스를 처리함에 따른 세포 사멸 수준을 비교한 결과이다.
도 14a는 LDH 방출량을 측정하여 고포도당 조건에 의한 세포 사멸 수준과 타크로리무스를 처리하였을 때의 세포 사멸 수준을 비교하였다.
도 14b는 웨스턴 블롯을 이용하여 고포도당 조건 및 고포도당 조건에서 타크로리무스를 처리한 조건 간의 세포 사멸 관련 단백질의 발현 수준을 비교하였다.
도 15는 미토트래커를 이용하여 고포도당 조건에서 배양된 경우와 고포도당 조건에서 타크로리무스를 처리한 조건에서 배양된 경우의 줄기세포 내 미토콘드리아의 역학을 비교한 결과이다.
도 15a는 미토트래커를 이용하여 줄기세포 내 미토콘드리아의 형태를 시각화한 결과와 이의 분석 그래프이다.
도 15b는 웨스턴 블롯을 이용하여 미토콘드리아의 분열에 기여하는 DRP1의 발현 및 활성화 정도를 확인한 결과와 이의 분석 그래프이다.
도 16은 미토트래커를 이용하여 고포도당 조건에서 배양된 경우와 고포도당 조건에서 DRP1 저해제인 Mdivi-1을 처리한 조건에서 배양된 경우의 줄기세포 내 미토콘드리아의 형태를 확인한 결과와 이를 분석한 그래프이다.
도 17은 고포도당 조건에서 DRP1 저해제인 Mdivi-1을 처리하였을 때의 줄기세포 내 미토콘드리아의 변화를 확인한 결과이다.
도 17a는 고포도당 조건에서 DRP1 저해제인 Mdivi-1을 처리하였을 때의 줄기세포 내 미토콘드리아의 산화 스트레스(ROS)의 변화를 보여준다.
도 17b는 고포도당 조건에서 DRP1 저해제인 Mdivi-1을 처리하였을 때의 줄기세포 내 미토콘드리아의 막 전하를 비교한 결과이다.
도 18은 DRP1 저해제인 Mdivi-1 처리 조건 하에서의 줄기세포 사멸을 확인한 결과이다.
도 18a는 LDH 방출량을 측정하여 고포도당 조건에서 DRP1 저해제를 처리하였을 때 세포 사멸 정도를 확인한 결과이다.
도 18b는 웨스턴 블롯을 이용하여 고포도당 조건에서 DRP1 저해제를 처리하였을 때 세포 사멸과 관련이 있는 단백질인 Bax 및 cleaved caspase 9과 세포 사멸을 저해하는 Bcl-2의 양을 비교한 결과이다.
도 1a는 다양한 농도의 D-글루코스를 포함하는 조건(0, 25, 50 및 100 mM의 D-글루코스)에서 줄기세포의 생존율을 확인한 결과이다.
도 1b는 50 mM의 D-글루코스를 포함하는 배지에서 다양한 시간(0, 24, 48 및 72 시간)동안 배양된 줄기세포의 생존율을 확인한 결과이다.
도 2는 동일한 농도의 D-글루코스와 L-글루코스를 포함하는 배지에서 배양된 줄기세포의 생존율을 비교한 결과이다.
도 3은 고포도당 조건에서 배양된 줄기세포 내 미토콘드리아 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 생성의 변화를 확인한 결과이다.
도 3a는 50 mM 글루코스를 포함하는 고포도당 조건에서 다양한 시간(0, 24, 48 및 72 시간)동안 배양된 줄기세포의 미토콘드리아 산화 스트레스를 확인한 결과이다.
도 3b는 고포도당 조건에서 다양한 시간(0, 24, 48 및 72 시간)동안 배양된 줄기세포 내 미토콘드리아의 막 전하를 확인한 결과이다.
도 4는 고포도당 조건에 미토콘드리아의 ROS 저해제인 mitoTEMPO 처리하였을 때의 줄기세포 생존율을 확인한 결과이다.
도 4a는 웨스턴블롯을 통하여 고포도당 조건 및 미토콘드리아 ROS 저해제인 mitoTEMPO 처리 조건에서의 세포 사멸 단백질인 Bax 및 cleaved caspase 9와 세포 사멸 저해 단백질인 Bcl-2의 양을 비교한 결과이다.
도 4b는 LDH 분비량을 측정하여 고포도당 조건에서는 미토콘드리아 ROS 저해제인 mitoTEMPO를 처리하였을 때 세포 사멸 정도를 확인한 결과이다.
도 5는 고포도당 조건에서 배양하는 시간에 따른 줄기세포 내 칼슘 이온의 양을 확인한 결과이다.
도 6은 고포도당 조건에서 세포 외 칼슘 이온 유입을 억제하는 EGTA 및 세포 내 칼슘 이온 유리를 억제하는 BAPTA-AM을 처리하여 칼슘 이온 축적 변화를 확인하는 결과이다.
도 7은 고포도당 조건에서 배양함에 따라 줄기세포 내 NFATC1의 발현 및 활성을 비교한 결과이다.
도 8은 고포도당 조건에서 세포 내 NFATC1의 위치를 확인한 결과이다.
도 8a는 NFATC1에 대한 항체를 이용하여 형광 염색한 결과이다.
도 8b는 도 8a의 결과를 분석하여 정리한 그래프이다.
도 9는 고포도당 조건에서 O-GlcNAc화를 확인하기 위해 O-GlcNAc 전이효소(O-GlcNAc transferase, OGT) 및 O-GlcNAc 제거 효소(O-GlcNAcase, OGA)의 양 및 O-GlcNAc의 양을 확인한 결과와 이의 분석 그래프이다.
도 10은 고포도당 조건에 OGT 억제제(ST045849)를 처리하여 O-GlcNAc 변화에 따른 NFATC1 활성도 변화를 확인한 결과이다.
도 11은 고포도당 조건 및 고포도당 조건에 OGT 억제제(ST045849)를 처리한 조건에서 NFATC1의 줄기세포 내 위치 변화를 확인한 결과이다.
도 11a는 NFATC1에 대한 형광 염색을 통하여 줄기세포 내 NFATC1의 위치를 확인한 결과이다.
도 11b는 도 11a의 결과를 분석하여 그래프로 정리한 결과이다.
도 12는 미토콘드리아를 염색하는 미토트래커(Mitotracker)를 이용하여 고포도당 조건에 의한 미토콘드리아 역학 변화를 확인한 결과이다.
도 12a는 미토트래커로 염색하여 미토콘드리아의 모양을 시각화한 결과이다.
도 12b는 도 12a의 결과를 분석하여 그래프로 정리한 결과이다.
도 12c는 웨스턴 블롯을 통하여 고포도당 조건의 배양 시간에 따라 미토콘드리아 분열을 유도하는 DRP1의 발현 및 활성 정도를 비교한 결과와 이의 분석 그래프이다.
도 13은 고포도당 조건에서 칼시뉴린 억제제인 타크로리무스를 처리함에 따른 미토콘드리아의 변화를 확인한 결과이다.
도 13a는 고포도당 조건에서 타크로리무스를 처리함에 따른 줄기세포 내 미토콘드리아의 활성산소종 생성을 비교한 결과이다.
도 13b는 고포도당 조건에서 타크로리무스를 처리함에 따른 줄기세포 내 미토콘드리아의 막 전하를 비교한 결과이다.
도 14는 고포도당 조건에서 타크로리무스를 처리함에 따른 세포 사멸 수준을 비교한 결과이다.
도 14a는 LDH 방출량을 측정하여 고포도당 조건에 의한 세포 사멸 수준과 타크로리무스를 처리하였을 때의 세포 사멸 수준을 비교하였다.
도 14b는 웨스턴 블롯을 이용하여 고포도당 조건 및 고포도당 조건에서 타크로리무스를 처리한 조건 간의 세포 사멸 관련 단백질의 발현 수준을 비교하였다.
도 15는 미토트래커를 이용하여 고포도당 조건에서 배양된 경우와 고포도당 조건에서 타크로리무스를 처리한 조건에서 배양된 경우의 줄기세포 내 미토콘드리아의 역학을 비교한 결과이다.
도 15a는 미토트래커를 이용하여 줄기세포 내 미토콘드리아의 형태를 시각화한 결과와 이의 분석 그래프이다.
도 15b는 웨스턴 블롯을 이용하여 미토콘드리아의 분열에 기여하는 DRP1의 발현 및 활성화 정도를 확인한 결과와 이의 분석 그래프이다.
도 16은 미토트래커를 이용하여 고포도당 조건에서 배양된 경우와 고포도당 조건에서 DRP1 저해제인 Mdivi-1을 처리한 조건에서 배양된 경우의 줄기세포 내 미토콘드리아의 형태를 확인한 결과와 이를 분석한 그래프이다.
도 17은 고포도당 조건에서 DRP1 저해제인 Mdivi-1을 처리하였을 때의 줄기세포 내 미토콘드리아의 변화를 확인한 결과이다.
도 17a는 고포도당 조건에서 DRP1 저해제인 Mdivi-1을 처리하였을 때의 줄기세포 내 미토콘드리아의 산화 스트레스(ROS)의 변화를 보여준다.
도 17b는 고포도당 조건에서 DRP1 저해제인 Mdivi-1을 처리하였을 때의 줄기세포 내 미토콘드리아의 막 전하를 비교한 결과이다.
도 18은 DRP1 저해제인 Mdivi-1 처리 조건 하에서의 줄기세포 사멸을 확인한 결과이다.
도 18a는 LDH 방출량을 측정하여 고포도당 조건에서 DRP1 저해제를 처리하였을 때 세포 사멸 정도를 확인한 결과이다.
도 18b는 웨스턴 블롯을 이용하여 고포도당 조건에서 DRP1 저해제를 처리하였을 때 세포 사멸과 관련이 있는 단백질인 Bax 및 cleaved caspase 9과 세포 사멸을 저해하는 Bcl-2의 양을 비교한 결과이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 고포도당 환경에서 증가하는 줄기세포의 생존율을 향상시키는 방법으로서, 줄기세포에 칼슘 신호 조절제 또는 미토콘드리아 역학 조절제를 처리하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
상기 고포도당 환경은 줄기세포가 생장하는 조건에 D-글루코스가 포함된 조건을 지칭한다. 여기서 D-글루코스는 25 mM 이상의 농도로 포함될 수 있다. 바람직하게는 50 mM 이상의 농도로 포함된다.
상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포로서 제대혈 줄기세포, 골수 줄기세포, 지방 줄기세포 및 신경 줄기세포로 구성된 군에서 선택되는 것이다. 바람직하게는 제대혈 줄기세포이다.
상기 줄기세포는 인간, 마우스, 랫트, 토끼, 소 및 돼지를 포함하는 포유류 동물에서 유래할 수 있고, 바람직하게는 인간 유래의 줄기세포이다.
상기 줄기세포는 동물에서 직접 채취하여 배양할 수 있고 상업적으로 판매하는 것을 구매하여 사용할 수 있다.
상기 칼슘 신호 조절제는 2차 신호 전달자인 칼슘 이온에 의해 세포 내에서 발생하는 신호 전달계의 활성을 저해하는 약물을 의미하고 칼시뉴린 억제제를 포함할 수 있다. 바람직하게는 타크로리무스(tacrolimus), 사이클로스포린(cyclosporine), 피메크로리무스(pimecrolimus) 및 보클로스포린(voclosporin)이고, 더욱 바람직하게는 타크로리무스이다.
상기 타크로리무스는 FK506으로도 불리는 약물로 면역 억제 활성 및 항진균 활성을 갖는 것으로 널리 알려져 있어 장기 이식 환자의 면역 거부 반응을 억제하기 위해 사용하거나 아토피와 같은 자가 면역 질환의 치료에도 사용되고 있다. 타크로리무스는 FKBP-12와 결합하여 칼슘/칼모듈린 의존성 단백질인 칼시뉴린의 활성을 저해하고 NFATC1의 탈인산화 및 전위를 방지하여 억제하여 면역 세포의 활성을 저해한다.
상기 타크로리무스의 처리 농도는 50 내지 200 nM일 수 있고 바람직하게는 75 내지 150 nM이며, 더욱 바람직하게는 100 nM이다.
상기 미토콘드리아 역학(mitochondria dynamics)은 미토콘드리아가 형태를 변화하는 것을 의미하고 미토콘드리아의 길이가 길어지는 융합(fusion)과 미토콘드리아가 쪼개지는 분열(fission)의 가역적인 변화 과정을 의미한다. 미토콘드리아의 형태 변화 조절을 통한 항상성 유지는 미토콘드리아의 기능 유지에 절대적으로 중요한 과정이다.
상기 미토콘드리아 역학 조절제는 미토콘드리아의 분열을 저해하는 약물을 의미한다. 바람직하게는 미토콘드리아의 분열에 관여하는 단백질의 활성을 저해하는 약물을 포함할 수 있다. 더욱 바람직하게는 DRP1 억제제로서 P110 및 Mdivi-1를 포함하며, 가장 바람직하게는 Mdivi-1을 포함할 수 있다.
상기 줄기세포에 칼슘 신호 조절제 또는 미토콘드리아 역학 조절제를 처리하는 단계는 줄기세포가 고포도당 환경에 노출되기 전에 수행될 수 있다.
본 발명은 상기 방법을 제조된 줄기세포를 제공한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 줄기세포의 생존율이 변화하는 고포도당 환경의 조건을 확인하여 50 mM 이상의 D-글루코스가 포함된 조건에서 배양 시간이 증가할수록 줄기세포의 생존율이 감소하고 특히 48시간 이상 배양하는 경우 유의미한 수준의 생존율 감소를 확인할 수 있었다(도 1 참조). 동일한 농도의 L-글루코스와 D-글루코스를 처리한 조건에서 줄기세포의 생존율을 비교한 결과, 이러한 줄기세포의 생존율 저하는 글루코스 농도 증가로 인해 발생하는 삼투압에 의한 현상이 아님을 확인하였다(도 2 참조).
고농도의 D-글루코스를 처리한 조건에서는 줄기세포 내 산화 스트레스가 증가하고 미토콘드리아의 막 전하는 감소한 것을 관찰하였고 이를 통해 고포도당 환경에서는 줄기세포 내 미토콘드리아의 기능에 이상이 생겨 줄기세포의 사멸이 발생하였을 것으로 유추할 수 있다(도 3 참조).
따라서 산화 스트레스를 저해하였을 때의 줄기세포 사멸에 대한 영향을 확인하고자 미토콘드리아 ROS 저해제인 mitoTEMPO를 처리하였고 산화 스트레스를 저해하면 세포의 사멸이 감소함을 확인하였다(도 4 참조).
고포도당 환경에서 관찰되는 미토콘드리아의 변화 및 줄기세포의 사멸이 칼슘 이온의 방출과 연관이 있는지 확인하기 위해 고포도당 환경에서 줄기세포 내 칼슘 이온의 방출 수준을 측정한 결과 칼슘 이온의 방출 수준이 증가하였고(도 5 참조) 이러한 증가는 세포 외부로부터의 칼슘 이온 유입이 증가하는 것이 아니라 세포 내부의 변화라는 것을 알 수 있었다(도 6 참조). 배양배지 내 포도당의 농도가 높을 때 줄기세포 내 칼슘 이온의 농도가 높아지는 것을 확인하였기 때문에 칼슘 신호 전달계에 속하는 단백질인 NFATC1의 발현 및 활성화 수준을 확인하였고, 그 결과 고포도당 조건에서 칼슘 이온이 증가함에 따라 NFATC1의 발현이 증가하고 NFATC1의 인산화가 증가하였으며(도 7 참조) 핵으로의 이동이 증가하여 NFATC1이 활성화되었음을 알 수 있었다(도 8 참조).
포도당의 농도가 증가하면 세포 내 당화 현상이 증가할 수 있기 때문에 당화 현상 중 하나인 O-GlcNAc 화 수준을 확인하였고 고포도당 조건에서 O-GlcNAc이 증가하며 O-GlcNAc 전이 효소(O-GlcNAc transferase, OGT)의 양이 증가하는 것을 확인하였다(도 9 참조).
O-GlcNAc의 증가가 NFATC1의 활성화에 영향을 미치는지 확인하기 위해 OGT 억제제인 ST045849를 처리한 후 NFATC1의 발현 및 활성화 수준을 비교하였고 그 결과 고농도 글루코스에 의해 증가하였던 NFATC1의 발현이 OGT 억제제 처리 조건에서 감소하였고(도 10 참조) NFATC1의 핵으로의 이동(전위)가 감소하였다(도 11 참조). 따라서 포도당에 의해 증가하는 당화 현상(O-GlcNAc)이 NFATC1의 발현 및 활성화를 증가시킬 수 있다는 것을 유추할 수 있다.
고포도당 환경에서 미토콘드리아의 산화 스트레스(활성산소종, ROS) 및 막 전하의 변화를 확인하였기에 미토콘드리아의 ROS 생성 및 에너지 생산 능력과 관련이 있는 미토콘드리아의 역학을 확인하였고 고포도당 환경에서는 미토콘드리아의 분열이 증가하고 미토콘드리아의 분열에 기여하는 단백질인 DRP1의 발현 및 활성화 수준이 증가함을 확인하였다(도 12 참조). 이를 통해 고포도당 환경이 미토콘드리아의 분열에 영향을 미쳐 미토콘드리아의 산화 스트레스 및 줄기세포의 생존율에 영향을 미칠 것이라고 유추할 수 있다.
고포도당 환경에서 당화 현상이 증가하고 세포 내 칼슘 이온이 증가하여 칼슘 신호 전달계가 활성화되며 그로 인해 줄기세포의 사멸이 증가하는 것을 확인하였기에 칼슘 신호 전달계 저해제인 타크로리무스를 처리하여 칼슘 신호 전달계의 활성을 저해하였을 때의 미토콘드리아의 산화 스트레스 및 줄기세포 생존율을 확인하였고, 타크로리무스를 처리하면 고포도당 처리에 의해 발생한 산화 스트레스의 증가 및 막 전하의 감소가 회복되는 것을 볼 수 있었고(도 13 참조) 고포도당 조건에 의해 감소한 줄기세포 생존율이 회복되는 것을 확인할 수 있었다(도 14 참조).
또한 타크로리무스를 처리하면 고포도당 조건에 의해 증가하였던 미토콘드리아의 분열을 감소시키고 DRP1의 발현 및 활성을 감소시킬 수 있음을 확인하였다(도 15 참조). 이를 통해 칼슘 신호 전달계 저해제를 이용하면 고포도당 조건에서의 줄기세포 생존율 감소를 저해할 수 있음을 알 수 있다.
이와 더불어 본 발명에서는 고포도당 환경에서 증가하는 미토콘드리아의 분열에 주목하여 미토콘드리아 역학 조절제로서 DRP1 억제제(Mdivi-1)을 처리하여 미토콘드리아의 분열을 저해하였을 때 줄기세포의 생존율을 확인하였다. DRP1 억제제인 Mdivi-1을 처리하면 미토콘드리아의 분열이 감소하고(도 16 참조) 이 때의 산화 스트레스 및 막 전하가 회복되는 것을 확인할 수 있으며(도 17 참조) 세포의 사멸이 감소하여 생존율이 증가함을 확인할 수 있었다(도 18 참조). 즉, 미토콘드리아 역학 조절제, 그 중에서도 미토콘드리아의 분열을 저해하는 약물을 이용하면 고포도당 환경에서의 줄기세포 생존율을 향상시킬 수 있음을 알 수 있다.
따라서 본 발명을 통하여 고포도당 환경에서는 칼슘 이온 증가로 인해 칼슘 신호 전달계가 활성화되고 미토콘드리아의 분열 증가로 인해 산화 스트레스 및 막 전하의 변화가 생겨 줄기세포의 생존율이 감소하지만, 이를 조절할 수 있는 사이클로스포린(cyclosporine) 및 타크로리무스와 같은 칼슘 신호 조절제 및 미토콘드리아 역학 조절제를 이용하면 고포도당 환경에서의 줄기세포 생존율을 향상시킬 수 있음을 확인하였다.
이하에서는, 구체적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해서 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 고포도당 환경에서 줄기세포의 생존율 확인
인간 제대혈 유래의 줄기세포(UCB-MSC, 이하 '줄기세포'라고 지칭함)는 국내업체를 통해 구매하였고 10% FBS 및 0.5% 항생제(페니실린 및 스트렙토마이신)을 포함하는 CEFOgro 인간 MSC 성장배지를 이용하여 37 ℃, 5% 이산화탄소 조건에서 배양되었다. 줄기세포의 배지에 0, 25, 50, 100 mM의 D-글루코스를 첨가하거나 다양한 시간(24, 48 및 72시간)동안 배양하여 고포도당 조건이 줄기세포에 미치는 영향을 확인하였다.
D-글루코스를 포함하지 않는 대조군에 비해 D-글루코스를 배지에 포함된 조건에서는 줄기세포의 생존율이 감소하였고 특히 50 mM 이상의 D-글루코스가 포함된 조건에서는 유의미한 수준의 생존율 감소를 확인할 수 있었다(도 1a).
D-글루코스의 농도 변화 실험과 유사하게 D-글루코스를 포함하는 배지에서 배양하는 시간이 증가할수록 줄기세포의 생존율이 감소하였고 특히, 48시간 이상 배양한 조건에서 유의미한 수준의 생존율 감소를 확인할 수 있었다(도 1b).
따라서 D-글루코스는 용량 및 시간에 대해 의존적으로 줄기세포의 생존율을 감소시킴을 알 수 있었다.
<실시예 2> MSC 생존율에 삼투압이 미치는 영향 확인
D-글루코스가 배지에 첨가됨으로써 배지의 삼투압이 변하여 줄기세포가 사망하였을 가능성을 배제하기 위하여 D-글루코스의 이성질체인 L-글루코스를 동량 처리하여 D-글루코스 첨가 조건과 L-글루코스 첨가 조건에서의 줄기세포에 대한 세포독성 평가를 진행하였다.
세포에 대한 독성을 확인하기 위해 줄기세포(UCB-MSC)를 1.5 X 104 세포/웰(well)의 농도로 96웰 플레이트에 넣어 각 조건에 맞는 배지를 넣고 배양한 후, 600 Xg의 속도로 5분간 원심분리하여 세포 상층액을 분리하였다. 분리한 세포 상층액 50 μL와 젖산탈수소효소(lactate dehydrogenase, LDH) 방출 평가 키트(LDH release assay kit)의 LDH 반응 혼합액(LDH reaction mixture) 100 μL를 혼합하여 마이크로플레이트 리더를 이용하여 450 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.
실험 결과, L-글루코스를 첨가한 배지에서는 글루코스를 첨가하지 않은 배지에서와 유사한 수준의 LDH 방출을 보였고 D-글루코스를 첨가한 배지에서는 LDH 방출이 유의미한 수준으로 증가하였다(도 2).
따라서 D-글루코스 첨가에 의한 줄기세포 생존율 저하는 삼투압에 의한 현상이 아님을 알 수 있고 D-글루코스, 즉 고포도당 자체가 줄기세포의 생존율을 저하시킨다는 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 3> 고포도당 환경에서 미토콘드리아의 산화적 스트레스 및 막 전하 변화 확인
고포도당 환경에서 줄기세포 내 미토콘드리아의 산화적 스트레스를 확인하기 위해 D-글루코스를 포함하는 배지에서 48시간 이상 배양된 줄기세포에 미토콘드리아 초과산화물 표지자인 MitoSOX를 처리하고 37 ℃에서 15분간 방치한 후, 세포를 PBS로 2회 세척하였다. 그리고 나서, 마이크로플레이트 리더를 이용하여 여기 파장(excitation wavelength)은 485 nm, 방출 파장(emission wavelength) 535 nm으로 설정하여 MitoSOX가 표지된 세포를 검출하였다.
그리고 위와 동일하게 D-글루코스를 포함하는 배지에서 48시간 이상 배양된 줄기세포 내 미토콘드리아의 막 전하 및 활성을 확인하기 위하여 미토콘드리아 막 전하 평가 키트를 이용하여 TMRE 염색을 수행하였다. D-글루코스를 포함하는 배지에서 48시간 이상 배양된 줄기세포에 활성 미토콘드리아에 반응하는 형광염료인 TMRE를 처리하고 37 ℃에서 15분간 방치한 후, 세포를 PBS로 2회 세척하였다. 그리고 나서, 마이크로플레이트 리더를 이용하여 여기 파장(excitation wavelength)은 530 nm, 방출 파장(emission wavelength) 580 nm으로 설정하여 TMRE가 표지된 세포를 검출하였다. TMRE 염색법을 통해 염색이 된 미토콘드리아는 막 전하를 정상적으로 유지하고 활성화된 미토콘드리아를 의미한다.
그 결과, D-글루코스가 없는 조건이거나 48시간 미만 배양된 줄기세포에 비해 D-글루코스 존재하에 48시간 이상 배양된 줄기세포는 MitoSOX-양성 세포 비율이 높았고 TMRE-양성 세포의 비율이 감소하였다(도 3a 및 3b 참조).
따라서 고포도당 조건에서는 미토콘드리아의 기능에 이상이 발생한다는 것을 확인할 수 있고 이로 인해 세포 사멸이 발생하였을 것으로 유추할 수 있다.
<실시예 4> 고포도당 환경에서 미토콘드리아 ROS 저해를 통한 줄기세포 사멸 저해 확인
미토콘드리아의 산화적 스트레스로 인해 줄기세포의 사멸이 발생한 것인지 확인하기 위하여 미토콘드리아 ROS 저해제인 mitoTEMPO 10 μM을 30분동안 미리 처리한 줄기세포에 D-글루코스를 처리하여 48시간동안 배양하고 세포 사멸과 연관된 단백질인 Bax 및 cleaved caspase 9의 양과 세포 사멸을 저해하는 Bcl-2의 양을 웨스턴블롯을 통해 확인하였고, 이와 동일한 조건으로 배양된 줄기세포를 이용하여 LDH 방출 수준을 평가하여 세포 사멸 정도를 비교하였다.
그 결과, D-글루코스를 포함하는 배지에서 배양한 줄기세포에서는 세포 사멸의 증가와 연관되는 단백질인 Bax 및 cleaved caspase 9의 양은 증가하였고 세포 사멸을 저해하는 단백질인 Bcl-2의 양은 감소하여 고포도당 조건에서 세포 사멸이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 하지만 미토콘드리아의 ROS 저해제인 MitoTEMPO를 처리하면 Bax 및 cleaved caspase 9의 양은 유의미한 수준으로 감소하는 것을 확인할 수 있었고 Bax와 Bcl-2의 비율이 유의미한 수준으로 감소하여 세포 사멸이 저해된 것을 확인할 수 있었다(도 4a 참조).
그리고 D-글루코스 첨가에 의해 증가하였던 LDH 방출 수준이 MitoTEMPO 처리에 의해 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 4b 참조).
즉, 고포도당 조건에서 증가하는 줄기세포의 사멸은 미토콘드리아의 산화적 스트레스에 의한 것이라는 것을 유추할 수 있고 미토콘드리아의 산화적 스트레스를 조절하면 고포도당 조건으로 인해 발생하는 줄기세포의 사멸을 저해할 수 있다.
<실시예 5> 고포도당 환경에서의 칼슘 축적 및 NFATC1 신호전달 활성 확인
고포도당 조건이 줄기세포의 칼슘 이온(Ca2+)의 방출과 연관이 있는지 확인하기 위해 칼슘 이온의 방출을 확인하고 칼슘 이온에 의해 활성화되는 단백질로 알려진 NFATC1의 발현을 확인하였다.
칼슘 이온 방출 수준을 확인하기 위해 세포를 PBS로 세척한 후 혈청을 포함하지 않는 배지에서 2 μM의 플루오-3, AM 용액(Fluo-3, AM)을 추가하여 37 ℃에서 20분 동안 배양하였다. 그 후, 세포를 PBS로 2회 세척하고 플레이트 리더(plate reader)를 이용하여 485 nm 및 528 nm의 여기 파장 및 방출 파장으로 형광의 세기를 측정하였다.
고포도당 조건으로서 50 mM의 글루코스를 처리하고 시간이 지남에 따라 칼슘 이온의 방출이 증가하는 것을 확인하였고 특히 처리 후 24시간 이후부터 유의미한 수준의 증가를 확인할 수 있었다(도 5 참조).
고포도당 조건에 의해 유입되는 칼슘 이온의 경로를 확인하기 위해 세포외 칼슘 이온 억제제(chelator)인 EGTA와 세포내 칼슘 이온 억제제(chelator)인 BAPTA를 처리하여 세포 내 칼슘 이온 농도의 변화를 확인하였다. 줄기세포는 50 mM의 글루코스의 존재하에서 24시간동안 배양되었고 세포 내 칼슘 이온 농도를 표지하는 약물인 플루오-3, AM 용액을 처리하기 30분 전에 EGTA(0.5 mM) 또는 BAPTA(10 μM)을 처리하였다. 그 후, 플루오-3 AM 용액을 이용하여 세포 내 칼슘 이온을 측정하였다.
그 결과, 고포도당 조건으로 인해 증가한 세포내 칼슘 이온 수치는 BAPTA 처리에 의해서는 역전되었으나, EGTA 처리에 의해서는 유의미한 변화가 없었다(도 6 참조).
즉, 세포내의 칼슘 이온에 의해 칼슘 이온 농도의 변화가 발생한다는 것을 유추할 수 있다.
유사하게 고포도당 조건에서 배양된 줄기세포의 세포 용해물을 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하여 NFATC1의 발현 및 인산화 수준을 확인하였다.
활성화된 형태인 탈인산화된 NFATC1 단백질의 수준이 24시간에 증가하였고 불활성화된 형태인 세린172 부위가 인산화된 NFATC1의 수준은 증가하지 않았다(도 7 참조).
NFATC1 단백질이 활성화될 경우 NFATC1 단백질은 세포질에서 핵으로 이동하여 전사인자로서 작동하기 때문에 세포 내 NFATC1에 대해 염색을 하였다. 세포를 공초점 접시에 배양하여 아세톤으로 10분간 고정하였다. 고정된 세포는 0.1% 트윈20이 포함된 PBS(PBST)를 이용하여 3회 세척하였다. 그리고 5% BSA를 포함하는 PBST로 30분동안 차단(blocking)시킨 후 NFATC1 항체를 넣고 1시간동안 방치하였다. PBST로 3회 세척해준 후 2차 항체인 Alexa Fluor 488을 넣고 30분동안 방치하였다. 세포를 PBST로 세척한 후 4',6-다이아미노-2-페니린돌 다이하이드로클로라이드(DAPI)를 추가하여 핵을 염색하여 세포 내 이동을 확인하였다.
그 결과, 글루코스를 처리한 후 시간이 흐를수록 핵 안에 존재하는 NFATC1 단백질의 양이 증가하는 것을 확인하였다(도 8a 및 8b 참조).
따라서 고포도당 조건에서 줄기세포 내 칼슘 이온의 방출이 증가하고 그로 인해 NFATC1 신호전달계가 활성화되는 것을 알 수 있다.
<실시예 6> 고포도당 환경에서의 O-GlcNAc화 확인.
고포도당 조건에서 발생할 수 있는 당화 현상 중 O-GlcNAc화가 칼슘 이온 방출을 유도할 수 있는지 확인하기 위해 글루코스(50 mM)를 처리하고 웨스턴블롯을 통해 시간에 따른 O-GlcNAc 전이효소(O-GlcNAc transferase, OGT)와 O-GlcNAc의 발현량을 확인하였다.
그 결과, 고포도당 조건에서는 OGT의 발현이 증가하고 O-GlcNAc의 양이 증가하는 것을 확인하였으나 O-GlcNAc 가수분해효소인 OGA의 발현은 변화가 없었다(도 9 참조).
따라서 고포도당 조건에서 O-GlcNAc화가 증가하는 것은 OGT에 의한 O-GlcNAc화의 증가에 의한 것이라는 것을 유추할 수 있었다.
<실시예 7> 고포도당 환경에서 O-GlcNAc 억제가 NFATC1에 미치는 영향 확인.
고포도당 조건에서 O-GlcNAc이 증가하는 것을 확인하였고 O-GlcNAc화가 NFATC1에 미치는 영향을 확인하기 위해 50 mM의 글루코스를 처리한 조건에 OGT 억제제인 ST045849 100 nM을 처리하고 NFATC1의 발현과 인산화를 비교하였고 실시예 5에서 수행한 것과 같이 NFATC1의 세포 내 위치를 확인하였다.
그 결과, 글루코스에 의해 증가하였던 NFATC1의 발현량이 O-GlcNAc을 억제함에 따라 감소하였고(도 10 참조), 글루코스를 첨가한 조건에서 증가한 NFATC1의 핵으로의 이동이 ST045849의 처리로 인해 감소하였다(도 11a 및 11b 참조).
<실시예 8> 고포도당 환경에서 미토콘드리아의 역학 변화 확인.
미토콘드리아는 분열되어 작은 조각으로 나뉘거나 융합되어 큰 조각을 형성하는 과정을 반복한다. 이러한 과정을 미토콘드리아의 역학이라고 정의한다.
분열된 미토콘드리아는 더 많은 ROS를 형성하는 경향이 있고 에너지를 생산하는 기능은 저해된다.
고포도당 처리 조건에서 미토콘드리아의 산화 스트레스(ROS) 및 막 전하의 변화가 발생하는 것을 확인하였기에 미토콘드리아의 형태를 확인하고자 D-글루코스 50 mM을 처리한 줄기세포를 미토트래커(Mitotracker)로 염색하여 관찰하였다.
고포도당 환경에서 시간이 흐름에 따라 미토콘드리아의 분열이 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 12a 및 12b 참조).
이를 확인하기 위해 미토콘드리아의 분열에 기여하는 단백질인 DRP1의 발현량을 확인하였고 고포도당 환경에 노출되는 시간이 길어질 수록 DRP1의 발현량이 증가하고 활성화된 DRP1의 형태인 인산화된 DRP1(p-DRP1 ser616)의 양이 증가함을 확인하였다(도 12c 참조).
즉, 고포도당 환경은 미토콘드리아의 역학에도 영향을 미친다는 것을 알 수 있고 미토콘드리아의 분열이 증가하면서 산화 스트레스 및 세포의 생존율에 영향을 미칠 것이라고 유추할 수 있다.
<실시예 9> 고포도당 환경에서 타크로리무스가 미토콘드리아 산화 스트레스 및 줄기세포의 생존에 미치는 영향.
실시예 1 및 3에서 확인한 바와 같이, 고포도당 환경은 줄기세포 내의 미토콘드리아의 산화 스트레스를 증가시키고 줄기세포의 생존율을 감소시킨다. 그리고 실시예 5를 통하여 고포도당 환경은 칼슘 이온을 증가시키고 NFATC1을 활성화시킨다는 것을 확인하였다.
칼시뉴린 억제제로서 Ca2+-NFATC1 신호 전달계를 저해하는 것으로 잘 알려져 있는 타크로리무스를 이용하여 NFATC1 신호를 저해하여 고포도당 환경에서 칼슘 신호 전달계가 줄기세포의 산화 스트레스 및 생존율에 미치는 영향을 확인하였다.
줄기세포에 타크로리무스 100 nM을 처리하고 30분 후에 D-글루코스 50 mM을 추가하여 48시간동안 배양하였다. 그 후, 실시예 1에서 수행한 것과 동일한 방법으로 줄기세포 내 미토콘드리아의 산화 스트레스 및 막 전하를 측정하였다.
그 결과, 타크로리무스는 고포도당 조건에 의해 발생된 미토콘드리아 ROS를 감소시켰고 막 전하를 회복시켰다(도 13a 및 13b 참조).
이와 더불어 실시예 2에서 수행한 것과 동일한 방법으로 고포도당 조건에서 타크로리무스 처리 유무에 따른 줄기세포의 생존율을 확인하였고 고포도당 조건에 의해 감소한 줄기세포의 생존율은 타크로리무스 처리에 의해 회복되는 것을 확인하였다(도 14 참조).
따라서 타크로리무스는 칼슘-NFATC1 신호 전달계를 조절함으로써 고포도당 조건에서 발생하는 미토콘드리아의 기능 이상을 저해하여 줄기세포의 생존율을 향상시켰음을 유추할 수 있다.
<실시예 10> 고포도당 환경에서 타크로리무스가 미토콘드리아의 역학에 미치는 영향.
실시예 9를 통하여 타크로리무스가 줄기세포 내 미토콘드리아의 산화스트레스 및 생존율에 영향을 미친다는 것을 확인하였기에 미토콘드리아의 역학에 미치는 영향도 확인하고자 하였다. 실시예 8에서 수행한 방법으로 미토콘드리아를 염색하여 미토콘드리아의 형태를 확인하고 DRP1의 발현 및 활성을 비교하였다.
그 결과, 고포도당 처리에 의해 증가한 미토콘드리아의 분열은 타크로리무스의 처리에 의해 회복되었고(도 15a 참조), 고포도당 조건에 의해 증가한 DRP1의 발현량 및 활성도 타크로리무스 처리에 의해 감소하였다(도 15b 참조).
따라서 타크로리무스에 의한 칼슘 신호전달계 저해는 미토콘드리아의 분열을 저해한다는 것을 알 수 있다.
<실시예 11> 고포도당 환경에서 DRP1 억제제가 줄기세포의 생존율에 미치는 영향 확인.
실시예 9 및 10을 통하여 타크로리무스에 의해 미토콘드리아의 분열이 저해되고 줄기세포의 생존율을 향상됨을 확인하였기에 미토콘드리아의 분열을 저해하는 DRP1 억제제도 줄기세포의 생존율에 영향을 미칠 수 있는지 확인하고자 하였다.
미토콘드리아의 역학을 조절하는 DRP1 억제제로서 Mdivi-1을 이용하였고 D-글루코스(50 mM)을 처리하기 30분 전에 Mdivi-1(1 μM)을 처리하였다.
DRP1 억제제로서 작동하는 것을 확인하기 위해 실시예 8에서 수행한 방법으로 미토콘드리아를 염색하여 미토콘드리아의 형태를 확인하였고 Mdivi-1에 의해 미토콘드리아의 분열이 저해되는 것을 확인하였다(도 16 참조).
미토콘드리아의 역학을 조절하는 것이 줄기세포 내 미토콘드리아의 산화 스트레스 및 막 전하에 영향을 미치는지 확인하기 위해 줄기세포에 Mdivi-1을 처리하고 고포도당 환경을 조성하였고 실시예 3과 같은 방법으로 줄기세포 내 미토콘드리아의 산화 스트레스 및 막 전하를 확인하였다.
그 결과, DRP1 억제제를 처리하면 고포도당 조건에 의해 증가하였던 산화 스트레스(ROS)가 감소하고, 감소하였던 막 전하가 회복되었다(도 17a 및 17b 참조).
그와 동시에 실시예 2에 기재된 방법으로 DRP1 억제제 처리에 의해 세포 생존율에도 영향을 미치는지 확인하였다.
그 결과, 고포도당 환경에서 LDH 방출량은 DRP1 억제제인 Mdivi-1 처리에 의해 회복되었고(도 18a 참조), 고포도당 환경에서 증가하였던 세포 사멸과 관련된 단백질 Bax, cleaved caspase-9의 양 또한 Mdivi-1 처리에 의해 감소하였다(도 18b 참조).
따라서 미토콘드리아의 역학을 조절함으로써 줄기세포의 생존율을 향상시킬 수 있음을 알 수 있다.
고포도당 환경은 줄기세포 내 칼슘 이온 농도를 증가시켜 Ca2+-NFATC1 신호 전달계를 활성화시키고, 미토콘드리아의 분열을 증가시키며, 미토콘드리아의 산화 스트레스를 증가시켜 줄기세포의 생존율을 저하시킨다. 따라서 칼시뉴린 억제제인 타크로리무스와 같은 칼슘 신호 조절제, DRP1 억제제와 같은 미토콘드리아 역학 조절제, 또는 미토콘드리아 산화 억제제를 통하여 고포도당 환경에서 증가한 줄기세포의 사멸을 억제시킬 수 있고 생존율을 증가시킬 수 있다.
Claims (12)
- 고포도당 환경에서 줄기세포의 생존율을 향상시키는 방법으로서,
줄기세포에 칼슘 신호 조절제 또는 미토콘드리아 역학 조절제를 처리하는 단계를 포함하되,
상기 칼슘 신호 조절제는 타크로리무스이고,
상기 미토콘드리아 역학 조절제는 Mdivi-1이며,
상기 고포도당 환경은 D-글루코스의 농도가 50 mM 이상인 환경이고,
상기 줄기세포에 타크로리무스 또는 미토콘드리아 역학 조절제를 처리하는 단계는 줄기세포가 고포도당 환경에 노출되기 전에 수행되는 것인, 고포도당 환경에서 줄기세포의 생존율을 향상시키는 방법. - 삭제
- 삭제
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- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포인 것인, 고포도당 환경에서 줄기세포의 생존율을 향상시키는 방법. - 제9항에 있어서,
상기 중간엽 줄기세포는 제대혈 줄기세포, 골수 줄기세포, 지방 줄기세포 및 신경 줄기세포로 구성된 군에서 선택되는 것인, 고포도당 환경에서 줄기세포의 생존율을 향상시키는 방법. - 제10항에 있어서,
상기 중간엽 줄기세포는 인간 제대혈 유래 줄기세포인 것인, 고포도당 환경에서 줄기세포의 생존율을 향상시키는 방법. - 삭제
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| KR20140068936A (ko) * | 2011-08-05 | 2014-06-09 | 마리아 피아 코스마 | 망막 변성 질환의 치료방법 |
| KR102241919B1 (ko) * | 2020-04-21 | 2021-04-19 | 가톨릭대학교 산학협력단 | 타크로리무스에 의해 신독성이 유도된 신장 오가노이드 및 그의 제조방법 |
| KR20220094194A (ko) * | 2019-09-20 | 2022-07-05 | 베이징 인스티튜트 포 스템 셀 앤드 리제너레이티브 메디슨 | 다능성 줄기 세포, 약제학적 조성물, 및 이의 제조 방법 및 이의 적용 |
| KR102479525B1 (ko) * | 2019-10-25 | 2022-12-20 | 사회복지법인 삼성생명공익재단 | 면역억제제를 포함하는 줄기세포의 치료효과 증진용 조성물 및 이를 이용한 줄기세포 치료효과 증진방법 |
| KR20230028182A (ko) * | 2021-08-19 | 2023-02-28 | 주식회사 강스템바이오텍 | 칼시뉴린 억제제와 줄기세포를 사용하여 면역질환을 치료하는 방법 |
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2023
- 2023-06-08 KR KR1020230073709A patent/KR102655748B1/ko active IP Right Grant
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