KR101859124B1 - 눈 손상 및 질환 치료용 성체 줄기 세포／전구 세포 및 줄기 세포 단백질 - Google Patents

눈 손상 및 질환 치료용 성체 줄기 세포／전구 세포 및 줄기 세포 단백질 Download PDF

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Abstract

본 발명은 포유동물에서 안구 질환, 질병 또는 상태를 치료하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 항-염증, 항-아폽토틱, 면역 조절 및 항-종양원성 특성을 갖는 중간엽 간질 세포의 집단을 포함한다. 본 발명은 포유동물에서 안구 질환, 질병 또는 상태의 치료제로서 TSG-6, STC-1 또는 이의 조합물을 눈에 투여하는 것을 포함한다.

Description

눈 손상 및 질환 치료용 성체 줄기 세포／전구 세포 및 줄기 세포 단백질{ADULT STEM CELLS/PROGENITOR CELLS AND STEM CELL PROTEINS FOR TREATMENT OF EYE INJURIES AND DISEASES}
본 출원은 그 전문이 본원에서 참조로서 포함된 2011년 2월 28일 출원된 가특허출원 61/464,172호 및 2010년 5월 3일 출원된 가특허출원 61/330,735호에 기반한 우선권을 주장한다.
본 발명은 부분적으로 미국정부로부터 받은 기금을 이용하여 제작되었으므로 (국립보건원 허가 번호 R21EY020962), 미국정부는 본 발명의 일정한 권리를 지닐 수 있다.
본 발명의 배경
줄기 세포는 현저한 치료 잠재력을 갖는다. 비제한적인 양태에서, 본 발명은 눈 손상 및 질환을 치료하기 위해 중간엽 줄기 세포를 이용하는 것에 관한 것이다. 다른 비제한적인 양태는 폐 및 심장의 질환을 포함하는 질환들을 치료하기 위한 중간엽 줄기 세포의 치료적 용도에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 비제한적인 양태는 STC-1 및 TSG-6과 같이 중간엽 줄기 세포에 의해 발현되는 항-아폽토틱(apoptotic) 및 항-염증 단백질의 상기 언급된 질환 및 질병을 치료하기 위한 용도에 관한 것이다.
각막은 눈의 굴절 시스템의 중요한 성분인 동시에, 눈의 내부 구조를 환경적 상해로부터 보호함에 의해 생물학적 및 물리적 장벽으로서 기능한다. 각막의 투명도, 및 결과적으로 시력은 최외층인 상피의 통합성 및 기능성 둘 모두에 의존적이다. 각막 상피에서 발생하는 대부분의 질환 (즉, 각막 표면 질환)은 무균 염증 및 상처 치유의 부족에 수반하여 일어난다. 이러한 질환의 치료는 여전히 문제로 남아 있다.
각막 표면 질환의 가장 심각한 형태는 윤부 상피 줄기 세포 결핍 (LSCD)이다. 이것은 일차적으로 유전된 눈 질환의 결과일 수 있으나, 더욱 일반적으로 이것은 화학적 또는 열화상 상해, 전신 자가면역 질환, 콘택트렌즈 각막병증, 재발 안과 수술, 또는 스티븐-존슨 증후군(Steven-Johnson Syndrome)(SJS)과 같은 후천적 상태의 결과이다. 화학적 화상의 발생률은 연간 500,000건이고, 해마다 미국의 응급실에서 보이는 250만 건의 안구 외상 중 7 내지 18%를 차지한다 (Melsaether et al., 2009). 심각한 LSCD를 야기하는 SJS의 연간 발생률은 백만명의 사람 당 2.6 내지 7.1건 또는 미국 인구 중 약 200,000명이다 (Foster et al., 2008). LSCD는 환자에게 어마어마한 심리적 스트레스를 줄 뿐만 아니라 환자의 일생 동안 생산성의 손실 및 예방적 건강 관리 비용의 관점에서 경제적 부담을 준다.
LSCD의 현행 치료는 초반에는 항-염증 약물 요법 (예컨대, 스테로이드) 및 말기에는 윤부 상피 줄기 세포 (LESC)의 이식을 포함한다 (Limb and Daniels, 2008). 그러나, 현재 이용가능한 항-염증 약물은 보잘 것 없으며, LESC의 후속 손실을 막을 수 없다. 환자의 건강한 눈(윤부 자가이식), 친척, 또는 사후기증자(윤부 동종이식)로부터 LESC를 이식함에 의해 LSCI를 교정하는 현재 전략은 많은 단점을 갖는다 (Ilari et al. 2002; Solomon et al, 2002; Cauchi et al. 2008). 윤부 자가이식은 공여자 눈에 LSCD를 발생시킬 위험을 지니며 (Jenkins et al., 1993) 양쪽 LSCD를 갖는 환자에서 이용될 수 없다. 윤부 자가이식은 이식편에 HLA-DR 항원 및 랑게르한스 세포의 존재로 인해 장기간 전신 면역억제를 필요로 한다. 면역억제에도 불구하고, 윤부 자가이식 후 42.9% 내지 64.0%의 환자에서 면역거부반응이 발생한다 (Rao et al., 1999; Tseng et al., 1998; Shi et al., 2008; Reinhard et al., 2004; Tsubota et al., 1999). 현재, LESC의 생체외 배양 및 이식이 일부 센터에서 LSCD에 대해 이용되고 있다 (Shortt et al., 2007에 요약됨). 그러나, 윤부(Iimbus)에서 관찰되는 추정상의 줄기 세포는 아직 재현가능하게 단리되거나 충분히 특성화되지 않았다. 더욱이, 배양된 LESC를 치료적으로 이용함에 있어서 주요 임상적 제한은 자가 공여자 조직의 이용가능성에 있다. 비록 배양된 동종이형 세포가 전신 면역억제와 함께 이용될 수 있다고 하더라도, 공여자 동종이형 LESC는 9개월 넘게 생존하지 않는다 (Daya et al., 2005; Sharpe et al., 2007). 안구 표면에서 염증의 효과적인 억제가 성공에 중요하다. 따라서, 본 발명의 목표가 되는 요법은 현행 요법에 중요한 진보를 제공할 수 있다.
시력-위협적인 LSCD 외에, 건성각막결막염(keratoconjunctivitis sicca), 재발 각막 미란(recurrent corneal erosion), 또는 굴절교정수술 후 각막염(post-refractive surgery keratitis)과 같이 각막 염증 및 상처 치유에서의 결함에 동반하는 다수의 안구 표면 질환이 있다. 미국 인구의 거의 10%에게 있는 안구건조증이 가장 일반적이다 (Moss et al., 2000; Sehaumberg et al., 2003; Moss et al., 2008). 미국에서 2000 내지 3000만명이나 되는 사람이 건성안의 조기 조짐 또는 징후를 나타내었고, 추정상 6백만명의 여성 및 3백만명의 남성이 삶의 질을 변경시키는 건성안의 전조를 겪고 있다 (Mertzanis et al.. 2005; Miljanovic et al., 2007). 불행히도, 현재-이용가능한 치료제의 대부분은 완화제일 뿐이며 어떤 것도 건성안의 조짐 또는 징후를 완전히 없애지 못한다 (Pflugfelder, 2007). 여러 연구 (Clegg et al., 2006; Reddy et al., 2004; Callaghan et al., 2007)는 안구건조증의 경제적 영향력도 직접적인 의학적 비용 (예컨대, 약제 및 의사 방문을 위한) 및 간접적인 비용 (예컨대, 작업 시간 낭비 및 손상된 생산성)의 두 관점 모두에서 실질적임을 확인시켜 주었다. 사실상, 각막 표면의 질환을 위한 효율적이고 안전한 치료 전략은 존재하지 않는다.
노인 황반 변성(age-related macular degeneration)(AMD) 및 색소성망막염(retinitis pigmentosa)(RP)을 포함하는 망막 변성(retinal degeneration)은 미국에서 법적 시각상실의 주요 원인이다. AMD 및 RP는 광수용체 및/또는 망막 색소 상피 (RPE) 세포 사멸로 인한 말기 실명을 포함하는 임상적 및 병리학적 특징을 공유한다. 특히 중요한 것은 광수용체의 아폽토시스(apoptosis)가 인간 AMD (Dunaief, et al., Arch. Ophthalmol ., Vol. 120, No. 11, pgs. 1435-1442 (2002); Xu, et al., Trans. Am. Ophthalmol . Soc ., Vol. 94, pgs. 411-430 (1996)) 및 RP (Cottet, et al., Curr . Mol . Med ., Vol. 9, No. 3, pgs. 375-383 (2009); Doonan, et al., Curr . Neurosci . Res., Vol 1 , No. 1, pgs. 47-53 (2004))의 현저한 특징으로 나타났다는 것이며, 이것은 망막 변성의 동물 모델 중 다수에서 근원적인 특징이다 (Doonan, 2004; Yu, Invest. Ophthalmol . Vis . Sci ., Vol. 45, No. 6, pgs. 2013-2019 (2004); Katai, et al., Invest. Ophthalmol . Vis . Sci ., Vol. 40, No. 8, pgs. 1802-1807 (1999); Katai, et al., Jpn . J. Ophthalmol.. Vol 50, No. 2, pgs. 121-127 (2006)). 활성 산소종 (ROS)은 AMD에서 세포 사멸의 개시 및/또는 악화에 관여하였고 (Fletcher, et al., Ophthalmic Res., Vol. 44, No. 3, pgs. 191-198 (2010); Beatty, et al., Surv . Ophthalmol ., Vol. 45, No. 2, pgs. 115-134 (2000); Winkler, Mol . Vis ., Vol. 5, pg. 32 (1999); Johnson, Curr . Opin . Cln. Nutr . Metab . Care., Vol. 13, pgs. 28-33 (2010); Totan, et al., Curr . Eve Res.. Vol. 34, No. 12, pgs. 1089-1093 (2009)) 항산화 비타민 요법이 현재 비-삼출성 AMD 및 RP에서 주요한 치료 중 하나이다 (Johnson, 2010; Hartong, et al., Lancet, Vol. 368, pgs. 1795-1809 (2006)). 비록 치료법은 아니지만, 항산화 비타민 요법 이후에 질환의 위험도 감소 및 시력의 안정화가 관찰되었다 (Flectcher, 2010; Beatty, 2000; Johnson, 2010; Hartong, 2006). 더욱이, AMD에서 주요한 경감가능한 위험 인자들 중 두 개인 흡연 및 광 노출은 ROS-매개 손상을 통해 광수용체 또는 RPE를 손상시키는 것으로 여겨진다 (Flectcher, 2010; Johnson, 2010). 또한, RP의 동물 모델에서의 산화 손상 연구가 ROS와 관련되었는데, 이것이 부분적으로 광수용체의 아폽토틱 손실의 원인이기 때문이다 (Komeima, et al., Proc . Nat. Acad . Sci.. Vol. 103, No. 30, pgs. 11300-11305 (2006); Shen, et al., J. Cell. Physiol ., Vol. 203, No. 3, pgs. 457-464 (2005)). 추가의 증거는 항산화제 기반 요법이 RP의 동물 모델에서 광수용체 사멸을 지연시키고 (Komeima, et al; J. Cell. Physiol ., Vol. 213, No. 3, pgs. 809-815 (2007); Galbinar, et al., J. Ocul. Pharmacol . Ther ., Vol 25, No. 6, pgs. 475-482 (2009); Chen, et al., Nat. Nanotechnol ., Vol. 1, No. 2, pgs. 142-150 (2006)) 일차 망막 세포 (Chen, 2006; Chucair, et al., Invest. Ophthalmol . Vis . Sci ., Vol. 48, No. 11, pgs. 5168-5177 (2007)) 또는 시험관내 RPE 세포 사멸 (Cao, et al., Exp . Eve Res., Vol. 91, No. 1, pgs. 15-25 (2010); Kim, et al., Invest. Ophthalmol . Vis . Sci., Vol. 51, No. 1, pgs. 561-566 (2010))을 감소시킴을 입증하는 연구를 포함한다. 광수용체는 여러 가지 이유로 산화 스트레스에 특히 민감하다: (a) 망막에 의한 산소 소비가 어떠한 다른 조직에 비해 크다 (Beatty, 2000); (b) 광수용체 외부 세그먼트가 풍부한 혈관 공급부 가까이에 존재하며 산소가 존재할 때 산화를 겪는 고농도의 폴리불포화 지방산 (PUFA)을 함유한다 (Winkler, 1999); (c) 리포푸신이 노화 동안 RPE에 쌓이며, 이것은 RPE에 독성인 ROS의 공급원인 것으로 여겨진다 (Beatty, 2000); 그리고 (d) 광수용체는 ROS를 생산하는 것으로 알려진 과정인 반복 광화학 손상을 겪는다 (Beatty, 2000). 본 발명자들의 예비 데이터와 함께 이러한 발견은 현재로서 망막의 불치 퇴행성 질병에서 RO-매개 아폽토시스를 감소시키는 것으로 알려진 신규한 줄기 세포 기반 요법을 시험하고자 하는 강력한 이론적 근거를 제공한다.
염증은, 예를 들어 심근경색증(myocardial infarction), 뇌졸중(stroke), 알츠하이머병(Alzheimer's disease) 및 죽상경화증(atherosclerosis)과 같은 다수의 질환에서 역할을 담당함이 증가적으로 밝혀지고 있다. 따라서, 본 발명은 비제한적인 양태에서, 심근경색증 및 폐 질환을 치료하는데 있어서, 중간엽 줄기 세포의 용도 및 TSG-6과 같은 특정 단백질의 역할에 관한 것이다.
요약컨대, 각막 염증 및 각막에 대한 화학적 상해에 의해 야기된 궤양을 치료하기 위한 효과적인 약물은 존재하지 않는다. 또한, 황반 변성에 대한 추가의 요법이 요구된다. 폐 및 심장의 질환에 대한 추가적인 요법이 또한 요구된다. 따라서, 본 발명은 중간엽 줄기 세포 및 줄기 세포 단백질의 치료제로서의 용도에 관한 것이다.
상기 개요, 및 본 발명의 하기 상세한 설명은 첨부된 도면에 관해 읽어볼 때 더 잘 이해될 것이다. 본 발명을 예시할 목적으로, 여기서 바람직한 도면 구체예(들)가 도시되어 있다. 그러나, 본 발명이 도시된 그대로의 배열 및 수단으로 제한되지 않음이 이해되어야 한다.
도 1a 내지 1c를 포함하는 도 1은 손상 1주일 후, 각막 염증 및 혈관신생의 유도를 도시하는 일련의 이미지이다. 도 1a는 슬릿 램프 조사시에, 활성 신규 혈관을 갖는 각막 염증이 관찰되었음을 나타내는 이미지이다. 도 1b는 각막에서 VEGF 발현의 현저한 증가를 나타내는 VEGF에 대한 면역형광 염색의 이미지이다. VEGF는 녹색으로서 그리고 핵은 청색으로서 대조염색되었다. 도 1c는 각막이 염증 세포로 조밀하게 침윤되었음을 나타내는 헤마톡실린-에오신 염색을 도시하는 이미지이다.
도 2a 및 2b를 포함하는 도 2는 각막으로 세포의 적용을 도시하는 일련의 이미지이다. 도 2a는 눈을 뜬 채로 유지하기 위해 설치된 6-mm-직경 공동 플라스틱 튜브 및 주문제작된 어플리케이터내로 각막에 적용된 세포 또는 배지의 이미지이다. 도 2b는 플루오레세인 현미경검사에 의해 각막에서 PKH26-표지된 세포의 동정에 의해 확인되는 각막에서 MSC의 생착(engraftment)을 도시하는 이미지이다.
도 3a 내지 3l을 포함하는 도 3은 손상후 1주 (도 3a-3d), 2주 (도 3e-3h), 및 3주 (도 3i-3l) 후에 각막의 사진을 묘사하는 일련의 이미지이다. 시간에 따라, 혈관신생 및 혼탁도가 MSC (도 3d, 3h, 3l) 또는 MSC-CM 배지로 3회 (도 3c, 3g, 3k) 처리된 각막에서 현저하게 감소한 반면, 대조군 (도 3a, 3e, 3i)에서는 증가하였다. MSC-CM로 1회 치료된 각막 (도 3b, 3f, 3j)은 중간 정도의 결과를 나타내었다.
도 4a 내지 4d를 포함하는 도 4는 손상 3주 후 각막의 헤마톡실린-에오신 염색을 도시하는 일련의 이미지이다. 대조군 (도 4a) 또는 MSC-조건화된 배지로 1회 처리된 각막 (도 4b)은 기질에서는 염증 세포로 그리고 상피에서는 술잔 세포로 조밀하게 침윤되었다. 침윤은 MSC-조건화된 배지로 3회 (도 4c) 또는 MSC (도 4d)로 처리된 각막에서 현저하게 감소되었다.
도 5a 내지 5d를 포함하는 도 5는 ELISA에 의해 평가된 염증-관련 사이토카인 발현을 입증하는 일련의 이미지이다. IL-2 및 IFN-γ는 대조군에 비해 MSC 또는 MSC-조건화된 배지로 3회 (MSC-CM II) 처리된 각막에서 억제되었다.
도 6a 내지 6d를 포함하는 도 6은 혈관형성-관련 사이토카인에 대한 실시간 PCR를 묘사하는 일련의 이미지이다. 대조군에 비해, TSP-1의 상향조절이 MSC 또는 MSC-조건화된 배지로 3회 (MSCCM II) 처리된 각막에서 관찰되었다. MMP-2 및 MMP-9는 MSC 그룹에서 하향조절되었다. VEGF의 발현에서는 차이가 없었다. 값들을 손상이 없는 새로운 각막에 대한 배수로서 표시하였다.
도 7은 화학적 손상 후 인간 각막 상피 세포 (HLEC)의 세포독성 시험을 묘사하는 이미지이다. hMSC-유래 배지를 이용하여 48시간 동안 배양시, 손상된 HLEC는 hMSC-조건화된 배지를 이용하지 않은 HLEC에 비해 현저하게 감소되었다.
도 8은 ELISA에 의해 평가된 사이토카인 분비를 묘사하는 이미지이다. VEGF, MMP-9, MMP-2, 및 TSP-I의 발현을 hMSC/hCEC/hPBMC의 다양한 공배지에서 정량하였다. 15% 에탄올로 30초간 처리 후 hCEC를 제조하였다. 데이터는 적어도 3회 실험을 대표한다.
도 9a 내지 9f를 포함하는 도 9는 마우스내로 융합된 hMSC의 운명에 대한 검정을 묘사하는 일련의 이미지이다. 도 9a는 약 2 X 106개의 hMSC를 마우스내로 IV 융합시킨 후 혈액으로부터 인간 Alu 서열의 제거를 묘사하는 이미지이다. 값들은 평균 +/- SD이다; n-6. 도 9b는 7개 기관에서 인간 Alu 서열의 실시간 PCR 검정에 대한 표준 곡선을 도시하는 이미지이다. 값들은 동일한 샘플 상에서 마우스/인간 GAPDH 유전자 및 Alu 서열에 있어서 프라이머에 대한 ΔΔCt를 나타낸다. 도 9c는 약 2 X 106개의 hMSC를 마우스내로 IV 융합시킨 후 15 mm 내에 인간 Alu 서열의 조직 분포를 나타내는 이미지이다. 값들은 평균 +/- SD이다; n-6. 도 9d는 GAPDH에 대해 인간 mRNA의 실시간 RT-PCR 검정에 대한 표준 곡선을 나타내는 이미지이다. 값들은 동일한 샘플 상에서 마우스/인간 GAPDH 유전자 및 인간 특이적 GAPDH에 대한 cDNA에 있어서 프라이머에 대한 AACt를 나타낸다. 도 9e는 약 2 X 106개의 hMSC의 IV 융합 후 폐 및 6개의 다른 조직에서 hMSC의 동력학을 묘사하는 이미지이다. 값들은 평균 +/- SD이다; n-6. 도 9f는 좌전하방 동맥의 영구적인 라이게이션(ligation) 후에 약 1 X 106개의 hMSC를 IV 융합시킨 후 심장에서 hMSC의 출현을 묘사하는 이미지이다.
도 10a 내지 10f를 포함하는 도 10은 TSG-6을 발현시키는 hMSC의 활성화를 묘사하는 일련의 이미지이다. 도 1Oa는 2 X 106개의 hMSC를 IV 융합시킨 지 10시간 후 폐에서 인간-특이적 mRNA에 대한 실시간 RT-PCR을 묘사하는 이미지이다. 값들은 hGAPDH의 경우 AACt에 의해 표준화된, 배양된 hMSC에 대한 값들에 대한 배수 증가이다. 기호: hMSC con, RNA를 추출하기 전에 대조군 마우스로부터 폐에 첨가된 hMSC의 샘플; hMSC IV 1 및 2, hMSC의 IV 융합 10시간 후에 2마리의 마우스의 폐로부터의 샘플. 도 10b는 마우스 폐에서 인간 TSG-6에 대한 실시간 RT-PCR을 묘사하는 이미지이다. 약 2 X 106개 hMSC를 나이브 마우스 (IV-nor) 또는 Ml 1시간 후 마우스 (IV-MI)에 IV 융합시키고, 0.25 hr 내지 24 hr 후에 폐를 회수하였다. 값들은 +/- SD이고; n은 정상 마우스의 경우 2 또는 3마리이고; MI 마우스의 경우 n=6이다. 도 10c는 10 ng/ml의 TNF-α를 갖는 무혈청 배지에서 24 또는 48 hr 동안 인큐베이션된 동일한 공여자로부터의 hMSC 및 인간 섬유모세포에서 TSG-6에 대한 실시간 RT-PCR를 묘사하는 이미지이다. 동일한 세포의 두 개의 계대를 이용한 결과가 도시된다. 값들은 +/- SD이다; n=3. 도 10d는 10 ng/ml의 TNF-α를 갖는 무혈청 배지에서 48 hr 동안 인큐베이션된 hMSC 및 인간 섬유모세포로부터의 배지에서 TSG-6에 대한 ELISA를 묘사하는 이미지이다. 값들은 +/- SD이다; n=3. 도 10e는 대조군 hMSC (Con), 트랜스펙션 시약만으로 처리된 hMSC (no siRNA), 스크램블링(scrambled) siRNA로 트랜스펙션된 hMSC (scr siRNA) 또는 TSG-6 siRNA로 형질도입된 hMSC (TSG-6 siRNA)의 TSG-6에 대한 실시간 RT-PCR 검정을 묘사하는 이미지이다. 세포를 10 ng/ml의 TNF-α와 함께 또는 이것 없이 6시간 동안 인큐베이션시켰다. 값들은 +/- SD이다; n=3. 도 10f는 TNF-α와 함께 또는 이것 없이 48시간 동안 세포를 인큐베이션시킨 후 배지에서 TSG-6에 대한 ELISA를 묘사하는 이미지이다. 기호: 도 10e에서와 같다. 값들은 +/- SD이다; n=3.
도 11a 내지 11e를 포함하는 도 11은 혈청 및 심장의 검정을 묘사하는 일련의 이미지이다. 도 11a는 MI 48시간 후 혈청에서 심장 트로포닌 I에 대한 검정을 묘사하는 이미지이다. 값들은 +/- SD이다; **. 그룹 당 n=3 (정상) 또는 6마리 마우스 (MI)에서 p < 0.01. 도 11b는 MI 48시간 후 혈청에서 플라스민 활성을 나타내는 이미지이다. 기호: 정상, 나이브 마우스;-, MI만; hMSC, MI 1시간 후 IV 융합된 2 X 106개 hMSC; scr siRNA, MI 1시간 후 IV 융합된 스크램블 siRNA로 형질도입된 2 X 106개 hMSC; TSG-6 siRNA, MI 1시간 후 IV 융합된 TSG-6 siRNA로 형질도입된 2 X 106개 hMSC; rhTSG-6, MI 1시간 후 그리고 24시간 후 다시 IV 융합된 30 ㎍ rhTSG-6 단백질. 값들은 +/- SD이다; 그룹 당 n=3 마우스에서 p < 0.01. N.S. = 현저하지 않음. 도 11c는 MI 48시간 후 젤라틴 지모겐 겔 상에서 전- 및 활성-매트릭스 MMP9에 대해 검정된 심장을 묘사하는 이미지이다. 이미지를 뒤집었다. 기호: 도 11b에서와 같음. 도 11d 및 11e는 MI 48 hr 후 심장에서 과립구 및 단핵구 침윤을 묘사하는 이미지이다. 섹션을 항-Ly-6G 및 Ly-6C로 염색하였다. 기호: 100 ㎍의 rhTSG-6 단백질을 MI 1시간 후 그리고 24시간 후 다시 IV 융합시키는 것을 제외하고, 도 11b에서와 같음. 확대 X 4. 스케일 바, 250 ㎛. 값들은 +/- SD이다; 각각의 그룹에 대해 n=3 또는 4이다. ** p < 0.001; N.S. = 현저하지 않음.
도 12a 내지 12f를 포함하는 도 12는 MI 3주후 경색 크기의 검정을 묘사하는 일련의 이미지이다. 각 심장을 끝에서 기부를 통해 400개 이상의 연속적인 5 ㎛ 섹션들로 절단하고 매슨 트리크롬(Masson Trichrome)으로 염색하였다. 20번째 섹션마다 전형적인 견본으로부터 도시된다. 도 12a는 MI를 묘사하는 이미지이다. 심장은 치료되지 않았다. 도 12b는 MI + hMSC를 묘사하는 이미지이다. 2 X 106개 hMSC가 MI 1시간 후 IV 융합되었다. 도 12c는 MI + scr siRNA를 묘사하는 이미지이고, 2 X 106개 hMSC가 MI 1시간 후 IV 융합된 스크램블링 siRNA로 형질도입되었다. 도 12d는 MI + TSG-6 siRNA를 묘사하는 이미지이다. 2 X 106개 hMSC가 MI 1시간 후 IV 융합된 TSG-6 siRNA로 형질도입되었다. 도 12e는 MI 1시간 후 그리고 24 hr 후에 다시 IV 융합된 MI + hTSG-6 100 ㎍ rhTSG-6 단백질을 묘사하는 이미지이다. 도 12f는 심장 당 총 20개 섹션에 대해 매 10번째 섹션의 경색 면적으로부터의 중간선 길이 측정으로 수득된 경색 면적 측정 (%)을 묘사하는 이미지이다 (Takagawa et al., 2007). 값들은 +/- SD이고; n=그룹 당 3 또는 4마리의 마우스이다; *** MI 대조군에 비해 p < 0.0001; N.S. MI 대조군에 비해 현저하지 않음; * MI + MSC 대 MI + rhTSG-6에 대해 p <0.05.
도 13은 저산소증에서 낮은 pH에서의 인큐베이션에 의해 아폽토틱이 된 폐 상피 세포주의 아폽토시스의 감소에 STC-1이 요구되며 충분함을 입증하는 이미지이다. 상부 좌측 및 우측: A549 세포의 배양액은 pH 5.8 또는 5.5에서 1% 산소에서 24시간 동안 인큐베이션시에 아폽토틱이 되었다. 그러나, MSC와의 트랜스웰(transwell)에서 A549 세포의 배양액은 아폽토시스를 감소시켰다. 하부 좌측: A549 세포의 아폽토시스가 rhSTC-1에 의해 억제되었고, 효과는 항-STC-1 항체에 의해 뒤집혔다. 하부 우측: STC-1에 대해 siRNA로 형질도입된 MSC는 트랜스웰 실험에서 A549 세포의 아폽토시스를 감소시키는데 있어서 대조군 MSC보다 덜 효과적이었다.
도 14는 각막 손상에 반응하여 hMSC에 의해 생산된 추가의 신규한 치료 인자를 찾는 전략의 개요이다.
도 15는 미리-활성화된 MSC 및 rhSTC-1으로부터의 조건화된 배지가 생존력을 향상시키고, 증식을 증가시키고, 손상된 hCEP의 아폽토시스를 억제하는 hMSC에서의 가장 큰 효과를 지녔음을 입증하는 일련의 이미지이다.
도 16a 내지 16f를 포함하는 도 16은 TSG-6 (2 ug)의 앞방내 주입이 손상후 각막 혼탁 및 각막에서의 혈관신생을 감소시켰음을 나타내는 일련의 이미지이다. 도 16a-16f는 각막의 포토 이미지이다. 도 16a-16c는 PBS-처리된 대조군을 묘사하는 이미지이다. 도 16d-16f는 TSG-6-처리된 각막을 묘사하는 이미지이다. 도 16a, 16d는 수술 3일후를 나타낸다. 도 16b, 16e는 수술 7일후를 나타낸다. 도 16c, 16f는 수술 21일후를 나타낸다. 하부 프레임: 각막의 혼탁도 (좌측 프레임) 및 혈관신생 (우측 프레임)의 임상 평가.
도 17a 내지 17g를 포함하는 도 17은 TSG-6 (2 ug)의 앞방내 주입이 손상후 각막에서 뉴트로필의 침윤 및 MMP-9의 생산을 감소시켰음을 나타내는 일련의 이미지이다. (도 17a-17d) 각막의 헤마톡실린-에오신 염색. (도 17a, 17b) PBS-처리된 각막. (도 17c, 17d) TSG-6-처리된 각막. (도 17a, 17c) 수술 3일후. (도 17b, 17d) 수술 21일후. (도 17e) 미엘로퍼옥시다제 검정. (도 17f) MMP-9에 대한 겔 지모그래피. (도 17g) 전체 및 활성 MMP-9에 대한 ELISA.
도 18은 수술 3일후 각막에서 임상 혼탁도 및 MPO의 양 간의 상관관계를 나타내는 그래프이다.
도 19a 내지 19d를 포함하는 도 19는 최대 2 ug의 TSG-6이 각막 혼탁, 염증, 및 MMP-9 생산을 감소시키는데 효과적임을 입증하는 일련의 이미지이다. (도 19a-19d) 각막의 사진. (도 19a) PBS-처리된 각막. (도 19b) TSG-6 0.02ug-처리된 각막. (도 19c) TSG-6 0.2ug-처리된 각막. (도 19d) TSG-6 2ug-처리된 각막. (도 19e) 미엘로퍼옥시다제 검정 및 혼탁의 임상 등급화. (도 19f) MMP-9에 대한 겔 지모그래피 및 ELISA.
도 20은 염증 사이토카인 및 케모카인에 대한 실시간 PCR을 묘사하는 이미지이다. RQ: 상대 유전자 발현, 수술 3일후, 7일후 및 21일후에 (POD) 비히클 치료 (PBS)와 TSG-6 치료 (2 ㎍)를 비교한다.
도 21은 사이토카인 및 케모카인에 대한 ELISA를 묘사하는 이미지이다. 도 20에서와 같은 조건.
도 22는, TSG-6이 뉴트로필이 침윤되기 시작하여 피크에 도달하는 시간을 지연시킬 뿐 아니라 침윤된 뉴트로필의 양을 감소시켰음을 나타내는 이미지이다. 케모카인 및 사이토카인의 발현 패턴은 유사한 동력학을 나타내었다. 하부 두 개의 프레임: MPO 및 백혈구의 혈중 수준 (WBC).
도 23. STC -1의 2회 주입이 로돕신 돌연변이 유전자이식 랫트에서 망막 변성을 회복시켰다. 상부 프레임: 대표적인 후부 조직학은 UI 대조군에 비해 STC-1 처리된 눈에서 두꺼워진 ONL을 나타내었다. ONL은 간체(rod) 및 추체(cone)의 핵을 함유하는 망막의 바깥핵층이다. 하부 프레임: 총 54회의 측정 (27회 상위 망막 및 27회 하위 망막)으로부터 얻은 ONL 층 두께의 대표적인 플롯은 STC-1이 ONL 두께를 UI 대조군에 비해 현저하게 개선시켰음을 입증하였다.
도 24. RCS 랫트에서 광수용체에 대한 mRNA의 연령 관련 손실. 광수용체 유전자에 대한 qRT-PCR 분석: 로돕신, 포스듀신, 중성 망막 류신 지퍼, 및 레코베린. 이러한 유전자들의 발현은 시간에 따라 RCS 랫트에서 감소한다. qPCR 방법에 대해서는, 문헌[Lee, 2008]을 참조하라.
도 25. RCS 랫트에서 STC-1의 유리체내 주입에 의한 광수용체에 대한 mRNA의 보호. 광수용체 유전자에 대한 qRT-PCR 분석을 도 24에 관해 기재한 대로 수행하였다.
도 26. 주입 후 MSC는 유리체강에서 생존한다. 좌측 패널: 생육할 수 있는 MSC의 반영으로서 인간 GAPDH mRNA에 대한 인간 특이적 qRT-PCR을 이용한 표준 곡선 (방법에 대한 참조: Lee, 2009). RNA를 추출하기 직전에 다양한 수의 인간 MSC를 전체 안구에 첨가하였다. 우측 패널: 100,000개 인간 MSC의 유리체내 주입 4일 후 생육할 수 있는 인간 세포의 회수.
도 27. 세포가 구상체내로 융합하도록 현적 배양(hanging drop)으로 인간 MSC의 배양에 의한 STC -1의 발현 활성화. 고밀도 단층 (Adh High), 구상체 (Sph 25k), 및 구상체 유래 MSC (Sph 25k DC)를 1.5 ml의 완전 배양 배지 (CCM) 및 고밀도 배양액으로부터의 200,000개 MCS, 8개 25k 구상체, 또는 200,000개 MSC를 함유하는 6웰 플레이트로 옮겼다. 24시간 후에, ELISA를 위해 배지를 회수하고, 단백질 검정을 위해 세포를 용해시켰다. 도면은 문헌 (Bartosh, 2010)으로부터 형성된다. 결과는, MSC의 표준 단층 배양액 (Adh High-Adh)에 비해 구상체 MSC (Sph 25k-Adh, Sph 25k-Non adh, 또는 Sph 25k DC-Adh)에 의한 STC-1의 분비에서의 20배 이상의 증가를 입증하였다.
도 28. RPE 세포의 배양액에서의 STC -1의 항- 아폽토틱 효과. 450 μM H202로 ARPE-19를 손상시킨 지 1시간 후 STC-1 (250 ng/mL)으로의 치료가 전-아폽토틱 유전자 (카스파제 3/7)의 발현, 세포 사멸 (아넥신 V & PI 염색 세포)을 감소시켰고 세포 생존력을 향상시켰다 (미토콘드리아 효소 MTT의 활성 증가). 카스파제 활성의 검출을 종래 문헌[Sharma, et al., Invest. Ophthalmol . Vis . Sci., Vol. 49, No. 11, pgs, 5111-5117 (2008)]에 기재된 대로 수행하였고, 아넥신/PI를 종래 문헌[Bartosh, 2010]에 기재된 대로 정량하였으며, MTT 전환을 종래 문헌[Mester, et al., J. Mol. Neurosci., (2010)]에 기재된 대로 측정하였다.
도 29. RCS 랫트에서 유리체내 주입된 STC -1의 항- 아폽토틱 효과. 전-아폽토틱 단백질을 엔코딩하는 전사체인 BAX의 유전자 발현은 qRT-PCR에 의해 정량한 대로 STC-1에 의해 현저하게 감소되었다.
도 30. 마우스 각막의 화학적 및 기계적 손상 직후에, PBS를 마우스에게 정맥내 또는 복막내 투여하거나, TSG-6 (2 mg/5 ml)을 마우스 각막의 표면에 적용시켰다. 그 후, 마우스의 눈에 외측 검판봉합술을 시행하였다. 3일 후, 각막을 추출하고 미엘로퍼옥시다제 (MPO) ELISA 검정을 수행하였다.
도 31. 손상후 각막에서의 조기 사건. A. 뉴트로필 침윤이 두 개의 상으로 일어났다: 1) 약 15분 이내에 시작되어 4 h에 플래토 수준에 도달하는 소형 초기 단계 (I 상) 및 2) 24 내지 48 h에 피크인 뉴트로필의 훨씬 큰 침윤 (II 상). B. 마이크로어레이에서의 발현의 일시적인 패턴에 기반하여, 손상된 각막에서 상향조절된 유전자를 세 개의 그룹으로 나누었다. C. 각각의 그룹에서 대표적인 유전자의 실시간 PCR 분석. 그룹 A 유전자는 mRNA 발현에서 그룹 B 및 C 유전자에 선행하였다. D. 손상 4 h 및 24 h 후 각막으로부터의 유전자의 마이크로어레이 히트맵. 2배 넘게 상향조절 (적색)되거나 하향조절된 (청색) 유전자의 수 및 유전자 실체의 범주가 표시된다. 발현 패턴에 기반하여, 유전자를 세 개의 그룹으로 분류하였다: 손상후 조속하게 발현이 증가하고 그 후 감소하는 유전자 (그룹 A), 안정된 수준으로 발현되는 유전자 (그룹 B), 및 손상후 점진적으로 증가하는 유전자 (그룹 C).
도 32. 손상된 각막에서 세크레토뉴린(secretoneurin)(SN) 및 HSPB4의 발현 패턴. A, E. 각막에서 SN 및 HSPB4의 웨스턴 블롯, SN은 손상 직후 각막으로 방출되었고, HSPB4는 4 h에 피크에 도달하였다. B, F. G. 혈청 및 각막에서 SN 및 HSPB4의 ELISA. SN은 손상후 0.25 h 내에 각막 및 혈청으로 방출되었다. HSPB4는 2 내지 4 h 후에 각막의 생체외 배양물의 상청액에서 측정된 바와 같이 세포외 공간으로 방출되었다. C, H. 각막에서의 SN 및 HSPB4의 면역조직화학. D, I. 뉴로펩티드 및 결정체의 실시간 PCR. 분석된 뉴로펩티드와 결정체 중에서, SN 및 HSPB4는 손상된 각막에서 가장 높은 발현을 나타내었다. J. 괴사 추출물에 반응하여, 배양액 중 각막세포는 HSPB4를 발현시켰다. K. 아코니타제 활성에 의해 측정된 바와 같이, 산화 스트레스가 손상에 의해 각막에서 발생하였다. L. 과산화수소는 각막세포에서 HSPB4의 발현을 증가시켰다. M. 각막에서 IL-6, IL1β, CXCLl , 및 CCL2의 일시적인 발현. ELISA는 그룹 B (IL-6) 및 그룹 C (IL-1β, CXCLl, 및 CCL2) 유전자의 단백질의 발현이 마이크로어레이 및 실시간 RT-PCR 검정으로 mRNA에 대해 검정된 바와 같은 유전자 발현과 유사함을 나타내었다.
도 33. SN은 I 상 염증 반응을 재현하였고, HSPB4는 I 상과 II 상 둘 모두를 재현하였다. A. 재조합 SN의 주입은 II 상이 아니라, I 상의 뉴트로필의 조기 침윤을 유도하였다. B, C. HSPB4 주입은 HSPB4가 주입된 각막 영역의 뉴트로필 엘라스타제에 대한 헤마톡실린-에오신 염색 및 면역염색에서 나타난 바와 같이 각막 혼탁 및 뉴트로필 침윤을 수반하는 I 상 및 II 상 반응을 유도하였다. D. 칼슘 채널 차단제 딜티아젬의 국소 적용은 화학적 손상에 대한 각막 손상에서 I 상 반응을 현저하게 억제하였다. E. HSPB4에 대한 폴리클로날 (pAb) 또는 모노클로날 (mAb) 항체의 결막하 주입은 아이소형 대조군 (IgG)-주입 그룹에 비해 II 상에서 뉴트로필 침윤을 현저하게 감소시켰다. F. 각막으로 방출된 SN 및 HSPB4의 양은 손상된 각막에서는 SN 및 HSPB4의 실시간 PCR 그리고 혈청 또는 각막에서는 SN 및 HSPB4에 대한 ELISA에 의해 측정되는 대로 손상의 중증도에 의존적이었다. mRNA 및 단백질의 농도는 각막 또는 혈청에서 경미한 손상 (15초 에탄올 및 찰과)에 비해 심한 손상 (30초 에탄올 및 찰과)에 의해 더 높았다. G. -2일 (즉, 손상 2일 전) 및 0일 (손상 직후)에 클로드로네이트-캡슐화 리포좀 (Cl2 MDP-LIP)의 결막하 주입 후에, 랫트 각막의 섹션을 헤마톡실린-에오신 (H&E), 또는 포식세포를 동정하기 위해 CD11b 및 CD68에 대한 항체로 염색하였다. H&E 상에서 각막의 구조는 Cl2 MDP-LIP에 의해 영향을 받지 않았다. 그러나 각막에서의 CD11b- 및 CD68-포지티브 세포는 PBS-캡슐화 리포좀-주입 대조군 (PBS-LIP)에 비해 C12MDP-LIP에 의해 현저하게 감소되었다.
도 34. HSPB4는 TLR2/NK-kB 신호전달을 통해 포식세포를 활성화시켰다. A. HSPB4는 각막 포식세포가 리포좀-캡슐화 클로드로네이트 (Cl2MDP-LIP)의 결막하 주입에 의해 고갈되었을 때 II 상 반응을 유도하지 않았다. B. TLR2/NF-kB 신호전달의 억제제인 TSG-6의 앞방내 주입은 손상후 각막의 II 상 염증 반응을 억제하였다. C. TSG-6 치료는 또한 HSPB4가 주입된 각막에서 II 상의 뉴트로필 침윤을 현저하게 감소시켰다. D. 포식세포는 각막의 괴사 추출물과 인큐베이션시에 전-염증 사이토카인을 발현시키기 위해 활성화되었다. 폴리클로날 (pAb) 또는 모노클로날 (mAb) 항체로 HSPB4를 차단시키는 것은 포식세포 활성화에 대한 괴사 각막 추출물의 효과를 현저하게 억제하였다. E. 재조합 HSPB4의 첨가는 용량-의존적 방식으로 배양액에서 포식세포를 활성화시켰다. F. HSPB4는 포식세포에서 세포질에서 핵으로의 NK-kB의 전위를 유도하였다. G. 각막의 괴사 추출물은 또한 TLR2 (HEK-TLR2)를 발현시키는 리포터 세포에서 TLR2 NK-kB 경로를 자극하였으나. HSPB4에 대한 항체는 이러한 효과를 부분적으로 억제하였다. H, I, J. 재조합 HSPB4는 TLR2 또는 TLR4 (HEK-TLR4)를 발현시키는 세포주에서 용량-의존적 방식으로 NF-kB 신호전달을 자극시킨 반면, 어느 수용체도 없는 세포에서는 아무런 효과가 없었다(HEK-null). K. 뮤린 포식세포 (RAW 264.7)를 그룹 A 분자 (HSPB4, HSPB5, 또는 β-결정체)와 인큐베이션하고, 실시간 RT-PCR에 의해 전-염증 사이토카인의 발현을 평가하였다. HSPB5는 물론 β-결정체도 포식세포를 활성화시키지 않은 반면, HSPB4는 포식세포에서 전-염증 사이토카인의 발현을 현저하게 유도하였다. 대조적으로, 열-처리된 HSPB4 (비등, 20분)는 배양액에서 포식세포를 활성화시키지 않았는데, 이는 발열원으로 오염되지 않은 HSPB4가 포식세포 활성화를 유도하였음을 나타낸다. TLR-2를 발현시키는 인간 배아 신장 세포 (HEK-TLR2)를 HSPB5 또는 β-결정체와 인큐베이션하고, NK-kB 신호전달의 활성화에 대해 평가하였다. HSPB5는 물론 β-결정체도 TLR2/NK-KB 신호전달을 활성화시키지 않았다. L. -2일 (손상 2일 전) 및 0일 (손상 직후)에 클로드로네이트-캡슐화 리포좀 (Cl2 MDP-LIP)의 결막하 주입에 의해 상주 포식세포를 고갈시킨 후 랫트 각막을 무균 손상시켰다. 미엘로퍼옥시다제에 대한 검정, 헤마톡실린-에오신 (H&E) 염색, 및 뉴트로필을 동정하기 위한 뉴트로필 엘라스타제에 대한 면역염색에 의해 뉴트로필 침윤에 대해 각막을 평가하였다. MPO에 의해 측정된 뉴트로필 침윤은 PBS-캡슐화 리포좀-주입 대조군 (PBS-LIP)에 비해 클로드로네이트-캡슐화 리포좀의 주입에 의해 손상시킨 지 24시간 후에 각막에서 현저하게 감소되었다. 염증 세포 및 뉴트로필의 침윤은 또한 포식세포-고갈 각막에서 현저하게 감소되었다.
도 35. TSG-6은 포식세포에서 CD44-의존적 방식으로 HSPB4-유도 활성화를 억제하였다. A, B. TSG-6은 용량 의존적 방식으로 HSPB4에 의한 포식세포의 활성화를 억제하였다. C, D. TSG-6은 CD44를 발현시키지 않는 HEK-TLR2 세포에서 NF-kB 신호전달의 HSPB4-매개 활성화를 억제하지 않았다. 그러나, 세포를 CD44를 발현하도록 트랜스펙션시킨 후에, TSG-6은 용량 의존적으로 NF-kB 신호전달의 HSPB4-매개 활성화를 억제하였다. E. TSG-6은 야생형 C57BL/6 마우스의 각막에서 염증을 현저하게 억제하였으나, CD44 녹아웃 마우스의 각막에서 염증을 억제하지 않았다. F. 뮤린 포식세포 (RAW 264.7)를 세크레토뉴린과 인큐베이션하고, 실시간 RT-PCR에 의해 전-염증 사이토카인의 발현에 대해 평가하였다. 세크레토뉴린은 포식세포를 활성화시키지 않았다. 인간 각막세포를 세크레토뉴린 또는 HSPB4와 함께 배양하였다. 세크레토뉴린은 물론 HSPB4도 사이토카인을 생산하기 위해 각막세포를 활성화시키지 않았다.
도 36. 각막에서 무균 염증의 개략적 도식. 손상 직후에, SN이 각막에서 신경 끝으로부터 방출되고, 순환 뉴트로필이 동원됨으로써 I 상 염증 반응을 유도하였다. 산화 스트레스를 포함하는 손상에 반응하여, 괴사 또는 손상 각막세포가 HSPB4를 분비시킨다. HSPB4는 TLR2/NF-kB 신호전달 경로를 통해 각막에서 상주 포식세포를 활성화시켜 IL-1 및 IL-6을 포함하는 전-염증 사이토카인을 생산한다. 이러한 손상 신호는 급속하게 전파되며 각막세포 활성화에 의해 증폭되어 II 상의 뉴트로필 침윤을 유도하는 케모카인을 생산한다. TSG-6은 TLR2/CD44/NF-kB 신호전달을 통해 포식세포 활성화의 초기 단계를 억제함에 의해 뉴트로필 침윤을 감소시켰다.
본 발명은 중간엽 간질 세포(MSC)와 같은 성체 줄기/전구 세포가 신규한 치료적 특성을 소유하고, 이에 따라 눈의 질환과 같은 요망되는 질환의 치료에 유용할 수 있다는 발견에 관한 것이다. 예를 들어, MSC를 이용하여 각막의 비감염성 염증 질환을 포함하나 이로 제한되지 않는 질환을 치료할 수 있다. 이는 본 발명의 MSC가 항-염증 단백질, 항-아폽토틱 단백질, 조혈작용을 조적하는 단백질, 암세포를 사멸시키는 단백질, 면역 반응을 조절하는 단백질, 세포의 귀소(homing)를 조절하는 단백질, 세포 부착 및 세포 신호전달에 관여하는 단백질, 혈관형성을 향상시키는 단백질 등의 발현을 포함하나 이로 제한되지 않는 치료적 특성을 소유하도록 조작될 수 있기 때문이다. 본 발명은 MSC가, 손상된 조직으로부터의 신호에 반응하여 생산된 재조합 치료적 단백질 MSC의 안구내 주입을 이용하여 각막의 염증 질환 및 눈의 그 밖의 질환 또는 질병을 치료하는데 이용될 수 있다는 발견에 기반한다. 이러한 요법은 랫트의 각막에 대한 화학적 화상 후에, MSC 또는 MSC로부터의 조건화된 배지의 적용이 염증 및 혈관재형성을 감소시켰다는 발견에 기반한다. 또 다른 비제한적인 구체예에서, 활성화된 MSC에 의해 생산된 하나 이상의 치료적 단백질, 예컨대 항염증 단백질 TSG-6 및 이의 생물학적 활성 단편 또는 유사체 및/또는 항-아폽토틱 단백질 STC-1 및 이의 생물학적 활성 단편 또는 유사체의 적용에 의해 각막의 염증 및 혈관재형성이 감소될 수 있고, 눈의 그 밖의 질환 또는 질병이 치료될 수 있다.
따라서, 본 발명의 양태에 따라, 환자의 눈의 질환 또는 질병을 치료 또는 예방하는 방법이 제공된다. 상기 방법은, 증가량의 하나 이상의 항-아폽토틱 단백질 및/또는 항-염증 단백질을 발현하는 조건하에 배양되지 않은 다른 동일한 집단의 중간엽 줄기 세포에 의해 발현된 하나 이상의 항-아폽토틱 단백질 및/또는 항-염증 단백질의 양에 비해, 항-아폽토틱 단백질 및 항-염증 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 증가량의 하나 이상의 단백질을 발현하는 조건하에 배양된 중간엽 줄기 세포를 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 중간엽 줄기 세포는 환자에서의 눈의 질환 또는 질병을 치료 또는 예방하기에 효과적인 양으로 투여된다.
비제한적인 구체예에서, 하나 이상의 단백질은 항-아폽토틱 단백질이다. 또 다른 비제한적인 구체예에서, 하나 이상의 항-아폽토틱 단백질은 스타니오칼신-1 (STC-1) 및 스타니오칼신-2 (STC-2) 및 이들의 생물학적 활성 단편 또는 유사체로 구성된 군으로부터 선택된다. 여전히 또 다른 비제한적인 구체예에서, 하나 이상의 항-아폽토틱 단백질은 STC-1 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 유사체이다. 또 다른 비제한적인 구체예에서, 하나 이상의 단백질은 항-염증 단백질이다. 여전히 또 다른 비제한적인 구쳉예에서, 항-염증 단백질은 TSG-6 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 유사체이다.
또 다른 비제한적인 구체예에서, 하나 이상의 항-염증 단백질은 비제한적으로 STC-1 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 유사체를 포함하는 항-아폽토틱 단백질일 수 있다. 본 구체예의 범위가 어떠한 이론적 근거로 제한되어서는 안 되나, 미해결 염증은 부분적으로 활성 산소종 또는 ROS의 증가에 의해 야기될 수 있다. STC-1은, ROS를 감소시키는데 있어서 미토콘드리아를 더욱 효율적이게 하는 커플링되지 않은 단백질-2의 발현을 증가시킴에 의해 활성 산소종을 감소시킨다는 것이 최근에 밝혀졌다. 따라서, STC-1과 같은 항-아폽토틱 단백질, 및 본 발명의 MSC를 포함하는 하나 이상의 항-아폽토틱 단백질을 발현시키는 세포는 본원에 언급된 눈의 질환 및 질병에서 ROS 및 미해결 염증을 감소시키는데 유용할 수 있다. 따라서, 본원에서 언급된 그러한 항-아폽토틱 단백질 및 세포가 또한 항염증제일 뿐 아니라 항-아폽토틱제일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 항-아폽토틱 단백질 및 항-염증 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 환자에서의 눈의 질환 또는 질병을 치료 또는 예방하기에 효과적인 양으로 환자에게 투여함에 의해, 환자에서 눈의 질환 또는 질병을 치료 또는 예방하는 방법이 제공된다.
비제한적인 구체예에서, 하나 이상의 단백질은 항-아폽토틱 단백질이다. 또 다른 비제한적인 구체예에서, 항-아폽토틱 단백질은 STC-1 또는 STC-2 또는 이들의 생물학적 활성 단편 또는 유사체이다. 여전히 또 다른 비제한적인 구체예에서, 항-아폽토틱 단백질은 STC-1 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 유사체이다.
또 다른 비제한적인 구체예에서, 하나 이상의 단백질은 항-염증 단백질이다. 또 다른 비제한적인 구체예에서, 항-염증 단백질은 TSG-6 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 유사체이다. 본 발명은 단지 각막의 질환을 치료하는데 국한되어서는 안 되며, 황반 변성(macular degeneration)을 포함하나 이로 제한되지 않는 망막 또는 황반의 질환과 같은 눈과 관련된 어떠한 질환에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명은 눈 조직의 염증 또는 변성과 관련된 눈의 질병, 질환, 또는 상태를 치료하는데 유용하다.
정의
본원에서 사용된 대로, 하기 용어들 각각은 이러한 섹션에서 이와 관련된 의미를 갖는다.
단수를 나타내는 표현은 하나 또는 하나를 초과하는 (즉, 적어도 1개) 표현의 문법적 대상을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 예로서, "엘리먼트"는 하나의 엘리먼트 또는 하나를 초과하는 엘리먼트를 의미한다.
용어 "약"은 당업자에 의해 이해될 것이고, 이것이 사용된 문맥상에서 어느 정도로 변경될 것이다.
본원에서 사용된 용어 "자가(autologous)"는 어떠한 물질이 이후에 재도입되는 개체와 동일한 개체로부터 유래된 물질임을 지칭하기 위한 것이다.
본원에서 사용된 용어 "생체적합한 격자(biocompatible lattice)"는 조직 발생에 기여하는 3차원 구조로의 형성을 촉진할 수 있는 기질을 지칭하기 위한 것이다. 따라서, 예를 들어, 세포가 세포외 매트릭스 물질, 합성 중합체, 사이토카인, 성장 인자 등을 포함하는 것과 같이, 그러한 생체적합한 격자 상에서 배양되거나 시딩될 수 있다. 격자는 조직 타입의 발생을 촉진시키는 요망되는 형상으로 몰딩될 수 있다. 또한, 세포의 배양 동안 적어도 초기 단계에, 배지 및/또는 기질에 적절한 조직 타입 및 구조의 발생을 촉진시키는 요소들 (예컨대, 성장 인자, 사이토카인, 세포외 매트릭스 물질 등)이 보충된다.
본원에서 사용된 용어 "골수 간질 세포", "간질 세포", "중간엽 줄기 세포", "중간엽 간질 세포" 또는 "MSC"는 상호교환적으로 이용되며, 골수 (Prockop, 1997에서 검토됨), 말초혈 (Kuznetsov et al., 2001), 지방 세포 (Guilak et al., 2004), 탯줄혈 (Rosada et al., 2003), 윤활막 (De Bari et al., 2001), 및 치주 인대 (Seo et al., 2005), 배아 난황 주머니, 태반, 탯줄, 피부, 및 혈액 (U.S. Patent No. 5,486,359 and 7,153,500), 지방, 및 윤활액으로부터 유래된 세포를 지칭한다. MSC는 플라스틱 조직 배양 표면에 부착하는 이의 능력 (Friedenstein et al.; reviewed in Owen & Friedenstein, 1988)과 조혈 줄기 세포를 위한 효과적인 공급층 (Eaves et al., 2001)이 되는 것이 특징이다. 또한, MSC는 배양액과 생체내 둘 모두에서 골모세포 및 연골세포, 지방세포, 근육 세포 (Wakitani et al., 1995) 및 심근세포 (Fukuda and Yuasa, 2006), 신경 전구체 (Woodbury et al., 2000; Deng et al., 2001, Kim et al., 2006; Marcsehi et al., 2006; Krampera et al., 2007)로 분화될 수 있다. 중간엽 줄기 세포 (MSC)는 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 정제될 수 있고 (Wakitani et al., 1995; Fukuda and Yuasa, 2006; Woodbury et al., 2000; Deng et al., 2001; Kim et al., 2006; Mareschi et al., 2006; Krampera et al., 2007), 뼈, 연골, 인대, 힘줄, 지방, 근육, 심장 조직, 간질, 진피, 및 다른 결합 조직 (See U.S. Patent Nos. 6,387,369 and 7,101 ,704)을 포함하는 중간엽 세포 계통에 대한 전구체로서 기능한다. 중간엽 줄기 세포 (MSC)는 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 정제될 수 있다 (Wakitami, et al., 1995; Fukuda and Yuasa, 2006; Woodbury, et al., 2000; Deng, et al., 2001; Kim, et al., 2006; Mareschi, et al., 2006, Krampera, et al., 2007).
본원에서 사용된 용어 "조절한다"는 생물학적 상태에서의 어떠한 변화, 즉, 증가, 감소 등을 나타내고자 한다.
용어 "전구 세포(precursor cell)", "전구 세포(progenitor cell)" 및 "줄기 세포"는 당 분야 및 본원에서 상호교환적으로 사용되고 자체적으로 재생하거나 요망되는 세포 타입으로 분화될 자손 세포를 생산하기 위해 잠재적으로 무한한 수로 유사 분열할 수 있는 다능성, 또는 직계-언커미티드 전구 세포를 지칭한다. 다능성 줄기 세포와 달리, 직계-커미티드 세포는 일반적으로 표현형적으로 서로 상이한 다수의 세포 타입을 생성할 수 없는 것으로 고려된다. 대신, 선조 세포는 하나 또는 가능하게는 두 개의 직계-커미티드 세포 타입을 발생시킨다.
"안구 영역" 또는 "안구 부위"는 눈의 전방 및 후방 세그먼트를 포함하고, 일반적으로 안구에서 발견되는 어떠한 기능적 (예컨대, 시력을 위해) 또는 구조적 조직, 또는 안구의 내부 또는 외부를 부분적으로 또는 완전히 라이닝하는 조직 또는 세포층을 비제한적으로 포함하는 안구의 어떠한 영역을 의미한다. 안구 영역에서 안구의 영역의 특수한 예는 앞방, 후방, 유리체강, 맥락막, 맥락막위 공간, 결막, 결막하 공간, 공막외 공간, 각막내 공간, 각막외 공간, 공막, 편평부분, 수술로 유도된 무혈관 영역, 황반, 및 망막을 포함하나 이로 제한되지 않는다.
"안구 질환"은 눈 또는 눈의 일부나 영역들 중 하나에 영향을 주거나 이와 관련된 질환, 병 또는 상태를 의미한다. 대체로 말하면, 눈은 각막을 포함하는 안구, 및 안구, 눈주위 근육 (예컨대 경사근 및 곧은근) 및 안구내 또는 안구에 인접한 시신경의 일부를 구성하는 다른 조직 및 유체를 포함한다.
"이식편"은 이식을 위한 세포, 조직, 기관, 또는 다른 어떠한 생물학적으로 적합한 격자를 지칭한다.
"녹내장"은 일차, 이차 및/또는 선천 녹내장을 의미한다. 일차 녹내장은 개방각 및 폐쇄각 녹내장을 포함할 수 있다. 이차 녹내장은 손상, 염증, 혈관 질환 및 당뇨병과 같은 다양한 다른 상태의 합병증으로서 발생할 수 있다. 녹내장의 증가압은, 이것이 눈으로 들어가는 시신경을 손상시키므로 실명을 야기한다. 따라서, 비제한적인 일 구체예에서, 활성 산소종을 저하시킴에 의해, STC-1, 또는 증가량의 STC-1을 발현시키는 MSC를 녹내장의 치료 및 실명의 개시를 예방 또는 지연시키는데 이용할 수 있다. 안구 질환과 관련하여 "염증-매개"는 항-염증제를 이용한 치료로부터 이익을 얻을 수 있는 눈의 어떠한 질환을 의미하고, 비제한적으로 포도막염(uveitis), 황반 부종(macular edema), 급성 황반 변성(acute macular degeneration), 망막 박리(retinal detachment), 안구 종양(ocular tumors), 진균 또는 바이러스 감염(fungal or viral infection), 다초점 맥락막염(multifocal choroiditis), 당뇨 포도막염(diabetic uveitis), 증식 유리체망막병증(proliferative vitreoretinopathy)(PVR), 교감 눈염증(sympathetic ophthalmia), 포그트-고야나기-하라다 증후군(Vogt Koyanagi-Harada (VKH) syndrome), 히스토플라스마증(histoplasmosis), 및 포도막 확산(uveal diffusion)을 포함한다.
"상해" 또는 "손상"은 상호교환적일 수 있고, 예를 들어 염증과 같은 염증-매개 질환으로부터 초래된 세포 및 형태 소견 및 징후뿐 아니라, 화학적 화상을 포함하는 화학적 손상과 같은, 염증 이외의 방법으로 야기된 조직 손상 및 비제한적으로 박테리아, 바이러스, 또는 진균 감염을 포함하는, 감염에 의해 야기된 손상을 지칭한다.
"안구내"는 안구 조직내 또는 안구 조직의 안을 의미한다. 약물 전달 시스템의 안구내 투여는 힘줄-하, 결막하, 맥락막위, 유리체내 등의 위치로의 약물 전달 시스템의 투여를 포함한다. 약물 전달 시스템의 안구내 투여는 국소, 전신, 근내, 피하, 복막내 등의 의치로의 약물 전달 시스템의 투여를 배제시킨다.
"황반 변성 관련 질환"은 황반을 변성시키거나 기능적 활성을 소실시키는 다수의 어떠한 질병 및 질환을 지칭한다. 변성 또는 기능적 활성의 상실은, 예를 들어 세포 사멸, 감소된 세포 증식, 정상적인(nonnal) 생물학적 기능의 상실, 또는 상기의 조합의 결과로서 일어날 수 있다. 황반 변성은 황반의 세포 및/또는 세포외 매트릭스의 구조적 통합성에서의 변경, 정상 세포 및/또는 세포외 매트릭스 구조의 변경, 및/또는 황반 세포의 기능 상실로서 초래되고/거나 나타날 수 있다. 세포는 RPE 세포, 광수용체, 및 모세관 내피 세포를 포함하는 황반 또는 황반 근처에 보통 존재하는 어떠한 세포 타입일 수 있다. 노인 황반 변성, 또는 ARMD는 주요 황반 변성 관련 질환이지만, 비제한적으로 베스트 황반 이영양증(Best macular dystrophy), 솔스비 안저 이영양증(Sorsby fundus dystrophy), 말라티아 레벤티네스(Mallatia Leventinese) 및 도인 허니콤 망막 이영양증(Doyne honeycomb retinal dystrophy)을 포함하는 그 밖의 다수가 공지되어 있다.
"안구 혈관신생" (ONV)은 맥락막 혈관신생 또는 망막 혈관 혈관신생, 또는 둘 모두를 지칭하기 위해 본원에서 이용된다.
"망막 혈관신생" (RNV)은, 예컨대 망막 표면 상에서 망막 혈관의 비정상적 발생, 증식, 및/또는 성장을 지칭한다.
"각막"은 눈의 안구섬유층의 전방부를 형성하는 투명한 구조를 지칭한다. 이것은 특히 1) 결막에 연속적인 전방 각막 상피; 2) 앞제한층 (보우만막); 3) 고유질, 또는 간질층; 4) 후제한층 (데스메막); 및 5) 전방의 내피 또는 각피의 5개 층으로 구성된다.
"망막"은 유리체를 둘러싸서 시신경을 따라 뒤로 연속하는, 안구의 3개 층들 중 최내층을 지칭한다. 이것은 맥락막 상에 있는 시부, 섬모체 상에 있는 모양체부, 및 홍채의 후방 표면 상에 있는 홍채부로 나뉜다. 총체적으로, 망막은 외부 색소침착층 (색소부) 및 내부 투명층 (신경부)을 포함하는데, 이들은 함께 시부를 구성한다. 눈의 시각 부분은 안에서 바깥쪽으로 1) 내경계막; 2) 신경 섬유층; 3) 신경절 세포의 층; 4) 내부 망상층; 5) 내부 핵층; 6) 외부 망상층; 7) 외부 핵층; 8) 외경계막; 및 9) 망막간체 및 추체세포의 층으로서 명명된 9개 층으로 구성된다.
"동종이형"은 동일한 종의 상이한 동물로부터 유래된 이식편을 지칭한다.
"이종발생성"은 상이한 종의 동물로부터 유래된 이식편을 지칭한다.
"이식체"는 이식하려는 생체적합한 격자 또는 공여자 조직, 기관 또는 세포를 지칭한다. 이식체의 예는 피부 세포 또는 조직, 골수, 및 심장, 췌장, 신장, 폐 및 간과 같은 고형 장기를 포함할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 바람직하게는 이식체가 인간 신경 줄기 세포이다.
본원에서 정의된 "동종이형 골수 간질 세포 (BMSC)"는 수용체와 같은 종의 상이한 개체로부터 수득된다.
"공여자 항원"은 수용체로 이식된 공여자 조직에 의해 발현되는 항원을 지칭한다.
"동종항원"은 수용체에 의해 발현된 항원과 상이한 항원이다.
본원에서 사용된 "이펙터 세포"는 항원에 대한 면역 반응을 매개하는 세포를 지칭한다. 이식체가 수용체에 도입된 상황에서, 이펙터 세포는 공여자 이식체에 존재하는 항원에 대한 면역 반응을 유도하는 수용체 자신의 세포일 수 있다. 또 다른 상황에서, 이펙터 세포는 이식체의 일부일 수 있어서, 수용체로의 이식체의 도입은 이식체의 수용체에 대해 면역 반응을 유도하는 이식체에 존재하는 이펙터 세포를 초래한다.
본원에서 사용된 "치료적 유효량"은 작용제가 투여된 피검체에게 이로운 효과를 제공하기에 충분한 작용제의 양이다.
본원에서 사용된 "내인성"은 유기체, 세포 또는 시스템으로부터의 어떠한 물질 또는 이들 내부에서 생산된 어떠한 물질을 지칭한다.
"외인성"은 유기체, 세포 또는 시스템으로부터 도입된 어떠한 물질 또는 이들 외부에서 생산된 어떠한 물질을 지칭한다.
"엔코딩"은 뉴클레오티드의 지정 서열 (즉, rRNA, tRMA 및 mRNA) 또는 아미노산의 지정 서열을 갖는 생물학적 과정에서 다른 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 주형으로서 기능하기 위한, 유전자, cDNA 또는 mRNA와 같은 폴리뉴클레오티드에서 뉴클레오티드의 특수한 서열의 고유 특성 및 그로부터 초래된 생물학적 성질을 지칭한다. 따라서, 유전자는 그 유전자에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질을 생산하는 경우, 단백질을 엔코딩하는 것이다. 두 개 모두의 코딩 가닥에서, 이의 뉴클레오티드 서열은 mRNA 서열과 동일하고 일반적으로 서열 목록으로 제공되며, 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로서 이용되는 비-코딩 가닥은 단백질 또는 그 유전자 또는 cDNA의 다른 생성물을 엔코딩한다고 언급될 수 있다.
달리 지시되지 않는 한, "아미노산 서열을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열"은 서로의 변성 형태이고 동일한 아미노산 서열을 엔코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단백질 및 RNA를 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열은 인트론을 포함할 수 있다.
"단리된 핵산"은 천연 발생 상태에서 이것에 플랭킹된 서열로부터 분리된 핵산 세그먼트 또는 단편을 지칭하며, 예컨대 보통은 단편에 인접한 서열, 예컨대 이것이 천연적으로 발생하는 유전체에서 단편에 인접한 서열로부터 제거된 DNA 단편을 지칭한다. 상기 용어는 또한 천연적으로 핵산에 수반되는 다른 성분들, 예컨대 세포에서 핵산에 천연적으로 수반되는 RNA 또는 DNA 또는 단백질로부터 실질적으로 정제된 핵산에 적용된다. 따라서, 상기 용어는, 예를 들어 벡터, 자가 복제하는 플라스미드 또는 바이러스, 또는 원핵생물 또는 진핵생물의 유전체 DNA로 혼입되거나, 다른 서열과 무관하게 분리된 분자로서 (예컨대, PCR 또는 제한 효소 분해에 의해 생산된 cDNA 또는 유전체 또는 cDNA 단편으로서) 존재하는 재조합 DNA를 포함한다. 이것은 또한 추가의 폴리펩티드 서열을 엔코딩하는 하이브리드 유전자의 일부인 재조합 DNA를 포함한다.
본 발명의 문맥에서, 흔하게 발생하는 핵산 염기에 대해 하기 약어를 이용한다. "A"는 아데노신을 나타내고, "C"는 시토신을 나타내며, "G"는 구아노신을 나타내고, "T"는 티미딘을 나타내며, "U"는 우리딘을 나타낸다.
"벡터"는 단리된 핵산을 포함하고 단리된 핵산을 세포의 내부로 전달하는데 이용될 수 있는 물질의 조성물이다. 다수의 벡터가 당 분야에 공지되어 있고, 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 친양쪽성 화합물과 관련된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 및 바이러스를 포함하나 이로 제한되지 않는다. 따라서, 용어 "벡터"는 자가 복제하는 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 상기 용어는 세포로의 핵산의 이동을 촉진하는 화합물, 예를 들어 폴리리신 화합물, 리포좀 등의 비-플라스미드 및 비바이러스 화합물을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 바이러스 벡터의 예는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 등을 포함하나 이로 제한되지 않는다.
"발현 벡터"는 발현시키려는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 발현 대조 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 발현에 충분한 시스-작용성 엘리먼트를 포함한다; 발현을 위한 다른 엘리먼트가 숙주 세포에 의해 또는 시험관내 발현 시스템에서 공급될 수 있다. 발현 벡터는 코스미드, 플라스미드 (예컨대, 네이키드 또는 리포좀에 함유됨) 및 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스와 같이 당 분야에 공지된 모든 것들을 포함한다.
설명
본 발명은 MSC가 항-염증 단백질의 경우, TSG-6 및 항-아폽토틱 단백질의 경우, STC-1과 같은 일련의 치료적 유전자를 높은 수준으로 발현시킨다는 발견에 관한 것이다. MSC는 각막의 비감염성 염증 질환, 고안압(ocular hypertension), 안구건조증(dry eye syndrome), 황반 변성, 및 망막 변성 질병 또는 질환을 포함하나 이로 제한되지 않는 안구 질환에서 항-염증 치료제로서 유용하다.
본 발명은 포유동물의 눈에서 염증을 감소 또는 억제시키고/거나 포유동물의 눈에서 손상된 조직을 복구하거나 치유하기에 효과적인 양의 MSC를 이용하여 포유동물을 치료함에 의해 포유동물에서 염증 반응을 감소 및/또는 제거하는 방법 및 조성물을 포함한다. 비제한적인 일 구체예에서, 손상 부위로 높은 수준의 치료적 단백질을 발현시키기 위해 배양액에서 미리 활성화된 MSC의 국소 적용이 손상을 치료하는데 유용하다. 또 다른 비제한적인 구체예에서, 미리-활성화된 MSC로부터 분비된 치료적 단백질을 손상 부위에 국소적으로 투여한다. 여전히 또 다른 비제한적인 구체예에서, MSC에 의해 분비된 바람직한 단백질에 상응하거나 이를 모방한 재조합 단백질 또는 합성 또는 정제된 단백질을 손상 부위에 투여할 수 있다.
비제한적인 일 구체예에서, MSC로부터 분비된 하나 이상의 치료적 단백질 또는 치료적 단백질의 재조합, 합성 또는 정제된 버젼을 안구내 투여 방식에 의해 포유동물에게 투여한다. 예를 들어, 비제한적인 구체예에서, MSC 또는 단백질을 유리체내 투여할 수 있다.
본 발명은 MSC로부터 유래되거나 MSC에 의해 발현된 유효량의 치료적 단백질 또는 재조합 버젼 또는 이의 합성되거나 정제된 버젼, 예컨대 생물학적 활성 단편 또는 유사체를 포함하는 TSG-6, 생물학적 활성 단편 또는 유사체를 포함하는 STC-1, 또는 이들의 조합물을 포유동물에게 안구내 주입시키는 것을 포함하는, 안구 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 그러나, 본 발명이 TSG-6 및 STC-1만으로 제한되어서는 안 된다. 오히려, MSC에 의해 분비된 임의의 치료적 단백질을 포유동물에서 안구 질환을 치료하는 본 발명에 적용시킬 수 있다. 예를 들어, MSC는 높은 생존력을 나타내고 치료적 단백질의 일련의 유전자를 높은 수준으로 발현시킨다: 항-염증 단백질의 경우, TSG-6; 항-아폽토틱 단백질의 경우, STC-1; 세포 성장 및 발생을 조절하는 단백질의 경우, LIF; 조혈작용을 조절하는 단백질의 경우, IL-11; 일부 암세포를 사멸시키고 면역 반응을 조절하는 단백질의 경우, TNFSFIO (TRAIL로도 알려짐); 일부 암세포를 사멸시키는 단백질의 경우, IL-24; 세포의 귀소를 조절하는 단백질의 경우, CXCR4; 세포 부착 및 세포 신호전달에 관여하는 단백질의 경우, ITGA2 (인테그린 α2로도 알려짐); 및 혈관형성을 향상시키는 단백질의 경우, IL-8.
안구 손상
(A) 이물질
모든 안구 손상의 25%는 각막 표면에서의 이물질과 관련된다. 손상이 각막 상피에만 영향을 주는 경우 흉터가 생기지 않을 것이나, 이것이 보우만 영역에도 영향을 주는 경우, 흉터가 생길 수 있다. 이물질의 제거 후에, 눈을 설폰아미드 또는 항생제로 치료하고, 섬모체 울혈 및 눈부심이 있는 경우나 이물질의 제거가 어려운 경우에는, 5% 호마트로핀과 같은 조절마비제로 치료한다. 일부 경우에, 본 발명의 치료적 조성물은 이물질에 의해 야기된 손상의 치유를 가속시키고 감염을 예방하고, 임상 결과를 개선시키도록 설계된다.
(B) 화학적 화상
화학적 화상은 눈을 유체로 플러싱하여 먼저 화학물질을 희석시킨 다음, 국소 항생제의 사용으로 감염을 예방함에 의해 치료된다.
안압은 티몰롤, 에피네프린, 아세타졸라미드, 또는 그 밖의 유사한 작용제를 적용시킴으로서 감소될 수 있다. 1주일 후에 각막의 상피화가 불완전한 경우, 감염의 위험 외에 간질 괴사의 위험이 있다. 따라서, 이러한 위험을 감소시키기 위해 치료를 빨리 하는 것이 중요하다.
심한 흉터는 화학적 화상의 또 다른 공통적인 결과이다. 본 발명의 치료적 조성물은 화학적 화상에 의해 야기된 각막 미란의 치유를 가속시키고, 눈의 간질 괴사 및 감염을 예방하고, 각막 흉터를 감소시킴으로써 각막 투명도를 회복/보존하도록 설계된다.
예상치 못하게도, 본 발명의 조성물은 안구 치유를 향상시키고, 상처 회복 및 각막 투명도를 유지하는 동시에 흉터 형성을 예방하거나 감소시킬 수 있다. 어떠한 특수한 작용 메카니즘에 의해 구속시키고자 하는 것은 아니지만, 이러한 이로운 효과가 본 조성물의 항-염증 작용으로 인해 수득될 수 있는 것으로 보인다. 일부 예에서, 이로운 효과는 본 발명의 조성물의 항-염증 및 항-아폽토틱 작용의 조합에 의해 수득될 수 있다.
(C) 열상
각막의 열상 이후에 상처를 닫는 홍채의 탈출이 따라온다. 모든 눈 손상에서와 같이, 감염의 위험이 있다. 열상은 또한 공막으로 확대될 수 있는데, 이것은 훨씬 더 심각한 손상이다. 그러한 경우, 손상된 부위로부터 탈출 포도막 조직을 제거하는 수술이 요구되며, 공막은 봉합으로 닫힌다. 본 발명의 치료적 조성물은 열상의 치유를 가속시키고 감염을 예방하도록 설계된다.
(D) 외상, 독성, 결핍, 및 선천성 시신경병증
시신경병증은 시신경에 영향을 주며, 이는 시력에 좋지 않은 영향을 줄 수 있다. 외상 시신경병증은 두부를 공과 같은 물체로 맞았을 때, 또는 탄알과 같은 물체가 관통했을 때 야기될 수 있다. 독성 시신경병증은 시신경에 유독한 화학물질에 의해 야기된다; 일반적인 예는 메탄올 섭취이다. 결핍 시신경병증은 B12 결핍과 같은 비타민 결핍으로부터 초래될 수 있고, 시신경에 병변을 야기할 수 있다. 선천성 시신경병증은 핵 또는 미토콘드리아 유전체의 돌연변이에 의해 야기될 수 있다. 본 발명의 치료적 및 예방적 화합물을 이용하여 시신경을 치유하고 비타민 결핍을 바로잡을 수 있었다. 이들은 또한 시신경 세포 유전체에서 돌연변이를 감소시키거나 예방하는 환경을 생성할 수 있다.
(E) 염증 질환
본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있는 눈의 염증-매개 질환은 포도막염, 황반 부종, 급성 황반 변성, 망막 박리, 안구 종양, 진균 또는 바이러스 감염, 다초점 맥락막염, 당뇨 포도막염, 증식 유리체망막병증(PVR), 교감 눈염증, 포그트-고야나기-하라다 증후군(VKH), 히스토플라스마증, 및 포도막 확산을 포함하나 이로 제한되지 않는다. 비제한적인 구체예에서, 눈의 염증-매개 질환은 포도막염이다. 또 다른 비제한적인 구체예에서, 눈의 염증-매개 질환은 증식 유리체망막병증(PVR)이다.
미세구의 현탁액을 눈의 항-염증 요법제로서, 특히 눈부속기관, 눈꺼풀 또는 안구 결막, 각막 및 안구의 전방 세그먼트의 염증 질환을 치료하는데 이용할 수 있다. 미세구의 항-염증 현탁액에 대한 일반적인 치료적 적응증은 바이러스, 알레르기 결막염, 여드름 장미증(acne rosacea), 홍채염(iritis) 및 홍채섬모체염(iridocyclitis)을 포함한다. 미세구는 또한 화학적 또는 열화상 또는 이물질의 침투로 인한 각막 손상과 관련된 염증을 개선하는데 이용될 수 있다. 그러한 질환은 눈에 대한 수술, 손상, 알레르기 또는 감염으로부터 초래될 수 있고 심각한 불편을 야기할 수 있다.
현저하게, 미세구는 널리 행해지는 NSAI 작용제 및 코르코스테로이드의 국소 안구 이용에 비해, 염증 반응을 감소시키는데 있어서 현저한 치료적 이익을 갖는다. 국소 스테로이드의 이용은 후낭하백내장(posterior subcapsular cataract) 형성, 안압 상승, 이차 안구 감염, 각막 상처 치유의 지연, 포도막염, 동공확대, 일시적 눈의 불편 및 안검하수를 포함하는 다수의 합병증과 관련된다. 다수의 전신 합병증이 또한 코르티코스테로이드의 국소 안구 적용으로부터 발생할 수 있다. 이러한 합병증은 부신부전(adrenal insufficiency), 쿠싱 증후군(Cushing's syndrome), 소화 궤양(peptic ulceration), 골다공증(osteoporosis), 고혈압(hypertension), 근무력 또는 위축(muscle weakness or atrophy), 성장 억제, 당뇨병(diabete), 감염 활성화, 기분 변화 및 상처 치유의 지연을 포함한다.
(F) 눈 수술 적용
본 발명에 따른 미세구의 조성물은 또한 눈 수술과 관련된 염증을 개선하는데 이용될 수 있고, 이에 관해 예방 양상뿐 아니라 상기 설명된 흉터의 치료 및 감소를 촉진하는데 특히 유용하다.
본 발명의 조성물은 섬유주절제술 후 (여과 수술); 군날개 수술 후; 눈부속기관 외상 및 수술 후; 안구내 수술 후 및 특히 유리체절제술 후, 망막 박리 후 및 망막절개술(retinotomylectomy) 후에 이용하기에 특히 적합하다.
당업자는 이러한 것들이 널리 행해지는 본 발명의 조성물 및 방법이 유용한 수술 절차의 비제한적인 예를 나타내기 위한 것임을 이해할 것이다.
미리-활성화됨
본원에 제공된 설명에 기반하여, MSC는 어떠한 공급원에서도 수득될 수 있다. MSC는 수용체에 관해 동종이거나 (동일한 숙주로부터 수득) 수용체에 관해 동종이형일 수 있다. 또한, MSC는 수용체에 이종발생성 (상이한 종의 동물로부터 수득)일 수 있고, 예를 들어 랫트 MSC를 인간에서 염증을 억제하는데 이용할 수 있다.
추가의 비제한적인 구체예에서, 본 발명에서 이용된 MSC를 비제한적으로 인간, 마우스, 랫트, 원숭이, 긴팔원숭이, 소를 포함하는 임의의 종의 포유동물의 골수로부터 단리시킬 수 있다. 비제한적인 구체예에서, MSC는 인간, 마우스, 또는 랫트로부터 단리된다. 또 다른 비제한적인 구체예에서, MSC는 인간으로부터 단리된다.
본 설명에 기반하여, MSC는 MSC가 구상체의 응집 및 형성을 촉진하는 방식으로 배양되는 한, 본원에 기재된 방법에 사용되는 충분한 수의 세포를 수득하기 위해 단리되고 시험관내 배양액에서 증량된다. 예를 들어, MSC는 인간 골수로부터 단리되고 완전 배지 (4 mM L-글루타민, 10% FBS, 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 DMEM 저 글루코스)에서 현적 배양 또는 비-부착 디시에서 배양될 수 있다. 그러나, 본 발명은 결코 배지를 단리시키고 배양하는 어느 한 가지 방법으로 제한되는 것으로 해석되지 않는다. 오히려, MSC가 구상체의 응집 및 형성을 촉진시키는 방식으로 배양되는 한, 배지를 단리시키고 배양하는 임의의 방법이 본 발명에 포함되는 것으로 고려되어야 한다.
시험관내 MSC를 지지할 수 있는 임의의 배지를 MSC를 배양하는데 이용할 수 있다. MSC의 성장을 지지할 수 있는 배지 제형은 둘베코의 변형된 이글 배지 (DMEM), 알파 변형된 최소 필수 배지 (αMEM), 및 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트 배지 1640 (RPMI Media 1640) 등을 포함하나 이로 제한되지 않는다. 전형적으로, 0 내지 20%의 우태아혈청 (FBS) 또는 1-20%의 말 혈청이 MSC의 성장을 지지하기 위해 상기 배지에 첨가된다. 그러나, 성장 인자, 사이토카인, 및 MSC를 배양하기 위해 필요한 호르몬이 배지에 적절한 농도로 제공되는 경우, 지정된 배지를 또한 이용할 수 있다. 본 발명의 방법에 유용한 배지는 MSC를 배양하는데 유용한 항생제, 분열촉진 또는 분화 화합물을 포함하나 이로 제한되지 않는 하나 이상의 관심 화합물을 함유할 수 있다. 세포는, 비제한적인 일 구체예에서, 27 내지 40℃의 온도, 또 다른 비제한적인 구체예에서 31 내지 37℃, 또 다른 비제한적인 구체예에서 가습 인큐베이터에서 성장할 수 있다. 이산화탄소 함량은 2% 내지 10%로 유지될 수 있고 산소 함량은 1% 내지 22%로 유지될 수 있으나; 본 발명은 결코 MSC를 단리시키고 배양하는 어느 한 가지 방법으로 제한되는 것으로 고려되어서는 안 된다. 오히려, MSC를 단리시키고 배양하는 임의의 방법이 본 발명에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
배지에 첨가될 수 있는 항생제는 페니실린 및 스트렙토마이신을 포함하나 이로 제한되지 않는다. 배양 배지 중 페니실린의 농도는 1 ml 당 약 10 내지 약 200 유닛이다. 배양 배지 중 스트렙토마이신의 농도는 1 ml 당 약 10 내지 약 200 ㎍이다.
비제한적인 구체예에서, 중간엽 줄기 세포는, 상기 지시된 대로, 구상체 응집물로의 중간엽 줄기 세포의 응집을 제공하고, 치료적 단백질(들)의 최적 발현을 제공하는 조건하에서 배양된다. 비제한적인 일 구체예에서, 중간엽 줄기 세포는 상기 지시된 치료적 단백질 중 하나 이상을 상향조절하기에 효과적인 양의 혈청을 포함하는, 예를 들어 완전 배양 배지 (CCM)와 같은 배지에서 배양된다. 예를 들어, 배지는 우태아혈청을 20% 이하의 양으로 포함할 수 있다. 비제한적인 구체예에서, 우태아혈청은 약 17%의 양으로 존재한다. 중간엽 줄기 세포를 추가 배양을 위한 충분한 수의 세포를 제공하기에 충분한 조건하에 충분한 시간 (예를 들어, 7 또는 8일) 동안 배양한다. 배양 배지는 상기 지시된 치료적 단백질 중 하나 이상을 상향조절하는 혈청 외에 또는 이에 추가하여 성장 인자를 포함할 수 있다.
비제한적인 일 구체예에서, 구상체는 MSC가 구상체로 자발적으로 응집하도록 박테리아 플레이트 (동물 세포를 배양하기 위해 처리된 플레이트와 별개임) 상에서 MSC를 배양함에 의해 제조될 수 있다 (Bartosh, 2010).
그 후, 세포를 세포의 구상체 응집물 형성을 촉진시키는 조건하에 배양시킨다. 비제한적인 일구체예에서, 세포를 현적으로서 배양한다. 세포의 각각의 드롭은 중간엽 줄기 세포를 하나 이상의 치료적 단백질의 최적 발현을 제공하는 양으로 함유한다. 비제한적인 구체예에서, 세포의 현적을, 20% 이하의 양으로 우태아혈청을 함유하는 완전 배양 배지와 같은 배지에서 배양시킨다. 비제한적인 구체예에서, 우태아혈청은 약 17%의 양으로 존재한다.
또 다른 비제한적인 구체예에서, 배양되는 중간엽 줄기 세포의 각각의 현적은 약 10,000 내지 약 500,000개 세포/드롭을 포함한다. 또 다른 비제한적인 구체예에서, 배양되는 중간엽 줄기 세포의 각각의 현적은 약 10,000 내지 약 250,000개 세포/드롭을 포함한다. 추가의 비제한적인 구체예에서, 세포의 각각의 현적은 약 10,000 내지 약 25,000개 세포/드롭을 포함한다. 여전히 또 다른 비제한적인 구체예에서, 세포의 각각의 현적은 약 25,000개/드롭을 포함한다. 중간엽 줄기 세포의 현적은 중간엽 줄기 세포의 구상체 응집물을 형성하기에 충분한 시간 동안 배양된다. 일반적으로, 세포의 드롭은 4일 이하의 기간 동안 배양된다.
일단 중간엽 줄기 세포의 구상체 응집물이 형성되면, 중간엽 줄기 세포는, 요망되는 경우, 예를 들어 트립신 및/또는 EDTA와 같은 분리제의 존재하에 구상체를 인큐베이션시킴에 의해 구상체로부터 분리될 수 있다.
본 발명은 안구의 질환을 치료하는데 효과적인 치료적 단백질을 발현시키기 위해 배양액에서 MSC의 처리를 포함한다. 예를 들어, MSC는 TNF-α의 존재하에 배양될 수 있다. 일부 예에서, MSC는 IFN-μγ의 존재하에 배양시킴에 의해 미리-활성화될 수 있다. 다른 예에서, MSC는 IL-lB의 존재하에 배양시킴에 의해 미리-활성화될 수 있다. 일부 예에서, MSC는 TNF-α, IFN-μ, 및 IL-lB의 임의의 조합물을 이용하여 미리-활성화될 수 있다. MSC의 미리-활성화는 치료적 단백질을 분비하는 세포를 유도한다. 따라서, MSC 자체, 분비된 단백질, 또는 둘 모두의 조합물은 치료적 조성물의 공급원을 제공한다. 일 구체예에서, 미리-활성화된 MSC로부터 분비된 치료적 단백질의 재조합 버젼을 치료적 조성물로서 이용할 수 있다.
일부 예에서, MSC를 MSC를 유도하는 작용제와 접촉시켜 배양 배지에서 치료적 단백질을 분비시킨다. 배양 배지는 일반적으로 기본 배지를 포함한다. 본 발명의 방법에 유용한 기본 배지의 비제한적인 예는 최소 필수 배지 이글, ADC-1, LPM (소혈청 알부민 없음), F1O(HAM), F12 (HAM), DCCM1 , DCCM2, RPMI 1640, BGJ 배지 (피톤-잭슨(Fitton-Jackson) 변형되고 변형되지 않음), 기본 배지 이글 (BME-얼(Earle)의 염 기재 첨가됨), 둘베코의 변형된 이글 배지 (DMEM-혈청 없음), 야먀네(Yamane), IMEM-20, 글래스고(Glasgow) 변형 이글 배지 (GMEM), 레보비츠(Leibovitz) L-15 배지, McCoy's 5A 배지, 배지 Ml99 (M199E-얼의 염 기재 첨가됨), 배지 M199 (M 199H-행크의 염 기재 첨가됨), 최소 필수 배지 이글 (MEM-E-얼의 염 기재 첨가됨), 최소 필수 배지 이글 (MEM-H-행크의 염 기재 첨가됨) 및 최소 필수 배지 이글 (비필수 아미노산이 첨가된 MEM-NAA)을 포함하며, 그 중에서도 배지 199, CMRL 1415, CMRL 1969, CMRL 1066, NCTC 135, MB 75261, MAB 8713. DM 145, Williams' G, Neuman & Tytell, Higuchi, MCDB 301, MCDB 202, MCDB 501, MCDB 401, MCDB 411, MDBC 153을 포함한다. 본 발명에서 사용되는 바람직한 배지는 DMEM이다. 이러한 및 그 밖의 유용한 배지는 특히 GIBCO(Grand Island, N.Y., USA) 및 Biological Industries(Bet HaEmek, Israel)로부터 이용가능하다. 다수의 이러한 배지가 문헌[Methods in Enzymology, Volume LVIII, "Cell Culture", pp. 62-72, edited by William B. Jakoby and Ira H. Pastan, published by Academic Press, Inc.]에 요약되어 있다.
본 발명의 방법에 유용한 배지의 추가의 비제한적인 예는 소 또는 다른 종의 태아 혈청을 적어도 1% 내지 약 30%, 바람직하게는 적어도 약 5% 내지 15%, 가장 바람직하게는 약 10%의 농도로 함유할 수 있다.
닭 또는 다른 종의 배야 추출물이 약 1% 내지 30%, 바람직하게는 적어도 약 5% 내지 15%, 가장 바람직하게는 약 10%의 농도로 존재할 수 있다.
비제한적인 구체예에서, MSC는 처리된 MSC가 도입되어야 하는 포유동물로부터 단리된다; 그러나, MSC는 포유동물과 동일하거나 상이한 종의 유기체로부터 단리될 수 있다. 포유동물은 골 조직을 갖는 임의의 유기체일 수 있다. 비제한적인 구체예에서, 포유동물은 인간이다.
유전자 변형
본 발명의 세포는 포유동물의 눈으로의 도입 전에 관심 핵산으로 안정하게 또는 일시적으로 형질전환될 수 있다. 관심 핵산 서열은 유전자 생성물 TSG-6 및 이의 생물학적 활성 단편 및 유사체, 및 STC-1 및 이의 생물학적 활성 단편 및 유사체를 엔코딩하는 것들을 포함하나 이로 제한되지 않는다. MSC의 형질전환 방법은, 세포를 수술 또는 골절 부위에서 뼈로 도입시키는 방법과 같이, 당업자에게 알려져 있다.
유전자 작제물이 세포로 트랜스펙션된 경우에, 이종 유전자는 세포에서 유전자의 발현을 달성하기 위해 요구되는 조절 서열에 작동적으로 연결된다. 그러한 조절 서열은 전형적으로 프로모터 및 폴리아데닐화 신호를 포함한다.
비제한적인 구체예에서, 유전자 작제물은, 벡터가 세포내로 트랜스펙션될 때, 코딩 서열이 세포에 의해 발현되도록 필수 조절 서열에 작동적으로 연결된 이종 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터로서 제공된다. 코딩 서열은 세포에서 그 서열의 발현에 필요한 조절 엘리먼트에 작동적으로 연결된다. 단백질을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열은 cDNA, 유전체 DNA, 합성된 DNA 또는 이들의 하이브리드, 또는 mRNA와 같은 RNA 분자일 수 있다.
유전자 작제물은 조절 엘리먼트에 작동적으로 연결된 이로운 단백질을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 기능 세포질 분자, 기능 에피솜 분자로서 세포에 여전히 존재할 수 있거나, 세포의 염색체 DNA로 통합될 수 있다. 외인성 유전자 물질은 세포로 도입될 수 있는데, 여기에서 여전히 플라스미드 형태의 분리된 유전자 물질이다. 대안적으로, 염색체로 통합될 수 있는 선형 DNA가 세포에 도입될 수 있다. DNA가 세포로 도입될 때, 염색체로의 DNA 통합을 촉진시키는 시약을 첨가시킬 수 있다. 통합을 촉진시키는데 유용한 DNA 서열이 또한 DNA 분자에 포함될 수 있다. 대안적으로, RNA가 세포에 도입될 수 있다.
유전자 발현을 위한 조절 서열은 프로모터, 개시 코돈, 스톱 코돈, 및 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 이러한 엘리먼트는 본 발명의 세포에서 작동가능한 것이 바람직하다. 더욱이, 이러한 엘리먼트는 단백질을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결될 수 있어서 뉴클레오티드 서열이 세포에서 발현될 수 있고, 이에 따라 단백질이 생산될 수 있는 것이 바람직하다. 개시 코돈 및 스톱 코돈은 일반적으로 단백질을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열의 일부인 것으로 고려된다; 그러나, 이러한 엘리먼트는 세포에서 기능적인 것이 바람직하다. 유사하게, 사용된 프로모터 및 폴리아데닐화는 본 발명의 세포 내에서 기능성이어야 한다. 본 발명의 실시예 유용한 프로모터의 예는 시토메갈로바이러스 프로모터, SV40 프로모터, 및 레트로바이러스 프로모터와 같은 다수의 세포에서 활성인 프로모터를 포함하나 이로 제한되지 않는다. 본 발명을 실시하는데 유용한 프로모터의 그 밖의 예는 조직-특이적 프로모터, 즉 다른 조직에서는 그렇지 않으나 일부 조직에서 기능하는 프로모터; 또한, 특수한 또는 일반적인 인핸서 서열을 갖거나 갖지 않는 세포에서 일반적으로 발현되는 유전자의 프로모터를 포함하나 이로 제한되지 않는다. 일부 비제한적인 구체예에서, 인핸서 서열이 있거나 없어도 항시적으로 세포에서 유전자를 발현시키는 프로모터가 이용된다. 인핸서 서열은 적절하거나 요망되는 그러한 구체예에서 제공된다.
본 발명의 세포는 당업자가 용이하게 이용할 수 있는 널리 공지된 기법을 이용하여 트랜스펙션될 수 있다. 외인성 유전자는 표준 방법을 이용하여 세포내로 도입될 수 있고, 여기에서 세포는 유전자에 의해 엔코딩된 단백질을 발현시킨다. 일부 구체예에서, 세포는 칼슘 포스페이트 침전 트랜스펙션, DEAE 덱스트란 트랜스펙션, 일렉트로포레이션, 미세주사, 리포좀-매개 이동, 화학적-매개 이동, 리간드 매개 이동 또는 재조합 바이러스 벡터 이동에 의해 트랜스펙션된다.
일부 구체예에서, 요망되는 서열을 갖는 DNA를 세포에 도입하기 위해 재조합 아데노바이러스 벡터를 이용한다. 일부 구체예에서, 요망되는 서열을 갖는 DNA를 세포에 도입하기 위해 재조합 레트로바이러스 벡터를 이용한다. 다른 구체예에서, 요망되는 DNA를 분화 세포에 혼입하는데 표준 CaP04, DEAE 덱스트란 또는 지질 담체 매개 트랜스펙션 기법을 이용한다. 일부 구체예에서, DNA는 미세주사에 의해 세포에 직접 도입된다. 유사하게, 널리-공지된 일렉트로포레이션 또는 입자 충격 기법을 이용하여 외래 DNA를 세포에 도입할 수 있다. 두 번째 유전자는 일반적으로 치료적 유전자에 공-트랜스펙션되거나 연결되어 있다. 두 번째 유전자는 종종 선택가능한 항생제-내성 유전자이다. 표준 항생제 내성 선택 기법을 이용하여 트랜스펙션된 세포를 동정하고 선택할 수 있다. 선택가능한 유전자를 획득하지 않은 세포를 사멸시킬 항생제에서 세포를 성장시킴에 의해 트랜스펙션된 세포를 선택한다. 두 개의 유전자가 공-트랜스펙션되고 연결되지 않은 대부분의 경우에, 항생제 처리에도 살아남은 세포는 두 개 유전자 모두를 함유하고 발현시킨다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 세포는, 예컨대 외인성 유전자를 발현하거나 내인성 유전자의 발현을 억제하도록 유전적으로 변형될 수 있다. 이러한 구체예에 따라, 세포를 이식유전자를 포함하는 핵산을 포함하는 유전자 이동 벡터에 노출시켜, 핵산이 이식유전자가 세포내에서 발현하기에 적절한 조건하에 세포로 도입되게 한다. 이식유전자는 일반적으로 적합한 프로모터에 작동적으로 연결된 코딩 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트에 함유되어 있다. 코딩 폴리뉴클레오티드는 단백질을 엔코딩할 수 있거나, 안티센스 RNA 또는 리보자임과 같은 생물학적 활성 RNA를 엔코딩할 수 있다. 따라서, 코딩 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 독소, 호르몬 (에컨대, 펩티드 성장 호르몬, 호르몬 방출 인자, 성 호르몬, 부신피질자극 호르몬, 인터페론과 같은 사이토카인, 인터류킨, 및 림포카인), 세포-부착 분자 및 호르몬 수용체와 같은 세포 표면-결합된 세포내 신호전달 모이어티(moiety), 및 주어진 계통의 분화를 촉진시키는 인자, 또는 공지된 서열을 갖는 어떠한 다른 이식유전자에 대한 내성을 부여하는 유전자를 엔코딩할 수 있다.
이식유전자를 함유하는 발현 카세트는 이식유전자를 세포로 전달하기에 적합한 유전적 벡터로 혼입되어야 한다. 요망되는 최종 적용에 따라서, 임의의 그러한 벡터가 세포를 유전학적으로 변형시키기 위해 그렇게 이용될 수 있다 (예컨대, 플라스미드, 네이키드 DNA, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스바이러스, 렌티바이러스, 파필로마바이러스, 레트로바이러스 등과 같은 바이러스). 그러한 벡터내에 요망되는 발현 카세트를 작제하는 임의의 방법을 이용할 수 있고, 그 중 다수가 당 분야에 널리 공지되어 있으며, 예컨대 직접 클로닝, 동종 재조합 등이 있다. 요망되는 벡터는 당 분야에 일반적으로 알려진, 세포내로 벡터를 도입시키기 위해 이용되는 방법을 충분히 결정할 것이다. 적합한 기법은 원형질 융합, 칼슘-포스페이트 침전, 유전자 총, 일렉트로포레이션, 및 바이러스 벡터로의 감염을 포함한다.
MSC는, 비제한적인 구체예에서, 변형된 하나 이상의 유전자를 지니거나, 변형으로 인해, 또는 두 번째 약물 (예컨대, 프로드럭) 또는 MSC의 그러한 파괴를 개시하는 신호전달 화합물을 제시할 때 MSC가 자가-파괴되거나 "자살"하도록 하는 능력을 변형으로 인해 갖도록 처리될 수 있다.
본원에 기재된 방법은 당 분야에 널리 공지된 다수의 방식으로 다양한 변형과 순서를 갖도록 수행될 수 있음이 이해되어야 한다. 또한, 작용 방식 또는 세포 타입들 간의 상호작용으로서 기재된 어떠한 이론은 본 발명을 어떠한 방식으로든 제한하는 것으로 해석되어서는 안 되며, 본 발명의 방법이 보다 충분히 이해될 수 있도록 제시된 것임을 이해하여야 한다.
치료제
본 발명은 안구 질환에 관해 염증을 억제하는 치료제로서 MSC를 이용하는 방법을 포함한다. 본 발명은 MSC가 높은 생존력을 나타내고 높은 수준의 항-염증, 항-아폽토틱, 면역 조절, 및 항-종양형성성 분자를 발현시킨다는 발견에 기반한다.
당업자는 본원에 제공된 기술에 기반하여, 염증 및 아폽토시스를 억제하는 MSC의 능력이 안구 질환을 치료하는 수단을 제공함을 이해할 것이다. 일 구체예에서, MSC 자체를 눈의 요망되는 부위에 투여할 수 있다. 또 다른 구체예에서, MSC로부터 분비된 치료적 단백질을 눈의 요망되는 부위에 투여할 수 있다. 여전히 또 다른 구체예에서, MSC로부터 분비된 요망되는 치료적 단백질의 재조합 버젼을 눈의 요망되는 부위에 투여한다.
본 발명은 하기를 포함하는 다양한 안구 질환 또는 상태를 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다: 황반병증(maculopathies)/망막 변성: 노인 황반 변성 (ARMD), 예컨대 비-삼출성 노인 황반 변성 및 삼출성 노인 황반 변성을 포함하는 황반 변성, 맥락막 혈관신생, 당뇨 망막병증, 급성 및 만성 황반 신경망막병증, 중심성 장액 맥락망막병증(central serous corioretinopathy)을 포함하는 망막병증, 및 주머니모양 황반 부종, 및 당뇨 황반 부종을 포함하는 황반 부종. 포도막염/망막염/맥락막염: 급성 다발성 판상 색소상피증(acute multifocal placoid pigment epitheliopathy), 베체트병, 버드샷 망막맥락막증(birdshot retinochoroidopathy), 감염 (매독, 라임병, 결핵, 톡소포자충증(toxoplasmosis)), 중간 포도막염 (주변포도막염) 및 전방 포도막염을 포함하는 포도막염, 다초점 맥락막염, 다발성소실성백반증후군(multiple evanescent white dot syndrome)(MEWDS), 눈 사르코이드증(ocular sarcoidosis), 후방 공막염, 사행성 맥락막염, 망막하 섬유증(subretinal fibrosis), 포도막염 증후군, 및 포그트-고야나기-하라다 증후군. 혈관 질환/삼출성 질환; 망막 동맥 폐쇄 질환(retinal arterial occlusive disease), 망막 중심 정맥 폐쇄(central retinal vein occlusion), 파종 혈관내 응고증(disseminated intravascular coagulopathy), 망막 정맥 분지 폐쇄(branch retinal vein occlusion), 고혈압성 안저 변화(hypertensive fundus changes), 눈 허혈 증후군(ocular ischemic syndrome), 망막 동맥 미세혈관류(retinal arterial microaneurysms), 코트병(Coat's disease), 중심오목부근 모세혈관확장증(parafoveal telangiectasis), 반-망막 정맥 폐쇄(hemi-retinal vein occlusion), 유두정맥염(papillophlebitis), 망막 중심 동맥 폐쇄(central retinal artery occlusion), 망막 동맥 분지 폐쇄(branch retinal artery occlusion), 경동맥 질환(carotid artery disease)(CAD), 언가지모양혈관염(frosted branch angitis), 낫적혈구 망막병증(sickle cell retinopathy) 및 그 밖의 혈색소병증(hemoglobinopathies), 혈관줄무늬(angioid streaks), 가족성 삼출유리체망막병증(familial exudative vitreoretinopahty), 일스병(Eales disease), 외상/수술: 교감 눈염증, 포도막 망막 질환(uveitic retinal disease), 망막 박리, 외상, 레이저, PDT, 광응고, 수술 동안 관류저하, 방사선 망막병증, 골수 이식체 망막병증. 증식성 질환: 증식성 유리체 망막병증 및 망막바깥 막, 증식성 당뇨 망막병증. 감염성 질환: 눈 히스토플라스마증, 눈 개회충증(ocular toxocariasis), 추정 눈 히스토플라스마증 증후군 (PONS), 안구내염, 톡소포자충증, HIV 감염과 관련된 망막 질환, HIV 감염과 관련된 맥락막 질환, HIV 감염과 관련된 포도막 질환, 바이러스 망막염, 급성 망막 괴사, 진행성 외망막 괴사, 진균 망막 질환, 눈 매독, 눈 결핵, 광범위 단안 아급성 시신경망막염(diffuse unilateral subacute neuroretinitis), 및 구더기증(myiasis). 유전 질환: 색소성망막염, 망막 이상증과 관련된 전신 질병, 선천 비진행성 야맹증(congenital stationary night blindness), 추체 이영양증(cone dystrophies), 스타가르트병(Stargardt's disease) 및 노란점안저(fundus flavimaculatus), 베스트병(Best's disease), 망막 색소 상피의 패턴 이상증(pattern dystrophy of the retinal pigmented epithelium), X염색체-관련 망막층간분리(X-linked retinoschisis), 솔스비 안저 이상증(Sorsby's fundus dystrophy), 양성 동심 황반병증(benign concentric maculopathy), 비에티 결정 이상증(Bietti's crystalline dystrophy), 탄력섬유거짓황색종(pseudoxanthoma elasticum). 망막 째짐/원공: 망막 박리, 황반 원공, 거대 망막 째짐(giant retinal tear). 종양: 종양과 관련된 망막 질환, RPE의 선천 비대, 후방 포도막 흑색종(melanoma), 맥락막 혈관종(hemangioma), 맥락막 골종(osteoma), 맥락막 전이, 망막 및 망막 색소 상피의 조합 과오종(hamartoma), 망막모세포종(retinoblastoma), 안저의 혈관증식성 종양, 망막 별아교세포종(retinal astrocytoma), 안구내 림프구 종양. 기타: 점상내층맥락막병증(punctate inner choroidopathy), 급성 후방 다발성 판상 색소상피증, 근시 망막 변성, 급성 망막 색소 상피염(acute retinal pigment epithelitis) 등.
전방 안구 질환은 눈주위 근육, 눈꺼풀 또는 수정체 피막 또는 섬모체근의 전방 내지 후방벽에 위치한 안구 조직 또는 유체와 같은 전방 (즉, 눈의 앞면) 안구 영역 또는 부위에 영향을 미치거나 이와 관련된 질환, 질병 또는 상태이다. 따라서, 전방 안구 질환은 주로 결막, 각막, 전방, 홍채, 후방 (망막 뒤에 있지만 수정체 피막의 후방벽의 앞), 수정체 또는 수정체 피막 및 전방 안구 영역 또는 부위에 혈관을 분포시키거나 신경이 통하게 하는 혈관 및 신경에 주로 영향을 미치거나 이와 관련된다.
따라서, 전방 안구 질환은, 예를 들어 무수정체증(aphakia); 인공수정체눈(pseudophakia); 난시(astigmatism); 눈꺼풀연축(blepharospasm); 백내장(cataract); 결막 질환; 아토피 각결막염(atopic keratoconjunctivitis)을 포함하나 이로 제한되지 않는 결막염; 각막 간질 영역에 대한 손상을 포함하나 이로 제한되지 않는 각막 손상; 각막 궤양; 안구건조증; 눈꺼풀 질환; 눈물 기관 질환; 비루관 폐쇄; 근시(myopia); 노안(presbyopia); 동공(pupil) 질환; 굴절 질환 및 사시(strabismus)와 같은 질환, 질병 또는 상태를 포함할 수 있다. 녹내장도 전방 안구 질환으로 고려될 수 있는데, 그 이유는 녹내장 치료의 임상적 목표가 눈의 전방에서의 수성 유체의 고혈압을 감소시키는 것일 수 있기 때문이다 (즉, 안구내 압력 감소).
후방 안구 질환은 맥락막 또는 공막 (수정체 피막의 후방벽을 통한 평면의 뒤에 있는 위치), 유리체, 유리체방, 망막, 시신경 (즉, 시신경 유두), 및 후방 안구 영역 또는 부위에 혈관을 분포시키거나 신경이 통하게 하는 혈관 및 신경과 같이 후방 안구 영역 또는 부위에 주로 영향을 미치거나 이와 관련된 질환, 질병 또는 상태이다. 따라서, 후방 안구 질환은, 예를 들어 급성 황반 신경망막병증(acute macular neuroretinopathy); 베체트병(Behcet's disease); 맥락막 혈관신생; 당뇨 포도막염; 히스토플라스마증; 진균 또는 바이러스-야기된 감염된 같은 감염; 급성 황반 변성, 비-삼출성 노인 황반 변성 및 삼출성 노인 황반 변성과 같은 황반 변성; 황반 부종, 주머니모양 황반 부종 및 당뇨 황반 부종과 같은 황반 부종; 다초점 맥락막염; 후방 안구 부위 또는 위치에 영향을 미치는 안구 외상; 안구 종양; 중심 망막 정맥 폐쇄, 당뇨 망막병증 (증식성 당뇨 망막병증 포함), 증식성 유리체망막병증 (PVR), 망막 동맥 폐쇄 질환, 망막 박리, 포도막 망막 질환과 같은 망막 질환; 교감 눈염증; 포그트-고야나기-하라다 (VKH) 증후군; 포도막 확산; 안구 레이저 치료로 야기되거나 영향을 받은 후방 안구 질환; 광역학 요법, 광응고술로 야기되거나 영향을 받은 후방 안구 질환, 방사선 망막병증, 망막앞막 질환, 망막 정맥 분지 폐쇄, 전방 허혈 시신경병증, 비-망막병증 당뇨 망막 기능장애, 색소성 망막염, 및 녹내장과 같은 질환, 질병 또는 상태를 포함할 수 있다. 녹내장도 후방 안구 질환으로 고려될 수 있는데, 그 이유는 치료적 목표가 망막 세포 또는 시신경 세포의 손상 또는 손실로 인한 시각 상실을 예방하거나 시각 상실의 발생을 감소시키는 것이기 때문이다 (즉, 신경보호).
본 발명에 따라 치료될 수 있는 눈의 그 밖의 질병 또는 질환은 비제한적으로 안반흔성유천포창(ocular cicatricial pemphigoid)(OCP), 및 백내장을 포함한다.
비제한적인 구체예에서, 눈의 염증 및/또는 손상 및/또는 질환이나 질병이 박테리아, 바이러스, 또는 진균 감염과 같은 감염과 관련될 때, 본 발명의 항-아폽토틱 또는 항-염증 단백질 또는 중간엽 줄기 세포를 하나 이상의 항-감염제와 함꼐 투여할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 항-아폽토틱 또는 항-염증 단백질 또는 중간엽 줄기 세포와 함께 투여되는 하나 이상의 항-감염제는 눈에 대한 박테리아, 바이러스, 또는 진균과 같은 감염의 유형, 감염과 관련된 박테리아, 바이러스, 또는 진균의 유형 또는 종, 및 감염의 정도와 중증도, 및 환자의 연령, 체중 및 성별에 의존적이다.
비제한적인 구체예에서, 눈의 감염이 하나 이상의 박테리아와 관련될 때, 본 발명의 단백질 또는 중간엽 줄기 세포와 함께 투여되는 하나 이상의 항-감염제는 하나 이상의 항균제이다. 투여될 수 있는 항균제는, 예를 들어 레보플록사신(levofloxacin)(Cravit), 목시플록사신(moxifloxacin)(Vigamox), 가티플록사신(gatifloxacin)(Zy-mar), 세팔로스포린(cephalosporin), 아미노글리코시드 항생제 (예컨대, 젠타마이신(gentamycin)), 및 이들의 조합물과 같은 퀴놀론 항생제를 포함하나 이로 제한되지 않는다.
또 다른 비제한적인 구체예에서, 눈의 감염이 하나 이상의 바이러스와 관련될 때, 본 발명의 단백질 또는 중간엽 줄기 세포와 함께 투여되는 항-감염제는 하나 이상의 항바이러스제이다. 이용될 수 있는 항바이러스제는 당업자에게 공지된 것들을 포함한다.
또 다른 비제한적인 구체예에서, 눈의 감염이 하나 이상의 진균과 관련될 때, 본 발명의 단백질 또는 중간엽 줄기 세포와 함께 투여되는 항-감염제는 하나 이상의 항진균제이다. 이용될 수 있는 항진균제는 나타마이신(natamycin), 암포테리신(amphotericin) B, 및 플루코나졸(fluconazole) 및 이트라코나졸(itraconzole)을 포함하는 아졸(azole)을 포함하나 이로 제한되지 않는다.
여전히 또 다른 비제한적인 구체예에서, 눈의 감염이 하나를 초과하는 박테리아, 바이러스, 및 진균과 관련될 때, 하나를 초과하는 항-박테리아, 항-바이러스 및 항진균제를 본 발명의 단백질 또는 중간엽 줄기 세포와 함꼐 투여한다. 비제한적인 구체예에서, 중간엽 줄기 세포 또는 항-아폽토틱 또는 항염증 단백질을 환자에게 투여하여 상기 기재된 형태의 황반 변성을 포함하는, 황반 변성을 치료하거나 예방한다. 또 다른 비제한적인 구체예에서, 중간엽 줄기 세포 또는 항-아폽토틱 또는 항-염증 단백질을 황반 변성을 치료하는데 이용되는 다른 치료제와 함께 환자에게 투여할 수 있다. 그러한 치료제는 비제한적으로 혈관형성 억제제, 및 항-혈관 내피 성장 인자 A (VEGF-A) 항체 (예컨대, 아바스틴(Avastin), 루센티스(Lucentis)), 혈관형성제에 결합하는 작용제 또는 약물, 예컨대 VEGF 트랩제(trap agent), 항-혈관형성성인 티로신 키나제 억제제, 혈관형성 단백질 수용체 길항제, 및 소형 열쇼크 단백질 HSPB4, HSP90, HSP70, HSP65, 또는 HSP27을 인지하는 항체 및 항체 단편을 포함하나 이로 제한되지 않는 열쇼크 단백질을 인지하는 항체 및 항체 단편, 및 HSPB4, HSP90, HSP70, HSP65, 및 HSP27에 대한 길항제를 포함하나 이로 제한되지 않는 열쇼크 단백질 길항제를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 열쇼크 단백질을 인지하는 하나 이상의 항체 또는 항체 단편 또는 하나 이상의 열쇼크 단백질 길항제를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 눈의 질환 또는 질병을 치료하거나 예방하는 방법이 제공된다. 하나 이상의 항체 또는 항체 단편이나 열쇼크 단백질 길항제를 상기 환자에서 눈의 질환 또는 질병을 치료하기에 효과적인 양으로 투여한다.
치료될 수 있는 눈의 질환 또는 질병은 비제한적으로 상기 기재된 것들을 포함한다.
본 발명에 따라 투여될 수 있는 항체 또는 항체 단편은 소형 열쇼크 단백질 HSPB4, HSP90, HSP70, HSP65, 또는 HSP27을 인지하는 항체 또는 항체 단편을 포함하나 이로 제한되지 않는다. 비제한적인 구체예에서, 항체 또는 항체 단편은 소형 열쇼크 단백질 HSPB4를 인지하는 항체 또는 항체 단편이다.
또 다른 비제한적인 구체예에서, 본 발명의 중간엽 줄기 세포 또는 항-아폽토틱 또는 항-염증 단백질을 열쇼크 단백질 길항제와 함께 투여한다. 비제한적인 구체예에서, 열쇼크 단백질 길항제는 HSPB4 길항제이다.
하나 이상의 항체 또는 항체 단편은 모노클로날 또는 폴리클로날 항체, 또는 인간, 비-인간, 인간화, 또는 키메라 항체일 수 있다.
하나 이상의 항체 또는 항체 단편 또는 열쇼크 단백질 길항제를 상기 기재된 바와 같은 방법에 의해, 그리고 상기 기재된 바와 같은 허용되는 약학적 담체와 함께 투여할 수 있다.
본 발명의 또 다른 비제한적인 구체예는 이식체의 수용체에게 MSC를 투여하는 경로를 포함한다. MSC는 이식하려는 이식체, 즉 생체적합한 격자 또는 공여자 조직, 기관 또는 세포의 배치에 적합한 경로에 의해 투여될 수 있다. MSC는 전신적으로, 즉 비경구적으로, 정맥내 주입에 의해 투여될 수 있거나, 골수와 같은 특정 조직 또는 기관으로 표적화될 수 있다. MSC는 세포의 피하 이식을 통해 또는 세포의 주입에 의해 결합 조직, 예를 들어 근육으로 투여될 수 있다. MSC는 세포의 안구내 이식 또는 세포의 주입에 의해 요망되는 안구 영역으로 투여될 수 있다. 비제한적인 구체예에서, MSC는 앞방내, 즉 눈의 전방에 투여된다.
MSC는 적절한 희석제에 현탁될 수 있다. 주입 용액에 적합한 부형제는 MSC 및 수용체에 생물학적 및 생리적으로 적합한 것들이고, 예컨대 완충된 염수 용액 또는 그 밖의 적합한 부형제이다. 투여를 위한 조성물은 적절한 무균성 및 안정성에 부합하는 표준 방법에 따라 제형화, 생산 및 저장될 수 있다. MSC의 용량은 광범한 한계내에서 다양하며, 각각의 특정 사례에서 개별적인 요건에 따라 조정될 수 있다. 사용된 세포의 수는 수용체의 체중 및 상태, 투여 횟수 및/또는 빈도, 및 환자의 연령 및 성별, 치료하려는 질환 또는 질병, 및 질병의 정도 및 중증도를 비제한적으로 포함하는 당업자에게 공지된 다른 변수들에 의존적이다.
치료적 단백질의 투여
본 발명은 손상 신호에 반응하여 MSC에 의해 생산된 치료적 단백질을 제공한다. 치료적 단백질은 각막 상피 전구체의 생존력 및 증식을 증가시키고 각막 표면에서의 염증을 억제함에 의해 각막 표면을 손상으로부터 보호할 수 있다.
비제한적인 일 구체예에서, 본 발명은 정제된 종양 괴사 인자-알파 자극된 유전자 6 (TSG-6) 단백질 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 유사체를 포유동물 피검체에게 제공하여 안구 질환과 관련된 염증의 하나 이상의 징후를 감소시키는 것을 포함하는, 눈의 질환 또는 질병을 치료하거나 예방하는 방법, 예를 들어 포유동물 피검체에서 안구 질환과 관련된 염증의 하나 이상의 징후를 감소시키는 방법을 제공한다.
또 다른 비제한적인 구체예에서, 본 발명은 정제된 스타니오칼신-1 (STC-1) 단백질 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 유사체를 포유동물 피검체에게 제공하여 안구 질환과 관련된 염증의 하나 이상의 징후를 감소시키는 것을 포함하는, 눈의 질환 또는 질병을 치료하거나 예방하는 방법, 예를 들어 포유동물 피검체에서 안구 질환과 관련된 염증의 하나 이상의 징후를 감소시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 치료적 단백질은 임의의 방법에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어, 비제한적인 구체예에서, 단백질은 (a) 상기 단백질을 엔코딩하는 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하고, (b) 상기 단백질을 발현시키는 유전자이식 세포로부터 정제될 수 있다.
이종 뉴클레오티드 서열을 발현하도록 형질전환될 수 있는 임의의 세포를 이용하여, 예를 들어 TSG-6 단백질, 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 유사체, 또는 STC-1 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 유사체를 발현시킬 수 있다. 그러한 세포는 인간 및 비-인간 진핵 동물 세포를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 세포는 비-인간 진핵 동물 세포이다.
또 다른 비제한적인 구체예에서, 치료적 단백질은 당업자에게 공지된 수단에 의해 자동 단백질 또는 펩티드 합성기에 의해 합성될 수 있다.
서열에 있어서 그 천연 발생 대응부와 상이하나 생물학적 활성을 보유하는 상기 언급된 단백질의 단편 또는 변이체 또는 유사체가 또한 이용될 수 있음을 인지할 것이다.
본 발명의 특정 비제한적인 구체예에서, 천연 발생 폴리펩티드의 단편 또는 변이체 또는 유사체는 천연 발생 대응부 길이의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 또는 100%를 구성하는 아미노산 부분에 대해 적어도 70% 동일하고, 적어도 80% 동일하고, 적어도 90% 동일하고, 적어도 95% 동일하다. 예를 들어, 서열의 관련 부분에 대해 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 그보다 큰 서열 동일성을 나타내는 변이체를 이용할 수 있었고, 여기서 % 동일성은 상기 기재된 대로 결정된다. 아미노산 부분은, 비제한적인 구체예에서, 적어도 20개 아미노산 길이고, 또 다른 비제한적인 구체예에서, 적어도 50개 아미노산 길이이다. 대안적으로, 단편 또는 변이체는 천연 발생 대응부에 현저하거나, 바람직하게는 실질적인 상동성을 나타낼 수 있다. 일반적으로 천연 발생 폴리펩티드의 단편 또는 변이체는 천연 발생 대응부를 인지하는 항체 (예컨대, 폴리클로날 또는 모노클로날 항체)에 의해 인지되는 천연 발생 대응부에 충분한 구조적 유사성을 소유한다.
본 발명의 조성물은 전형적으로 비경구적으로, 정맥매, 피하, 근내 또는 복막내 주사에 의해, 또는 주입이나 어떠한 그 밖의 허용되는 전신적 방법에 의해 투여된다. 비제한적인 구체예에서, 본 발명의 조성물은 안구내 투여에 의해 포유동물에게 제공된다. 비제한적인 구체예에서, 투여는 전형적으로 약 1 내지 5시간의 시간 동안 정맥내 주입에 의해서이다. 또한, 치료적 단백질을 투여하기 위한 다양한 경구 전달 방법이 존재하며, 이들을 본 발명의 치료적 단백질에 이용할 수 있다.
대안적으로, 비제한적인 구체예에서, 본 발명의 조성물을, 예를 들어 점안제의 형태와 같이 눈에 국소적으로 투여할 수 있다. 추가의 비제한적인 구체예에서, 적어도 하나의 항-염증 단백질, 예컨대 TSG-6 단백질 또는 이의 유사체 또는 단편을 포함하는 점안제를 각막에 투여하여 각막의 질환 또는 질병을 치료하거나 예방한다.
또 다른 비제한적인 구체예에서, 본 발명의 조성물을 정맥내 투여와 같이 전신적으로, 또는 앞방내 투여와 같이 안구내에, 즉 눈의 전방에 투여할 수 있다.
종종, 치료 용량은 안전성 및 효능을 최적화하기 위해 낮은 수준으로부터 위쪽으로 적정된다. 일반적으로, 매일 용량은 체중 1 kg 당 약 0.01 내지 20 mg의 단백질의 범위 내에 있을 것이다. 전형적으로, 용량 범위는 체중 1 kg 당 약 0.1 내지 5 mg의 단백질일 것이다.
폴리에틸렌 글리콜 사슬의 첨가 (페길화)와 같은 단백질의 다양한 변형 또는 유도체를 제조하여 약동학 및/또는 약역학적 성질에 영향을 미칠 수 있다.
비경구 이외의 투여에 의해 단백질을 투여하기 위해, 단백질을 그 활성화를 막는 물질로 코팅하거나 공동-투여할 수 있다. 예를 들어, 단백질을 불완전 애주번트에서 투여할 수 있거나, 효소 억제제와 공동-투여할 수 있거나, 리포좀으로 투여할 수 있다. 효소 억제제는 췌장 트립신 억제제, 디이소프로필플루오로포스페이트 (DEP) 및 트라실롤을 포함한다. 리포좀은 수중유중수, CGF 에멀젼뿐 아니라 통상적인 리포좀을 포함한다 (Strejan et al.. (1984) J. Neuroimmunol. 7:27).
본 발명의 조성물의 "유효량"은 각막과 관련된 염증뿐 아니라 상기 기재된 그 밖의 눈의 질환 및 질병과 같은 의학적 상태를 특징으로 하는 널리 공지된 파라메터들 중 하나 이상을 개선시킬 양이다. 각막의 염증 질환 및 상기 기재된 그 밖의 질환 또는 질병에 관해 유효량은 하기 중 하나 이상을 달성하기에 충분한 단백질 또는 세포의 양 또는 둘 모두의 조합물의 양이다: 징후의 중증도의 감소; 질병 악화의 지속성의 감소; 질병 경감/무증상 기간의 빈도 및 지속성의 증가; 고정 장애 및 무능력의 예방; 및/또는 질병의 만성 진행의 예방/감쇠.
본 발명의 조성물은 단순 용액으로 투여될 수 있으나, 담체, 바람직하게는 약학적 담체와 같은 그 밖의 물질과 함께 이용되는 것이 더욱 전형적이다. 유용한 약학적 담체는 본 발명의 조성물을 환자에게 전달하기에 적합한 어떠한 상용성 무독성 물질일 수 있다. 무균수, 알코올, 지방, 왁스, 및 비활성 고체가 담체에 포함될 수 있다. 약학적으로 허용되는 애주번트 (완충제, 분산제)가 또한 약학적 조성물에 혼입될 수 있다. 일반적으로, 그러한 약물의 비경구 투여에 적합한 조성물이 널리 알려져 있다; 예컨대, 문헌[Remington's Pharmaceutical Science, 17th Ed. (Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1990)]. 대안적으로, 본 발명의 조성물은 이식가능한 약물 전달 시스템에 의해 환자의 신체내로 도입될 수 있다 [Urquhart et al., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 24: 199 (1984)].
치료적 제형은 다수의 통상적인 투여 제형으로 투여될 수 있다. 제형은 전형적으로 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적어도 하나의 활성 성분을 포함한다.
제형은 편리하게는 단위 용량 형태로 제시될 수 있고 제약 분야에 널리 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 참조: 예컨대 문헌[Gilman et al. (eds.) (1990), The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th Ed., Pergamon Press; and Remington's Pharmaceutical Sciences, supra, Easton, Pa.; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications Dekker, N.Y.; Lieberman et al. (eds.) (1990), Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Dekker, N.Y.; and Lieberman et al. (eds.) (1990), Phamiaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Dekker, N.Y.].
추가의 비제한적인 구체예에서, 본 발명은 유전자 요법에 의한 단백질의 투여, 예컨대 관심 단백질을 엔코딩하는 단리된 핵산의 투여를 고려한다. 본 발명의 단백질은 단백질을 엔코딩하는 핵산 서열 및 단백질의 생성된 아미노산 서열 둘 모두로서 잘 특성화되어 있다. 재조합 DNA 방법에 의한 그러한 단리된 핵산의 공학처리는 충분히 당업자의 능력내에 있다. 특정 세포 배경에서 재조합 단백질 수율을 최대화할 목적의 코돈 최적화도 충분히 당업자의 능력내에 있다. 유전자 요법은 당 분야에 널리 알려져 있다. 참조: 예컨대 세포내 항체를 생성하는 유전자 요법의 이용을 기술하고 있는 WO96/07321호.
단백질을 엔코딩하는 핵산 (임의로 벡터에 함유됨)을 환자의 세포에 도입시키기 위한 생체내 및 생체외 두 가지 주요 접근법이 존재한다. 생체내 전달을 위해, 핵산을 환자에게, 일반적으로 단백질이 요구되는 부위에 직접 주입한다. 생체외 치료를 위해, 환자의 세포를 분리시키고, 이러한 단리된 세포에 핵산을 도입시키고, 변형된 세포를 환자에게 직접 투여하거나, 예를 들어 환자에게 이식되는 다공성 막내에 캡슐화한다 (참조: 예컨대 U.S. Pat. Nos. 4,892,538 및 5,283,187). 핵산을 생육가능한 세포에 도입시키는데 이용가능한 다양한 기법이 존재한다. 기법들은, 핵산이 시험관내 배양된 세포, 또는 의도된 숙주의 세포에서 생체내 배양된 세포로 이동하는지에 따라 다양하다. 시험관내 포유동물 세포로 핵산의 이동에 적합한 기법은 리포좀의 이용, 일렉트로포레이션, 미세주사, 세포 융합, DEAE-덱스트란, 칼슘 포스페이트 침전법 등을 포함한다. 유전자의 생체외 전달에 일반적으로 이용되는 벡터는 레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터이다.
바람직한 생체내 핵산 이동 기법은 아데노바이러스, 헤르페스 단순포진 I 바이러스, 아데노-관련 바이러스, 지질-기반 시스템 (유전자의 지질-매개 이동에 유용한 지질은 예를 들어 DOTMA, DOPE 및 DC-Chol이다), 네이키드 DNA, 및 트랜스포손-기반 발현 시스템과 같은 바이러스 벡터를 이용한 트랜스펙션을 포함한다. 현재 공지된 유전자 표지 및 유전자 치료 프로토콜의 검토를 위해서는, 문헌[Anderson, et al., Science 256:808-8 13 (1992)]을 참조하라. 또한 WO 93/25673 및 여기에 인용된 참고문헌을 참조하라.
본 발명의 치료적 조성물 및 이의 제형은, 예를 들어 계절성 또는 박테리아 결막염으로 인한 염증을 감소시키거나, 수술후 통증 및 염증을 감소시키거나, 눈의 진균 또는 박테리아 감염을 예방 또는 치료하거나, 눈대상포진(herpes ophthalmicus)을 치료하거나, 안구내압을 감소시키거나, 안구내염을 치료하기 위해 이용될 수 있다.
보다 구체적으로, 비제한적인 일 구체예에서, 본 발명은 포유동물 (예컨대, 인간 및 비-인간 영장류 포함)에서 안과 질병을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본원에 상기 기재된 대로 지질상, 수성상 및 치료제를 포함하는 본 발명의 치료적 유효량의 제형을 포유동물의 눈에 투여하는 것을 포함하고, 여기서 치료제는 안과 질병을 치료하는데 유용하다. 일 구체예에서, 안과 질병은 수술후 통증이다. 또 다른 구체예에서, 안과 질병은, 예컨대 홍채염, 결막염, 계절성 알레르기 결막염, 급성 및 만성 안구내염, 전방 포도막염, 전신 질환과 관련된 포도막염, 후안부 포도막염, 맥락망막염(chorioretinitis), 주변포도막염(pars planitis), 눈의 림프종을 포함하는 가면 증후군(masquerade syndrome), 유사천포창(pemphigoid), 공막염(scleritis), 각막염, 심한 눈 알레르기, 각막 마모 및 혈액방수장벽 파괴로부터 초래된 안구 염증이다. 여전히 또 다른 구체예에서, 안과 질병은, 예를 들어 굴절교정 레이저각막절제술, 백내장 제거 수술, 안내 렌즈 삽입술 및 방사상 각막 절개술로부터 초래된 수술후 눈 염증이다.
본 발명의 리포좀 제형을 적용하는데 있어서, 비제한적인 구체예에서, 투여는 안내 투여이며, 이러한 용어는 공막, 각막, 결막 및 윤부를 포함하는 눈의 표면을 통해, 또는 눈의 전방으로의 치료제의 전달을 의미하기 위해 이용된다. 눈 전달은 다수의 수단에 의해, 예를 들어 점안제와 같은 제형의 국소 도포, 주입, 또는 전계확산 약물 전달 시스템에 의해 달성될 수 있다.
또 다른 비제한적인 구체예에서, 눈의 질병 또는 질환을 치료하는데 이용되는 중간엽 줄기 세포 또는 치료적 단백질은 나노입자에 함유될 수 있다. 그러한 나노입자는 당업자에게 공지된 방법에 의해 형성될 수 있다.
그러한 나노입자는 안내로, 즉 공막, 각막, 결막, 및 윤부를 포함하는 눈의 표면을 통해서나 눈의 전방으로 투여될 수 있다. 그러한 눈의 투여는, 비제한적인 구체예에서, 점안제와 같은 제형의 국소 도포, 주입, 또는 전계확산 약물 전달 시스템을 포함하는 임의의 다양한 수단에 의해 달성될 수 있다.
실시예
본 발명은 이제 하기 실시예를 참조로 하여 기술된다. 이러한 실시예는 단지 예시를 목적으로 제공된 것이며, 본 발명은 이러한 실시예로 제한되지 않고, 오히려 본원에 제공된 교시의 결과로서 명백한 모든 변형을 포함한다.
실시예 1: MSC 및 MSC -유래 인자는 화학적으로-손상된 랫트 각막에서 염증 및 혈관신생을 억제하고, 상처 치유를 촉진하였다.
MSC 및 MSC-유래 인자의 이로운 효과는 각막 염증/혈관신생을 억제하고 상처 치유를 치유하는 데에서 관찰되었다 (Oh et al., 2008). 100% 에탄올을 30초간 적용시키고 윤부의 상피 및 전체 각막 둘 모두를 찰과시킴에 의해 랫트에서 각막 염증, 혈관신생, 및 지연된 상처 치유를 유도하였다. 이러한 모델의 신뢰성 및 재현성은 이전에 확인되었고 다른 연구자들에 의해 반복적으로 이용되었다 (Cho et al., 1998; Avila et al., 2001; Ti et al., 2002; Espana et al., 2003; Homma et al., 2004; Oh et al., 2009b). 이러한 모델에서 염증 세포의 대량 침윤 및 각막에서 신규한 혈관의 성장이 유도되었다 (도 1).
손상 직후에, 랫트 MSC 또는 MSC 배양액으로부터 유래된 조건화된 배지 (CM)를 어플리케이터에 넣어서 손상된 각막에서 2시간 동안 유지되게 하였다. 6-mm-직경의 공동 튜브를 어플리케이터로서 이용하였다 (도 2). 이러한 적용 방법은 줄기 세포를 각막에 이용하는데 효과적인 것으로 이전에 입증된 바 있다 (Homma et al., 2004; Ueno et al., 2007). 하기는 연구되고 네 가지 치료를 받은 네 개의 그룹이다: (1) 200 ㎕의 신선한 배지 (대조군, n=10), (2) MSC 배양액으로부터 수집된 200 ㎕의 상청액 (MSC-CM I 그룹, n=10), (3) 연속 3일에 걸쳐 하루에 2시간 동안 200 ㎕의 MSC-CM 적용함 (MSC-CM II 그룹, n=10), (4) 2xl06개 MSC를 함유하는 200 ㎕의 배지 (MSC 그룹, n=10).
각막에 대한 MSC 또는 MSC-CM의 효과를 세 가지 방식으로 측정하였다: (1) 투명도, 혈관신생 (NV), 및 상피 결함의 조사에 기반한 슬릿-램프 생체현미경검사에 의한 육안 조사, (2) 염증 세포 (헤마톡실린-에오신 염색) 또는 CD4+ T 세포 (면역형광 염색)의 침윤에 대한 조직학적 분석, 및 (3) 염증- 및 혈관형성-관련 사이토카인에 대한 ELISA 및 실시간 PCR 검정. 결과적으로, 각막 염증 및 NV가 손상후 시간 경과에 따라 MSC-처리된 각막에서 신속하게 감소한 반면, 비히클-처리된 대조군에서는 점차적으로 증가하는 것으로 나타났다 (도 3). 각막 염증 및 NV의 정도는 MSC 그룹에서 가장 낮았고, 대조군에서 가장 높았다. 현저하게는, MSC-CM이 또한 MSC-CM의 적용 횟수에 비례하여 각막 염증 및 NV를 감소시키는데 효과적인 것으로 관찰되었다. 보다 특히, MSC-CM (MSC-CM II 그룹)으로 3회 처리된 각막은 대조군 및 MSC-CM으로 단 1회 처리된 (MSC-CM I 그룹) 각막 둘 모두에 비해 더욱 투명하였다. 재상피화는 MSC 및 MSC-CM로 처리된 각막에서 더 빨랐다.
임상적 결과와 유사하게, 조직학적 분석 (도 4)은 MSC 및 MSC-CM II 그룹이 대조군 및 MSC-CM I 그룹보다 적은 염증 세포 침윤을 지녔음을 나타내었다. MSC 및 MSC-CM II 그룹 간의 비교는 MSC로 처리된 각막이 MSC-CM으로 3회 처리된 각막에 비해 현저하게 적은 염증 세포를 지녔음을 나타내었다.
ELISA는 전염증 사이토카인 IL-2 및 IFN-μ의 생산이 MSC- 및 MSC-CM-처리된 각막에서 감소하였음을 나타내었다 (도 5a, b). 대조적으로, 다량의 항-염증 사이토카인 IL-10 및 TGF-B가 MSC-처리된 각막에서 검출되었다 (도 5c, d)
MSC에 의한 신규한 혈관의 퇴행과 관련된 메카니즘을 측정하기 위해, 혈관형성-관련 사이토카인, TSP-1 , MMP-2, MMP-9, 및 VEGF의 발현을 평가하였다. 실시간 PCR은 항-혈관형성 인자인 TSP-1의 수준이 MSC 및 MSC-CM II 그룹에서 현저하게 상향조절되었음을 나타내었다 (도 6). 전-혈관형성 인자인 MMP-2 및 MMP-9의 발현은 대조군 각막에 비해 MSC-처리된 각막에서 현저하게 퇴행하였다.
실시예 2 - 인간 MSC -조건화된 배지는 화학적-유도된 아폽토시스로부터 인간 각막 상피 세포를 보호하였다.
인간 각막 상피 세포 (hCEC)를 15% 에탄올에서 30초간 인큐베이션함에 의해 화학적으로 손상시켰다. 손상된 hCEC를 하기 중 하나와 함께 배양하였다: (1) hMSC-조건화된 배지, (2) hMSC-손상된 hCEC 배양액으로부터 조건화된 배지, 또는 (3) 신선한 배지. 그 후, hCEC의 생존을 MTT 검정으로 평가하였다. 이러한 결과는 손상된 hCEC의 비율이 hMSC-조건화된 배지와 함께 배양시 현저하게 감소되었음을 나타내었다 (도 7).
실시예 3: MMP -9의 생산은 hMSC에 의해 화학적-손상된 인간 각막 상피 세포에서 현저하게 억제되었다.
MSC가 염증 및 혈관형성 사이토카인 분비에 관해 각막 상피 세포에 어떠한 영향을 주는 지를 평가하기 위해 하기 실험을 수행하였다. hCEC를 화학적으로 손상시킨 다음, hMSC와 24시간 동안 공동배양하고, 마지막으로, 무세포 상청액을 ELISA에 의해 사이토카인 농도에 대해 분석하였다. 공동배양 그룹은 다음과 같았다: (I) hPBMC (인간 말초혈 단핵 세포), (2) hCEC, (3) hPBMC/hCEC, (4) hMSC, (5) hMSC/hPBMC, (6) hMSC/hCEC, 및 (7) hMSC/hPBMC/hCEC. 결과적으로, MSC는 VEGF, MMP-2, 및 TSP-1을 항시적으로 분비시키는 것으로 관찰되었다 (도 8). 손상된 hCEC에 의해 고도로 분비되는 MMP-9가 hMSC에 의해 현저하게 억제됨을 주목하는 것이 중요하다 (도 8, 상부 우측). 사실상, hMSC 억제의 결과로서, MMP-9의 수준은 100%에서 8%로 감소되었다. 이러한 결과에 기반하여, 각막 염증, 혈관형성 및 상처 치유에서의 중요한 플레이어인 MMP-9의 억제가 각막 재생 동안 MSC 작용의 원인이 되는 메카니즘 중 하나일 것으로 여겨진다. MMP-9는 TSG-6에 의해 그 활성화가 현저하게 억제되는 전-염증 프로테아제 중 하나이다 (Milner and Day, 2003; Milner et al., 2006).
본원에 제시된 결과는 MSC 또는 MSC로부터의 조건화된 배지의 이용이 각막의 비감염성 염증에 대한 랫트 모델에서 염증 및 혈관신생을 감소시켰음을 입증한다. 어떠한 특정 이론에 구속시키고자 하는 것은 아니지만, MSC의 이로운 효과는 적어도 부분적으로 각막 손상의 랫트 모델 및 추체 상피 세포와의 공동배양액 둘 모두에서 염증 사이토카인 및 염증-관련 프로테아제의 수준을 감소시키는 효과에 의해 설명된다. 따라서, 이러한 데이터는 MSC의 이로운 효과가 항-염증 단백질 TSG-6 및/또는 항-아폽토틱 단백질 STC-1의 세포에 의한 생산에 의해 설명된다는 가설과 일치한다.
실시예 4: 각막의 치료를 위해 미리-활성화된 MSC의 이용
하기 실험은 치료적 단백질을 발현시키도록 배양액에서 미리 활성화된 MSC가 각막에 대한 화학적-유도된 손상 후에 염증 및 혈관신생을 감소시키는데 있어서 MSC의 표준 배양액보다 효과적인 지를 시험하기 위해 설계되었다. (a) 도 3 및 4에서와 같이 혈관신생, 혼탁, 상피 결함, 및 염증 세포의 침윤에 있어서의 현저한 개선; (b) 염증 사이토카인 IFN-μ의 현저한 감소 (도 5); 및 (c) 염증 관련 프로테아제 MMP-2 및 MMP-9의 현저한 감소 (도 6)를 제공하는데 요구되는 최소의 세포수에 관해, 랫트 모델에서 MSC의 표준 제조물과 TNFα를 지니는 배양액에서 미리 활성화된 MSC를 비교하도록 실험을 설정하였다 (도 10c 및 d). 동시에, 이러한 모데에서 표준 제조물과 미리-활성화된 MSC를 앞방내 주입 (IC; 전방으로)에 의해 동일한 유효성 척도를 이용하여 비교하였다.
표 1에 요약된 대로, hMSC가 결과의 잠재적인 임상적 적용과 더욱 관련이 있기 때문에 랫트 MSC 및 인간 MSC (hMSC) 둘 모두를 이용하여 초기 실험을 수행하였고, 인간 및 설치류 MSC가 그 밖의 설치류 모델에서 동등하게 유효한 것으로 입증되었다 (Lee et al., 2009; Block et al.; 2009; Ohtaki et al., 2008; Iso et al., 2007; Ortiz et al., 2007; Lee et al., 2006; Munoz et al., 2006).
Figure 112017057811105-pat00001
본원에 기재된 실험에 이용된 물질 및 방법을 여기에 기술한다.
각막 표면 염증 모델
문헌[Oh et al. (2008)]에 기재된 프로토콜을 이용하여 100% 에탄올을 적용시키고 각막 및 윤부 상피의 기계적 죽은조직제거술을 시행함에 의해 랫트에서 각막 표면 염증을 생성할 수 있다. 이러한 모델은 각막에서 뉴트로필의 침윤, 포식세포, 혈관신생, 및 지연된 상처 치유를 유도한다 (도 1).
MSC - 인간 MSC (hMSC5) 및 랫트 MSC (rMSC)는 본 발명자들의 NIH/NCRR 투자 센터 (P40 RR 17447)에 의해 널리 배급된 표준화 제조물로부터 획득할 수 있다. hMSC의 경우, PODXL에 대해 90% 이상 포지티브인 제조물을 선택하기 위해 표준화 세포를 추가로 스크리닝할 수 있다. PODXL은 생체내에서 초기 전구체에 대해 그 밖의 에피토프 (c-MET, CXCR4, 및 CXC3CR1)를 발현할 것 같은 MSC에 대한 마커로서 기능한다. rMSC의 경우, MSC는 루이스(Lewis) 랫트의 골수로부터 단리될 수 있다 (Javazon et al., 2001).
치료제 전달의 경로
국소 적용 (도 2) 및 IC 주입을 비교하였다. 이러한 비교로부터 IC 주입이 국소 적용보다 낮은 용량에서 효과적인 지를 결정할 수 있다. 국소 전달의 경우, 공동 튜브를 각막에 적용시킬 수 있고, 세포 (200 ㎕)를 튜브에 넣어서, 2시간 동안 각막에 유지되게 할 수 있다 (도 2). 세포의 용량은 이전에 효과적으로 것으로 밝혀진 2X104개에서 2X106개까지 다양할 수 있다 (도 3 내지 6). 국소 적용은 총 3개의 치료제에 대해 연일간 반복될 수 있다. IC 주입의 경우, 배지 (5 ㎕)를 랫트 눈의 전방에 1회 주입할 수 있다. 세포의 용량은 2X103개에서 2X105개로 다양할 수 있고, 즉, 이것은 세포의 응집 없이 적용될 수 있는 최대 농도이다 (Lee et al., 2009).
각막 표면 재생에 대한 검정
슬릿-램프 생체현미경검사로 눈을 조사하고, 1주일에 1회 사진으로 기록하였다. 임상적 결과를 하기 기준에 따라 안과의사인 조사자에 의해 맹검식으로 등급화하였다; (1) 각막 상피의 통합성, (2) 투명도, 및 (3) 혈관신생 (NV). 1% 플루오레세인 소듐 용액을 이용하여 각막 상피 결함의 정도를 평가할 수 있다. 후속하여, 이미지 분석기를 이용하여 결함을 전체 각막 면적에 대한 상피 결함 면적의 비로서 정량하였다. 문헌[Fantes et al., (1990) and Oh et al., (2008)]의 방법을 이용하여 각막 맑음을 0 내지 4로 등급화하였다. 각막 NV를 문헌[D'Amato et al. (1994), Oh et al.(2008), and Oh et al. (2009b)]에서 이용된 방법으로 혈관 성장의 면적을 계산함에 의해 정량하였다. 3주 후에, 각막을 절제하고, 본원의 다른 부분에서 논의된 적절한 검정을 이용하여 조사하였다.
각막 염증에 대한 검정
각막을 헤마톡실린-에오신으로 염색하거나 뉴트로필- 및 포식세포-특이적 마커로 면역염색하였다. 염증 세포의 수를 H&E-염색된 슬라이드 상에서 계수하였다. 포지티브-염색된 세포의 수를 면역염색된 슬라이드 상에서 계수하였다. 또한, MPO 샌드위치 ELSIA 검정으로 미엘로퍼옥시다제 (MPO) 활성을 측정함에 의해 각막에서 뉴트로필의 침윤 및 축적을 정량하였다 (Armstrong et al., 1998).
염증-, 혈관형성-, 및 아폽토시스-관련 분자의 조절에 대한 검정
염증-관련 인자 (IL-1B, IL-2, IFN-μ, IL-6, IL-10, TGF-B1), 혈관형성-관련 인자 (TSP-1, VEGF), 아폽토시스-관련 인자 (Fas/Fas 리간드), 및 젤라티나제 (MMP-2, MMP-9)에 대한 단백질의 발현을 ELISA 검정을 이용하여 각막에서 측정하였다.
이러한 실험의 결과를 이제부터 기술한다. 어떠한 특정 이론에 구속시키고자 하는 것은 아니지만, (1) hMSC는 각막 염증의 랫트 모델에서 rMSC만큼 효과적이고; (2) 미리-활성화된 MSC는 MSC의 표준 제조물보다 더욱 효과적이며; (3) MSC의 1회 IC 주입은 낮은 용량에서 국소 적용보다 효과적인 것으로 고려된다.
hMSC로부터의 인간 단백질은 랫트 모델에서 rMSC만큼 효과적이지 않을 수 있다. 그러나, 단백질이 종을 가로질러 고도로 보존되고, hMSC가 염증의 다양한 뮤린 모델에서 작용함이 이전에 밝혀졌기 때문에 (Lee et al., 2009; Block et al.; 2009; Ohtaki et al.. 2008; Iso et al., 2007; Ortiz et al., 2007; Lee et al., 2006; Munoz et al., 2006) hMSC는 rMSC만큼 효과적인 것으로 여겨진다. 그러나, hMSC가 랫트에서 효과가 없는 것으로 관찰될 경우, hMSC 대신 rMSC를 이용할 수 있다.
TNF-α로 활성화된 MSC는 효과가 없거나 각막에서 독성 효과를 초래할 수 있다. TNF-α를 이용한 hMSC의 활성화는 염증을 조절하는 일부 인자 및 세포 생존을 증가시키는 그 밖의 인자를 현저하게 상향조절하는 것으로 예비 실험에서 관찰되었다 (Lee et al., 2009). 그러나, TNF-α 활성화가 효과가 없는 것으로 나타난 경우, MSC는 이전에 보고된 바와 같이 IFN-μ, IL-1B, 또는 이들의 조합물로 미리-활성화될 수 있다 (Ren, et al., 2008). 효과가 없는 경우, 변형되지 않은 MSC를 추가 실험을 위해 이용할 수 있다.
실시예 5: 각막의 염증 및 혈관신생은 활성화된 MSC에 의해 생산된 두 개의 치료적 단백질인 항-염증 단백질 TSG -6 및 항- 아폽토틱 단백질 STC -1의 적용에 의해 감소될 수 있다.
하기 실험은 각막의 염증 및 혈관신생을 치료하기 위해 TSG-6 및 STC-1을 이용하는 유효성을 평가하도록 설계되었다. 재조합 단백질의 투여는 MSC를 이를 필요로 하는 포유동물에 투여하는 것에 대한 대안이다. 실험을 표 2에 요약된 대로 수행하였다.
Figure 112017057811105-pat00002
간략하게, 재조합 TSG-6 (R & D Systems, Minneapolis, MN), 재조합 STC-1 (BioVendor Laboratory Medicine, Inc.; Czech Republic), 및 이들의 조합물을 적절한 전달 방법을 이용하여 랫트의 눈에 각각 적용시켰다. 국소 적용을 이용하는 경우, TSG-6의 용량은 1 내지 100 ㎍으로 다양할 수 있다 (Lee et al., 2009). 대안적으로, IC 주입을 이용하는 경우, 0.1 내지 10 ㎍의 투여량을 이용할 수 있다. 재조합 STC-1에 대해서도 동일한 범위의 용량을 시험하였다. 각각의 단백질의 최대 유효 용량을 측정하였다. 그 후, 단백질을 1:1 혼합물로 제조하고, 최대 유효 용량을 다시 측정하였다.
어떠한 특정 이론에 구속시키고자 하는 것은 아니지만 (1) TSG-6 또는 STC-1의 투여는 각막 염증을 억제하고 상피 상처 치유를 촉진하는데 용량-의존적 방식으로 유효하고; (2) 대안적으로, 1:1 혼합물의 투여는 단백질의 상승적 효과로 인해 보다 낮은 용량에서 유효할 수 있으며; (3) 어느 한 쪽의 단백질 또는 두 개 단백질 모두의 앞방내 투여는 국소 적용보다 낮은 용량에서 유효할 수 있다.
실시예 6: 각막 손상에 반응하여 hMSC에 의해 생산된 신규한 치료 인자
본 발명은 TSG-6 및 STC-1로만 제한되지 않는다. 즉, 현재 이용가능한 데이터는 MSC가 다른 치료적 유전자의 발현에 의해 조직 회복에 대해 이로운 효과를 제공한다는 가설을 배제시키지 않는다. 따라서, 각막 손상에 대한 랫트 모델에서 MSC에 의해 발현되는 추가의 치료적 유전자를 시험하기 위한 실험들을 설계할 수 있다. 도 14에 도시된 첨부 도식에 표시된 대로, 3개의 상보적 상으로 실험을 수행할 수 있다: I 상: 각막 손상에 대한 랫트 모델에 hMSC 이용, 처리된 각막으로부터 총 RNA 단리 및 종-특이적 마이크로어레이 상에서 총 RNA 검정 이후에 프로브의 교차-하이브리드화로부터 데이터 필터링. II 상: GFP (MSC의 분배를 위해 본 발명자들의 NCRR/NIH 센터로부터 이용가능함)를 발현시키는 랫트 MSC를 이용하여 생체 실험 반복, 각막 샘플의 효소적 분해, FACS 분류에 의해 GFP-발현 rMSC의 단리, 및 랫트-특이적 마이크로어레이를 이용한 RNA 분석. III 상: MSC 및 표적 세포로부터 RNA가 별도로 단리될 수 있도록 손상된 각막 상피 세포를 갖는 트랜스웰에서 공동-배양 실험 수행 (도 7 및 8). 세 개 상의 실험으로부터의 마이크로어레이 데이터를 이용하여 하기 기준에 따라 후보 치료적 유전자를 동정할 수 있다: (i) 손상된 각막 또는 각막 상피 세포와의 인큐베이션에 의해 hMSC 또는 rMSC에 의해 상향조절되는 유전자, (ii) 분비 단백질에 대한 유전자, 및 (iii) 항-염증 또는 면역억제 효과를 지닐 수 있음을 시사하는 기능을 갖는 유전자. 실시간 RT-PCR, ELISA 또는 웨스턴 블롯, MSC에서 siRNA 또는 렌티바이러스를 이용한 특이적 유전자의 녹다운, 차단 항체, 및 재조합 단백질에 의한 MSC의 대체를 이용하여 후보 유전자의 역할을 확인할 수 있다 (도 10 내지 13).
본원에 기재된 실험에 이용된 물질 및 방법을 여기에 기재한다.
각막 손상에 대한 랫트 모델에서 hMSC에 대한 검정
손상 직후에, hMSC (2x106개 세포/200 ㎕)를 어플리케이터에 넣어서 손상된 각막에서 2시간 동안 유지되게 하였다 (도 2a). 이식된 세포의 박리(shedding)를 막기 위해 랫트가 눈을 깜박이지 않도록 눈꺼풀을 봉합하였다. 당일, 1주일 후, 2주일 후, 및 3주일 후에, 각막을 절제하고, 균질화시키고 (PowerGen; Fisher Scientific), DNA 추출하고 (Phase Lock Gel; Eppendor/Brinkmann Instruments) 인간 유전체에 독특한 고도로 반복적인 Alu 서열에 대해 DNA를 검정하여 랫트의 눈에서 hMSC의 운명을 추적하였다 (도 9b). Alu 서열의 이용은 세포 당 약 500,000개의 복사체가 존재하므로 고도로 민감한 검정을 제공한다. 그러나, 예비 실험으로부터, 통상적인 절차의 이용은 인간 세포의 함량을 크게 과대 평가하는 것으로 나타났다. 따라서, 추출된 DNA에 대한 화학적 검정 및 각각의 조직의 실시간 PCR에 대한 표준 곡선에 기반한 개선된 프로토콜이 이용된다. 민감한 검정으로 고려되는 Alu 서열에 대한 검정은 랫트 조직에서 살아 있는 인간 세포를 검정하기 위해 GAPDH에 대한 인간 mRNA인 RNA (트리아졸 시약, Invitrogen)를 추출하였다 (도 9d). 상기 결과는 hMSC의 생착에 대한 정량적 데이터를 제공한다.
마이크로어레이에 의해 각막에서 인간 및 랫트 mRNA의 검정
손상된 랫트 각막에 적용된 hMSC에서 발생하는 변화 및 hMSC에 의해 야기된 랫트 각막에서의 변화를 조사하기 위해, RNA를 각막으로부터 단리시키고 (트리아졸; Invitrogen), 랫트 및 인간 마이크로어레이 둘 모두에 대해 검정하였다 (Affymetrix, Santa Clara, CA). 교차-하이브리드화를 위해 데이터를 필터링하고 (Ohtaki et al., 2008; Lee et al., 2009), dChip 프로그램으로 분석하고, 2 SD 변수로 표준화하였다. 교차-하이브리드화를 위해, 본 발명자들은 3개의 대조군을 필요로 한다: (i) 비히클로 처리된 손상되지 않은 랫트 각막, (ii) 비히클로 처리된 손상된 랫트 각막, 및 (iii) hMSC로 처리된 손상되지 않은 랫트 각막. hMSC에서 2배 이상 상향조절된 인간 유전자의 분석 후에, 본 발명자들은 후보 유전자를 선택하여 인간-특이적 실시간 RT-PCR 검정에 의해 데이터를 확인할 것이다.
실시간 PCR 및 ELISA 분석
후보 유전자가 배양된 hMSC에서 상향조절되는 지를 측정하기 위해, 실시간 PCR을 배양된 hMSC에서 수행하였다. 이중 가닥 cDNA를 합성하고 (Superscript III; Invitrogen) 실시간 PCR로 분석하였다 (ABI 7900, Sequence Detector; Applied Biosystems).
인간-특이적 프라이머를 상업적 공급원으로부터 수득하거나 유전자 서열로부터 설계하였다. 데이터를 상업적 공급원으로부터의 인간-특이적 ELISA 검정 또는 상업적 항체로부터 개발된 키트를 이용하여 추가로 증명하였다. 대안적으로, 단백질의 발현은 항체를 이용할 수 있는 웨스턴 블롯에 의해 증명된다.
재조합 단백질, siRNA, 및 차단 항체를 이용한 확인
재조합 단백질이 상기 선택된 후보 유전자에 대해 이용가능한 경우, 단백질이 MSC의 효과를 모방하는 지를 평가하기 위해 단백질을 랫트 모델에 이용하였다. 또한, 선택된 유전자가 siRNA 또는 렌티바이러스로 녹다운된 MSC를 시험하였다 (도 11e 및 f). 또한, 차단 항체를 이용할 수 있는 경우, 이들을 랫트 모델에서 시험할 수 있다 (도 13).
트랜스웰에서의 공동-배양으로부터 검정
도 7 및 8에 기재된 대로 hMSC 및 rMSC 둘 모두를 이용하여 실험을 수행하였다. 분리된 세포 분획을 먼저 마이크로어레이로 검정하고 후보 유전자의 역할을 상기대로 확인하였다.
이러한 실험의 결과를 여기에 기술한다. 어떠한 특정 이론에 구속시키고자 하는 것은 아니지만, (1) 추가의 각막-보호 유전자 중 하나 이상이 마이크로어레이 데이터로부터 동정될 수 있고; (2) 후보 유전자(들)로부터의 단백질이 랫트 모델 및 손상된 수정체 상피를 갖는 공동-배양액에서 증가된 수준으로 발현될 수 있으며; (3) 후보 단백질(들)의 적용이 각막 염증을 억제하는데 있어서 hMSC만큼 효과적이고; (4) 유전자를 발현시키지 않는 hMSC 및 차단 항체와 조합된 hMSC 둘 모두가 랫트 모델에서 이로운 효과를 제공하지 못하는 것으로 여겨진다.
실시예 7: 성체 줄기/전구 세포 ( MSC ) 로부터의 항-염증 및 항- 아폽토틱 단백질은 아폽토시스를 막고 염증을 억제함에 의해 각막을 손상으로부터 보호한다.
각막의 염증이 활성화 MSC에 의해 생산된 두 개의 치료적 단백질인 항-염증 단백질 TSG-6 및/또는 항-아폽토틱 단백질 STC-1의 적용에 의해 감소될 수 있는 지를 결정하기 위해 하기 실험을 설계하였다.
시험관내 STC-1의 항-아폽토틱 효과를 시험하기 위해, 인간 각막 상피 전구 세포(hCEP)를 에탄올로의 노출 후에 하기 중 하나와 함께 24시간 동안 배양시켰다: (a) 인간 MSC (hMSC)의 표준 배양액으로부터 조건화된 배지, (b) TNF-α와 24시간 인큐베이션시킴에 의해 치료적 인자를 발현하도록 미리-활성화된 hMSC로부터의 조건화된 배지, (c) rhSTC-1, (d) rhSTC-1에 대한 조건화된 배지 및 차단 Ab, 또는 (e) IgG. 신선한 배지 및 인간 진피 섬유모세포의 배양액으로부터 조건화된 배지 둘 모두를 대조군으로서 이용하였다. 인큐베이션 후에, 세포 생존력, 증식 및 아폽토시스를 MTT 검정, BrdU 흡수, 및 PI/아넥신 유동 세포계수법을 이용하여 평가하였다. 미리-활성화된 MSC 및 rhSTC-1으로부터의 조건화된 배지는 생존력을 향상시키고, 증식을 증가시키고, 손상된 hCEP의 아폽토시스를 억제함에 있어서 hMSC에서의 가장 큰 효과를 지니는 것으로 관찰되었다 (도 15).
생체내 TSG-6의 항-염증 효과를 시험하기 위해, 에탄올 적용 및 각막과 윤부 상피의 기계적 죽은조직제거술에 의해 각막 표면 염증을 루이스 랫트에서 생성하였다. 손상 직후에, rhTSG-6 (2ng-2ug) 또는 동일한 부피의 PBS를 전방에 주입하였다. 각막에 대한 효과를 세 가지 방식으로 측정하였다: (1) 투명도 및 혈관신생 (NV)의 소견에 기반한 슬릿-램프 생체현미경검사에 의한 육안 조사, (2) 염증 세포의 침윤에 대한 조직학적 분석 (헤마톡실린-에오신 염색), (3) 뉴트로필의 침윤에 대한 미엘로퍼옥시다제 (MPO) 검정, (4) 염증-관련 케모카인 및 사이토카인에 대한 ELISA 및 실시간 PCR, (5) 전체 및 활성 MMP-9에 대한 겔 지모그래피 및 ELISA. WBC 계수 및 MPG 평가에 의해 전신 순환에서의 염증 마커의 변화를 또한 측정하였다. 각막 혼탁도 및 혈관신생이 PBS-처리된 대조군에 비해 TSG-6-처리된 각막에서 현저하게 감소되었음이 관찰되었다 (도 16). 염증 세포의 침윤 및 MMP-9의 발현은 PBS-처리된 대조군에 비해 TSG-6-처리된 각막에서 현저하게 감소하였다 (도 17). 또한, 0.002ug/ml 이하의 농도의 TSG-6이 각막 혼탁도, 염증, 및 MMP-9 생산을 감소시키는데 효과적인 것으로 관찰되었다 (도 19). 더욱이, TSG-6의 투여가 염증 사이토카인 및 케모카인의 발현을 감소시켰음이 관찰되었다 (도 20, 21, 22).
본원에 제시된 결과는 손상 신호에 반응하여 MSC에 의해 생산된 치료적 단백질이 각막 상피 전구체의 생존력 및 증식을 증가시키고 각막 표면에서 염증을 억제함에 의해 손상으로부터 각막 표면을 보호할 수 있음을 입증한다.
실시예 8
1. 망막의 변성 질환에서 항- 아폽토틱 치료제로서 성체 줄기/전구 세포 (MSC) 및 STC-1의 잠재력
1.1. MSC는 망막의 변성 질환을 회복시킨다. 골수-유래 설치류 MSC를 유전성 망막 변성의 마우스 및 랫트 모델에서 망막하 주입을 통해 이식시켰다 (Pan, et al., Acta Biochem . Biophys . Sin (Shanghai), Vol. 40, No. 3, pgs. 202-208 (2008); Inoue, et al, Exp . Eve Res., Vol. 85, No. 2, pgs. 234-241 (2007); Arnhold, et al., Graefe's Arch. Clin . Exp . Ophthalmol.. Vol. 245, No. 3, pgs. 414-422 (2007); Kicic, et al., J, Neurosci, Vol. 23, No. 21, pgs. 7742-7749 (2003)). 조직학적 분석에 의해 ONL의 해부학상 보존이 확인되었다 (Pan, 2008; Inoue, 2007; Arnhold, 2007). 또한, 망막전위도검사 (Inoue, 2007)로부터 MSC 요법을 이용한 망막 기능의 보존을 확인하였다. 망막하 전달된 설치류 MSC를 이용한 이러한 공개된 결과는 망막 변성의 회복에 있어서 MSC의 포지티브 치료 효과를 시사한다. 비록 일부 연구에서 분비 인자의 생산을 강조하고 있으나 (Inoue, 2007), 작용 또는 분비 인자의 메카니즘은 규정되지 않았다. 추가로, 세포 치료제의 망막하 전달은 중요한 단점을 갖는다: 망막하 세포 치료 이후에 망막 박리 (Pan, 2008) 및 주입 부위에서 단지 광수용체의 국소 회복 가능성 (Arnhold, 2007).
1.2. MSC는 항- 아폽토틱 단백질 STC -1의 분비에 의해 조직을 회복시킬 수 있다. 다양한 질환 모델에서 골수 (중간엽 줄기 세포, 골수 간질 세포, MSC)로부터의 성체 줄기/전구체의 치료적 이익이 수차례 알려져 왔다 (Prockop, Science, Vol. 276, pgs. 71-74 (1997); Prockop, et al; Proc . Nat. Acad Sci.. Vol. 100, Supp. 1, pgs. 11917-11923 (2003)). 세포를 생착시키고 분화시켜 손상된 세포를 대체할 수 있고, 더욱 빈번하게는 이들은 치료 인자를 발현시키기 위해 손상된 조직으로부터 신호에 의해 활성화됨에 의해 기능적 개선을 제공한다 (Lee, Cell Stem Cell (2009)). MSC에 의해 생산된 치료 인자에는 항-아폽토틱 단백질 스타니오칼신-1 (STC-1)이 있다. STC-1은 MSC에 의해 분비된 가용성 인자가 UV-조사된 피부 섬유모세포의 시험관내 모델에서 아폽토시스를 감소시킬 수 있었다는 가설을 시험했던 실험에서 본 발명자들의 연구에 의해 동정되었다. 섬유모세포 아폽토시스는 MSC의 트랜스웰 공동-배양에 의해 감소되는 것으로 나타났다. 마이크로어레이 분석은 MSC에 의한 항-아폽토틱 단백질 스타니오칼신-1 (STC-1)의 증가된 발현을 검출하였는데, 이러한 발견은 웨스턴 블롯 분석에 의해 나중에 확인되었다. 이러한 결과는 STC-1에 대한 항체의 첨가가 MSC의 능력을 억제하여 UV-조사된 섬유모세포의 아폽토시스를 감소시켰을 때 추가로 입증되었다 (Block, et al., Stem Cells, Vol. 27, No. 3, pgs. 670-681 (2009)). 추가로, 재조합 인간 STC-1은 A549 세포에서 저산소증 유도된 아폽토시스를 감소시킬 수 있었다 (Block, 2009). 당업자는 STC-1의 항-아폽토틱 및 항-괴사 효과를 설명하는 STC-1의 작용을 보고하였으며, 이러한 작용은 미토콘드리아 언커플링 단백질 2 (UCP2)의 유도를 통해 ROS 생산에서의 감소를 초래하는 산화 포스포릴화의 언커플링이다 (Wang, et al., J. Leukoc . Biol., Vol. 86, No. 4, pgs. 981-988 (2009)). 우리의 동업자들은 또한 최근에 폐암 세포주에서 보여진 STC-1의 항-아폽토틱 효과가 UCP2 의존성 ROS 감소에 의한 것임을 증명하였다 (Ohkouchi et al, Proc . Nat. Acad . Sci ., in press). STC-1은 또한 랫트 및 인간 둘 모두에서 뇌허혈에 반응하여 뉴런에서 상향조절되고 (Zhang, et al., Proc . Nat. Acad . Sci ., Vol. 97, No. 7, pgs. 3637-3642 (2000)) 시험관내 저산소증으로부터 신경 세포를 보호하는 것으로 나타났다 (Zhang, 2000). 포식세포 화학주성을 억제하고 (Kanallis, et al., Am. J. Physiol . Renal Physiol . Vol. 286, No. 2, pgs. 356-362 (2004)), 백혈구의 내피세포통과(transendothelial) 이동을 조절하고 (Chakraborty, et al., Am. J. Physiol . Renal Physiol ., Vol. 292, No. 2, pgs. 895-904 (2007)), T-세포 침윤을 감소시킴에 의해 (Huang, et al., Am. J. Pathol.. Vol. 174, No. 4, pgs. 1368-1378 (2009)) 염증을 억제하는 능력을 포함하는 (Sheik-Hamad, et al., Am. J. Physiol . Renal. Physiol ., Vol. 298, No. 2, pgs. 248-254 (2010)) STC-1의 그 밖의 작용이 기재되어 있다. 이러한 관찰은, 망막 변성의 모델에서 이전에 관찰된 MSC의 치료적 이익이 (Pan, 2008; Inoue, 2007; Arnhold, 2007) 동물 모델 및 환자 둘 모두에서 질환의 두드러진 특징인 아폽토시스를 감소시키는 세포 분비 STC-1에 의해 설명되었음을 시사하였다 (Dunaief, 2002; Xu, 1996; Cottet, 2009; Doonan, 2004, Yu, 2004; Katai, 1999; Katai, 2006).
이러한 실험은, (a) 변성 망막에서 광수용체 사멸을 감소시키기 위해 골수로부터 용이하게 수득될 수 있는 인간 성체 줄기/전구 세포 및 항-아폽토틱 단백질 STC-1의 유리체내 투여; 및 (b) 분자 및 세포 메카니즘을 설명하기 위해 이전에 이용되었던 한 벌의 고도로 민감한 검정 및 실험 프로토콜을 이용하며, 이에 의해 MSC는 인간 질환의 다른 동물 모델에서 치료적 이익을 제공한다.
접근법
목표 1. 본 발명자들이 STC -1의 투여 용량, 횟수 및 빈도를 최적화함에 의해 망막 변성의 로얄 컬리지 오브 서젼 (RCS) 랫트 모델에서 STC -1의 유리체내 투여를 이용한 예비 결과를 개선시킬 수 있다는 가설을 시험함.
1.1. 이론. STC-1의 유리체내 투여가 생체내 광수용체 변성을 지연시키는 지를 측정하기 위해, 두 마리의 망막 변성 설치류 모델을 이용하였다. S334ter-3 로돕신 유전자이식 랫트를 출생 9일 후 (P9) 및 P12에 다시 1 ㎍ STC-1의 유리체내 주입으로 치료하였다. P19일에 랫트를 희생시켰다. 조직학적 분석은 손상되지 않은 (UI) 대조군에 비해 증가된 외핵 (ONL) 두께를 나타내었다. 하위 (inf), 상위 (sup), 및 총 망막의 평균 ONL 두께를 문헌[Lewin, et al., Nat. Med . Vol. 4, No. 8, pgs. 967-971 (1998)]에 이전에 개시된 대로 정량하였다. 총 망막 ONL 두께가 STC-1 치료된 랫트 (n=4, p=0.018)에서 현저하게 증가하였다 (도 23).
추가로, 망막 변성의 로얄 컬리지 오브 서젼 (RCS) 랫트 모델을 시험하였다. 이러한 연구의 일부로서, 광수용체 회복을 검출하기 위한 조직학적 및 기능적 분석과 함께 이용될 수 있었던 유전자 발현 검정을 개발하였다. 광수용체 특이적 유전자의 발현을 다양한 시점에 RCS 랫트로부터 단리된 망막에서 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR)에 의해 시험하였다. 광수용체 유전자 발현은 문헌[LaVail, et al., Exp. Eye Res., Vol. 21 , No. 2, pgs. 167-192 (1975)]에서 이전에 기재된 하락과 유사한 비율로 RCS 랫트에서 시간 추이에 따른 감소를 나타내었다 (도 24).
광수용체 생존력을 정량하기 위한 기반으로서 이러한 검정을 이용하여, STC-1의 유리체내 투여가 광수용체 생존력을 개선시킬 것이라는 가설을 시험하였다. 랫트는 2.5 ㎍의 STC-1을 유리체내 투여받았다. 주입은 ONL 하락의 대략적인 개시 시점인 P21에 일어났다 (LaVail, 1975). 랫트를 희생시키고, 조직을 P40에 회수하였다. 랫트의 망막으로부터의 총 RNA를 RNeasy 미니 키트 (Qiagen)를 이용하여 추출하였다. 1 ㎍의 총 RNA를 이용하여 cDNA를 역전사 (Super Script III; Invitrogen)에 의해 생성하였다. Taq Man 유니버셜 PCR 마스터 믹스 (Applied Biosystems)를 이용하여 실시간 증폭을 수행시켰다. 18S rRNA 프로브 (Taq Man)를 유전자 발현의 표준화에 이용하였다. 유전자 발현 분석은 PBS 주입된 대조군에 비해 STC-1 치료된 동물에서 광수용체 유전자 발현의 현저한 증가를 나타내었다 (도 25).
1.2. 설계. STC-1의 유리체내 주입은 망막 변성의 두 개의 설치류 모델에서 광수용체 변성을 감소시켰다. 하기 기재된 대로, 다음 세트의 실험은 RCS 랫트에서 STC-1의 용량, 투여 횟수, 및 투여 빈도를 최적화하는 것에 관한 것이다.
1.2.1. STC -1의 용량 최적화. 먼저, 광수용체 생존력을 가장 효과적으로 보존하는 STC-1의 용량 (STC-10ptD)을 결정하였다. 표 3에 요약된 대로 실험을 수행하였다. 이러한 실험을 위해, STC-1을 P21에 주입시키고, 조직을 P40에 회수하였다. 광수용체 유전자 발현에 기반하여 결과를 평가하였다 (도 24 참조).
표 3. STC -1의 용량. P21 (출생 21일 후); P40, (출생 40일 후). qRT -PCR, 도 24에 도시된 대로 광수용체 유전자의 경우 ; 다른 눈, 내부 대조군으로서 주입된 다른(반대쪽) 눈을 나타낸다.
Figure 112017057811105-pat00003
병행 실험에서, 하기 표 4에 요약된 대로, 최적 투여 횟수를 결정할 것이고 2회 주입이 1회보다 효과적인 지를 결정할 것이다.
표 4. 주입일과 치료 횟수.
Figure 112017057811105-pat00004
1.2.2. STC - 1 OptD 및 STC - 1 OptT 에 의한 조직학적 및 기능적 치료적 회복.
PBS 주입된 대조군에 비해 망막 변성을 회복시키는 STC-1OptD 및 STC-1OptT의 능력을 시험하기 위해 조직학적 및 기능적 시험을 이용하였다. 문헌[Lewin, et al., 1998]에 기재된 대로 ONL 두께를 정량하기 위해 고정된 눈이 보내졌다. 망막전위도 (ERG) 분석을 문헌[Ren, et al., Exp . Eve Res.; Vol. 70, No. 4, pgs. 467-473 (2000)]에 이전에 기재된 대로 수행하였다.
표 5. 광수용체 회복의 조직학적 및 기능적 시험.
Figure 112017057811105-pat00005
이정표: 망막 변성을 회복시키는 STC-1의 능력의 해부학적 및 기능적 측정
목표 2. STC -1의 지속된 분비가 단백질 단독의 투여보다 효과적일 것이라는 근거하에 다량의 STC -1을 분비하도록 배양액에서 미리-활성화된 MSC의 유리체내 투여가 광수용체 생존력을 개선시킬 것이라는 가설 시험.
2.1. 이론. 세포 치료가 단백질 단독의 치료에 비해 광수용체 생존력의 보다 큰 회복을 제공할 수 있는 지를 결정하기 위해, 유리체내 투여된 인간 MSC가 랫트 유리체강에서 생존할 수 있다는 가설을 시험하였다. 센터 포 더 프리퍼레이션 앤 디스트리부션 오브 어덜트 스템 셀 (http://medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html)로부터 동결된 한 계대 인간 중간엽 줄기 세포 (hMSC)의 바이알을 입수하였다. 24시간 동안 회복시킨 후에, hMSC를 100개 세포/cm2의 밀도로 플레이팅하고, 16% 우태아 혈청 (FBS)를 지닌 완전 배양 배지 (CCM)에서 약 70% 컨플루언스에 도달할 때까지 8일 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 3회 계대 세포를 모든 실험에 이용하였다.
1X105 인간 MSC의 유리체내 주입을 출생 21일 후에 수행하였다. 주입한 지 4일 후에, 눈에서 세포핵을 빼내고 전체 안구로부터 RNA를 추출하여 얼마나 많은 인간 세포가 안구강에 남아 있는지를 평가하였다. 인간 GAPDH (hGAPDH)의 발현을 상기 기재된 대로 qRT-PCR에 의해 측정하였고, 이에 의해 랫트 눈에서 어떠한 생존한 인간 세포의 징후를 제공하였다. 생성된 표준 곡선에 기반하여 (도 26, 좌측 패널), 주입된 세포의 10-20%로 추정되는 세포가 주입한 지 4일 후에 생육가능한 채로 남아 있었다 (도 26, 우측 패널). 이러한 데이터는, 다량의 STC-1를 분비하도록 배양액에서 미리-활성화된 MSC에 의한 STC-1의 지속된 분비가 단백질 단독의 투여보다 큰 치료적 이익을 지닐 것이라는 가설을 시험하기 위한 근거를 제공한다. 추가로, 항-염증 단백질 TSG-6 (Lee, 2009), 신경영양 인자 (Li, et al., Graefe's Arch. Clin . Exp . Ophthalmal ., Vol. 247, No. 4, pgs. 503- 514 (2009)), 예컨대 CNTF, bDNF, 또는 bFGF, 또는 망막-보호성 단백질 LIF (Bartosh , et al.. Proc . Nat. Acad . Sci.. Vol. 107, No. 31, pgs. 13724-13729 (2010); Joly, et al; J. Neurosci., Vol. 28, No. 51, pgs. 13765-13774 (2008))을 포함하는 MSC로부터 분비된 그 밖의 인자가 광수용체 생존력을 보존하기 위해 STC-1와 함께 작용할 수 있다.
MSC는 배양액에서 자극되거나 숙주 세포로부터의 손상 신호에 의해 생체내 활성화되지 않는 경우, 표준 배양 조건에서 비교적 낮은 수준의 치료적 단백질을 발현시킨다 (Lee, 2009; Bartosh, 2010). 본 발명자들의 연구실로부터의 최근의 보고서는, MSC를 3D 구상체로서 배양하는 것이 세포를 활성화시켜 STC-1을 포함하는 다량의 치료적 분자를 제공함을 나타내었다 (Bartosh, 2010). MSC의 표준 배양 제조물에 비해, 세포를 25,000개 세포의 3D 구상체로서 배양하는 것은 (Sph 25K) STC-1의 분비를 약 20배만큼 증가시켰다. 구상체를 단층 MSC에 비해 높은 수준의 STC-1을 분비하는 능력을 보유한 MSC 구상체 분리 세포내로 (Sph 25k DC) 분리시킬 수 있다 (도 27).
2.1.1. Sph 25k DC의 용량 최적화. 먼저, 광수용체 생존력을 가장 효과적으로 보존하는 Sph 25k DC의 용량 (Sph 25k DC0ptD)을 결정하였다. 표 6에 요약된 대로 실험을 수행하였다. 이러한 실험을 위해, 광수용체 유전자 발현에 기반하여 Sph 25k를 (도 24 참조) 주입하였다.
표 6. Sph 25k DC의 용량. 도 24에 도시된 대로 광수용체 유전자에 대한 qRT-PCR 분석.
Figure 112017057811105-pat00006
잠재적 함정 및 대안적인 방법. MSC가 Sph 25k DC보다 더 큰 회복을 제공하는 경우, MSC를 후속 실험에 이용하였다.
2.1.2. Sph 25k DC의 투여 횟수 및 빈도의 최적화. 하기 표 7에 요약된 대로 수행된 병행 실험에서, 최적 투여 횟수를 결정하고 2회 주입이 1회보다 효과적인 지를 결정하였다.
표 7. Sph 25k DC의 투여 횟수 및 빈도.
Figure 112017057811105-pat00007
2.1.3. Sph 25k DC OptD 및 Sph 25k DC 0ptT 의 조직학적 및 기능적 치료 효과. 하기 표 8에 기재된 대로 수행된 조직학적 및 기능적 시험을 이용하여 PBS 대조군에 비해 망막 변성을 회복시키는 Sph 25k DCOptD 및 Sph 25k DC0ptT의 능력을 시험하였다.
표 8. 광수용체 회복의 조직학적 및 기능적 시험.
Figure 112017057811105-pat00008
이정표: Sph 25k DC의 회복 효과의 해부학적 및 기능적 증거
목표 3. RCS 랫트에서 광수용체의 회복을 입증하는 본 발명자들의 예비 결과가, STC -1이 언커플링 산화 포스포릴화에 의해 아폽토시스를 억제하고 활성 산소종을 감소시킨다는 이전의 관찰에 의해 설명된다는 가설을 시험.
3.1 이론. RP를 갖는 환자는 간상 광수용체 사멸 이후 산화성 손상으로 인해 추체 광수용체 사멸을 겪는 것으로 제안되었다 (Shen, 2005; Usui, Mol . Ther ., Vol. 17, No. 5, pgs. 778-786 (2009)). 광수용체 변성이 발생함에 따라 증가된 수준의 산소가 RCS 랫트를 포함하는 RP의 설치류 모델에서 관찰되었다 (Yu, 2004; Yu, et al., Invest. Ophthalmol . Vis . Sci.. Vol. 41 , No. 12 pgs. 3999-4006 (2000)). 증가된 수준의 산소로 인해, 광수용체애 대한 산화적 손상이 RP의 소형 (Komeima, 2006) 및 대형 (Shen, 2005) 동물 모델 둘 모두에서 관찰되었다. 추가의 증거는, 항산화제 치료가 RP의 동물 모델에서 광수용체 사멸을 늦춤을 나타내는 연구를 포함한다 (Komeima, 2007). 초기에 산화적 RPE 손상의 시험관내 모델에서 가설을 시험하였다. 세포주 ARPE-19 (ATCC Catalog No. CRL-2302)로부터의 인간 RPE 세포를 문헌[Kim, et al., Korean J. Ophthalmol.. Vol. 17, No. 1, pgs. 19-28 (2003)]에 이전에 기재된 대로 450 μM의 과산화수소로 손상시켰다. 하기 표 9에 요약된 대로, 손상 1시간 후에, 세포를 250ng/ml의 STC-1, 또는 비히클 (대조군)로 처리하였다.
표 9. 과산화수소-손상된 ARPE-19의 STC-1 처리를 이용한 시험관내 연구
Figure 112017057811105-pat00009
처리 후 세포를 전-아폽토틱 유전자의 발현 (카스파제 3/7), 세포 사멸 (세포의 아넥신 V & PI 염색) 및 향상된 세포 생존력 (미토콘드리아 효소 MTT의 증가된 활성)에 대해 평가하였다. 카스파제 활성의 검출을 문헌[Sharma, et al., Invest. Ophthalmol . Vis . Sci ., Vol. 49, No. 11, pgs. 5111-5117 (2008)]에 기재된 대로, 그리고 아넥신/PI 정량을 문헌[Bartosh, et al., Proc . Nat. Acad . Sci ., Vol. 107, No. 31, pgs. 13724-13729 (2010)]에 기재된 대로 수행하였고, MTT 전환을 문헌[Mester, et al., J. Mol . Neurosci . (2010)]에 이전에 기재된 대로 측정하였다.
손상 후에, STC-1을 이용한 처리는 비히클 대조군에 비해 아폽토시스를 감소시켰고 세포 생존력을 향상시켰다 (도 28).
추가로, RCS 랫트에서 가설을 시험하였다. RCS 랫트에서 P21에 2.5 ㎍의 STC-1의 유리체내 주입 후에, 전-아폽토틱 단백질을 엔코딩하는 전사체인 BAX의 유전자 발현이 qRT-PCR에 의해 측정된 바와 같이 P40에 RCS 망막에서 현저하게 감소하였다 (도 29). 따라서, 이러한 결과는, STC-1이 RCS 망막 아폽토시스를 억제한다는 견해와 일치한다. 그 다음, 이러한 결과가 언커플링 산화 포스포릴화에 의해 활성 산소종을 감소시키는 STC-1의 능력 때문이라는 가설을 시험하였다.
3.2. 설계. 표 9에 요약된 대로 시험관내 실험을 수행하였다. 표 10에 요약된 대로 생체내 실험을 수행하였다. 먼저, 과산화수소 유도된 ARPE-19 손상의 시험관내 모델 (Kim, 2003)을 이용하였다. 시험관내 아폽토시스는 TUNEL 염색, 락테이트 생산 (Tanito, Invest. Ophthalmol . Vis . Sci.. Vol. 46, No. 3, pgs. 979- 987 (2005)), 및 qRT-PCR을 이용하여 평가되었다. 활성 산소종, 또는 ROS의 수준을 미토콘드리아 잠재력의 측정을 이용하여 평가하였다. qRT-PCR을 이용하여 UCP2에서의 변화를 또한 평가하였다.
생체내 연구를 위해, RCS 랫트의 망막에서의 아폽토시스를 TUNEL 염색 (Mizukoshi, Exp . Eve Res., Vol. 91 , No. 3, pgs. 353-361 (2010)) 및 qRT-PCR을 이용하여 평가하였다. 추가로, ROS의 수준을 문헌[Tarpey, et al., Am. J. Physiol. Regul . Inteer . Comp. Physiol ., Vol. 286, No. 3, pgs. 431-444 (2004)]에 이전에 기재된 대로 조직 아코니타제 활성을 측정함에 의해 평가하였다.
표 10. RCS 랫트에서 STC -1의 유리체내 투여를 이용한 생체내 연구
Figure 112017057811105-pat00010
실시예 9.
15마리의 마우스를 이소플루란 흡입에 의해 마취시켰다. 각막에 화학적 손상을 입히기 위해, 100% 에탄올을 윤부를 포함하는 전체 각막에 30초간 적용시킨 다음 10 ml의 평형 염 용액으로 세정하였다. 그 후, 전체 각막 및 윤부 상피를 메스날을 이용하여 기계적으로 찰과시켰다 (참조: Oh., et al., Proc . Nat. Acad , of Sci., Vol. 107, No. 39, pgs. 16875-16880 (Sept. 28, 2010)). 두 마리의 마우스를 대조군으로서 이용하였다. 직후에, 5 ㎕의 PBS를 10마리의 마우스에게 정맥내 또는 복막내 투여하고, 2 ㎍/5 ㎕의 TSG-6을 5마리의 각막 표면에 국소적으로 적용시켰다. 그 후, 마우스의 눈꺼풀을 눈꺼풀 가장자리의 외측 3/1 지점에서 한 땀의 8-0 견 봉합사로 꿰맸다.
3일 후, 마우스를 희생시키고, 각막을 절제하였다. 그 후, 각막을 소형 단편들로 절단하고, 프로테아제 억제제를 함유하는 150 ㎕의 조직 추출 시약 (Invitrogen)으로 용해시켰다. 그 후, 샘플을 얼음 상에서 음파 처리하고 2회 원심분리시켰다 (4℃에서 20분간 15,000 x g). 상청액을 미엘로퍼옥시다제 (MPO)에 대해 상업적 ELISA 키트로 검정하였다 (MPO ELISA 키트, Hy Cult Biotech).
도 30에 도시된 대로, TSG-6의 국소 투여는 대조군에 비해 각막 염증을 효과적으로 억제하였다.
실시예 10
현재 무균 염증은 심근경색증, 뇌졸중, 알츠하이머병, 및 죽상경화증을 포함하는 다수의 질환에서 중요한 역할을 하는 것으로 인지된다 (Chen, et al., Nat. Rev. Immunol ., Vol. 10, No. 12, pgs. 826-837 (2010); Rock, et al., Ann. Rev. Immunol, Vol. 28, pgs. 321-342 (2010); Spite, et al., Circ . Res.. Vol. 107, No. 10, pgs. 1170-1184 (2010)). 무균 염증의 분자 및 세포 반응은 전-염증 사이토카인의 발현을 상향조절하는 적어도 세 개의 세포내 경로를 활성화시키는 상주 포식세포 상에서 패턴 인지 수용체 (PRR)를 통해 신호를 보내는 손상-관련 분자 패턴 (DAMP)으로서 지칭되는 20개 이상의 비미생물 내인성 자극을 포함한다. 당 분야에서의 집중된 관심에도 불구하고, 시험관내 역할로부터 동정된 일부 DAMP가 생체내에서 중요할 역할을 수행하는지, 일부 DAMP가 중복 역할을 수행하는지, 상이한 조직이 상이한 DAMP를 이용하는지를 포함하는 일련의 중요한 문제들은 여전히 해결되지 않고 있다 (Matzinger, Nat. Immunol ., Vol. 8, No. 1, pgs. 11-13 (2007)).
각막은 생체내 및 시험관내 실험적 조작으로의 접근이 용이하므로 무균 염증을 조사하기 위한 매력적인 모델 시스템이다. 더욱이, 무균 염증은 윤부 줄기 세포 결핍, 화학적 화상, 및 알레르기 또는 자가면역 각막염 (Wagner, Surv . Ophthalmol., Vol. 41, No. 4, pgs. 275-313 (1997); Krachmer, Cornea, 2nd. Ed., Vol. 1, pgs 1 179-1308)을 포함하는 각막 질환에서 발생한다. 무균 염증에 대한 시간적 연결 및 자극을 조사하기 위해, 각막을 알코올에 노출시킨 다음 찰과시켜 줄기 세포를 함유하는 각막 및 윤부의 상피를 제거시킨 모델을 이용하였다. 손상은 두 상이한 상의 뉴트로필 침윤을 일으키는 것으로 관찰되었다: 15 mm에서 시작하여 4 내지 8시간 사이에 플래토에 도달하는 소형 초기 I 상 및 24시간 내지 48시간에 피크를 나타내는 훨씬 큰 두 번째 II 상. 두 개의 상의 분석으로부터, I 상은 뉴로펩티드 세크레토뉴린 및 아마도 그 밖의 신호에 의해 자극되는 것으로 나타났다. 뉴트로필 침윤의 두 번째 더 큰 II 상은, 각막 간질의 손상된 각막세포에서 합성되고 방출되며 상주 포식세포를 활성화시키는 DAMP로서 작용하는 소형 열쇼크 단백질인 HSPB4에 의해 자극되었다.
방법
동물
루이스 랫트 (LEW/Crl)를 찰스 리버 래보러토리 (Wilmington, MA)로부터 구입하였다. HSPB4 녹아웃 마우스 (Cryaa-1-)는 표적화 유전자 붕괴에 의해 내셔널 아이 인스티튜트에서 최초에 생성되었고 129 S6/SvEvTac 백그라운드에서 유지되었다 (Brady, et al. Proc . Nat. Acad . Sci.. Vol. 94, No. 3, pgs. 884-889 (1997)). 129S6/SvEvTac, C57BL/6 (C57BL/6J) 및 CD44 녹아웃 마우스 (CD44h-1-; B6.Cg-Cd44tmlHbg/J)를 잭슨 래보러토리 (Bar Harbor, ME)로부터 구입하였다. 모든 동물을 인스티튜셔널 애니멀 케어 및 유스 커미티 오브 텍사스 에이&엠 헬쓰 사이언스 센터 컬리지 오브 메디슨에 의해 승인된 프로토콜하에 이용하였다.
손상 및 치료의 동물 모델
100% 에탄올을 윤부를 포함하는 전체 각막에 30초간 적용시킨 다음 10 ml의 평형 염 용액으로 세정함에 의해 손상시켰다. 그 후, 전체 각막 및 윤부 상피를 메스날을 이용하여 기계적으로 찰과시켰다.
재조합 인간 SN (Polypeptide Laboratories, Hillerod, Denmark) 또는 HSPB4 (Enzo Life Sciences, Plymouth Meeting, PA)의 주입을 위해, PBS 중 2 ㎕의 단백질 (2 ㎕ PBS 중 0.2 ng SN 또는 2 ㎕ PBS 중 100 ng HSPB4; 손상시킨 지 15분 후에 소정량의 SN 또는 HSPB4가 각막에서 검출되었다)을 32 게이지 바늘을 이용하여 관자 윤부에 가까운 각막 간질내에 주입시켰다. 단백질을 사용 전에 제조자의 지시에 따라 내독소 결합 컬럼에 의해 정제 및 살균시켰고 (EndoClear, blue; Hycult Biotech Inc. Plymouth Meeting, PA), 리뮬러스 변형세포 용해물 키트 (Hycult Biotech Inc.) 및 이.콜라이 HCP ELISA 키트 (Cygnus Technologies, Southport, NC)를 이용하여 검출가능한 수준의 그램-네거티브 박테리아 내독소 (<0.01 EU/ml) 또는 단백질 (1 ng/ml)은 없는 것으로 조사되었다.
포식세포 고갈을 위해, 100 ㎕의 클로드로네이트-캡슐화 리포좀 (현탁액 1 ml에 대해 5 mg의 클로드로네이트; Encapsula Nano Sciences, Nashville, TN) 또는 동일한 부피의 PBS-캡슐화 리포좀을 -2일 (손상 2일 전) 및 0일 (손상 당일)에 윤부에 가깝게 결막하 주입하였다. 각막을 둘러싼 원형 수포가 형성되도록 주입을 네 개의 사분면 상에 (각각 25 ㎕) 분배시켰다.
신경 끝으로부터 SN의 방출을 차단하기 위해, 등장성 염수 중 20 ㎕의 2 mM 딜티아젬 용액 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 손상시키기 15분 전에 각막에 국소적으로 적용시켰다 (Gonzalez, et al., Invest. Ophthalmol . Vis . Sci ., Vol. 34, No. 12, pgs. 3329-3335 (1993). 각막에서 HSPB4를 차단하기 위해, 랫트 HSPB4에 대한 마우스 모노클로날 또는 토끼 폴리클로날 항체 (100 ㎕ PBS 중 10 ㎍ 또는 50 ㎍; Abeam, Cambridge, MA)를 손상 전에 윤부 오른쪽에 가깝게 결막하 주입하였다. 동일한 농도의 아이소형 lgG를 또한 대조군으로서 주입하였다.
손상된 각막에서 TLR2 억제의 효과를 평가하기 위해, rhTSG-6 (5 ㎕의 PBS 중 2 ㎍; R&D Systems, Minneapolis, MN) 또는 동일한 부피의 PBS를 손상 직후 랫트 눈의 전방에 주입시켰다.
세포 및 세포주
뮤린 포식세포 (RAW 264.7)를 ATCC (Rockville, MD)로부터 입수하였다. 인간 배아 신장 (HEK) 293 세포를 인간 TLR2 또는 TLR4를 발현시키는 벡터 및 알칼리 포스파타제 리포터 유전자를 발현시키는 벡터로 InvivoGen으로부터 구입한 유도가능한 NF-kB 프로모터 (HEK-Blue™ -hTLR2 및 HEK-Blue™ -hTLR4; San Diego, CA)의 조절하에 트랜스펙션시켰다. TLR2 또는 TLR4를 발현시키지 않는 대조군 세포주도 입수하여 이용하였다 (HEK-Blue™- Null1). 인간 CD44 (Origene, Rockville, MD) 또는 PCDNA 3.1 대조군 벡터 (Invitrogen)를 발현시키는 안정한 세포주를 생성시켰다. 일차 인간 각막세포를 ScienCell (Carlsbad, CA)로부터 입수하고, 5회 계대로 이용하였다.
세포 손상 유도
시험관내 손상된 세포의 효과를 조사하기 위해, 괴사 각막 조직 추출물을 제조하였다. 랫트 각막을 모터-구동 균질화기를 이용하여 PBS (하나의 각막에 대해 100 ㎕)에서 균질화시킨 다음 5회 동결-해동 사이클 및 37℃에서 5시간 동안 두었다 (Chen., et al., Nat. Med ., Vol. 13, No. 7, pgs. 851-856 (2007). 12000 rpm에서 5분간 원심분리한 후에, 상청액을 괴사 추출물로서 제조하였다. 괴사 추출물의 일부를 열-처리하였다 (100℃, 20분). 괴사 추출물을 1:10 희석으로 배양액에서 세포와 함께 2시간 동안 인큐베이션시켰다. HSPB4의 효과를 평가하기 위해, HSPB4에 대한 항체 (10 ㎍ 또는 50 ㎍) 또는 아이소형 IgG 항체를 또한 배양액에 첨가하였다.
sHSP 및 SN의 효과를 평가하기 위해, 결정체 (HSPB4, HSPB5, βB 결정체; 0.001 내지 10 ㎍/ml) 또는 SN (0.1 내지 10 ng/ml)을 배양액에 첨가하고, 배양액을 2시간 동안 인큐베이션시켰다. TSG-6의 효과를 조사하기 위해, 100 ng/ml 또는 500 ng/ml의 rhTSG-6을 배양액에 첨가하였다. sHSP의 박테리아 또는 LPS 오염 가능성을 제외시키기 위해, 모든 시험관내 실험을 LPS의 중화를 위한 폴리믹신 B (10 ㎍/ml)의 존재하에 수행하였다. 더욱이, 추가의 대조군 실험을 위해, 열 (100℃, 20분)에 의해 변성된 sHSP를 유사한 실험 세트에 이용하였다. 각막세포가 손상에 반응하여 sHSP를 발현시키는 지를 조사하기 위해, 괴사 추출물 또는 H202 (100 내지 500 nM)를 각막세포의 배양액에 첨가하였다.
각막에서 미엘로퍼옥시다제 양의 측정
뉴트로필 침윤의 정량적 측정을 위해, 이전에 보고된 대로 (Oh, et al., Proc. Nat. Acad . Sci.. Vol 101, No. 39, pgs. 16875-16880 (2010)) 미엘로퍼옥시다제 (MPO) 농도 (Rat MPO ELISA 키트; HyCult biotech)에 대해 각막을 검정하였다. 단백질 추출을 위해, 각막을 소형 단편들로 절단하고, 프로테아제 억제제 칵테일 (Roche, Indianapolis, IN)을 함유하는 150 ㎕의 조직 추출 시약 (Invitrogen, Carlsbad, CA)에 용해시켰다. 초음파 분쇄기를 이용하여 샘플을 얼음 상에서 초음파분해시켰다. 12,000 rpm에서 4℃에서 20분간 원심분리한 후에, 맑아진 상청액을 수집하고 MPO의 수준에 대해 검정하였다.
마이크로어레이
마이크로어레이에 대한 RNA 표적을 3' IVT Express 키트 (Affymetrix)를 이용하여 제조자의 지시에 따라 제조하였다. 간략하게, 200 ng의 총 RNA를 첫 번째 가닥의 cDNA를 합성하는데 이용하였다. 그 후, cDNA를 이중-가닥 cDNA로 전환시키고, 시험관내 전사에 이용하여 비오티닐화된 cRNA를 합성하였다. cRNA를 자기 비드로 정제시키고, 단편화하고, 12.5 ㎍을 RG-230 2.0 어레이 상에서 하이브리드화에 이용하였다. 어레이를 염색하고, 세척하고, 형광성에 대해 탐지하였다. 마이크로어레이 데이터를 표준화하고, Partek Genomics Suite 6.4 (Partek) 및 dChip 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 비교상 분석을 위해, 데이터를 2배 이상의 배수 변화에 기반하여 필터링하였다 (상향조절 또는 하향조절). 계층적 클러스터링 분석을 위해, 데이터를 0.6보다 높은 변동 계수 및 적어도 33%의 프레즌스 콜(presence call)을 이용하여 필터링하였다. 필터링된 유전자의 발현 수준을 표준화하고, 계층적 클러스터링에 이용하였다. 유사한 계층 수준에 대해 각각의 계층적 클러스터링에서 총 6개의 클러스터를 선택하고 초기하 분포에 기반하여 풍부한 유전자 온톨로지 태그에 대해 연구하였다.
실시간 RT- PCR
각막 또는 세포로부터 총 RNA를 추출하고 (RNeasy Mini 키트; Qiagen, Valencia, CA) 역전사에 의해 이중-가닥 cDNA를 합성하는데 이용하였다 (Superscript III; Invitrogen). 실시간 증폭을 수행하고 (Taqman Universal PCR Master Mix Applied Biosystems, Carlsbad, CA) 자동화 기계 상에서 분석하였다 (7900HT Fast 실시간 PCR System; Applied Biosystems). 시판되는 PCR 프로브 세트를 구입하였다 (Taqman Gene Expression Assay Kits, Applied Biosystems). 검정을 위해, 반응물을 50℃에서 2분간, 95℃에서 10분간, 그 다음 95℃에서 15초에 이어서 60℃에서 1분의 40회 사이클로 인큐베이션하였다. 유전자 발현의 표준화를 위해, 18S rRNA 프로브 (Taqman Gene Expression Assays ID, Hs03003631_gl)를 내부 대조군으로서 이용하였다. 역치 사이클 (Ct)을 이용하여 로그-선형기 동안 PCR 생성물의 지수적 성장과 관련된 신호에서의 증가를 검출하였다. 알고리듬 2- ΔΔCt를 이용하여 분자의 발현을 계산하였다.
웨스턴 블롯
상기 기재된 대로 제조된 투명한 용해물을 단백질 농도에 대해 측정하였고, 총 10 ㎍ 단백질을 10% 비스-트리스 겔 (Invitrogen) 상에서 SD-PAGE에 의해 분획화하고, 니트로셀룰로스 막 (Invitrogen)으로 옮기고, SN (Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA) 또는 HSPB4 (Abeam)에 대한 항체로 블롯팅하였다.
ELISA
단백질을 상기 기재된 대로 각막으로부터 추출하고, IL-6, IL-1β, 및 CXCLl/CINC-1 (Quantikine 키트; R&D Systems), 및 CCL2/MCP-1 (면역검정 키트; Invitrogen)에 대해 상업적 ELISA 키트를 이용하여 전-염증 사이토카인 및 케모카인의 수준을 검정하였다. HSPB4를 측정하기 위해, HSPB4에 대한 마우스 모노클로날 항-랫트 항체 (Abeam)를 포획 항체 (4 ㎍/ml)로서 이용하고, HSPB4에 대한 토끼 폴리클로날 항-랫트 항체 (Abeam)를 이차 항체 (400 ng/ml)로서 이용하였다.
손상된 각막에서 HSPB4의 방출
손상 후 각막으로부터 방출된 HSPB4의 양을 측정하기 위해, 랫트의 각막을 손상 직후에 회수하여 37℃에서 5% C02와 함께 12시간 동안 배양하였다. 2시간마다, 배양 배지를 교환하고, 각각의 시간 프레임 동안 조건화된 배지에서 HSPB4의 농도를 ELISA에 의해 측정하였다.
조직병리학
랫트를 희생시킨 후에 각막을 절제하고, 10% 파라포름알데히드에 고정시켰다. 각막을 4 ㎛의 섹션으로 절단하고, 헤마톡실린-에오신 (H&E)으로 염색하거나 면역조직화학 처리하였다. 포르말린-고정된 각막 섹션을 에탄올로 탈파라핀화하고, 항원을 에피토프 재생 용액 (IHC WORLD, Woodstock, MD)을 이용하여 재생시켰다. 뉴트로필 엘라스타제에 대한 토끼 폴리클로날 항-랫트 항체 (1:200, Abeam), 세크레토그라닌 II에 대한 마우스 모노클로날 항-랫트 항체 (1:200, Abeam), 또는 HSPB4에 대한 마우스 모노클로날 항-랫트 항체 (1:200, Abeam)를 일차 항체로서 이용하였고, 항-토끼 IgG (1:5000, Abeam) 또는 항-마우스 IgG (1:5000, Abeam)를 이차 항체로서 이용하였다. DAPI 용액 (VECTASHIELD Mounting Medium; Burlingame, CA)을 대비염색제로서 이용하였다.
아코니타제 활성 검정
손상에 의한 각막에서의 산화적 손상을 평가하기 위해 (Ma, et al., Biochem, Biophvs . Acta, Vol. 1790, No. 10. pgs. 1021-1029 (2009)), 각막 용해물에서 아코니타제 활성의 손실을 아코니타제 검정 키트를 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 측정하였다 (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI).
NF - kB 전위 검정
약 1X105개 마우스 포식세포를 8웰 챔버 슬라이드에 플레이팅하고 (Lab-Tek II Chamber Slide; Nalge Nunc, Rochester, NY) 10 ㎍/mL의 HSPB4가 있거나 없는 α-MEM에서 0.2 ml의 2% FBS에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 원심분리에 의해 PBS로 2회 세척하고, 100% 메탄올에 5분간 고정시켰다. 세포를 PBS로 세척하고, Image-iT™ FX Signal Enhancer (Invitrogen)로 차단시켰다. 그 후, 세포를 차단 완충제 (PBS 중 5% BSA) 중 1 ㎍/mL의 항 NF-kB p65 항체 (Abeam)와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 샘플을 항-토끼 IgG의 이차 항체의 1:2000 희석액 (Alexa Fluor® 488 goat; Invitrogen)과 함께 1시간 동안 인큐베이션시켰다. DAPI 용액을 이용하여 세포 핵을 염색하였다. 슬라이드를 정립 현미경을 이용한 형광 현미경 (Eclipse 80i, Nikon, Melville, NY)으로 가시화하였다.
통계적 분석
스튜던트 t 테스트, 비모수 만-휘트니 테스트 또는 SPSS 소프트웨어 (SPSS 12.0)를 이용한 피어슨 상관관계 테스트에 의해 그룹들 간의 파라메터를 비교하였다. 차이는 p<0.05에서 유의한 것으로 고려되었다.
결과
각막에 대한 무균 손상 후 뉴트로필 침윤의 두 개의 상
루이스 랫트의 각막을 100% 에탄올에 30초간 노출시키고 각막 및 윤부를 찰과시켜 윤부에서 발견되는 상피 및 줄기 세포 둘 모두를 제거함에 의해 손상시켰다. 이전에 개시된 대로 (Oh, et. al, Proc . Nat. Acad . Sci ., Vol. 107, No. 34, pgs. 16875-16880 (2010)), 뉴트로필 과립 내에 저장되고 세포의 활성화에 의해 방출되는 미엘로퍼옥시다제 (MPO)에 대한 검정에 의해 뉴트로필 침윤을 모니터링하였다 (Borregard, et al., Blood, Vol. 89, pgs. 3503-3521 (1997). 뉴트로필 침윤이 두 개의 상으로 발생하였다. 약 15분 내에 개시되어 4 내지 8시간에 플래토 수준에 도달하는 소형 개시 상이 존재하였다 (도 31a의 I 상). 플래토 후에, 훨씬 큰 뉴트로필의 침윤에 이어 24 내지 48시간에 최대에 도달하였다 (도 31a의 II 상). 그 후, 뉴트로필은 48시간 내지 7일에 걸쳐 회복 상에서 점차적으로 사라졌다.
I 상 및 II 상에 대한 후보 신호 검색
두 개의 상을 개시한 후보 신호를 확인하기 위한 방법으로서, 마이크로어레이를 이용하여 손상에 대한 각막의 반응을 조사하였다. 유전자 발현의 일시적 패턴에 기반하여, 유전자를 세 개의 그룹으로 분류하였다 (도 31b, 도 31d). 약 842개의 그룹 A 유전자가 상향조절되었고, 약 108개의 그룹 B 유전자가 상향조절되었으며, 약 307개의 그룹 C 유전자가 상향조절되었다 (도 31d). 그룹 A 유전자에 초점이 맞추어졌는데, 그 이유는 이들이 일찌감치 발현하므로 I 상 및 II 상에 대한 자극을 포함할 것 같았기 때문이다 (도 31b 및 c). 그룹 B 유전자의 대부분은 아폽토시스/사멸 및 방어 반응과 관련된 분자였다 (참조: 하기 표 11, 도 31d). 그룹 C 분자의 대부분은 전-염증 케모카인 및 사이토카인이므로 (참조: 하기 표 11, 도 31d, 도 32m), 염증 반응에서 늦게 피크에 도달하는 유전자일 것 같았다. 그룹 A 유전자의 대부분은 눈의 신경/신경전달-관련 및 구조적 단백질에 대한 유전자였다 (참조: 하기 표 11). 그룹 A 유전자의 범주로부터, 하기를 염증 신호에 대한 매력적인 후보로서 선택하였다: 뉴로펩티드 세크레토뉴린 (SN) (이유: 이것이 혈액 세포의 화학주성 이동 및 내피세포통과 혈관밖유출을 활성화하는 것이 이전에 밝혀졌다)(Helle, Regul Pept, Vol. 165, No. 1, pgs. 45-51 (2010); Taupenot, et al., N. Engl . J. Med ., Vol. 348, No. 12, pgs. 1134-1149 (2003)), 및 두 개의 소형 열쇼크 단백질 (HSPB4 및 HSPB5) (이유: 일부 열쇼크 단백질이 DAMP로서 작용하는 것이 이전에 밝혀졌다)(Joly, et al., J. Innate Immun.. Vol. 2, No. 3, pgs. 238-247 (2010); Van Wijk, et al., J. Leukoc . Biol ., Vol. 88, No. 3, pgs. 431-434 (2010); Quintana, et al., J. Immunol ., Vol. 175, No. 5, pgs. 2777-2782 (2005); Asea, et al., Nat. Med ., Vol. 6, No. 4, pgs. 435-442 (2000)).
표 11. 손상 4시간 후 및 24시간 후에 각막에서 유전자 발현 프로파일의 마이크로어레이 분석. 손상에 의해 상향조절된 상위 20개 전사체가 각각의 그룹에서 도시되었다 (그룹 A, B, 및 C). 기호: 손상 (4h)/con, 손상 4시간 후 각막 vs. 손상 직후 각막; 손상 (24h)/con, 손상 24시간 후 각막 vs. 손상 직후 각막; '-'은 하향조절을 의미한다. 값들은 각각의 그룹에 대해 n=4의 집단 샘플로부터의 결과이다.
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I 상에 대한 후보로서 SN 및 II 상에 대한 HSPB4
발현의 시간 추이에 따른 데이터는 I 상에 대한 개시 신호로서 작용하는 SN과 일치하였다. SN은 손상되지 않은 각막의 추출물에서는 검출되지 않았으나, 손상 후 0.25시간 이내에 랫트의 각막 추출물 및 혈청 둘 모두에서 나타났다 (도 32a 및 b). 손상된 각막의 추출물 및 혈청에서 SN의 수준은 0.5시간에 감소한 다음 유전자의 증가된 발현의 결과로서 명백하게 증가하였다 (도 32a-d). 대조적으로, 각막에서 발현되는 것으로 알려진 두 개의 다른 뉴로펩티드인 물질 P 및 칼시토닌 유전자-관련 펩티드 (CGRP)에 대한 유전자의 발현에서는 거의 변화가 없었다 (도 32d)(Troger, et al., Brain Res. Rev., Vol. 53, No. 1, pgs. 39-62 (2007).
발현의 시간 추이에 따른 유사한 데이터는 II 상에 대한 자극으로서 기능하는 HSPB4와 일치하였다. 손상되지 않은 각막은 낮은 수준의 HSPB4 단백질을 함유하였으나, 손상 0.5시간 후에 양이 증가되기 시작하여 약 4시간에 피크에 도달하였다 (도 32e 및 f). 각막을 생체내 손상시킨 다음 생체외 인큐베이션시킨 실험에서 배지로의 HSPB4의 방출에 있어서 유사한 시간 추이가 관찰되었다 (도 32g). 마이크로어레이 데이터로부터 예상된 대로, HSPB4에 대한 mRNA 및 그룹 A로부터의 관련 유전자의 발현이 증가되었다 (도 32i); 그러나, HSPB4 발현에서의 증가는 SN에 대한 mRNA에서의 증가에 비해 지연되었다 (도 32d 및 i를 비교함). 손상된 각막의 면역조직화학은 이러한 결과와 일치하였다. SN-면역반응성 신경은 손상시킨 지 2시간 후에 각막에서 증가되었다 (도 32c). HSPB4의 발현은 손상시킨 지 약 4시간 후에 증가되었다 (도 32h).
또한, SN 및 HSPB4의 발현은 손상의 심한 정도에 의존적이었다. 단백질 및 mRNA 둘 모두의 농도는 가벼운 손상에 비해 (15초 에탄올 및 찰과) 심한 손상 (30초 에탄올 및 찰과) 이후에 각막 또는 혈청에서 더 높았다 (도 33f).
각막 간질로부터의 각막세포가 손상에 반응하여 HSBP4를 합성시켰다.
손상된 각막에서 HSPB4의 세포 기원을 정의하기 위해, 각막 간질로부터의 섬유모세포-유사 세포인 각막세포를 반복된 동결 및 해동에 의해 괴사된 각막의 추출물과 함께 인큐베이션시켰다. 괴사 추출물은 각막세포에서 HSPB4의 발현을 유도하였다 (도 32j). 괴사 추출물은 두 번째 소형 열쇼크 단백질 HSPB5 또는 세 번째 그룹 A 유전자인 βB 결정체의 발현을 현저하게 증가시키지 않았다. 대부분의 무균 염증은 활성 산소종 (ROS)을 증가시켰다 (Kolnitzer, et al., Ann. N.Y . Acad . Sci., Vol. 1203, pgs 45-52 (2010); Martinon, Eur . J. Immunol.. Vol. 40, No. 3, pgs. 616-619 (2010)). 손상된 각막의 검정으로부터, 아코니타제 활성의 신속한 감소가 입증되었는데, 이는 ROS의 증가를 반영하는 것이다 (도 32k). 예상대로, ROS를 증가시키는 H202와 각막세포의 인큐베이션도 HSPB4의 발현을 증가시켰다 (도 32l).
재조합 SN은 I 상을 재현시켰고 재조합 HSPB4는 II 상을 재현시켰다.
각막의 간질로 재조합 SN을 주입하는 것은 C 상의 뉴트로필 침윤을 자극하였다 (도 33a). 이러한 효과는 뉴로펩티드의 방출을 억제하는 칼슘 차단제 (딜티아젬)의 국소 적용에 의해 부분적으로 취소된다 (도 33d) (Gonzalez, et al, Invest. Ophthalmol. Vis . Sci ., Vol. 34, No. 12, pgsr 3329-3335 (1993)). 따라서, 이러한 결과는, SN이 I 상에 대한 주요 자극제로서 기능하였음을 나타내나, 손상된 각막에 의해 방출되는 그 밖의 신호와 협력하여 작용할 가능성을 배제시키지 않았다.
발열원이 없는 재조합 HSPB4의 주입은 (방법 참조) I 상 및 II 상 둘 모두의 뉴트로필 침윤을 자극시켰다 (도 33b 및 c). I 상의 재현은 각막에 대한 손상 후에 이것이 조직에서 나타나기 전에 단백질이 주입되었음에 의해 명백하게 설명되었다 (도 32e-h). 각막의 한 영역으로 재조합 HSPB4의 재현이 또한 무균 염증에 의해 생성된 혼탁을 재현시켰다 (도 33c). HSPB4의 역할은 단백질에 대한 항체를 손상 직후에 각막 간질에 주입시키는 실험에 의해 확인되었다 (도 33e). HSPB4에 대한 항체는 손상 후에 각막에서 II 상 염증 반응을 현저하게 억제하였다. 또한, 손상 후 각막에서 II 상의 뉴트로필 침윤이 HSPB4 녹아웃 마우스의 각막에서 야생형 대조군에 비해 현저하게 감소하였다 (도 33f).
HSPB4는 TLR2 / NF - kB 신호전달을 통해 상주 포식세포를 활성화시켰다 .
각막에서 HSPB4에 반응한 세포를 확인하기 위해, 클로드로네이트 리포좀을 결막하 주입시킨 다음, 재조합 HSPB4를 각막 간질에 주입시킴에 의해 상주 포식세포를 루이스 랫트의 각막에서 고갈시켰다. 포식세포-특이적 마커 CD68 및 CD11b에 대한 면역염색으로 포식세포 고갈을 확인하였다 (도 33g). 단백질은 포식세포가 고갈된 랫트에서 II 상을 재현하지 않았는데 (도 34a), 이는 HSPB4의 효과가 상주 포식세포의 존재에 의존적임을 시사한다. 유사하게, 상주 포식세포가 손상 전에 고갈되었을 때 염증은 화학적/기계적 손상 후에 각막에서 현저하게 감소하였으며 (도 34l), 이는 각막의 무균 손상-유도된 염증에서 상주 포식세포의 중대한 역할을 나타낸다. 병행 실험에서, I 상이 아닌 II 상의 뉴트로필 침윤이 포식세포에서 TLR2/NF-kB 신호전달을 억제하는 항-염증 단백질 TSG-6의 안구내 주입에 의해 현저하게 억제된 것으로 관찰되었다 (도 34b) (Choi, Blood, in press; Lesley, et al., J. Biol . Chem.. Vol. 279, pgs. 25745-25754 (2004)). 또한, TSG-6은 각막 간질로의 HSPB4의 주입에 의해 야기된 II 상 염증 반응을 현저하게 억제하였다 (도 34c). 따라서, 이러한 결과는 HSPB4가 상주 포식세포에서 TLR2/NF-kB 신호전달을 활성화시킴에 의해 II 상에 신호를 전달함을 시사한다.
포식세포에 대한 HSPB4의 효과를 시험하기 위해, 포식세포를 괴사 각막의 추출물과 함께 인큐베이션하였다. 추출물은 전-염증 사이토카인 IL-1α, IL-1β, 및 IL-6의 발현을 증가시켰으나 (도 34d); 추출물의 열 불활성화는 이러한 효과를 억제하였는데, 이는 추출물의 활성 인자(들)가 단백질(들)이었음을 나타낸다. HSPB4에 대한 폴리클로날 또는 모노클로날 항체의 첨가가 포식세포 활성화에 대한 괴사 추출물의 효과를 현저하게 억제하였으며, 이는 괴사 각막 추출물 중 활성 인자들 중 하나가 HSPB4이었음을 나타낸다 (도 34d). 또한, 재조합 HSPB4는 포식세포에 의한 전-염증 사이토카인의 발현을 용량-의존적 방식으로 증가시켰다 (도 34e). 예상대로, HSPB4는 포식세포에서 NF-kB 복합체의 핵에 대한 전위를 야기하였다 (도 34f). HSPB4가 TLR2/NF-kB 경로를 통해 신호전달하는 지를 시험하기 위해, 형질도입된 리포터 세포주를 이용하여 TLR2/NF-kB 신호전달을 검정하였다 (HEK-TLR2). HEK-TLR2 세포주에서의 실험으로부터, 각막의 괴사 추출물이 TLR2/NF-kB 신호전달을 증가시키고, HSPB4에 대한 항체가 이러한 효과를 억제하였음이 입증되었다 (도 34g). 재조합 HSPB4는 동일한 세포주에서 용량-의존적 방식으로 NF-kB 신호전달을 자극하였다 (도 34h). HSPB4는 TLR2를 통해 주로 작용하며; TLR4를 발현시키는 리포터 세포주에서 보다 작은 효과를 나타내고 어느 쪽 수용체도 없는 리포터 세포에서는 아무런 효과가 없으나 (도 34l 및 j); HSPB4는 전-염증 사이토카인을 발현시키는 배양액에서 각막세포를 자극하지 않았다 (도 35f). HSPB5 및 βB-결정체와 같은 그 밖의 그룹 A 분자도 포식세포에서의 전-염증 사이토카인 생산이나 HEK-TLR2 세포에서의 NF-KB 활성화에 아무런 영향을 주지 않았다 (도 34k). 또한, SN은 포식세포 또는 시험관내 각막세포에서 전-염증 사이토카인의 발현을 유도하지 않았다 (도 35f). 유사하게, HSPB4는 전-염증 사이토카인을 발현시키는 배양액에서 각질형성세포를 자극하지 않았다 (도 35f). 더불어, 이러한 결과는, HSPB4가 II 상에 대한 주요 DAMP이고 각막에서 상주 포식세포의 활성화를 통해 작용함을 나타내었다.
TSG -6은 포식세포의 HSPB4 -유도 활성화를 억제하였다.
TSG-6은 각막의 화학적 손상에 대해 잠재적인 치료를 제공하나 그 작용 메카니즘은 확립되지 않은 것으로 종래에 제시되었다 (Oh, Proc . Nat. Acad . Sci ., 2010). 따라서, TSG-6이 II 상 반응을 억제하나, I 상은 억제하지 않는다는 가설 (도 34b 및 c)을, 포식세포의 HSPB4 유도된 활성화를 감소시킴에 의해 시험하였다. 재조합 TSG-6은 HSPB4에 의해 자극된 포식세포에서 전-염증 사이토카인의 발현을 감소시켰다 (도 35a 및 b). 단백질이 CD44와의 상호작용에 의해 포식세포에서 TLR2/NFkB 신호전달을 억제하는 것이 이전에 제시되었으므로 (Choi, Blood, in press; Lesley J, Gal I, Mahoney DJ, et al.), TSG-6는 히알루로난 및 세포 표면 CD44 간의 상호작용을 조절한다 (J Biol Chem ., 2004; 279:25745-25754). TSG-6의 효과가 CD44-의존적인지를 또한 조사하였다. 예상대로, TSG-6은, 세포주가 CD44를 발현하도록 형질도입되지 않는 한, HEK-TLR2 리포터의 세포주에서 NF-kB 신호전달에 대해 아무런 현저한 효과도 지니지 않았으며 (도 35c 및 d); TSG-6은 CD44를 발현시키지 않는 모 세포주에서 전혀 효과가 없었다. 또한, TSG-6은 CD44 녹아웃 마우스의 각막에 대한 화학적/기계적 손상 후에 II 상 염증 반응에 아무런 효과가 없었는데 (도 35e), 이는 포식세포에 대한 TSG-6의 작용이 CD44-의존적임을 나타낸다.
논의
도 36에 요약된 대로, 본원의 결과들은 무균 손상 후 각막에서 두 가지 상이한 상의 뉴트로필 침윤이 존재함을 증명하였다: (a) 15분 내에 시작하여 4 내지 8시간에 플래토 수준에 도달하는 소형 초기 I 상, 및 (b) 4시간 내지 48시간에 피크를 나타내는 훨씬 큰 II 상. I 상 및 II 상 반응에 대한 자극에 대한 검색에서, 손상 후 활발히 생산되는 분자 조직이 무균 염증을 유도하는 주요 자극일 수 있다는 가정 아래 손상 후 상향조절된 분자를 스크리닝하였다.
I 상 반응에 대한 주요 자극은 뉴로펩티드 SN이었다. I 상 반응은 손상 15분 이내에 시작되었고, 클로드로네이트를 이용한 고갈 실험에서 나타난 대로, 포식세포가 관여할 필요가 없었다. 뉴로펩티드는 I 상 자극에 대한 매력적인 후보인데, 그 이유는 이들이 미리 형성되고 손상에 반응하여 지각 신경 끝으로부터 신속하게 방출되기 ‹š문이다. 또한, 각막은 가장 조밀하게 신경지배된 조직 중 하나이다. 재조합 SN의 간질내 주입은 I 상 반응을 재현시켰고, 뉴로펩티드의 억제제는 이러한 효과를 차단시켰다. 포식세포 고갈을 이용한 실험에 의해 나타난 대로, I 상은 상주 포식세포가 관여할 필요가 없었다. SN은 상주 포식세포의 활성화에 의해 매개된 II 상에서 뉴트로필의 추가의 심한 침윤을 유도하지 않았다. 따라서, I 상 반응은 II 상 반응과 무관하였다.
뉴로펩티드는 미리 형성되고 손상에 의해 신경 끝으로부터 신속하게 방출되기 때문에 조직의 초기 염증 반응을 자극하기 위한 매력적인 후보이다. 뉴로펩티드는 각막이 신체에서 가장 크게 신경지배되는 조직 중 하나이기 때문에 손상에 대한 각막의 반응에서 특히 중요할 수 있다 (Nishida, Cornea, 2nd Edition (Krachmer, et al., eds.), pg. 4. (Elsevier Mosby, Philadelphia, 2005)). SN은 뉴로펩티드/신경전달체의 그라닌 패밀리의 구성원이고, 면역 세포의 화학주성 이동 및 내피세포통과 혈관밖유출을 활성화시킴에 의해 선천면역에 기여한다 (Helle, 2010; Taupenot, 2003). 중요하게는, SN은 내피 세포 장벽을 통해 뉴트로필의 유출을 자극하는데 있어서 TNF-α만큼 효과적인 것으로 나타났다 (Kahler, et al., Exp. Lung. Res.. Vol. 27, No. 1, pgs. 25-46 (2001); Kahler, et al., Regul . Pep., Vol. 105, No. 1, pgs. 35-46 (2002)). 또한, 최근의 생체내 연구는 SN이 신경성 염증에서 역할을 담당할 뿐만 아니라, 심근경색증, 만성 심부전, 본태 고혈압(essential hypertension), 류마티스모양 질환(rheumatoid diseases), 또는 급성 염증 대장 증후군과 같은 흔한 질환에서 종래에 이해된 바에 비해 더욱 복잡한 역할을 담당함을 시사한다 (Helle, 2010; Taupenot, 2003; Wiedermann, Peptides, Vol. 21 , No. 8, pgs. 1289-1298 (2000)).
데이터로부터 II 상 반응에 대한 주요 DAMP가 소형 열쇼크 단백질 HSPB4이었음이 입증되었다. 발열원이 없는 재조합 HSPB4 단백질은 TLR2 NF-KB 신호전달 경로를 통해 상주 포식세포를 활성화시킴에 의해 II 상 반응을 재현시켰다. HSPB4의 역할은, 손상된 각막에서의 II 상 반응이 HSPB4에 대한 차단 항체의 주입에 의해 크게 감소되었다는 관찰에 의해 확인되었다. 각막에 대한 손상은 HSPB4를 세포밖으로 방출시켰다. 각막 조직으로부터의 괴사 추출물의 첨가는 간질 각막세포에 의해, 아마도 괴사 각막에서의 증가된 ROS 및 그 밖의 자극의 결과로서, HSPB4의 합성을 증가시켰다. 더욱이, HSPB4는 포식세포에서 TLR2/NF-KB 신호전달을 자극시켜 IL-1α 및 IL-1β와 같은 전-염증 사이토카인의 캐스캐이드를 방출시켰다.
DAMP로서 HSPB4의 역할은 HSP60, 70, 72, 또는 96과 같은 단백질 및 그 밖의 열쇼크 단백질을 이용한 종래의 관찰과 일치하였다 (Lehnardt, et al. J. Neurosci; Vol. 28, pgs. 2320-2331 (2008); Asea, et al., Nat. Med ., Vol. 6, pgs. 435-442 (2000); Wheeler, et al.; Respir . Res.. Vol. 10, pgs. 31-43 (2009). Huang, et al., J. Immunol ., Vol. 182, pgs 4965-4973 (2009); Chen, et al., Eur . J. Immunol.. Vol. 40, pgs. 1541-1544 (2010)). HSPB4는 크기가 15-30kDa인 소분자량 열쇼크 단백질 (sHSP)의 구성원이다. 다른 열쇼크 단백질과 같이, sHSP는 열과, 산화성 및 염증 스트레스와 같은 그 밖의 자극에 의해 유도되며, 미스폴딩된 단백질에 의해 생산된 손상으로부터 세포를 보호하는 샤프론(chaperone)으로서 작용한다. 그러나, HSP는 모순적인 효과를 갖는다 (Kobba, et al., Shock, December 9, 2010 online publication; DeMeester, et al., FASEB J., Vol. 15, pgs. 270-274 (2000); Chen, et al., Inflamm . Allergy Drug Targets, Vol. 6, pgs. 91-100 (2007)). 열쇼크 전처리는 염증에 대해 보호하는 세포내 HSP를 유도하는 반면 (Ousman, et al., Nature, Vol. 448, pgs. 474-479 (2007); Saraswathy, et al., Invest. Ophtalmol . Vis . Sci ., Vol. 51 , No. 7, pgs. 3680-3686 (2010); Munemasa, et al., Invest. Ophthalmol . Vis . Sci ., Vol. 50, No. 8, pgs. 3869-3875 (2009), 염증 손상이 프라이밍되거나 세포 통합성이 손상된 후에는, 열쇼크가, 손상되거나 스트레스를 받은 세포로부터 방출되는 HSP의 발현을 유도하여 세포 손상을 악화시킨다 (Asea, et al., Nat. Med ., Vol. 6, No. 4, pgs. 435-442 (2000); Quintana, et al. J. Immunol ., Vol. 175, No. 5, pgs. 2777-2782 (2005); Lehnardt, et al., J. Neurosci, Vol. 28, No. 10, pgs. 2320-2331 (2008); Huang, et al., J. Immunol ., Vol. 182, No. 8, pgs. 4965-4973 (2009); Wheeler, et al., Respir . Res., Vol. 10, pg. 31 (2009)). 게다가, HSP는 면역 세포로의 다른 위험 신호의 결합을 촉진시켜 면역원성을 향상시키는 내인성 애쥬번트로서 기능하는 것이 알려져 있다 (Chen, et al., Eur . J. Immunol ., Vol. 40, pgs. 1541-1544 (2010)). 이러한 보고에 일치하여, 여기에서는 소형 HSP인 HSPB4가 TLR2/NF-kB 경로를 통해 시험관내 포식세포를 자극하고 손상된 각막에서의 II 상 염증 반응에 대한 주요 DAMP로서 작용함이 보고되었다. 반면, 또 다른 소형 HSP인 HSPB5는 이러한 반응을 유도하지 않았다.
II 상 염증 반응에 대한 주요 DAMP로서 HSPB4의 확인은 가능한 요법에 대한 여러 암시를 제공한다. 한 가지는, 이러한 결과가 종래에 각막에 대한 화학적 손상 이후에 TSG-6을 적용시켜 관찰된 유리한 효과에 대한 설명을 제공한다는 것이다 (Oh, 2010). TSG-6은 포식세포 상에서 CD44와 상호작용하여 감소되었고, 이에 따라 HSPB4는 손상된 각막으로부터 방출된 HSPB4에 의해 유도된 TLR2/NFkB 신호전달을 유도하였다 (Choi, in press).
또 다른 암시는, HSPB4에 대한 항체 또는 길항제가 각막의 무균 염증을 조절하거나 억제하기 위해 단독으로 또는 TSG-6과 함께 치료제로서 기능할 수 있다는 것이다 (Oh, 2010). 여전히 또 다른 암시는, 이러한 결과가 눈 또는 비안구 조직의 그 밖의 질환에 대한 치료제를 개발하기 위한 지침을 제공할 수 있다는 것이다. HSPB4는 포도막염 (Sarawathy, et al., Invest. Ophthalmal . Vi- Sci ., Vol. 51, pgs. 3680-3686 (2010); Rao, et al., Invest. Ophthalmol . Vis . Sci ., Vol. 49, pgs. 1161-1171 (2008)), 녹내장 (Munemasa, et al., Invest. Ophthalmol . Vis . Sci., Vol. 50, pgs. 3869-3875 (2009)), 노인 황반 변성 (Kapphahn, et al., Biochemistry, Vol. 42, pgs. 15310-15325 (2003)), 및 저산소 망막병증 (Miyara, et al., Jpn . J. Ophthalmol ., Vol. 52, pgs. 84-90 (2008))의 모델에서 각막에서 발현되고 상향조절되는 것으로 나타났다. HSPB4는 또한 비장, 흉선, 췌장, 및 신장과 같은 비안구 조직에서 발현되는 것으로 알려져 있다 (Deng, et al., Biochem . Biophys. Acta, Vol. 1802, pgs. 621-631 (2010); Srinivasan, et al., J. Biol . Chem., Vol. 267, pgs. 23337-23341 (1992)). 무균 염증이 다수의 질환의 발병기전에 기여하므로 (Chen, et al. Nat. Rev. Immunol ., Vol. 10, pgs. 826-837 (2010); Rock, et al., Ann. Rev. Immunol ., Vol. 28, pgs. 321-342 (2010); Spite, et al., Circ . Res., Vol. 107, pgs. 1170-1184 (2010)), TSG-6 또는 세포외 HSP에 대한 항체 또는 길항제를 이용하여 HSP 또는 관련 수용체의 활성을 조절하는 방법은 HSP가 염증에 대한 주요 신호인 다양한 염증 질환, 예컨대 허혈-재관류 손상, 급성 폐 손상, 다양한 신장 질환, 죽상동맥경화증, 비만, 및 당뇨병을 치료하기 위한 유용한 약물 표적을 제공할 수 있다 (Gill, et al., Free Radic . Biol. Med ., Vol. 48, pgs. 1121-1132 (2010)).
본원에 인용된 각각의 모든 특허, 특허출원, 공개, 데이터베이스 수납 번호, 및 보관 수납 번호의 기재는, 각각의 특허, 특허출원, 공개, 데이터베이스 수납 번호, 및 보관 수납 번호가 개별적으로 참조로서 포함되는 것과 동일한 정도로, 그 전문이 본원에 참조로서 포함된다.
비록 본 발명이 특수한 구체예를 참조로 하여 기술되었으나, 본 발명의 그 밖의 구체예 및 변형이 본 발명의 진정한 정신 및 범위로부터 벗어나지 않으며 당업자에 의해 고안될 수 있음이 자명하다. 첨부된 청구범위는 그러한 모든 구체예 및 동등한 변형을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
참조문헌
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Claims (45)

  1. 소형 열쇼크 단백질 HSPB4를 인지하는 하나 이상의 항체 또는 항체 단편을 포함하고, 상기 소형 열쇼크 단백질 HSPB4를 인지하는 하나 이상의 항체 또는 항체 단편이 환자에서 각막의 염증 반응을 감소시키거나 억제하기에 효과적인 양으로 투여되는, 환자의 각막에서 염증 반응을 감소시키거나 억제하기 위한 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 소형 열쇼크 단백질 HSPB4를 인지하는 하나 이상의 항체 또는 항체 단편이 모노클로날 항체인, 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 소형 열쇼크 단백질 HSPB4를 인지하는 항체 또는 항체 단편이 폴리클로날 항체인, 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 소형 열쇼크 단백질 HSPB4를 인지하는 항체 또는 항체 단편이 인간 항체인, 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 소형 열쇼크 단백질 HSPB4를 인지하는 항체 또는 항체 단편이 비-인간 항체인, 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 소형 열쇼크 단백질 HSPB4를 인지하는 항체 또는 항체 단편이 인간화된 항체인, 약학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 소형 열쇼크 단백질 HSPB4를 인지하는 항체 또는 항체 단편이 키메라 항체인, 약학적 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 각막에서 염증 반응이 망막 손상에 의해 야기된, 약학적 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 각막에서 염증 반응이 안구건조증에 의해 야기된, 약학적 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 소형 열쇼크 단백질 HSPB4를 인지하는 항체 또는 항체 단편이 점안제의 형태로 눈에 투여되는, 약학적 조성물.
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