CN115364201B - 治疗卵巢早衰的骨髓浓缩细胞制剂组合物 - Google Patents
治疗卵巢早衰的骨髓浓缩细胞制剂组合物 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115364201B CN115364201B CN202211299173.9A CN202211299173A CN115364201B CN 115364201 B CN115364201 B CN 115364201B CN 202211299173 A CN202211299173 A CN 202211299173A CN 115364201 B CN115364201 B CN 115364201B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- cells
- bone marrow
- stimulating factor
- granulocyte
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 98
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 title claims abstract description 91
- 208000002500 Primary Ovarian Insufficiency Diseases 0.000 title claims abstract description 53
- 206010036601 premature menopause Diseases 0.000 title claims abstract description 53
- 208000017942 premature ovarian failure 1 Diseases 0.000 title claims abstract description 53
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 180
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 56
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 31
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims abstract description 29
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 claims abstract description 26
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 claims abstract description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 45
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims description 27
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 25
- BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L disodium selenite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Se]([O-])=O BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 23
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 23
- 229960001471 sodium selenite Drugs 0.000 claims description 23
- 239000011781 sodium selenite Substances 0.000 claims description 23
- 235000015921 sodium selenite Nutrition 0.000 claims description 23
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 22
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 20
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 claims description 18
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 claims description 18
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 13
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 12
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 claims description 12
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 11
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 11
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 11
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 11
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 8
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 claims description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 claims description 4
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000005303 weighing Methods 0.000 claims description 4
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 claims 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 abstract description 18
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 7
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 abstract description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 22
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 21
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 20
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 18
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 18
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 15
- 230000006870 function Effects 0.000 description 13
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 12
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 11
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 11
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 11
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 9
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 9
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 9
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 9
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 9
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 9
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 9
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 9
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 8
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 8
- 102000003745 Hepatocyte Growth Factor Human genes 0.000 description 7
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 description 7
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 7
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 6
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 6
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 6
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 6
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 5
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 5
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 5
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 5
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 5
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 5
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 4
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 4
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 4
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 4
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 4
- 238000002657 hormone replacement therapy Methods 0.000 description 4
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 201000002364 leukopenia Diseases 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 201000000736 Amenorrhea Diseases 0.000 description 3
- 206010001928 Amenorrhoea Diseases 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 231100000540 amenorrhea Toxicity 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 231100001022 leukopenia Toxicity 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 238000013517 stratification Methods 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 description 2
- YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 7-aminoactinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=C(N)C=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 0.000 description 2
- 108700012813 7-aminoactinomycin D Proteins 0.000 description 2
- 206010065553 Bone marrow failure Diseases 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 2
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 208000033830 Hot Flashes Diseases 0.000 description 2
- 206010060800 Hot flush Diseases 0.000 description 2
- 208000008454 Hyperhidrosis Diseases 0.000 description 2
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 2
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 2
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 2
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 2
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000003796 beauty Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 2
- 230000010478 bone regeneration Effects 0.000 description 2
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 238000010293 colony formation assay Methods 0.000 description 2
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 2
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 2
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 2
- 230000003325 follicular Effects 0.000 description 2
- 230000008217 follicular development Effects 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 210000003098 myoblast Anatomy 0.000 description 2
- 230000000399 orthopedic effect Effects 0.000 description 2
- 210000002394 ovarian follicle Anatomy 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 2
- 238000013190 sterility testing Methods 0.000 description 2
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 230000035924 thermogenesis Effects 0.000 description 2
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- 201000010000 Agranulocytosis Diseases 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 208000019901 Anxiety disease Diseases 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 208000018240 Bone Marrow Failure disease Diseases 0.000 description 1
- 108010049931 Bone Morphogenetic Protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 108010049870 Bone Morphogenetic Protein 7 Proteins 0.000 description 1
- 108010007726 Bone Morphogenetic Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007350 Bone Morphogenetic Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010051779 Bone marrow toxicity Diseases 0.000 description 1
- 102100024506 Bone morphogenetic protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100022544 Bone morphogenetic protein 7 Human genes 0.000 description 1
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 1
- 208000000094 Chronic Pain Diseases 0.000 description 1
- 102100031162 Collagen alpha-1(XVIII) chain Human genes 0.000 description 1
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 1
- 108010079505 Endostatins Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 description 1
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 description 1
- 206010018687 Granulocytopenia Diseases 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 206010027304 Menopausal symptoms Diseases 0.000 description 1
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010030247 Oestrogen deficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010033165 Ovarian failure Diseases 0.000 description 1
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 1
- 206010033557 Palpitations Diseases 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 208000018262 Peripheral vascular disease Diseases 0.000 description 1
- 206010039966 Senile dementia Diseases 0.000 description 1
- 208000013738 Sleep Initiation and Maintenance disease Diseases 0.000 description 1
- 102000008221 Superoxide Dismutase-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010021188 Superoxide Dismutase-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000008219 Uncoupling Protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 108010021111 Uncoupling Protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 206010047249 Venous thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002924 anti-infective effect Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000036506 anxiety Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000006472 autoimmune response Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000009583 bone marrow aspiration Methods 0.000 description 1
- 231100000366 bone marrow toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 229940112869 bone morphogenetic protein Drugs 0.000 description 1
- 239000000316 bone substitute Substances 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- -1 compound sodium citrate Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000004041 dendritic cell maturation Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000010595 endothelial cell migration Effects 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960005309 estradiol Drugs 0.000 description 1
- 229930182833 estradiol Natural products 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 230000005713 exacerbation Effects 0.000 description 1
- 239000002360 explosive Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000002436 femur neck Anatomy 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 description 1
- 210000002503 granulosa cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 1
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 1
- 238000007731 hot pressing Methods 0.000 description 1
- 230000037315 hyperhidrosis Effects 0.000 description 1
- 230000000642 iatrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 206010022437 insomnia Diseases 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 201000002818 limb ischemia Diseases 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 230000005906 menstruation Effects 0.000 description 1
- 230000004630 mental health Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 208000004235 neutropenia Diseases 0.000 description 1
- 230000003448 neutrophilic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 1
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000002997 osteoclast Anatomy 0.000 description 1
- 201000004535 ovarian dysfunction Diseases 0.000 description 1
- 231100000539 ovarian failure Toxicity 0.000 description 1
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 1
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000008447 perception Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 238000004886 process control Methods 0.000 description 1
- 239000000583 progesterone congener Substances 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012207 quantitative assay Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 1
- 206010040882 skin lesion Diseases 0.000 description 1
- 231100000444 skin lesion Toxicity 0.000 description 1
- 230000036560 skin regeneration Effects 0.000 description 1
- 239000008354 sodium chloride injection Substances 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000035900 sweating Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
- A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
- A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
- A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid or pantothenic acid
- A61K31/198—Alpha-amino acids, e.g. alanine or edetic acid [EDTA]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
- A61K33/04—Sulfur, selenium or tellurium; Compounds thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/193—Colony stimulating factors [CSF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
- A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0669—Bone marrow stromal cells; Whole bone marrow
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Virology (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及治疗卵巢早衰的骨髓浓缩细胞制剂组合物。一方面，所述细胞组合物包含骨髓浓缩细胞、粒细胞巨噬细胞刺激因子和任选的赋形剂；所述浓缩细胞与粒细胞巨噬细胞刺激因子的比例为，浓缩细胞以CD45+细胞数计5x10^6个细胞：10~15ng粒细胞巨噬细胞刺激因子。所述骨髓浓缩细胞是通过细胞自动分离系统即封闭式PXP分离系统分离获得的。还涉及所述细胞组合物在制备用于治疗卵巢早衰的细胞治疗剂中的用途。本发明细胞组合物呈现优良技术效果例如生物学活性更优良。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和生物医药领域，涉及使用骨髓浓缩细胞治疗剂治疗卵巢早衰(Premature ovarian failure，POF)的方法和组合物。
背景技术
卵巢早衰(Premature ovarian failure，POF)，是指由于卵巢功能衰竭，导致女性40岁之前闭经、不孕的现象。POF是一种以闭经、不孕、雌激素缺乏、卵泡减少和促性腺激素增高为特征的疾病，并伴有一系列低雌激素症状如：潮热多汗、面部潮红、性欲低下等，严重影响女性的身心健康。此外，POF的女性，患骨质疏松症、心血管疾病和老年痴呆的风险增加。POF是导致女性不孕的重要原因之一。育龄女性POF的发病率约1-3%，且呈上升和年轻化趋势。
根据欧洲人类生殖与胚胎学学会的指南(ESHRE)，POF的诊断标准：少经或闭经至少4个月，间隔4周以上的两次FSH水平升高>40IU/L。卵巢早衰病因不明，可能与遗传和自身免疫性疾病、环境因素以及医源性和特发性情况有关，尚无有效的治疗方法。激素替代疗法(HRT)是POF最常见的治疗方法之一，但效果并不理想，而且已被证明会增加静脉血栓、乳腺癌和卵巢癌的风险。POF除了少经、闭经、不孕等症状，还可出现潮热、多汗、焦虑、抑郁、心悸、失眠等更年期症状，可能加快女性衰老，导致骨质疏松、心血管疾病、痴呆症等绝经后疾病，影响女性生活质量和寿命。
POF病因复杂，尚未完全阐明，可能与自身免疫应答、感染、遗传因素、化疗、放疗、手术等治疗效果及内分泌功能障碍有关，尚无有效的治疗方法。目前，POF的最常用的治疗方法是激素替代疗法(hormone replacement therapy，HRT)。该疗法虽然对POF的临床症状具有一定的缓解作用，然而，HRT不能从根本上修复受损的卵巢，恢复卵巢功能。此外，研究表明，长期HRT治疗增加心脏病和中风的风险，可能会增加乳腺癌和卵巢癌的风险。因此，需要新的治疗策略来恢复POF患者的卵巢功能。
骨髓(bone marrow)是人体主要的造血器官，由造血细胞、脂肪组织和基质细胞组成。骨髓中的造血干细胞(Hematopoietic stem cells，HSCs)，可以分化为血液循环中的红细胞、白细胞和血小板。骨髓中的间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSCs)是一种具有分化形成骨、软骨、脂肪、神经及成肌细胞的多种分化潜能的细胞亚群，MSCs通过旁分泌多种生长因子，对HSCs起到支持的作用，维持骨髓造血微环境的稳定。
骨髓浓缩细胞(BMAC)是将骨髓经过离心、分离后获得的有核细胞的浓缩物。骨髓浓缩细胞(BMAC)中包含富集的造血干细胞(HSCs)和间充质干细胞(MSCs)，以及大量的多种细胞生长因子。HSCs可以分化为血液循环中的红细胞、白细胞和血小板。MSCs是一种具有分化形成骨、软骨、脂肪、神经及成肌细胞的多种分化潜能的细胞亚群。BMAC中含有血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子β(TGF-β)、肝细胞生长因子(HGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、胰岛素样生长因子I(IGF-I)、骨形态发生蛋白(BMP-2，BMP-7)和白细胞介素(IL-1，IL-6，IL-8)等多种生长因子和细胞因子。
骨髓浓缩细胞具有抗炎、免疫调节特性、促血管生成、促进组织再生修复等作用。临床前和初步临床研究证实，BMAC通过改善卵巢微环境，促进血管生成，促进卵泡发育，增加窦状卵泡数量，促进排卵，从而改善卵巢功能，是治疗POF患者潜在的治疗方法。
然而，骨髓穿刺液在传统上采用手工操作方式以密度梯度离心法进行分离，存在操作复杂、耗时长、易污染、结果重复性差等非常棘手的问题。本领域技术人员期待有一种操作简单、耗时短、不易受到污染、结果可重复性好等一个或者多个方面有益效果的处理骨髓穿刺液以获得骨髓浓缩物即骨髓浓缩细胞的方法。此一技术进步已在本研究团队的中国专利申请号2021116067849中得以实现。
粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)主要由T细胞和巨噬细胞产生，能够诱导粒细胞前体和巨噬细胞前体细胞呈集落生长，故简称为粒-巨细胞集落刺激因子。GM-CSF在体内的主要生物学作用是维持粒细胞系和单核细胞系细胞的存活、促进生长、诱导分化和增强吞噬功能和杀菌作用；诱导树突状细胞成熟和功能分布。临床上使用的粒细胞巨噬细胞刺激因子通常为重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子，其通常适用于癌症化疗和在用骨髓抑制疗法时所引起的白细胞减少症，亦适用于治疗骨髓衰竭患者的白细胞低下，也可预防白细胞减少时可能潜在的感染并发症，还能使感染引起的中性粒细胞减少的恢复加快。
现有的治疗卵巢早衰的方法仍然有待改进。因此，本领域技术人员还期待提供一种治疗卵巢早衰的方法例如使用骨髓浓缩细胞治疗剂治疗卵巢早衰的方法，例如期待提供一种使用骨髓浓缩细胞和GM-CSF的组合治疗剂来治疗卵巢早衰的方法。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种制备骨髓浓缩细胞的方法，期待该种方法具有操作简单、耗时短、不易受到污染、结果可重复性好等一个或者多个方面的有益效果；或者，本发明的一个目的在于提供一种新的治疗卵巢早衰的方法，该新的方法通过使骨髓浓缩细胞和GM-CSF配制成组合治疗剂得以实现。已经出人意料地发现，本发明通过使用封闭式的PXP细胞自动分离系统制备骨髓浓缩细胞，和/或通过使获得的骨髓浓缩细胞与GM-CSF配制成组合治疗剂来治疗卵巢早衰，能够实现上述一个或者多个目的，本发明基于此类发现而得以完成。
为此，本发明第一方面提供了一种制备骨髓浓缩细胞的方法，其包括如下步骤：
(1)提供生物样本骨髓穿刺液，使其置于含有抗凝剂的无菌袋中备用；
(2)取下细胞自动分离系统的输入管上的护帽，将注射器连接到输入管鲁尔锁定接头上，以缓慢而稳定的速度通过血栓过滤器，将抗凝的生物样本转移到一次性无菌分离杯中，沿水平轴摇动混合样本；所述细胞自动分离系统是封闭式的PXP分离系统，其由四个部件组成：a)一次性无菌分离杯、b)控制模块、c)用于传输数据的分离底座、d)DataTrak软件处理系统；
(3)将一次性分离杯放入控制模块中，离心前控制模块状态显示为“0”，将分离杯/控制模块组件称重，配平后，放置于可编程的离心机中，并按照如下程序设定离心机的参数：
(4)启动离心机进行离心，进程如下：
4a)P1期使生物样本中的细胞通过离心密度分层在一次性分离杯中分为下中上三个组分：红细胞层、细胞浓缩层、血浆层；
4b)P2期使大部分红细胞进入红细胞回收舱；
4c)P3期进一步将处理室中的细胞分层，P4期降低离心力以进一步除去红细胞；
4d)P5期使细胞浓缩层和血浆进一步分层，至P6期降低离心力，使细胞浓缩层通过输送管转移至回收舱室，血浆保留在中央舱室中；
(5)离心完成后，确认控制模块窗口显示“P”即合格状态，从控制模块中取出分离杯，将注射器连接至分离杯与回收舱室连通的输出管上，收集得到的骨髓浓缩细胞。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)提供的生物样本的体积为20~200ml。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)中另外抽取1ml样本以备检测。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)所用抗凝剂为枸橼酸钠溶液。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)所用抗凝剂为3.2%枸橼酸钠溶液。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)所用抗凝剂为3.2%枸橼酸钠溶液，其中增补添加0.5mg/ml组氨酸和0.1mg/ml磷脂酰胆碱。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)所用抗凝剂与生物样本的体积比为1：12。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)所用抗凝剂的配制方法为：使枸橼酸钠、组氨酸和磷脂酰胆碱加至适量水中，加热至60°C搅拌使溶解，加水至全量，0.22µm微孔滤膜过滤，121°C热压灭菌，即得。
根据本发明第一方面的方法，其还包括以下步骤：(6)使分离杯和控制模块置于分离底座上以传输数据并用DataTrak软件处理系统处理离心过程中所捕获的数据。
进一步的，本发明第二方面提供了一种骨髓浓缩细胞，其是通过包括如下步骤的方法制备得到的：
(1)提供生物样本骨髓穿刺液，使其置于含有抗凝剂的无菌袋中备用；
(2)取下细胞自动分离系统的输入管上的护帽，将注射器连接到输入管鲁尔锁定接头上，以缓慢而稳定的速度通过血栓过滤器，将抗凝的生物样本转移到一次性无菌分离杯中，沿水平轴摇动混合样本；所述细胞自动分离系统是封闭式的PXP分离系统，其由四个部件组成：a)一次性无菌分离杯、b)控制模块、c)用于传输数据的分离底座、d)DataTrak软件处理系统；
(3)将一次性分离杯放入控制模块中，离心前控制模块状态显示为“0”，将分离杯/控制模块组件称重，配平后，放置于可编程的离心机中，并按照如下程序设定离心机的参数：
(4)启动离心机进行离心，进程如下：
4a)P1期使生物样本中的细胞通过离心密度分层在一次性分离杯中分为下中上三个组分：红细胞层、细胞浓缩层、血浆层；
4b)P2期使大部分红细胞进入红细胞回收舱；
4c)P3期进一步将处理室中的细胞分层，P4期降低离心力以进一步除去红细胞；
4d)P5期使细胞浓缩层和血浆进一步分层，至P6期降低离心力，使细胞浓缩层通过输送管转移至回收舱室，血浆保留在中央舱室中；
(5)离心完成后，确认控制模块窗口显示“P”即合格状态，从控制模块中取出分离杯，将注射器连接至分离杯与回收舱室连通的输出管上，收集得到的骨髓浓缩细胞。
根据本发明第二方面的骨髓浓缩细胞，其中步骤(1)提供的生物样本的体积为20~200ml。
根据本发明第二方面的骨髓浓缩细胞，其中步骤(1)中另外抽取1ml样本以备检测。
根据本发明第二方面的骨髓浓缩细胞，其中步骤(1)所用抗凝剂为枸橼酸钠溶液。
根据本发明第二方面的骨髓浓缩细胞，其中步骤(1)所用抗凝剂为3.2%枸橼酸钠溶液。
根据本发明第二方面的骨髓浓缩细胞，其中步骤(1)所用抗凝剂为3.2%枸橼酸钠溶液，其中增补添加0.5mg/ml组氨酸和0.1mg/ml磷脂酰胆碱。
根据本发明第二方面的骨髓浓缩细胞，其中步骤(1)所用抗凝剂与生物样本的体积比为1：12。
根据本发明第二方面的骨髓浓缩细胞，其中步骤(1)所用抗凝剂的配制方法为：使枸橼酸钠、组氨酸和磷脂酰胆碱加至适量水中，加热至60°C搅拌使溶解，加水至全量，0.22µm微孔滤膜过滤，121°C热压灭菌，即得。
根据本发明第二方面的骨髓浓缩细胞，其还包括以下步骤：(6)使分离杯和控制模块置于分离底座上以传输数据并用DataTrak软件处理系统处理离心过程中所捕获的数据。
进一步的，本发明第三方面提供了一种由骨髓浓缩细胞制成的细胞组合物，其包含浓缩细胞、粒细胞巨噬细胞刺激因子和任选的赋形剂。
根据本发明第三方面的细胞组合物，其中所述浓缩细胞与粒细胞巨噬细胞刺激因子的比例为，浓缩细胞以CD45+细胞数计5×10^6个细胞：10~15ng粒细胞巨噬细胞刺激因子；例如比例为，浓缩细胞以CD45+细胞数计5×10^6个细胞：12.5ng粒细胞巨噬细胞刺激因子。
根据本发明第三方面的细胞组合物，其中所述赋形剂为生理盐水或5%葡萄糖溶液。
根据本发明第三方面的细胞组合物，其中所述赋形剂为生理盐水，粒细胞巨噬细胞刺激因子在组合物中的浓度为10~15ng/ml，例如为12.5ng/ml。
根据本发明第三方面的细胞组合物，其中所述粒细胞巨噬细胞刺激因子是人粒细胞巨噬细胞刺激因子。
根据本发明第三方面的细胞组合物，其中所述粒细胞巨噬细胞刺激因子是重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子。
根据本发明第三方面的细胞组合物，其中所述浓缩细胞如本发明第二方面任一实施方案所述。
根据本发明第三方面的细胞组合物，其中还包含谷氨酰胺和亚硒酸钠。
根据本发明第三方面的细胞组合物，其中还包含谷氨酰胺和亚硒酸钠，粒细胞巨噬细胞刺激因子与谷氨酰胺和亚硒酸钠在组合物中的重量比为12.5ng：0.1~0.5mg：5~20µg。
根据本发明第三方面的细胞组合物，其中还包含谷氨酰胺和亚硒酸钠，粒细胞巨噬细胞刺激因子与谷氨酰胺和亚硒酸钠在组合物中的重量比为12.5ng：0.2~0.3mg：10~15µg。
根据本发明第三方面的细胞组合物，其中还包含谷氨酰胺和亚硒酸钠，粒细胞巨噬细胞刺激因子与谷氨酰胺和亚硒酸钠在组合物中的重量比为12.5ng：0.2mg：15µg。
根据本发明第三方面的细胞组合物，其包含：CD45+细胞数4~6× 10^6的浓缩细胞、10~15ng的gmCSF、0.1~0.5mg谷氨酰胺、5~20µg亚硒酸钠、生理盐水适量至1mL。
根据本发明第三方面的细胞组合物，其包含：CD45+细胞数4~6× 10^6的浓缩细胞、10~15ng的gmCSF、0.2~0.3mg谷氨酰胺、10~15µg亚硒酸钠、生理盐水适量至1mL。
根据本发明第三方面的细胞组合物，其包含：CD45+细胞数5× 10^6的浓缩细胞、12.5ng的gmCSF、0.2~0.3mg谷氨酰胺、10~15µg亚硒酸钠、生理盐水适量至1mL。
根据本发明第三方面的细胞组合物，其包含：CD45+细胞数5×10^6的浓缩细胞、12.5ng的gmCSF、0.2mg谷氨酰胺、15µg亚硒酸钠、生理盐水适量至1mL。
进一步的，本发明第三方面提供了本发明第二方面任一项所述骨髓浓缩细胞或者第三方面任一项所述细胞组合物在制备用于治疗卵巢早衰的细胞治疗剂中的用途。
本文所述的短语“CD45+细胞数5×10^6的浓缩细胞”中的5× 10^6是指5乘以10的6次方，其余类似表述亦具有相同含义。
本发明使用PXP自动化细胞快速处理系统，应用自动分离和浓缩的封闭式系统，安全、高效、简捷获得BMAC的方法，为BMAC用于治疗POF患者的临床应用奠定了基础。本发明提供的快速分离获得骨髓浓缩细胞的方法，该方法将取自人的骨髓穿刺液，使用封闭式自动化细胞分离系统，分离获得骨髓浓缩细胞。本发明获得的骨髓浓缩细胞作为治疗卵巢损伤的活性成分，能够促进血管生成、卵泡发育，从而改善卵巢功能。
现有的研究业已证实，污染性红细胞与干细胞/祖细胞功能的下降有关，红细胞污染细胞浓缩物被认为会降低细胞治疗的效果。为了更好地发挥细胞治疗的潜力，行业迫切需要能提高靶细胞纯度和污染性红细胞去除率的新处理系统。
本发明具体实验中使用的细胞分离系统为PXP®自动分离系统，其生产商为美国ThermoGenesis公司。创新的PXP系统解决了当前市场上现有系统的许多缺陷。PXP系统使临床医生能够在几乎没有红细胞污染的情况下，通常少于起始样本的5%，迅速获得很高的干细胞和祖细胞回收率。
PXP系统针对开发和使用细胞治疗技术的临床机构在手术室环境下快速、高效、无菌的细胞处理需求，是一种相当高效的手术室即时系统(Point-of-Care)产品。作为前沿的自动化细胞快速处理系统，PXP系统不需要细胞分离介质或沉淀剂，可以同时处理多个样本，MNC和CD34+、CD45+细胞回收率高，能够让临床医生在医院外科中心或者诊所实现30分钟之内从生物样品(例如骨髓)中高效提取干细胞，并且红细胞的去除率超过90%。此外，该PXP系统还配备了专利的DataTrak软件来追踪捕获数据，以方便为客户提供GMP流程控制和报告信息。
本发明将PXP系统用于处理骨髓提取物，能够实时快速自动化处理骨髓细胞，确保单个核细胞(MNC)的回收率，能够同时处理多个骨髓单元，并且不需要细胞分离介质或沉淀剂。
本发明PXP系统用于具体试验，其优点包括但不限于：稳定优异的MNC(单核细胞)和CD34+、CD45+细胞回收率、30分钟内快速处理骨髓样本、95%以上的红细胞去除率、自动化封闭式无菌系统、快速准确的数据追踪和文档记录、样本处理数据可以通过DataTrak软件上传到计算机，提供符合GMP要求的生产记录和报告信息。
骨髓浓缩物因富含大量的干细胞和生长因子而被广泛应用于骨科、重症下肢缺血等相关学科的临床中。骨髓浓缩物是将骨髓经过离心、分离后获得的有核细胞的浓缩物，其内富含间充质干细胞。众所周知，全球骨髓浓缩物市场应用领域可分为骨外科、伤口愈合、慢性疼痛、周围性血管疾病、皮肤病变及其他。由于全球老龄化的加剧以及骨关节炎发病率的上升，未来骨科疾病的应用将主导整个骨髓浓缩物市场。随着行业的蓬勃发展、技术的进步以及可支配收入的增加，未来皮肤病学领域预计将以最高的复合年增长率增长(6.0%)。人皮肤中的成纤维细胞和角化细胞的再生能力已经被用来开发细胞疗法，同时科学家们正在研究骨髓源性皮外细胞在皮肤再生中的可塑性，这些都将加速细胞疗法在皮肤病学领域的应用。骨髓浓缩物被认为是骨替代材料的“铂金标准”。研究发现，骨髓浓缩物中的细胞、前体细胞、生长因子、血小板等对骨再生发挥重要的作用。例如骨髓浓缩物中的内皮细胞在血管再生中扮演重要的角色；骨髓浓缩物中含有的大量生长因子能作用于成骨细胞和破骨细胞，调节骨改建过程，促进新骨生成；骨髓浓缩物中的血小板能为间充质干细胞提供更快更有效的骨再生环境。
本发明通过使用PXP系统进行细胞分离获得了令人满意的效果。
GM-CSF可以是人粒细胞巨噬细胞刺激因子，亦可以是重组粒细胞巨噬细胞刺激因子，其已载入多个版本的中国药典并有诸多品牌的产品被批准用于临床。在本发明中，若未另外说明，试验所用GM-CSF是市售注射用重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子(S19991012，规格750000IU/75μg，10IU/ng)的产品，配制组合物时若有必要可以预先用0.9%氯化钠注射液稀释至适宜浓度。GM-CSF (Granulocyte- macrophage Colony Stimulating Factor，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，或粒细胞巨噬细胞刺激因子)，其作用于造血祖细胞，促进其增殖和分化，其重要作用是刺激粒、单核巨噬细胞成熟，促进成熟细胞向外周血释放，并能促进巨噬细胞及噬酸性细胞的多种功能。GM-CSF是临床上用于各种原因引起的白细胞或粒细胞减少症的药物，其能兴奋骨髓的造血功能、刺激粒细胞、单核细胞、T细胞的增殖，并能促进单核细胞和粒细胞的成熟。此外，GM-CSF还能克服放疗和化疗引起的骨髓毒性，缩短肿瘤化疗时中性粒细胞减少时间，使患者易于耐受化疗。GM-CSF能够通过增强单核细胞、粒细胞、嗜酸性细胞和巨噬细胞功能，进而提高机体抗肿瘤及抗感染免疫力。
本发明通过使经PXP系统分离获得的骨髓浓缩细胞与GM-CSF组合，使用卵巢早衰模型进行验证，获得了积极的效果。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细的描述。
在本发明中，如未另外说明，具体实验中使用的细胞分离系统为PXP®自动分离系统，其在本发明中亦可简称为PXP系统、PXP细胞自动分离系统、PXP自动分离系统、PXP分离系统等。实验中使用的该PXP系统的型号为80065-01，供应商为深圳博雅感知医疗科技有限公司，生产商为美国ThermoGenesis公司。在本发明中，术语“骨髓浓缩细胞”亦可称为“骨髓浓缩细胞制剂”，如无特别的语境，二者具有相同含义。
实施例1：快速分离制备骨髓浓缩细胞(BMAC)
(1)提供生物样本骨髓穿刺液(可以处理20~200ml体积的样本)，使其置于含有抗凝剂的无菌袋中备用，另抽取1ml样本以备检测；所述抗凝剂为3.2%枸橼酸钠溶液，其中增补添加0.5mg/ml组氨酸和0.1mg/ml磷脂酰胆碱，抗凝剂与生物样本的体积比为1：12；抗凝剂的配制方法为：使枸橼酸钠、组氨酸和磷脂酰胆碱加至适量水中，加热至60°C搅拌使溶解，加水至全量，0.22µm微孔滤膜过滤，121°C热压灭菌，即得；
(2)取下细胞自动分离系统的输入管上的护帽，将注射器连接到输入管鲁尔锁定接头上，以缓慢而稳定的速度通过血栓过滤器，将抗凝的生物样本转移到一次性无菌分离杯中，沿水平轴摇动混合样本；所述细胞自动分离系统是封闭式的PXP分离系统，其由四个部件组成：a)一次性无菌分离杯、b)控制模块、c)用于传输数据的分离底座、d)DataTrak软件处理系统；
(3)将一次性分离杯放入控制模块中，离心前控制模块状态显示为“0”，将分离杯/控制模块组件称重，配平后，放置于可编程的离心机中，并按照如下程序设定离心机的参数：
(4)启动离心机进行离心，进程如下：
4a)P1期使生物样本中的细胞通过离心密度分层在一次性分离杯中分为下中上三个组分：红细胞层、细胞浓缩层、血浆层；
4b)P2期使大部分红细胞进入红细胞回收舱；
4c)P3期进一步将处理室中的细胞分层，P4期降低离心力以进一步除去红细胞；
4d)P5期使细胞浓缩层和血浆进一步分层，至P6期降低离心力，使细胞浓缩层通过输送管转移至回收舱室，血浆保留在中央舱室中；
(5)离心完成后，确认控制模块窗口显示“P”即合格状态，从控制模块中取出分离杯，将注射器连接至分离杯与回收舱室连通的输出管上，收集得到的骨髓浓缩细胞；
(6)使分离杯和控制模块置于分离底座上以传输数据并用DataTrak软件处理系统处理离心过程中所捕获的数据。
本实施例1对收集的10份生物样本人骨髓穿刺液(通过本领域公知的方法获取，例如本发明的生物样本是照宋建华文献(宋建华，等，自体骨髓浓缩干细胞治疗股骨颈骨析,实用骨科杂志，2008,14(8):467)所载方法获得的)进行细胞分离制备，获得10份骨髓浓缩细胞(BMAC)，分别标记为No.1~ No.10。
试验例1：分析骨髓穿刺液(BMA)和骨髓浓缩细胞(BMAC)中MNC回收率
使用实施例1的方法，对收集的10份人骨髓穿刺液(分离前体积在79~97ml范围内)进行细胞分离；接着，参考中国专利申请号2021116067849记载的方法，对各分离级分进行细胞检测，10份样品的结果：输入骨髓穿刺液均值为88.26ml、输出BMAC均值为12.74ml、红细胞(RBC)去除率均值为97.9%、单个核细胞(MNC)回收率均值为97.2%、MNC浓度平均提升6.93倍。例如某一份穿刺液(No.2)的结果：分离前体积=91.34ml、终体积=12.97ml、红细胞去除率=98.3%、MNC回收率=97.6%、MNC浓缩倍数=7.04。
结果表明，使用PXP动分离系统能够以操作简单、耗时短、不易受到污染、结果可重复性好的方式富集骨髓中的MNC，同时去除大部分红细胞。
试验例2：BMA和BMAC样本中的细胞活率
针对试验例1涉及的10个样本进行考察。细胞活率是表示细胞是否具有生物学功能的最直观的指标。骨髓样本采集24-36小时内(T<36小时)，使用FC500流式细胞仪，应用7-AAD染色法，分析BMA、BMAC中的细胞活率。
PXP处理前的10份骨髓穿刺液样本(BMA)细胞活率=88.17±3.14%、PXP处理后的10份骨髓浓缩细胞样本(BMAC)细胞活率=97.42±1.24%，例如某一份穿刺液样本(No.2)的结果：BMA细胞活率=89.64%、BMAC细胞活率=98.27%。显示BMAC样本中的细胞活率显著高于BMA细胞活率。
试验例3：BMA和BMAC样本中CD45+、CD34+细胞计数
针对试验例1涉及的10个样本进行考察。在FC500流式细胞仪上，应用7-AAD染色法，对所有处理前、处理后的骨髓样本中的CD45+和CD34+细胞数量进行了分析，结果：CD45+活细胞数量方面，骨髓穿刺液样本(BMA)=(15.08±2.84) ×10^6/mL、骨髓浓缩细胞样本(BMAC)=(106.41±6.94) × 10^6/mL，增加7.1倍；CD34+活细胞数量方面，骨髓穿刺液样本(BMA)=(127.42±10.36) ×10^3/mL、骨髓浓缩细胞样本(BMAC)=(882.63±16.41)× 10^3/mL，增加6.9倍。
试验例4：骨髓样本无菌检测
针对试验例1涉及的10个样本进行考察。使用革兰氏染色法进行无菌检测，制备BMA、BMAC样本的涂片，用甲醇固定，染色后测试，结果：10个BMA样本的革兰氏染色分析样本涂片均未见微生物，10个BMAC样本的革兰氏染色分析样本涂片均未见微生物。
本发明使用PXP系统制备BMAC的过程具有快速、封闭、全程无菌的特点。
试验例5：细胞水平有效性研究
本发明使用PXP系统制备的BMAC是一种细胞制剂的注射液，其中含有多种干细胞成分，包括造血干细胞(HSCs)，间充质干细胞(MSCs)，内皮祖细胞(EPCs)，以及多种细胞因子，如血管内皮生长因子(VEGF)，基质细胞衍生因子(SDF-1)，内皮抑素(Entostatin)等，促进新血管生成和内皮细胞迁移。
本试验例针对试验例1涉及的10个样本进行考察，通过CFU集落形成能力评价BMAC的干细胞生物学效力，ELISA定量检测BMAC中富含的细胞因子。
5.1、干细胞生物学效力—CFU集落形成实验
骨髓干细胞生物学效力(Potency Assays)，通过体外CFU集落形成实验，鉴定分析祖/干细胞的集落形成能力，表征BMAC混合细胞中的细胞干性。采用CFU-H(造血祖/干细胞)，CFU-F(基质祖细胞)对BMA和BMAC样本中多种干细胞的效能进行了分析，结果：CFU-H(造血祖/干细胞)方面，骨髓穿刺液样本(BMA)=(34.3±4.1) × 10^3/mL、骨髓浓缩细胞样本(BMAC)=(213.6±19.3) × 10^3/mL，增加6.2倍；CFU-F(基质祖细胞)方面，骨髓穿刺液样本(BMA)=(41.7±5.3) × 10^3/mL、骨髓浓缩细胞样本(BMAC)=(302.4±28.1) × 10^3/mL，增加7.3倍。
结果表明，PXP系统能够有效地富集骨髓干细胞，同时维持骨髓干细胞的生物学效力。
5.2、细胞因子定量分析
PXP系统制备的BMAC注射液中含有多种细胞因子。酶联免疫吸附实验(ELISA)定量检测分析BMA和BMAC样品中，转化生长因子-β(TGF-β)、血管内皮生长因子(VEGF)和肝细胞生长因子(HGF)水平，结果：BMA和BMAC的TGF-β分别为34.1±3.1pg/ml和218.3± 17.2pg/ml，BMA和BMAC的VEGF分别为17.4±2.6pg/ml和151.6± 13.4pg/ml，BMA和BMAC的HGF分别为194.3±24.2pg/ml和1312.4± 44.7pg/ml。
结果显示，BMAC中的TGF-β、VEGF和HGF，显著高于BMA中的TGF-β、VEGF和HGF水平(p<0.01)，表明PXP系统能够有效地浓缩富集细胞生长因子。
试验例6：BMAC治疗卵巢早衰(POF)的有效性
中国专利申请号2021116067849中使用BMAC浓缩液进行了治疗卵巢早衰(POF)的有效性研究。本试验例使用上文制备的BMAC浓缩液配合GM-CSF(本文亦记作gmCSF)进行POF的有效性研究。
(1)建立POF小鼠模型
给8周龄雌性C57BL/6小鼠腹腔注射50mg/kg/day环磷酰胺(CTX)，连续腹腔注射15d，每天同一时间注射，建立卵巢早衰(POF)小鼠模型。对照组不做任何处理。POF造模完成后进行BMAC细胞移植治疗，模型动物随机分组。
(2)通过激素水平、卵泡数和生育测试等指标来评估卵巢的储备功能。
A.激素水平
动物分组：对照组(n=20)、POF模型组(n=20)、BMAC治疗组(n=20)、BMAC+gmCSF治疗组(n=20)。
BMAC治疗组小鼠，分别于POF建模后第1天，每只动物尾静脉注射给予BMAC浓缩细胞组合物200µl(该200µl的BMAC浓缩细胞组合物为实施例1涉及的No.2号浓缩液样本，用无菌生理盐水稀释制成以CD45+细胞计浓度为4× 10^6细胞/200µl的溶液)；
BMAC+gmCSF治疗组小鼠，分别于POF建模后第1天，每只动物尾静脉注射给予BMAC浓缩液gmCSF组合物200µl；
POF模型组注射等体积生理盐水；对照组不作注射处理；
细胞移植后各组同等正常给予饮食和饮水。
注：以上BMAC+gmCSF治疗组给予的BMAC浓缩液gmCSF组合物(其可简称为BMAC-gmCSF组合物)，其每200µL中包含：实施例1所得No.2号浓缩液样本适量以CD45+细胞数计为1× 10^6、2.5ng的gmCSF、无菌生理盐水定容，即得组合物；该组合物在配制后2~4°C温度条件下保存并在4小时内完成注射给药，gmCSF为市售冻干粉针剂。经BMAC移植后14天和28天，每组分别取10只小鼠，眼眶采血，分离血清，-20℃保存。酶联免疫吸附试验(ELISA)分析雌二醇(E2)、促卵泡素(FSH)的水平(具体方法参考相丽论文(相丽，等，人胎盘间充质干细胞移植通过降低超氧化物歧化酶1和解耦联蛋白-2的表达提高卵巢功能，中华生殖与避孕杂志，2018年02期)方法进行)，结果见下表。
结果显示：与POF模型组相比，BMAC组小鼠血清中E2水平在28d升高，FSH水平下降，均具有显著性差异(P<0.05)；另外，已经发现，通过与GM-CSF组合使用，可以显著地减少BMAC的用量并且可以获得基本相同的效果。
B.小鼠卵巢组织的卵泡计数
BMAC移植后28天，每组分别取10只小鼠，处死，取小鼠左侧卵巢组织于4%多聚甲醛固定，将固定后的组织进行系列酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，连续切片，切片厚度5um，进行HE染色，显微镜下观察。
结果显示：相比于对照组，POF模型组小鼠初级卵泡、次级卵泡和成熟卵泡数量明显减少，闭锁卵泡数量明显增加；BMAC治疗后28天，各级卵泡数均有不同程度的恢复，颗粒细胞生长增加，凋亡减少，卵巢上皮细胞形态稳定，初级卵泡、次级卵泡和成熟卵泡数量明显增加，闭锁卵泡数量明显减少。BMAC移植后28天各级卵泡计数，与POF组比较有显著差异，具体结果见下表。
与POF模型组比较，**p<0.01。
C.小鼠生育能力观察
在BMAC移植后第28天，将雌雄小鼠按2：1比例合笼饲养，统计小鼠的生育率，并对小鼠的产仔数进行比较，观察BMAC移植对小鼠卵巢功能的修复作用，结果显示BMAC组与POF组比较有显著差异。小鼠产仔数比较结果如下表。
根据上文结果可见，BMAC移植治疗可明显改善POF小鼠受损卵巢的储备功能，卵泡数增加，雌孕激素升高，小鼠生育力得到恢复，为BMAC应用于POF的临床治疗提供了实验依据。
试验例7：BMAC-gmCSF组合物
以上试验例6所用BMAC-gmCSF组合物在配制后尽快完成注射给药，本发明人发现，该呈液体状态的组合物在4°C条件下放置12小时和24小时后，GM-CSF的生物学活性呈现下降的趋势，并且通过向该液体组合物中添加微量谷氨酰胺和亚硒酸钠能够显著缓解这种生物学活性下降的趋势，具体试验如下。
配方a：使用实施例1所得No.1~No.5的5种BMAC，照如下配方制成5种呈液体状态的组合物分别记为组合物aNo.1~组合物aNo.5：包含CD45+细胞数5× 10^6的BMAC、12.5ng(即125IU)的gmCSF、无菌生理盐水适量至1mL；
配方b：照上述配方a但不添加BMAC，制成呈液体状态的组合物，记为组合物b；
配方c：使用实施例1所得No.1~No.5的5种BMAC，照上述配方a但还添加谷氨酰胺(至终浓度0.2mg/ml)和亚硒酸钠(至终浓度15µg/ml)，制成5种呈液体状态的组合物，分别记为组合物cNo.1~组合物cNo.5；
配方d：使用实施例1所得No.1~No.5的5种BMAC，照上述配方a但还添加谷氨酰胺(至终浓度0.2mg/ml)，制成5种呈液体状态的组合物，分别记为组合物dNo.1~组合物dNo.5；
配方e：使用实施例1所得No.1~No.5的5种BMAC，照上述配方a但还添加亚硒酸钠(至终浓度15µg/ml)，制成5种呈液体状态的组合物，分别记为组合物eNo.1~组合物eNo.5。
上述各种组合物的配制方法为本领域技术人员熟知的常规方法，例如，在无菌操作条件下，将规定量冻干粉状态的gmCSF及任选的谷氨酰胺和任选的亚硒酸钠用无菌生理盐水定量溶解至规定体积，另外将BMAC用无菌生理盐水稀释至以CD45+细胞计的适宜浓度，按配方比例将两种溶液用无菌生理盐水稀释至规定浓度，用玻璃瓶分装，即得。
将上述5种配方的各组合物置4°C条件下放置，分别于0h、12h、24h取样，照中国药典2015年版四部附录之“3526 重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子生物学活性测定法”，测定各组合物在规定时间的生物学活性(IU/ml)；对于某一组合物，以其12h或24h的生物学活性除以0h的生物学活性再乘以100%所得百分数，即为该组合物在该时间点gmCSF生物学活性的残余百分数。
结果：配方a至配方e的全部组合物在0h的生物学活性均在122.4~128.3IU/ml范围内例如组合物aNo.1在0h的生物学活性为126.4IU/ml；配方b组合物12h残余百分数为97.4%，配方c的全部组合物12h残余百分数均在97~101%范围内例如组合物cNo.1之12h残余百分数为98.6%，配方a、配方d、配方e的全部组合物12h残余百分数均在82~87%范围内例如组合物aNo.1在12h的残余百分数为85.3%；配方b组合物24h残余百分数为94.7%，配方c的全部组合物24h残余百分数均在91~95%范围内例如组合物cNo.1之24h残余百分数为93.6%，配方a、配方d、配方e的全部组合物24h残余百分数均在66~73%范围内例如组合物aNo.1在24h的残余百分数为70.4%。
这些结果表明，包含有细胞的组合中gmCSF生物学活性下降较快，当向该种组合物中添加微量谷氨酰胺和亚硒酸钠后可以显著克服这种生物学活性下降的现象。
另外，照上文试验例3方法测定CD45+活细胞数量，结果：配方a和配方c至配方e的全部组合物在0h的CD45+活细胞数量均在472~524 × 10^4/ml范围内例如组合物aNo.1在0h的CD45+活细胞数量为511.7 × 10^4/ml，配方a和配方c至配方e的全部组合物在24h的CD45+活细胞数量均在144~212 × 10^4/ml范围内例如组合物aNo.1在24h的CD45+活细胞数量为196.7 × 10^4/ml；这些结果表明，各组合物在不同时间点的CD45+活细胞数量无明显差异，进而可以预期谷氨酰胺和亚硒酸钠不会影响细胞的生物学活性。因此，尽管配方a的BMAC+gmCSF组合物能够呈现优良的治疗卵巢早衰的生物学效果，然而当增补添加少量谷氨酰胺和亚硒酸钠后能够显著改善组合物中gmCSF生物学活性的稳定性，并且组合物中的活细胞无明显差异，这种gmCSF生物学活性稳定性的改善对于治疗应用来讲将是极其有意义的。
另外，由于gmCSF廉价易得，通过与可获得性差的BMAC组合可以显著降低细胞的用量但仍然能够获得优良的治疗卵巢早衰的生物学效果。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
Claims (7)
1.一种由骨髓浓缩细胞制成的细胞组合物，其由骨髓浓缩细胞、粒细胞巨噬细胞刺激因子、谷氨酰胺、亚硒酸钠和生理盐水组成；所述浓缩细胞与粒细胞巨噬细胞刺激因子的比例为，浓缩细胞以CD45+细胞数计5×106个细胞：10~15ng粒细胞巨噬细胞刺激因子；粒细胞巨噬细胞刺激因子与谷氨酰胺和亚硒酸钠在组合物中的重量比为12.5ng：0.1~0.5mg：5~20µg；所述粒细胞巨噬细胞刺激因子在组合物中的浓度为10~15ng/ml；所述骨髓浓缩细胞是按照包括如下步骤的方法制备得到的：
(1)提供生物样本骨髓穿刺液，使其置于含有抗凝剂的无菌袋中备用；所述抗凝剂为3.2%枸橼酸钠溶液，其中增补添加0.5mg/ml组氨酸和0.1mg/ml磷脂酰胆碱；
(2)取下细胞自动分离系统的输入管上的护帽，将注射器连接到输入管鲁尔锁定接头上，以缓慢而稳定的速度通过血栓过滤器，将抗凝的生物样本骨髓穿刺液转移到一次性无菌分离杯中，沿水平轴摇动混合生物样本骨髓穿刺液；所述细胞自动分离系统是封闭式的PXP分离系统，其由四个部件组成：a)一次性无菌分离杯、b)控制模块、c)用于传输数据的分离底座、d)DataTrak软件处理系统；
(3)将一次性分离杯放入控制模块中，离心前控制模块状态显示为“0”，将分离杯/控制模块组件称重，配平后，放置于可编程的离心机中，并按照如下程序设定离心机的参数：
程序P1：加速9、减速9、相对离心力2000、时间8.5min，
程序P2：加速9、减速9、相对离心力50、时间2min，
程序P3：加速9、减速9、相对离心力500、时间2min，
程序P4：加速9、减速9、相对离心力50、时间1min，
程序P5：加速9、减速9、相对离心力250、时间0.5min，
程序P6：加速9、减速9、相对离心力50、时间1min；
(4)启动离心机进行离心，进程如下：
4a)P1期使生物样本骨髓穿刺液中的细胞通过离心密度分层在一次性分离杯中分为下中上三个组分：红细胞层、细胞浓缩层、血浆层；
4b)P2期使大部分红细胞进入红细胞回收舱；
4c)P3期进一步将处理室中的细胞分层，P4期降低离心力以进一步除去红细胞；
4d)P5期使细胞浓缩层和血浆进一步分层，至P6期降低离心力，使细胞浓缩层通过输送管转移至回收舱室，血浆保留在中央舱室中；
(5)离心完成后，确认控制模块窗口显示“P”即合格状态，从控制模块中取出分离杯，将注射器连接至分离杯与回收舱室连通的输出管上，收集得到骨髓浓缩细胞。
2.根据权利要求1所述的细胞组合物，其中所述骨髓浓缩细胞与粒细胞巨噬细胞刺激因子的比例为，骨髓浓缩细胞以CD45+细胞数计5×106个细胞：12.5ng粒细胞巨噬细胞刺激因子。
3.根据权利要求1所述的细胞组合物，其中所述粒细胞巨噬细胞刺激因子是人粒细胞巨噬细胞刺激因子。
4.根据权利要求1所述的细胞组合物，其中粒细胞巨噬细胞刺激因子与谷氨酰胺和亚硒酸钠在组合物中的重量比为12.5ng：0.2~0.3mg：10~15µg。
5.根据权利要求1所述的细胞组合物，其组成为：CD45+细胞数5×106的骨髓浓缩细胞、12.5ng的粒细胞巨噬细胞刺激因子、0.2~0.3mg谷氨酰胺、10~15µg亚硒酸钠、生理盐水适量至1mL。
6.根据权利要求1所述的细胞组合物，其组成为：CD45+细胞数5×106的骨髓浓缩细胞、12.5ng的粒细胞巨噬细胞刺激因子、0.2mg谷氨酰胺、15µg亚硒酸钠、生理盐水适量至1mL。
7.权利要求1~6任一项所述细胞组合物在制备用于治疗卵巢早衰的细胞治疗剂中的用途。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211299173.9A CN115364201B (zh) | 2022-10-24 | 2022-10-24 | 治疗卵巢早衰的骨髓浓缩细胞制剂组合物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211299173.9A CN115364201B (zh) | 2022-10-24 | 2022-10-24 | 治疗卵巢早衰的骨髓浓缩细胞制剂组合物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115364201A CN115364201A (zh) | 2022-11-22 |
| CN115364201B true CN115364201B (zh) | 2023-02-03 |
Family
ID=84072938
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211299173.9A Active CN115364201B (zh) | 2022-10-24 | 2022-10-24 | 治疗卵巢早衰的骨髓浓缩细胞制剂组合物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115364201B (zh) |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105076114A (zh) * | 2015-08-21 | 2015-11-25 | 深圳爱生再生医学科技有限公司 | 脐带间充质干细胞无血清保存液及其应用 |
| CN107385517A (zh) * | 2017-08-07 | 2017-11-24 | 章毅 | 间充质干细胞库的构建方法 |
| CN111643526A (zh) * | 2020-07-14 | 2020-09-11 | 贵州金元泰生物科技有限公司 | 一种用于延缓卵巢衰老及防治老年痴呆和抑郁的间充质干细胞制剂 |
| WO2021052503A1 (zh) * | 2019-09-20 | 2021-03-25 | 北京干细胞与再生医学研究院 | 一种多能干细胞、药物组合物及其制备方法与用途 |
| CN113980894A (zh) * | 2021-12-27 | 2022-01-28 | 深圳博雅感知医疗科技有限公司 | 制备骨髓浓缩细胞的方法及其用于治疗卵巢早衰的用途 |
| CN114177203A (zh) * | 2021-12-27 | 2022-03-15 | 博雅干细胞科技有限公司 | 脐带血浓缩细胞治疗卵巢早衰的细胞治疗剂 |
| CN114196619A (zh) * | 2021-12-27 | 2022-03-18 | 深圳博雅感知医疗科技有限公司 | 治疗卵巢早衰的动员外周血浓缩细胞治疗剂 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109652366B (zh) * | 2018-12-21 | 2021-02-23 | 博雅干细胞科技有限公司 | 用于治疗卵巢早衰的胎盘间充质干细胞制剂 |
| CN109481466B (zh) * | 2018-12-21 | 2021-02-05 | 博雅干细胞科技有限公司 | 使用胎盘间充质干细胞治疗卵巢早衰的方法和细胞制剂 |
-
2022
- 2022-10-24 CN CN202211299173.9A patent/CN115364201B/zh active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105076114A (zh) * | 2015-08-21 | 2015-11-25 | 深圳爱生再生医学科技有限公司 | 脐带间充质干细胞无血清保存液及其应用 |
| CN107385517A (zh) * | 2017-08-07 | 2017-11-24 | 章毅 | 间充质干细胞库的构建方法 |
| WO2021052503A1 (zh) * | 2019-09-20 | 2021-03-25 | 北京干细胞与再生医学研究院 | 一种多能干细胞、药物组合物及其制备方法与用途 |
| CN111643526A (zh) * | 2020-07-14 | 2020-09-11 | 贵州金元泰生物科技有限公司 | 一种用于延缓卵巢衰老及防治老年痴呆和抑郁的间充质干细胞制剂 |
| CN113980894A (zh) * | 2021-12-27 | 2022-01-28 | 深圳博雅感知医疗科技有限公司 | 制备骨髓浓缩细胞的方法及其用于治疗卵巢早衰的用途 |
| CN114177203A (zh) * | 2021-12-27 | 2022-03-15 | 博雅干细胞科技有限公司 | 脐带血浓缩细胞治疗卵巢早衰的细胞治疗剂 |
| CN114196619A (zh) * | 2021-12-27 | 2022-03-18 | 深圳博雅感知医疗科技有限公司 | 治疗卵巢早衰的动员外周血浓缩细胞治疗剂 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Treatment of Complete Spinal Cord Injury Patients receiving Autologous Bone Marrow Cell Transplatation and Bone Marrow Stimulation with Granulocyte Macrophag-Colony Stimulating Factor;HYUNG CHUN PARK等;《Tissue Engineering》;20050531;第11卷(第5/6期);第913-923页 * |
| 骨髓来源间充质干细胞对卵巢早衰小鼠的修复作用;彭静等;《中南大学学报(医学版)》;20180115(第01期);第7-13页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115364201A (zh) | 2022-11-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN113980894B (zh) | 制备骨髓浓缩细胞的方法及其用于治疗卵巢早衰的用途 | |
| CN114196619B (zh) | 治疗卵巢早衰的动员外周血浓缩细胞治疗剂 | |
| KR101766203B1 (ko) | 재프로그래밍된 성숙 성체 세포를 이용한 치료 | |
| US10512660B2 (en) | Activator for mesenchymal stem cells, activated mesenchymal stem cells, and method for producing same | |
| CN108348555B (zh) | 细胞扩增方法和治疗组合物 | |
| CN111973632B (zh) | 一种用于治疗糖尿病的干细胞制剂及其制备方法 | |
| CN114177203B (zh) | 脐带血浓缩细胞治疗卵巢早衰的细胞治疗剂 | |
| CN113209279A (zh) | 用于保护原始卵泡的组合物、应用及间充质干细胞功能评价方法 | |
| CN118252850A (zh) | 含有线粒体的组合物 | |
| CN116474000B (zh) | 脐带间充质干细胞制剂、制备方法及其在治疗膝骨关节炎中的应用 | |
| RU2739515C1 (ru) | Способ приготовления лизата тромбоцитов с высоким содержанием факторов роста | |
| CN115364201B (zh) | 治疗卵巢早衰的骨髓浓缩细胞制剂组合物 | |
| CN112111449A (zh) | 一种免疫调节功能预授权型间充质干细胞、制备方法及注射液 | |
| CN115531521B (zh) | 细胞治疗剂及其制法和用途 | |
| CN115518075B (zh) | 细胞组合物及其医疗用途 | |
| CN111778212B (zh) | 动员后造血干细胞血浆外泌体制备方法及其应用 | |
| CN115531522A (zh) | 脐带血浓缩细胞制剂及其治疗卵巢早衰的用途 | |
| CN115025206A (zh) | 一种抗母牛卵巢衰老的添加剂及其应用 | |
| CN115501254A (zh) | 包含脐带血浓缩细胞的组合物 | |
| CN115645514A (zh) | 外周血浓缩细胞和浓缩上清组合剂治疗卵巢早衰的用途 | |
| WO2011145110A1 (en) | A novel cord blood plasma nutrient formulation and a method for the preparation thereof | |
| Liang et al. | Amniotic fluid transplantation alleviates hematopoietic deficits in experimental rat aplastic anemia | |
| CN116135213A (zh) | 调节性t细胞在制备提高皮下脂肪移植存活率和存活质量的试剂或药物中的应用 | |
| Sultan et al. | Ameliorative Effects of induced pluripotent stem cells on experimentally induced ovarian ablation in adult female rats | |
| US20200289574A1 (en) | Augmentation of fertility by platelet rich plasma |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |