KR102241919B1 - 타크로리무스에 의해 신독성이 유도된 신장 오가노이드 및 그의 제조방법 - Google Patents

타크로리무스에 의해 신독성이 유도된 신장 오가노이드 및 그의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 줄기세포를 신장 오가노이드로 분화시키고, 칼시뉴린 억제제(calcineurin inhibitor)인 타크로리무스 처리를 통해 신독성이 유도된 신장 오가노이드 및 이를 제조하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 신독성 유도 신장 오가노이드는 생체 조건 모델과 유사한 신독성을 나타내어 병원성 경로를 조사하는 효과적인 체외 모델로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

타크로리무스에 의해 신독성이 유도된 신장 오가노이드 및 그의 제조방법{Kidney organoid with nephrotoxicity induced by tacrolimus and method of preparing the same}
본 발명은 타크로리무스(tacrolimus)가 처리되어 신독성(nephrotoxicity)이 유도된 신장 오가노이드 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
면역억제제는 항원에 대하여 항체를 만드는 체액성 면역반응이나 세포성 면역반응을 차단하거나 저하시키는 약물로, 주로 장기이식 후 발생하는 면역 거부반응이나 골수이식 후의 이식편대숙주병(graft-versus-host disease)을 치료하는데 사용되어왔다. 뿐만 아니라, 면역억제제는 낭창(lupus), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis)과 같은 자가면역질환과 알러지, 아토피와 같은 과면역반응, 염증성 질환의 증상을 장기간에 걸쳐 치료하는 데에도 중요하게 쓰인다.
현재 사용되고 있는 면역억제제는 작용기작에 따라 코티코스테로이드(corticosteroid), 대사길항물질(antimetabolite), 칼시뉴린 억제제(calcineurin inhibitor), 라파마이신 타겟 억제제(mammalian target of rapamycin inhibitor), 항체(antibody) 등으로 나뉘는데, 이들은 각기 다른 단계에서 면역계의 T 세포의 증식 또는 활성화를 차단함으로써 면역억제 효과를 낸다.
이 중 칼시뉴린 억제제(calcineurin inhibitor, CNI) 계열의 면역억제제는 환자에서의 단기적인 예후가 특히 좋아서 1970년대 도입된 이래 가장 널리 사용되며 장기이식 분야의 발전을 가능케 했다. 칼시뉴린은 칼슘과 칼모듈린 의존적인 단백질 포스파타아제(calcium- and calmodulin-dependent protein phosphatase)로, T 세포 분화에 중요한 전사인자인 nuclear factor of activated T cells, cytoplasmic(NFATc)을 탈인산화시켜 활성화시킨다. 칼시뉴린에 의해 활성화된 NFATc는 세포핵으로 이동하여 인터루킨 2(interleukin 2, IL-2)의 발현을 증가시 키고, IL-2는 T 세포의 증식과 분화를 촉진한다. 이같이 T 세포의 활성에 중요한 칼시뉴린을 억제하여 면역억제 효과를 내는 CNI 계열 면역억제제로는 대표적으로 사이클로스포린(cyclosporine)과 타크로리무스(tacrolimus)가 있다.
치료상의 이점에도 불구하고, 타크로리무스의 사용은 신독성으로 인해 제한된다. 타크로리무스 신독성을 감소시키기 위해서는 병원성 메커니즘을 조사하는 효과적인 체외 실험모델이 필수적이다.
한국등록특허 10-1832900 (2018.02.21)
이에 본 발명자들은 줄기세포 중 하나인 인간 iPSC(induced pluripotent stem cell, 유도만능줄기세포)로부터 유래된 신장 오가노이드에 타크로리무스를 처리하여 신독성을 유도하였으며, 신독성 유도 신장 오가노이드가 생체 조건 모델과 유사한 신독성을 나타내어 병원성 경로, 병리 기작 및 치료제 스크리닝 등에 효과적인 체외 모델로 사용될 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 목적은 타크로리무스가 처리되어 신독성이 유도된, 신독성 유도 신장 오가노이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 신독성 유도 신장 오가노이드의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 신독성 유도 신장 오가노이드를 이용한 신독성 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 타크로리무스(tacrolimus)가 처리되어 신독성이 유도된, 신독성 유도 신장 오가노이드를 제공한다.
또한, 본 발명은 줄기세포를 신장 오가노이드로 분화시키는 단계; 및 상기 신장 오가노이드에 타크로리무스를 처리하여 신독성을 유도하는 단계를 포함하는, 신독성이 유도된 신장 오가노이드의 제조방법을 제공한다.
나아가, 본 발명은 신독성이 유도된 신장 오가노이드에 신독성 치료 후보약물을 처리하는 단계; 및 상기 후보약물을 처리한 신장 오가노이드에서 신독성 개선 정도(여부)를 확인하는 단계를 포함하는, 신독성 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 신장 오가노이드는 줄기세포로부터 분화된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 줄기세포는 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 신장 오가노이드는 라파마이신(rapamycin)이 추가적으로 처리되어 신독성 유도가 가속화된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 타크로리무스는 20 내지 80 μM로 처리되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 라파마이신은 10 내지 120 μM로 처리되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 신장 오가노이드는 네프론(nephron) 유사 구조를 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 신독성은 세뇨관의 구조적 변화, 세포 생존능 감소 또는 산화스트레스 증가로 인한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 세뇨관의 구조적 변화는 세뇨관 세포의 감소, 세뇨관 극성의 파괴, 세뇨관 액포화 또는 다리세포(podocyte)의 손상으로 인한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 줄기세포를 신장 오가노이드로 분화시키고, 칼시뉴린 억제제(calcineurin inhibitor, CNI)인 타크로리무스 처리를 통해 신독성이 유도된 신장 오가노이드 및 이를 제조하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 신독성 유도 신장 오가노이드는 생체 조건 모델과 유사한 신독성을 나타내어 병원성 경로를 조사하는 효과적인 체외 모델로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1a는 본 발명의 신장 오가노이드에서 다리세포(NPHS1), 벽 상피 세포(Claudin 1), 근위 세뇨관(LTL), 원위 세뇨관(E-cadherin), 사구체 기저막(Laminin) 및 접합(ZO-1)을 공초점(confocal) 형광 이미지로 나타낸 것이다. Scale bars: 20 μm, 50 μm.
도 1b는 밝은 곳에서 대조군 신장 오가노이드 및 타크로리무스(FK506) 처리된 신장 오가노이드 형태의 이미지(상단) 및 타크로리무스 처리 후 오가노이드의 직경(하단)을 나타낸 것이다. Scale bars: 100 μm.
도 1c는 대조군 신장 오가노이드 및 타크로리무스(FK506) 처리된 신장 오가노이드의 Live/dead 염색의 이미지(상단) 및 dead 세포의 백분율 정량(하단)을 나타낸 것이다. Scale bars: 100 μm.
도 1d는 Cell Counting Kit 8(CCK-8) 분석에 의해 측정된 타크로리무스(FK506) 처리에 의한 신장 오가노이드의 생존능을 나타낸 것이다.
도 2a는 신장 오가노이드에 타크로리무스(FK506) 처리 후 근위 세뇨관(LTL) 및 원위 세뇨관(E-cadherin)의 공초점(confocal) 형광 이미지(왼쪽) 및 LTL 양성 세포(근위 세뇨관) 및 E-cadherin 양성 세포(원위 세뇨관)의 백분율의 정량(오른쪽)을 나타낸 것이다. Scale bars: 50 μm.
도 2b는 생체 내 타크로리무스(FK506) 신독성을 가지는 마우스 모델에서 근위 세뇨관(LTL) 및 원위 세뇨관(E-cadherin)의 공초점(confocal) 형광 이미지(상단) 및 LTL 양성 세포(근위 세뇨관) 및 E-cadherin 양성 세포(원위 세뇨관)의 백분율의 정량(하단)을 나타낸 것이다. Scale bars: 50 μm.
도 3a는 타크로리무스(FK506) 신독성에 의한 신장 오가노이드 근위 세뇨관 및 마우스 모델의 근위 세뇨관의 구조적 변화(극성)를 비교한 결과를 공초점(confocal) 형광 이미지로 나타낸 것이다. Scale bars: 20 μm.
도 3b는 신장 오가노이드에 타크로리무스(FK506) 처리 후 세뇨관 유사 구조의 세포질 전체에 고르게 분포된 액포의 TEM 이미지(왼쪽) 및 액포 직경의 정량(오른쪽)을 나타낸 것이다(빨간색 화살표가 액포를 나타냄). Scale bars: 2 μm.
도 4a는 신장 오가노이드에 타크로리무스(FK506) 처리 후 다리세포(NPHS1) 및 접합 마커(ZO1)의 공초점(confocal) 형광 이미지(왼쪽) 및 NPHS1 양성 세포(다리세포)의 백분율 정량(오른쪽)을 나타낸 것이다. Scale bars: 50 μm, 20 μm.
도 4b는 신장 오가노이드에 타크로리무스(FK506) 처리 후 다리세포 및 다리세포 사이의 미세융모의 변화를 TEM 이미지로 나타낸 것이다. Scale bars: 5 μm, 2 μm.
도 5a는 신장 오가노이드에 타크로리무스(FK506) 처리 후 손상된 미토콘드리아를 TEM 이미지로 나타낸 것이다(빨간색 화살표가 손상된 미토콘드리아를 나타냄). Scale bars: 1 μm.
도 5b는 신장 오가노이드에 타크로리무스(FK506) 처리 후 미토콘드리아 기능장애를, Mitotracker로 염색하여 공초점(confocal) 형광 이미지(상단) 및 Mitotracker 형광 강도의 정량화(하단)로 나타낸 것이다. Scale bars: 20 μm.
도 5c는 신장 오가노이드에 타크로리무스(FK506) 처리 후 ROS 수준을, MitoSox Red로 염색하여 공초점(confocal) 형광 이미지(상단) 및 MitoSox Red 형광 강도의 정량화(하단)로 나타낸 것이다. Scale bars: 50 μm.
도 5d는 신장 오가노이드에 타크로리무스(FK506) 처리 후 세포 내 칼슘 수준을, Fluo-8로 염색하여 공초점(confocal) 형광 이미지(상단) 및 Fluo-8 형광 강도의 정량화(하단)로 나타낸 것이다. Scale bars: 100 μm, 50 μm.
도 5e는 신장 오가노이드에 타크로리무스(FK506) 처리 후 미토콘드리아 탈분극 수준을, tetramethylrhodamine ethyl ester(TMRE)로 염색하여 공초점(confocal) 형광 이미지(상단) 및 TMRE 형광 강도의 정량화(하단)로 나타낸 것이다. Scale bars: 50 μm.
도 6a는 신장 오가노이드에 타크로리무스(FK506) 처리 후 자가포식을 확인하기 위하여 웨스턴 블롯으로 LC3-II/LC3-I 발현을 확인하고(왼쪽), 정량화한 결과(오른쪽)를 나타낸 것이다.
도 6b는 신장 오가노이드에 타크로리무스(FK506) 처리 후 자가포식소체를 확인하기 위하여, Cyto-ID로 염색하여 공초점(confocal) 형광 이미지(왼쪽) 및 Cyto-ID 형광 강도의 정량화(오른쪽)로 나타낸 것이다(흰색 큰 화살표는 확대 된 puncta, 작은 화살표는 작은 puncta, 화살표 머리는 큰 puncta를 나타냄). Scale bars: 50 μm, 20 μm.
도 6c는 신장 오가노이드에 타크로리무스(FK506) 처리 후 리소좀 활성을 확인하기 위하여, Lysotracker로 염색하여 공초점(confocal) 형광 이미지(왼쪽) 및 Lysotracker 형광 강도의 정량화(오른쪽)로 나타낸 것이다. Scale bars: 100 μm, 50 μm.
도 6d는 신장 오가노이드에 타크로리무스(FK506) 처리 후 리소좀의 수 및 크기를 TEM 이미지(왼쪽) 및 정량화 결과(오른쪽)로 나타낸 것이다(빨간색 화살표가 리소좀을 나타냄). Scale bars, 2 μm.
도 7a는 타크로리무스(FK506)로 유도된 신독성 신장 오가노이드에 라파마이신 처리 후, 세포 생존율(상단) 및 신장 오가노이드 형태의 이미지(하단)를 나타낸 것이다. Scale bars: 100 μm.
도 7b는 타크로리무스(FK506) 및/또는 라파마이신 처리된 신독성 신장 오가노이드에서 자가포식 억제제(3-MA)에 의한 세포 생존능 변화를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 신독성이 유도된 신장 오가노이드의 제조방법 및 병원성 메커니즘을 조사하는 방법에 대한 개략도를 나타낸 것이다.
본 발명은 타크로리무스(tacrolimus)가 처리되어 신독성이 유도된, 신독성 유도 신장 오가노이드를 제공한다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 줄기세포를 신장 오가노이드로 분화시키는 단계; 및 상기 신장 오가노이드에 타크로리무스를 처리하여 신독성을 유도하는 단계를 포함하는, 신독성이 유도된 신장 오가노이드의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 신장 오가노이드는 줄기세포로부터 분화된 것일 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 줄기세포는 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC)일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "줄기세포(stem cell)"란, 개체를 구성하는 세포나 조직의 근간이 되는 세포로서 그 특징은 반복 분열하여 자가 재생(self-renewal)할 수 있고, 환경에 따라 특정한 기능을 지닌 세포로 분화할 수 있는 다분화 능력을 갖는 세포를 의미한다. 태아의 발생과정 중 모든 조직에서 생겨나며, 성인이 되어서도 골수, 상피조직 등 세포가 활발히 교체되는 일부 조직에서 발견된다. 줄기세포는 분화 가능한 세포의 종류에 따라 수정란이 첫 분열을 시작할 때 형성되는 전능성 줄기세포(totipotent stem cells)와, 이 세포들이 계속 분열 해 만들어진 포배 내막에 있는 만능성 줄기세포(pluripotent stem cells), 그리고 성숙한 조직과 기관 속에 존재하는 다능성 줄기세포(multipotent stem cells)로 분류된다. 이때, 다능성 줄기세포는, 이 세포가 포함되어 있는 조직 및 기관에 특이적인 세포로만 분화할 수 있는 세포로써 태아기, 신생아기 및 성체기의 각 조직 및 장기의 성장과 발달은 물론 성체조직의 항상성 유지와 조직 손상 시 재생을 유도하는 기능에 관여하고 있다. 이러한 조직 특이적 다능성 세포들을 총칭하여 성체 줄기세포라고도 한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC)"는 역분화 줄기세포로서 분화가 끝난 체세포에 세포 분화 관련 유전자를 주입하여 분화 이전의 세포 단계로 되돌린, 배아 줄기세포처럼 만능성을 유도해낸 세포를 의미한다. 상기 유도만능줄기세포는 인간 유래일 수 있으며, 예컨대 인간의 조직, 혈액 등, 유도만능줄기세포의 원천이 인간인 것을 의미하고, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 용어, "오가노이드(organoid)"는 줄기세포를 이용해 최소 기능을 할 수 있도록 만든 '미니 유사 장기'로서, 3차원 구조로 만들어져 실험실에서도 실제 신체 기관과 비슷한 환경을 만들 수 있는 것이 특징이다. 성체줄기세포(adult stem cell, ASC), 배아줄기세포(embryonic stem cell, ESC), 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC)로부터 자가 재생 및 자가 조직화를 통해 형성된 3차원 세포집합체로 세포를 3차원 배양법으로 다시 응집 재조합하여 만듦으로써 모델 장기의 특이적 세포를 포함하고 있다. 2D 세포주 배양법의 한계를 극복하면서도 기존의 효율적인 2D 배양 기반 생화학적, 세포생물학적 분석 기법을 쉽게 활용할 수 있다. 또한, 인체의 생리활성기능을 유사하게 재현할 수 있고, 환자의 조직으로부터 장기유사체를 구축함으로써 환자의 유전정보를 기반으로 한 질병 모델링, 반복시험을 통한 약물 스크리닝 등을 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 신장 오가노이드는 네프론(nephron) 유사구조를 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실험예에서는 본 발명의 iPSC 유래 신장 오가노이드가 개별 네프론 유사구조를 가지고 있는 것을 확인하여, 신장과 유사함을 입증하였다(실험예 1 참조).
본 발명에서 사용되는 용어, "타크로리무스(tacrolimus)"는 칼시뉴린 억제제(calcineurin inhibitor, CNI)로, 면역억제제의 종류로서 단기적인 예후가 좋아 가장 널리 사용되고 있으며, 대표적으로 타크로리무스와 사이클로스포린(cyclosporine)이 있다. 타크로리무스는 FK506(또는 FK-506), 후지마이신(fujimycin) 등으로도 알려져 있으며, 일본 토양에 서식하는 박테리아 Streptomyces tsukubaensis로부터 발견되었다. 타크로리무스는 마크로라이드 락톤 (macrolide lactone) 구조의 화합물이다(화학식 C44H69NO12, 분자량 804.02). 타크로리무스는 이뮤노필린(immunophilin) 단백질인 FKBP12에 결합하고, 이어 타크로리무스와 FKBP12의 복합체가 칼시뉴린에 결합하여 칼시뉴린의 효소 활성을 억제한다. 타크로리무스는 시중에서 Prograf, Advagraf, Astagraf XL 등의 브랜드명으로 유통되며, 제네릭 의약품도 판매되고 있다. 그러나, 타크로리무스는 면역계의 T 세포뿐 아니라, 다른 세포와 조직에서도 발현되기 때문에 칼시뉴린 억제 작용은 면역억제 외에 다양한 부작용을 동반한다(Liu, E. H. et al., Nat. Immunol. 8(1):25-30, 2007). CNI 면역억제제의 부작용 중 특히 중요한 것으로 급성, 만성 신장 독성(nephrotoxicity)이 있다(Naesens, M. et al., Clin. J. Am. Soc. Nephrol. 4(2):481-508, 2009).
본 발명에 있어서, 상기 타크로리무스는 20 내지 80 μM로 처리되는 것일 수 있으며, 예를 들어, 20 내지 70 μM, 20 내지 60 μM, 30 내지 80 μM, 30 내지 70 μM 또는 30 내지 60 μM로 처리되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 타크로리무스를 0 μM, 30 μM 및 60 μM로 처리하였고(실시예 2 참조), 그 결과, 일 실험예에서는 신독성이 타크로리무스의 용량 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다(실험예 1 내지 3 참조).
본 발명에 있어서, 상기 신독성은 세뇨관의 구조적 변화, 세포 생존능 감소 또는 산화스트레스 증가로 인한 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "신독성(nephrotoxicity)"은 독성 물질 또는 특정 약물 등에 의해 신장에 손상을 주는 특성을 말한다. 예컨대, 이러한 신장 독성은 세뇨관 세포의 감소, 세뇨관 극성의 파괴, 세뇨관 액포화 또는 다리세포(podocyte) 손상 등의 신장의 구조적 변화와 유효신혈류와 사구체 여과율 감소 등의 신장 기능 저하로 나타난다.
본 발명에 있어서, 상기 세뇨관의 구조적 변화는 세뇨관 세포의 감소, 세뇨관 극성의 파괴, 세뇨관 액포화 또는 다리세포(podocyte)의 손상으로 인한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실험예에서는 타크로리무스 신독성 유도 모델에서 신독성을 확인하기 위하여 iPSC 유래 신장 오가노이드의 구조적인 변화, 세포 생존능 감소 및 병인에서 중요한 역할을 하는 원인으로 알려진 산화스트레스 증가 등을 통해 신독성이 유발된 것을 확인하였다(실험예 1 내지 3 참조).
본 발명에 있어서, 상기 신장 오가노이드는 라파마이신(rapamycin)이 추가적으로 처리되어 신독성 유도가 가속화된 것일 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 라파마이신은 10 내지 120 μM로 처리되는 것일 수 있으며, 예를 들어, 10 내지 110 μM, 10 내지 100 μM, 20 내지 120 μM, 20 내지 110 μM 또는 20 내지 100 μM로 처리되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 라파마이신을 25 μM, 50 μM, 75 μM 및 100 μM로 처리하였고(실시예 2 참조), 그 결과, 일 실험예에서는 신독성이 라파마이신의 용량 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다(실험예 4 참조).
본 발명에 있어서, "라파마이신(rapamycin)"은 면역체계를 약화시켜서 새로 이식된 장기에 대해 거부반응을 일으키지 않도록 하는 mTOR(mammalian target of rapamycin) 억제제에 속한 면역억제제이며, 자가포식(오토파지, autophagy)의 강력한 유도자로 알려져 있다.
본 발명의 일 실험예에서는 타크로리무스 신독성에서 산화스트레스는 자가포식의 유도를 유발하는 것으로 알려져 있어 자가포식 유도가 방어적인지 또는 타크로리무스 신독성을 촉진시키는지 여부를 판단하기 위하여 라파마이신 처리를 통해 그 결과를 확인하였다. 그 결과, 라파마이신의 처리에 의한 자가포식의 증강이 타크로리무스 신독성을 가속화 할 수 있음을 입증하였다(실험예 4 참조).
따라서, 본 발명의 신독성이 유발된 신장 오가노이드는 신독성의 메커니즘을 조사하고 구조적 신독성을 모델링 하는데 효율적임을 보여준다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 신독성이 유도된 신장 오가노이드에 신독성 치료 후보약물을 처리하는 단계; 및 상기 후보약물을 처리한 신장 오가노이드에서 신독성 개선 정도(여부)를 확인하는 단계를 포함하는, 신독성 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 스크리닝 방법은 본 발명에 따른 신독성이 유도된 신장 오가노이드를 사용하여 실시하는바, 양 발명 사이에 공통된 내용은 그 기재를 생략한다.
상기 후보약물은 신장 오가노이드의 신독성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에 이용되는 미지의 물질을 의미하며, 예를 들어 상기 후보약물은 화학 물질, 뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 항체 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 신독성 개선 정도 또는 개선 여부의 확인은 세뇨관의 구조적 변화의 감소, 세포 생존능 증가 및/또는 산화스트레스 감소에 대한 지표 확인인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예 및 실험예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 인간 iPSC 세포 배양 및 신장 오가노이드 분화
CMC11 iPSC는 한국 가톨릭대학교(남성 기증자)에서 얻었다. 세포는 계대수 20과 40 사이인 것을 사용하였다. 신장 오가노이드 분화는 인간 iPSC를 24-well 플레이트에 mTeSR1 배지(Stem Cell Technologies) + 10 μM Y27632(LC Laboratories)에서 3% GelTrex(Thermo Fisher Scientific)로 코팅된 유리 플레이트상에 5,000 cells/well의 밀도로 플레이팅 하였다(-3일). 배지는 1.5% GelTrex in mTeSR1(-2일), mTeSR1(-1일), RPMI(Thermo Fisher Scientific) + 12 μM CHIR99021(Tocris)(0일), RPMI + B27 supplement(Thermo Fisher Scientific)(1.5일)의 순서로 교환하고 세포는 2-3일마다 공급되어 신장 오가노이드 분화를 촉진시켰다.
실시예 2. 타크로리무스 및 라파마이신 처리
분화 18일째에 신장 오가노이드를 96-well 플레이트에 다시 시드하고 타크로리무스는 인큐베이터에서 37℃, 5% CO2에서 24시간 동안 각각 0 μM, 30 μM 및 60 μM로 처리하였다. 타크로리무스 신독성에서 자가포식의 역할을 조사하기 위해 라파마이신을 각각 25 μM, 50 μM, 75 μM 및 100 μM로 타크로리무스 60 μM과 함께 처리하였다.
실시예 3. 면역형광 분석(Immunofluorescence analysis)
면역형광 분석을 위해, 신장 오가노이드를 분화 18일째에 고정시켰다. 고정을 위해, 동일한 부피의 PBS(Thermo Fisher Scientific) + 8% 파라포름알데하이드(Electron Microscopy Sciences)를 15분 동안 배지에 첨가한 후, 샘플을 PBS로 3회 세척하였다. 고정 오가노이드 배양물을 5% 당나귀 혈청 (Millipore) + 0.3% Triton-X-100/PBS에서 block하고, 1차 항체와 함께 3% 소 혈청 알부민(Sigma) + PBS에서 밤새 배양하여 세척하고, Alexa Fluor(Invitrogen) 2차 항체로 배양하고 세척한 뒤 Vectashield H-1000에서 DAPI로 염색 또는 마운팅 하였다. 사용된 1차 항체는 다음과 같다: anti-LTL(Vector Labs FL-1321, 1:500 dilution), anti-ZO-1(Invitrogen 339100, 1:100), anti-NPHS1(R&D AF4269, 1:500), anti-ECAD(Abcam ab11512, 1:100), anti-Claudin 1(Abcam an15098, 1:100), anti-WT1(Abcam ab89901, 1:100), anti-CD31(R&D Systems AF3628, 1:200), anti-laminin(Sigma-Aldrich L9393. 1:200) 및 anti-WT1(Santa Cruz sc-192, 1:100).
실시예 4. CCK-8 분석
타크로리무스 처리된 세포를 well 당 10 μL의 CCK-8 용액(Cell Counting Kit-8, Dojindo, Japan)으로 처리하고 인큐베이터에서 37℃로 1시간 동안 배양한 뒤, 450/650 nm에서 흡광도를 측정하였다.
실시예 5. 3D 세포 생존능 분석
타크로리무스 및 라파마이신이 처리된 신장 오가노이드에 96개의 각 well에 존재하는 세포 배양 배지의 부피와 동일한 부피의 CellTiter-Glo® 3D 시약(Promega)을 첨가하였다. 세포 용해를 유도하기 위해 내용물을 5분 동안 혼합하였다. 플레이트를 사용하여 실온에서 25분 동안 배양하고 발광을 기록하였다.
실시예 6. 세포 염색
신장 오가노이드 분화 18일째에 시작하여, 인큐베이터에서 37℃, 24시간 동안 타크로리무스는 각각 0 μM, 30 μM 및 60 μM로 처리되었다. PBS로 1회 세척 한 후, 인큐베이터에서 Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit(Ethidium homodimer 2 mM, Calcein AM 4 mM; Thermo Fisher Scientific)를 신장 오가노이드에 1시간 동안 첨가하였다. 세포를 PBS로 2회 세척하고, 형광 현미경을 사용하여 z-stack 형광 이미지를 얻었다.
실시예 7. 전자 현미경(Electron microscopy, EM) 분석
신장 오가노이드 시험관 내 샘플을 4% 파라포름알데하이드 및 2.5% 글루타알데하이드를 포함하는 0.1 M 포스페이트 완충액에서 4℃로 밤새 고정시켰다. 0.1 M 포스페이트 완충액으로 세척 한 후, 샘플을 1% osmium tetroxide가 포함된 동일한 완충액에서 4℃로 1시간 동안 고정시켰다. 이어서, 샘플을 일련의 등급화된 에탄올 용액으로 탈수시키고, 아세톤으로 교환하고, Epon 812에 매립시켰다.
Ultramicrotome(Leica Ultracut UCT, Germany)에 의해 초박형 섹션(70-80 nm)을 얻었다. 초박형 섹션을 우라닐 아세테이트 및 납 시트레이트로 이중 염색하고, 투과 전자 현미경(JEM 1010, Japan) 60 kV로 검사하였다. 정량분석을 위해, 피질 (cortex)의 각 섹션에서 20개의 저배율(x 6,000) 필드가 무작위로 선택되었고 100 μm2 당 자가포식소체의 수가 결정되었다.
실시예 8. 웨스턴 블롯 분석
신장 오가노이드를 끓는 용해 완충액(1% SDS, 1mM sodium orthovanadate, 10mM Tris, pH7.4)에서 균질화하고 단백질 농도를 BCA 단백질 분석 키트(Pierce Biotechnology Inc., Rockford, IL, USA)로 측정하였다. 동일한 양의 단백질을 SDS-폴리아크릴아마이드 겔에서 분리하였다. 그 다음, 겔을 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼다. 면역 검출을 위해, 블롯을 1차 항체와 함께 0.1% 트윈-20 및 5% 탈지유를 함유하는 PBS에서 밤새 배양하였다. 블롯을 세척 한 후 horseradish peroxidase(Jackson Immuno Research Laboratories)에 접합된 2차 항체와 함께 배양하고 웨스턴 블롯팅 루미놀 시약 키트(Santa Cruz Biotechnology, SantaCruz, CA)를 사용하여 블롯을 시각화 하였다. 1차 항체는 LC3B (anti-LC3B; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 사용하였으며, 2차 항체는 Peroxidase AffiniPure F(ab')₂ Fragment Donkey Anti-Rat IgG (H+L) (Jackson Immuno Research Laboratories)을 사용하였다.
실시예 9. 미토콘드리아 및 리소좀 염색 및 활성산소종(ROS) 검출
신장 오가노이드 분화 18일째에 시작하여, 타크로리무스는 각각 0 μM, 30 μM 및 60 μM로 인큐베이터에서 37℃, 24시간 동안 처리되었다. 미토콘드리아 상태를 나타내기 위해, PBS로 1회 세척한 후, 5 mM Mitotracker(Thermo Fisher Scientific) 및 200 mM Hoechst(Thermo Fisher Scientific)를 세포에 첨가하였다. 리소좀 염색을 위해, 5 μM LysoMitotracker(Thermo Fisher Scientific) 및 200 mM Hoechst(Thermo Fisher Scientific)를 세포에 첨가하였다. 1시간 동안 배양 한 후, 형광 현미경을 사용하여 z-stack 형광 이미지를 얻었다. 활성산소 음이온 수준을 측정하기 위해 MitoSoX Red(Thermo Fisher Scientific)를 적용하였다. 신장 오가노이드는 37℃암실에서 Hoechst 33342(200 mM)로 1시간 동안, MitoSox Red(5 μM)로 15분 동안 처리하고, PBS로 세척한 뒤 형광 현미경을 사용하여 z-stack 형광 이미지를 얻었다.
실시예 10. 자가포식소체(autophagosomes)의 검출
타크로리무스가 처리된 신장 오가노이드를 1X Assay buffer로 2회 세척하고, well당 100 μL의 Microscopy Dual Detection Reagent(CYTO-ID Green Detectoin Reagent, Hoechst 33342 및 1X Assay buffer)으로 처리하고 30분 동안 암실에서 배양하였다. 염색 후, 신장 오가노이드를 1X Assay buffer로 세척하고, 형광 현미경을 사용하여 z-stack 형광 이미지를 수득하였다.
실시예 11. 미토콘드리아 막 전위 및 세포 내 칼슘 전위 측정
미토콘드리아 막 전위의 측정을 위해, 타크로리무스 처리된 신장 오가노이드를 TMRE(tetramethylrhodamine ethyl ester; 200 nM; Thermo Fisher Scientific)와 함께 30분 동안, Hoeschst 33342(200 mM)와 1시간 동안 암실에서 배양하고, 0.2% BSA 포함 PBS로 세척하였다. 세포 내 칼슘 전위의 검출을 위해, 신장 오가노이드를 PBS로 세척하고, 37℃암실에서 Fluo-8 calcium assay kit(5 μM; AAT Bioquest)로 1시간 동안 처리하였다. 그 다음, 신장 오가노이드를 PBS로 세정하고, 형광 현미경을 사용하여 z-stack 형광 이미지를 얻었다.
실시예 12. 타크로리무스로 유도된 신장 질환 마우스 모델
모든 실험은 한국 가톨릭대학교 동물실험윤리위원회의 권고 및 윤리 지침에 따라 수행되었다. 모든 실험동물을 xylazine(rompun) 마취 하에 희생시켰다. 8주령 수컷 BALB/c 마우스(ORIENT BIO, Seongnam-Si, Korea)에 0.01%의 소금식이(Research Diets Inc, New Brunswick, NJ, USA) 및 물을 임의로 제공하였다. 1주일 순응 후, 체중이 적합한 마우스를 4개의 그룹(n = 8/그룹)으로 무작위로 분류하고 1.5 mg/kg/일의 Tacrolimus(Prograf; Astellas Pharma, Ibaraki, Japan) 또는 10 mL/kg/일의 vehicle(Vh, olive oil; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 4주 동안 피하에 처리하였다. 그 다음, 동물을 마취시키고, 추가분석을 위해 혈액샘플 및 조직표본을 수득하였다.
[실험예]
실험예 1. 인간 iPSC 유래 신장 오가노이드를 이용한 타크로리무스 신독성 모델에서의 세포 생존능
iPSC 유래 신장 오가노이드를 사용하여 타크로리무스 신독성을 조사하기 위해, 부착성 배양 분화 프로토콜을 적용하였다. iPSC 유래 신장 오가노이드는 다리세포(podocyte), 벽 상피 세포(parietal epithelial cell), 근위 세뇨관 및 원위 세뇨관을 포함하는 개별 네프론 유사구조를 가지고 있는 것을 확인하였다(도 1a 참조).
분화 18일째에 신장 오가노이드를 미세 절개하여 96-well 플레이트로 재-시드 하고 타크로리무스를 각각 0 μM, 30 μM 또는 60 μM로 24시간 동안 처리하였다. 타크로리무스 처리 후 세뇨관 유사 구조의 변형으로 신장 오가노이드의 크기가 감소하는 것을 확인하였다(도 1b 참조). Live/Dead 세포 염색을 통해 Dead 세포의 비율이 용량 의존적으로 증가되는 것을 확인하였다(도 1c 참조). 신독성을 CCK-8 분석으로 평가한 결과, 세포 생존율은 타크로리무스 0 μM 처리에서 100%로 나타났으며, 60 μM 처리에서 60%로 감소하는 것을 확인하였다(도 1d 참조).
실험예 2. 타크로리무스 신독성 모델에서 iPSC 유래 신장 오가노이드의 구조적 변화
iPSC 유래 신장 오가노이드가 타크로리무스에 의한 신독성의 구조적 변화를 재현 할 수 있는지 확인하기 위해, 타크로리무스 신독성 모델에서 iPSC 유래 신장 오가노이드의 구조적 변화를 분석하고, 타크로리무스 신독성을 갖는 마우스 모델과 비교하였다. iPSC 유래 신장 오가노이드에서 근위 세뇨관 세포(Lotus tetragonolobus lectin(LTL)-양성 부위)와 원위 세뇨관 세포(E-cadherin-양성 부위)는 마우스 생체 내 모델과 유사하게 타크로리무스 용량 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 2a 및 도 2b 참조). 타크로리무스 처리 후 신장 오가노이드 및 생체 내 모델에서 brush border 마커 LTL의 정단 발현은 타크로리무스 신장 독성에서 근위 세뇨관 극성의 파괴를 시사한다(도 3a 참조).
등척성 세뇨관 액포화(Isometric tubular vacuolization)는 타크로리무스 신독성의 전형적인 병리학적 소견 중 하나로 알려져 있다. Ultrastructural 분석을 통해 타크로리무스 처리 후 신장 오가노이드에서 세뇨관 유사 구조의 세포질 전체에 고르게 분포된 작고 투명한 액포를 확인하였다(도 3b 왼쪽 참조). 액포의 크기는 용량 의존적으로 증가하였다(도 3b 오른쪽 참조). 이러한 결과는 iPSC 유래 신장 오가노이드가 타크로리무스 신독성에서 네프론의 구조적 변화를 보여줄 수 있는 가능성이 있음을 시사한다.
다리세포(podocyte) 손상 또한 상기 모델에서 관찰되었다. NPHS1의 발현은 용량 의존적 방식으로 감소하는 것을 확인하였다(도 4a 참조). 접합 마커인 ZO-1 트랙의 선형 패턴은 감소하였고, 타크로리무스 처리 후 보다 비극성 패턴으로 변하는 것을 확인하였다(도 4a 참조).
투과 전자 현미경(TEM) 검사에 따르면, 대조군 조건의 다리세포는 기저막과 같은 트랙을 따라 배열되고 인접 다리세포로부터 분리되었으며, 수많은 미세융모가 다리세포 사이의 공간을 채우고, 이는 인간 신생아 신장과 유사한 구조임을 확인하였다. 타크로리무스 처리 후, 다리세포는 기저막과 다리세포 사이의 공간을 따라 비구조화된 배열로 불규칙적으로 변형되었고 미세융모의 수가 감소하였다. 타크로리무스 60 μM로 처리시, 다리세포 분리 및 수많은 자가포식 액포가 관찰되었다(도 4b 참조).
실험예 3. 타크로리무스 신독성 모델에서 손상된 미토콘드리아 축적 및 산화스트레스 증가
타크로리무스 신독성에서 증가된 산화스트레스 및 활성산소종(ROS)은 병인에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있어, iPSC 유래 신장 오가노이드 타크로리무스 신독성 모델에서 산화스트레스를 조사하였다. 미토콘드리아는 ROS 생성의 주요 원천이며 미토콘드리아 DNA는 ROS의 주요 타겟이므로 미토콘드리아의 기능장애를 확인하였다. TEM 결과는 구형으로 손상된 미토콘드리아의 축적을 보여 주었고, 타크로리무스 신독성 모델에서 크리스토 용해(cristolysis)가 풍부하게 관찰되었다(도 5a 참조). 약물-유도 미토콘드리아 기능장애를 조사하기 위해 신장 오가노이드를 Mitotracker로 염색하였다. 타크로리무스 처리 후 염색 강도는 용량 의존적으로 감소하였다(도 5b 참조). 또한 미토콘드리아의 superoxide에 의해 산화되는 MitoSox Red로 염색하고 적색 형광 방출을 확인하여 미토콘드리아의 superoxide를 검사하였다. 타크로리무스 신독성은 MitoSox Red 형광을 상당히 증가시키는 것을 확인하였다(도 5c 참조). 이러한 결과는 타크로리무스 신독성 모델에서 미토콘드리아 산화스트레스의 증가를 나타낸다.
산화스트레스와 ROS는 이온 수송체를 변화시키며, 이는 2차 메신저 시스템, 일차 칼슘 항상성에서 세포질 내로의 칼슘 유입을 증가시키는 변화를 일으킨다. 따라서, 칼슘에 민감한 형광 염료인 Fluo-8로 염색하여 세포 내 칼슘을 검사하였다. 그 결과, Fluo-8-양성 세포는 타크로리무스 처리 후 용량 의존적으로 증가 하였다(도 5d 참조).
세포질에서 증가된 칼슘은 미토콘드리아로의 칼슘 유입을 유도하고, 이는 미토콘드리아 막 전위의 소실을 초래하고, 이어서 비정상적인 전기적 활동을 유도하고 신호 전달을 방해하여, 세포 아팝토시스를 유발한다. 따라서, 형광 염료, tetramethylrhodamine ethyl ester(TMRE)로 염색하여 미토콘드리아 막 전위를 조사하였다. 그 결과, 타크로리무스 신독성 모델에서 미토콘드리아 막 전위의 강도가 감소 된 것을 확인하였다(도 5e 참조). 결과를 종합하면, 타크로리무스 신독성이 산화스트레스 및 미토콘드리아 기능장애를 유도함을 시사한다. 상기 결과는 iPSC 유래 신장 오가노이드가 타크로리무스 신독성의 메커니즘을 조사하고 타크로리무스의 구조적 신독성을 모델링 하는데 효율적임을 보여준다.
실험예 4. 라파마이신 유도 자가포식의 증강에 의한 타크로리무스 신독성 가속화
자가포식은 세포질에서 손상된 소기관, 단백질 응집체 및 기타 거대분자 분해의 진화적으로 보존 된 리소좀 매개 세포 과정이며, 병리학적 조건뿐만 아니라 정상적인 생리적 조건하에서도 세포 사멸을 조절한다. 타크로리무스 신독성에서의 산화스트레스는 자가포식의 유도를 유발하는 것으로 알려져 있다. 따라서 타크로리무스 신독성 모델에서 자가포식의 유도를 확인하였다.
웨스턴 블롯 분석 결과, 고전적 자가포식 마커인 LC3-II/LC3-I 비율이 용량 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다(도 6a 참조). Cyto-ID Green 염료는 살아있는 세포에서 자가포식소체 감지에 사용될 수 있다. Cyto-ID Green 형광 염료로 염색한 결과, 타크로리무스 처리 후 자가포식소체의 축적이 증가하였다(도 6b 참조). 자가포식소체는 손상된 세포 내 성분을 감싸고 리소좀과 융합하여 자가리소좀을 형성하며, 이는 내용물을 분해하여 영양소를 재생시킨다. LysoTracker는 살아있는 세포에서 자가리소좀과 같은 자가포식 관련 리소좀의 활동을 감지하는데 유용하다. LysoTracker Red 염색을 통해 타크로리무스 신독성에서 리소좀 활성의 정도와 강도가 증가한 것으로 확인되었다(도 6c 참조). 투과 전자 현미경(TEM) 검사에 따르면, 타크로리무스 처리 후 신장 오가노이드에서 리소좀의 수와 크기가 증가한 것으로 나타났다(도 6d 참조). 종합하면, 이들 데이터는 타크로리무스 신독성에서 산화스트레스 상태는 자가포식이 증가하는 것을 시사한다.
자가포식 유도가 방어적인지 또는 타크로리무스 신독성을 촉진시키는지는 확실하게 알려져 있지 않다. 라파마이신은 음성 조절 mTOR 경로를 통한 자가포식의 강력한 유도제이다. 타크로리무스로 유도된 신독성 신장오가노이드 시험관 내에서 24시간 동안 라파마이신을 각각 25 μM, 50 μM 또는 75 μM 처리했을 때, 용량 의존적일 뿐만 아니라 신장 오가노이드의 구조적 변형에서와 같이 세포 생존능이 감소하는 것을 확인하였다(도 7a 참조). 3-methyadenine(3-MA) 처리에 의한 자가포식의 억제는 60 μM의 타크로리무스 및 25 μM 라파마이신으로 처리된 신장 오가노이드에서 세포 생존력을 회복시켰다(도 7b 참조). 이러한 발견은 라파마이신의 처리에 의한 자가포식의 증강이 타크로리무스 신독성을 가속화 할 수 있음을 나타낸다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예 및 실험예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.

Claims (11)

  1. 줄기세포로부터 분화되고, 분화 0일 이후에 외부에서 FGF9를 추가로 처리한 바 없는 신장 오가노이드에 타크로리무스(tacrolimus)가 처리되어 신독성이 유도된, 신독성 유도 신장 오가노이드로서, 상기 신독성 유도 신장 오가노이드는 다음 특징을 갖는, 신독성 유도 신장 오가노이드 :
    세뇨관의 구조적 변화로 세뇨관 세포의 감소, 세뇨관 극성의 파괴, 세뇨관 액포화 또는 다리세포(podocyte) 손상;
    세포 생존능 감소; 또는
    산화스트레스 증가.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 줄기세포는 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC)인 것을 특징으로 하는, 신독성 유도 신장 오가노이드.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 신장 오가노이드는 라파마이신(rapamycin)이 추가적으로 처리되어 신독성 유도가 가속화된 것을 특징으로 하는, 신독성 유도 신장 오가노이드.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 타크로리무스는 20 내지 80 μM로 처리되는 것을 특징으로 하는, 신독성 유도 신장 오가노이드.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 라파마이신은 10 내지 120 μM로 처리되는 것을 특징으로 하는, 신독성 유도 신장 오가노이드.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 신장 오가노이드는 네프론(nephron) 유사구조를 갖는 것을 특징으로 하는, 신독성 유도 신장 오가노이드.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 줄기세포를 신장 오가노이드로 분화시키는 단계, 여기서 분화 0일 이후에 외부에서 FGF9를 추가로 처리한 바 없는 것을 특징으로 함; 및
    상기 신장 오가노이드에 타크로리무스를 처리하여 신독성을 유도하는 단계를 포함하는, 다음 특징을 갖는 신독성이 유도된 신장 오가노이드의 제조방법,
    세뇨관의 구조적 변화로 세뇨관 세포의 감소, 세뇨관 극성의 파괴, 세뇨관 액포화 또는 다리세포(podocyte) 손상;
    세포 생존능 감소; 또는
    산화스트레스 증가.
  11. 제1항, 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항의 신독성 유도 신장 오가노이드에 신독성 치료 후보약물을 처리하는 단계; 및
    상기 후보약물을 처리한 신장 오가노이드에서 신독성 개선 정도를 확인하는 단계를 포함하는, 신독성 치료제의 스크리닝 방법.
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WO2021215722A1 (ko) 2021-10-28

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