CN102600509A - 冻存骨来源的成骨细胞及其在骨组织再生中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种冻存骨来源的成骨细胞在骨组织再生中的应用，包括以下步骤：（1）冻存：收集碎骨颗粒放入冻存管中，加入配方为DMSO：血清：DMEM体积比1：3：6的冻存液，先置于-75℃—-85℃冰箱中，30-40分钟后放入-196℃液氮中冻存；（2）复温：取出冻存骨，快速复温，洗去冻存液，进行组织块培养，所述快速复温指37℃复温1—2分钟；（3）构建组织工程化骨：将步骤（2）得到的细胞、生物支架材料复合构建组织工程化骨。本发明验证了深低温冷冻技术对于组织内细胞生物学活性的影响及其在再生医学中的价值，同时又可以提高现有冻存组织库的使用效率，扩大冻存组织库的应用范围。

Description

冻存骨来源的成骨细胞及其在骨组织再生中的应用

技术领域

本发明涉及骨组织缺损的修复与重建领域，具体地说，涉及一种冻存骨来源的成骨细胞在骨组织再生中的应用。

背景技术

骨组织缺损的修复与重建仍然是生物学和临床医学面临的重大难题，传统的治疗方法包括自体骨移植、异体骨移植、异种骨移植和生物材料的植入。自体骨移植虽然取得一定效果，但这种以创伤修复创伤的模式不仅面临供区骨量的限制，而且还会给患者带来各种手术并发症的风险。近年来，有学者对深低温冻存骨进行了初步的研究，发现此类骨仍存在一定的活性，组织块体外培养可移行出具有一定成骨能力细胞。为了进一步研究深低温冻存组织的特点及其在再生医学中的意义，我们配制冻存液，开始尝试将不同时间深体温保存的冻存骨进行组织块培养，并将其与新鲜骨来源的成骨细胞相对照，分析不同冻存时间对组织的影响，探索深低温冻存骨组织来源的成骨细胞特性和该类细胞在未来组织再生中的可行性。

本课题组前期已经掌握骨组织来源的成骨细胞的培养方法，并能将细胞扩增到足够的数量，维持较好的成骨表型。参见：Wang S, Zhang Z, Zhao J, Zhang X, Sun X, Xia L, Chang Q, Ye D, Jiang X. Vertical alveolar ridge augmentation with beta-tricalcium phosphate and autologous osteoblasts in canine mandible. Biomaterials, 2009,30(13):2489-98）。将取自beagle犬下颌磨牙后区的骨皮质剪成直径1.0~1.5mm大小骨颗粒，放入PBS中冲洗3次。接种于10mm板中加入少量DMEM培养液，4h后正常加入培养液，置于37℃恒温混合气体（5％CO₂，95％O₂），100％饱和湿度条件下的培养箱中培养，每3-4d换培养液1次。待细胞移行至80%融合时，进行传代。吸弃培养液，PBS洗涤一次，加入0.25%胰酶1-1.5ml，同时加入等量PBS稀释，移至倒置显微镜下观察。当镜下细胞突起收缩，细胞呈圆形后，加入等量培养液终止消化，收集细胞混悬液于离心管内，吹打使细胞分散均匀，并用血细胞计数器计算细胞数量；将细胞悬液以1000r/min离心5min，弃上清液，加入适量标准培养液，调整细胞浓度为1×10⁵个/ml，吹打使细胞分散均匀，接种于数个培养皿内，置于培养箱中。传至2-3代时加入诱导液，培养后进行细胞增殖和成骨表型检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种冻存骨来源的成骨细胞在骨组织再生中的应用。

本发明的第二个目的是提供一种冻存骨来源的成骨细胞。

为实现以上目的，本发明公开以下技术方案：一种冻存骨来源的成骨细胞在骨组织再生中的应用，包括以下步骤：

（1）冻存：收集碎骨颗粒放入冻存管中，加入配方为DMSO：血清：DMEM体积比1：3：6的冻存液，先置于-75℃—-85℃冰箱中，30-40分钟后放入-196℃液氮中冻存；

（2）复温：取出冻存骨，快速复温，洗去冻存液，进行组织块培养，所述快速复温指37℃复温1—2分钟；

（3）构建组织工程化骨：将步骤（2）得到的细胞、生物支架材料复合构建组织工程化骨。

作为一个优选方案，步骤（1）冻存中，先置于-80℃冰箱中，30分钟后放入-196℃液氮中冻存。

一种冻存骨来源的成骨细胞，所述成骨细胞来源于冻存骨，且保持增殖与成骨分化能力。

本发明通过对1个月、3个月、6个月、12个月深低温冻存骨来源成骨细胞的生物学特性体内外比较，探索深低温冻存骨来源成骨细胞增殖和成骨分化规律及其在再生医学中的价值。

研究结果表明冻存骨来源的成骨细胞有如下的特点：(1)不同冻存时间的骨组织来源的成骨细胞均保持较好的增殖能力。(2)不同冻存时间的骨组织来源的成骨细胞均保持较好的成骨分化的能力。(3)不同冻存时间的骨组织来源的成骨细胞均保持较好的促进裸鼠皮下成骨的能力。(4)不同冻存时间的骨组织来源的成骨细胞均具有较好的促进犬上颌窦提升种植体骨结合的能力。

本发明的优点在于：本发明一方面验证了深低温冷冻技术对于组织内细胞生物学活性的影响以及其在再生医学中的潜在价值，同时又可以提高现有冻存组织库的使用效率，扩大冻存组织库的应用范围；另一方面可以探索深低温冻存技术储存自体少量组织，通过保持组织中细胞的活性，进而避免随着机体年龄增长，组织细胞所面临的老化问题，最终能够提高未来组织再生的效率。同时，又可以有助于推动对冻存器官的研究。

附图说明

图1为冻存骨培养后成骨细胞移行至组织块周围，分别为1个月（A）、3个月（B）、6个月（C）、12个月（D）（100×）。

图2为1个月、3个月、6个月、12个月冻存骨来源的成骨细胞增殖活力MTT法检测情况。

图3为冻存骨来源的成骨细胞碱性磷酸酶检测，分别为1个月（A）、3个月（B）、6个月（C）、12个月（D）（100×）。

图4为定量分析冻存骨来源成骨细胞的钙结节形成情况，分别为1个月（A）、3个月（B）、6个月（C）、12个月（D）（50×），E显示各组未见到统计学差异（P>0.05）。

图5为冻存骨来源的成骨细胞OPN免疫组化呈阳性，分别为1个月（A）、3个月（B）、6个月（C）、12个月（D）（200×）。

图6为冻存骨来源成骨细胞的Col I, OCN, OPN, BSP 成骨基因表达，分别为1个月（A）、3个月（B）、6个月（C）、12个月（D）。

图7为冻存1个月、3个月、6个月、12个月和新鲜骨来源成骨细胞异位成骨的显微硬度分析。

图8为冻存1个月、3个月、6个月、12个月及新鲜骨来源成骨细胞复合β-TCP的异位成骨分别是（A）、（B）、（C）、（D）、（E）（100×），F显示各组间新骨形成面积差异无统计学意义（P>0.05）。

图9为 4组上颌窦提升种植体植入的非脱钙组织切片，分别为A组（A）、B组（B）、C组（C）、D组（D）（200×），（E）表示四组种植体骨结合分析（*表示有统计学差异，P<0.05）。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做详细说明，实施例的作用仅是解释而非限定本发明。

实施例一：犬冻存骨来源成骨细胞的培养及生物学特性。

步骤一、骨组织获取与冻存。 

将beagle犬经5%戊巴比妥钠按照0.5mg/kg全身麻醉后，侧卧位，常规消毒铺巾，在下颌磨牙后区取2~3cm切口，分离软组织和骨膜，暴露下颌骨表面，凿取下颌骨，缝合创口，术后青霉素80 万单位肌注5d，每天2 次，预防感染。并将所取骨剪成直径1.0~1.5mm大小骨颗粒，放入PBS中冲洗3次，分置于冻存管，每管0.3~0.4ml，加入冻存液至0.6~0.7ml，标记冻存时间和动物编码。将冻存骨置于-75—-85℃冰箱内，30-40min后，放入-196℃的液氮中冻存。

步骤二、成骨细胞的原代培养。 

组织复温时先打开37℃水浴锅，自液氮中取出冻存1个月、3个月、6个月、12个月不同时间的骨组织，迅速放置于37℃水浴锅中1min，取出复温骨颗粒放入PBS中洗涤3次，接种于10mm板中加入少量DMEM培养液，4h后正常加入培养液，置于37℃恒温混合气体（5％CO₂，95％O₂），100％饱和湿度条件下的培养箱中培养，每3-4d换培养液1次。待细胞移行至80%融合时，进行传代。吸弃培养液，PBS洗涤一次，加入0.25%胰酶1-1.5ml，同时加入等量PBS稀释，移至倒置显微镜下观察。当镜下细胞突起收缩，细胞呈圆形后，加入等量培养液终止消化，收集细胞混悬液于离心管内，吹打使细胞分散均匀，并用血细胞计数器计算细胞数量；将细胞悬液以1000r/min离心5min，弃上清液，加入适量标准培养液，调整细胞浓度为1×10⁵个/ml，吹打使细胞分散均匀，接种于数个培养皿内，置于培养箱中。倒置相差显微镜下连续观察体外培养细胞的生长、增殖、基质分泌和细胞形态的变化。传至2-3代时加入诱导液，培养后进行实验。

步骤三、犬冻存骨来源成骨细胞的生物学特性检测。

（1）细胞增殖的检测(MTT法)：二甲基噻唑二苯基四唑溴蓝[MTT]可以自由地进入活细胞中，当细胞增殖快时，代谢旺盛，线粒体琥珀酸脱氢酶的活性增强，可以将细胞浆中的MTT还原成蓝紫色的不溶性甲瓒颗粒而留存在细胞内，使用酸化溶剂或去垢剂等溶解结晶颗粒时会呈现深浅不同的颜色，在特定波长下产生吸收峰。吸光值与活细胞量成线性正相关，因此可以反映细胞活性。将冻存1个月、3个月、6个月、12个月不同时间骨组织来源的成骨细胞以0.5-l×10⁴个细胞/孔接种于96孔板中，每组3个复孔，每孔加入细胞悬液200 μl，培养1-2d后，进行检测。先加入新鲜配制的MTT液(5mg/m1)20μl，继续孵育4h后吸尽培养液，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150μl，振荡使结晶物充分溶解10min，酶标仪在490nm波长下检测各孔光密度值(OD)，以每组3份样本值的均数绘制细胞的生长曲线。

（2）碱性磷酸酶(ALP)检测：将冻存1个月、3个月、6个月、12个月不同时间骨组织来源的第2代成骨细胞传代后14d进行碱性磷酸酶染色，步骤如下：①吸去培养液，PBS冲洗细胞数次。②将4℃固定液加入六孔板中，细胞固定30s后，流水冲洗，空气晾干。③配制工作液：用二甲基甲酰胺溶解底物后，倒入缓冲液中，再加入固紫B混匀。③将配制好的工作液加入六孔板中，置于37℃水浴箱中恒温加热。45min后可见溶液逐渐变色为棕黄色。④流水冲洗，苏木精复染色，然后流水冲洗晾干，光学显微镜下观察其中的紫红色颗粒。

（3）钙结节检测（Von Kossa法）：将冻存1个月、3个月、6个月、12个月不同时间骨组织来源的第2代成骨细胞, 接种在6孔板内，每孔接种2×10⁵个，每组设计6个复孔，传代后14-21d进行钙结节染色。步骤如下：①吸去培养液，用无Ca²⁺、Mg²⁺的PBS冲洗细胞3次；②在室温下4%多聚甲醛固定60min。去离子水冲洗3次；③加入新鲜配置的1%硝酸银，避光染色30min，去离子水冲洗数次；④紫外线照射10min，蒸馏水洗2次；⑤5%硫代硫酸钠2min，蒸馏水冲洗3次；⑥中性红复染，酒精脱色，显微镜观察钙结节。计算直径大于0.5mm的钙结节数目。统计学方法应用SNK法进行成组设计的方差分析，以P<0.05为显著性标准。

（4）骨桥蛋白（osteopontin）免疫组化：将冻存1个月、3个月、6个月、12个月不同时间骨组织来源的第2代成骨细胞传至六孔板中制作细胞爬片，传代后4d分别进行骨钙素免疫组化检测。步骤如下：①将玻片放入0.01M的PBS容器中，PBS漂洗。②固定：加入4%多聚甲醛固定液，室温下固定10-15min。③细胞透化：室温下，1%的TritonX-100/PBS室温下孵育10- 30min。PBS漂洗。④细胞封闭：去除玻片上多余水分，滴加3%BSA/PBS约70μl，使其铺满整个玻片，以封闭非特异性抗原。放入37℃恒温水浴箱中，孵育30min，PBS漂洗。⑤一抗孵育：加入稀释后的一抗（稀释度1：100），4℃冰箱中过夜，PBS漂洗。⑥二抗孵育：将荧光标记二抗用PBS以1：1000稀释后，以微量移液器在玻片上加荧光二抗约70μl，使其铺满整个玻片。室温下孵育2h。注意避光，PBS漂洗，蒸馏水冲洗。⑦封片：甩干多余水分，用抗荧光淬灭封片剂封片后立即在荧光显微镜下观察。

（5）成骨基因的表达：通过RT-PCR不同冻存时间来源的成骨细胞内β-actin，CollagenⅠ，OCN，OPN，BSP等成骨基因的表达。其过程如下：取出第2代各组成骨细胞，PBS 漂洗原培养液，弃去漂洗液，加入1mlTrizol，室温下孵育5 min，使核内复合物完全裂解。加入0.2ml氯仿，盖紧管口，振荡15s，室温下孵育5 min。4℃下12000g离心15 min，离心后液体分成3相，底部红色的酚一氯仿相，中间混合相及上部无色的水相。上部无色的水相约占总体积的60％。将上层水相转移到另一新的离心管中，加入0．5ml异丙醇，充分混匀，室温下放置孵育l0 min，4℃下12000 g离心5 min以沉淀RNA。吸弃上清，加入1ml 75％乙醇洗涤RNA沉淀，旋转混匀，4℃下7500 g离心5min。用10μlRNA free水溶解RNA。按照10μl反应体系进行逆转cDNA，加入 5×PrimeScriptTM Buffer（含有d NTP Mixture 和Mg²⁺）2μl，PrimeScriptTM RT Enzyme MixⅠ0.5μl，Oligo dT primer 0.5μl，Random 6 mers 0.5μl，RNA 6.5μl，水浴锅37℃15min，85℃15s，合成好的cDNA模板立即进行PCR反应。各基因及引物设计如下：COLⅠS: 5'CCAAGAAGAAGACATCCCACC3', COLⅠA: 5'CAGATCACGTC ATCGCACAA3'; OCNS:5'TCACAGACCCAGACAGAACC G3', OCN A: 5'AGCCCAGAGTCCAGG TAGCG3'; OPN S:5'CACTGACATTCC AGCAAC3',OPN A:5'ATCT TCCATACTCGCA CT3'; BSP S: 5' TGGCTCTAA GACAACACTC 3', BSP A:5' TGTGC CCTTTATAGTA GCT 3'; β-actin S: 5'CCTGTGGCATCCACGAAACT3', β-actin A:5'GAAGCATTTGCGGTGGACG A 3'，退火温度53℃，预计产物大小分别是135bp、207bp、190bp、245bp、307bp。目的基因PCR扩增：EXTaq 14.5μl， 引物S: 0.5 μl，引物R: 0.5 μl，H2O 7.5 μl，cDNA 2 μl。 循环 参 数 为：95℃ 预变性5min，95℃ 30s，53℃ 30s，72℃ 30s，30个循环，最后，72℃ 延伸10 min。PCR产物采用2%凝胶电泳紫外灯下观察，与DNA Ladder Marker对比碱基大小，以出现与预计产物碱基大小相同的片断为阳性。

实施例二：冻存骨来源成骨细胞复合β-TCP进行裸鼠皮下成骨。

步骤一、支架材料的处理与细胞复合。

β- TCP材料高温消毒备用。与细胞复合前24小时与成骨诱导培养液中浸泡以充分排出孔隙中的气泡。用消毒滤纸吸出孔隙中的培养液后，立即复合。将冻存骨来源的成骨细胞第二代消化，制成细胞密度为30×10⁶/ml的细胞悬液，缓慢滴加到β-TCP材料至饱和状态，复合后的细胞－支架复合物即刻植入。实验按照随机原则分为：A组（1个月组，n = 12），B组（3个月组，n = 12），C组（6个月组，n = 12），D组（12个月组，n = 12），E组（新鲜骨组，n = 12）。观察时间为6个月。

步骤二、细胞－支架复合物裸鼠皮下植入。

取上述所构建的组织工程复合体，每只裸鼠植入左、右两个部位。所有的植入操作均在SPF级动物房的超净台内进行。裸鼠经乙醚少量吸入麻醉后，于其背部两侧两个各剪开1cm左右的切口，充分游离周围的皮下组织，将材料置入后缝合切口。每组12个标本，6个生物力学测定，6个标本组织学检测。术后6个月取材。

步骤三、显微硬度测定。

按照植入标本的最大径剖开断面，包埋固定于树脂中，暴露最大剖面，进行显微硬度测定。按照负载25g，持续时间20s操作，每标本测量前、后、左、右、中五个部位取平均值。每组6个标本的平均值为该组力学参数。

步骤四、组织病理学观察。

标本处理过程如下：①固定：10%甲醛溶液固定3d，自来水冲洗过夜；②梯度酒精脱水：75%，85%，90%，95%，100% 5个梯度对标本行脱水处理。每个梯度2d；③透明化：弃酒精，将标本放在甲苯中浸泡4h；④包埋：将标本放入单体中，单体应高于标本顶部1-1.5cm，加入固化单体（最为催化剂），在干燥器内抽气处理（防止产生气泡），4℃放置一周，室温下放置至单体变粘稠，转入37℃烘箱内至单体硬化。⑤硬组织切片：MMA完全硬化后，采用 LeicaSP1600硬组织切片机切片，切片厚度为150μm，打磨至50μm，封片，抛光。苦味酸-品红（Van Geison）染色：①超声洗片2min；② 将切片放置在0.1％甲酸溶液中3min，水冲洗切片2min。③将切片放置20％甲醇溶液中，2h，擦干。④60℃ Stevenol蓝染色5-15min，流水冲洗切片2 min。⑤Van Geison--苦味酸品红染色3-8min，100%乙醇清洗；蒸馏水洗，晾干。切片在40×下整体统计新骨形成面积。

实施例三：冻存骨来源成骨细胞复合β-TCP构建组织工程化骨进行犬上颌窦提升同期种植体植入。

步骤一、冻存骨来源成骨细胞的培养。

参照按前述的方法使用DEMEM培养液获取、扩增深低温冻存1个月、3个月以及新鲜骨组织来源的第2代成骨细胞，更换培养液为DMEM成骨诱导培养液。细胞生长至70－80%融合时，予以传代。

步骤二、组织工程骨的构建。

准备灭菌直径1.5-2.5mm的β-TCP颗粒（上海贝奥路生物材料有限公司），将细胞收集后按照20×10⁶个/ml的浓度与β-TCP复合至饱和状态，使得材料湿润,而液体不流出。然后放入37℃恒温混合气体（5％CO₂，95％O₂），100％饱和湿度条件下培养4h备用。

步骤三、冻存骨来源成骨细胞复合β-TCP进行犬上颌窦升同期种植体植入。

实验按照随机原则分为：A组（1个月冻存骨来源的成骨细胞复合β-TCP，n = 6）；B组（3个月冻存骨来源的成骨细胞复合β-TCP，n = 6）；C 组（新鲜骨来源的成骨细胞复合β-TCP，n = 6），D组（自体髂骨组，n = 6）。观察时间为12个月。全麻下将拔除犬双侧上颌区磨牙及前磨牙尖牙3-4颗，修整牙槽嵴，缝合创口，观察2-4个月后行上颌窦提升并同期种植体植入术。

手术过程：全麻成功后于备皮，常规口内外消毒铺巾，沿上颌后牙区牙槽嵴顶作4-5cm长切口，依此切开各层组织，暴露上颌骨外侧壁，在上颌窦外侧壁KaVo打磨钻制备2.0cm×1.5cm骨缺损。细心用微型骨膜分离器剥离上颌窦黏膜，并推之向后方，于是形成了一较大的空腔。在牙槽嵴顶偏腭侧玻璃粘骨膜，暴露种植区，在上颌窦粘膜与窦底之间插入一骨膜分离器,以免上颌窦粘膜在种植体植入备洞时受损，然后定点，按操作步骤规范植入种植体（CDIC，直径3.85，长度10mm）。将各组植入材料植入上颌窦底，每侧上颌窦植入材料体积为1.0ml，分层缝合（图5-1. A，B）。术后青霉素80 万单位肌注5d，每天2 次，预防感染。术后12个月处死取材。

步骤四、标本制备和组织病理学观察。

取材后将上颌窦提升标本放入10% 中性缓冲福尔马林中固定3d，梯度脱水，二甲苯透明，放入包埋液中，待固化后使用Leica SP1600硬组织切片机连续切割标本，厚度150μm，打磨抛光至50μm，苦味酸-品红（Van Geison）染色。

实验结果如下。

细胞培养：倒置相差显微镜观察原代及传代后的冻存骨来源的成骨细胞：骨组织块接种5-9 d后，可见到梭形、短梭形或多角形细胞在组织块周围移行生长，接着4-7d后可达到80%以上融合，呈放射样。然后传代，刚传代后的细胞呈圆形漂浮在培养液中，轮廓清晰。24h后开始贴壁，此时贴壁细胞多呈不规则形态或椭圆形。细胞出现有丝分裂，进入增殖期，待细胞达到80%以上可进行再次传代。经条件培养液诱导后的细胞的胞体形态变得稍小，其它如增殖速度未见到明显变化。4组成骨细胞在形态和增殖速度上未见到明显区别（图1）。

细胞增殖检测(MTT法)：4组成骨细胞培养8d，每天以MTT法测定OD值。随着培养天数的增加，所测得的OD值也随之上升，表明细胞体外增殖呈递增趋势，7、8d后细胞增殖减缓，逐渐进入平台期（图2）。

细胞成骨分化能力检测：第2代冻存1个月、3个月、6个月、12个月不同时间骨组织来源的成骨细胞染色后胞浆可见紫红色的颗粒，4组未见到明显差异（图3. A，B，C，D）。钙结节染色显示局部可见散在黑色斑块分部，大小不均匀，细胞密集区出现明显的较大钙结节，各组之间未见到统计学差异（图4. A，B，C，D）（P>0.05）。OPN免疫组化各组均显示阳性表达（图5. A，B，C，D）。RT-PCR显示成骨基因CollagenⅠ，OCN，OPN，BSP在4组均有阳性表达（图6. A，B，C，D）。

裸鼠皮下成骨显微硬度测定：冻存1个月、3个月、6个月、12个月和新鲜骨来源成骨细胞异位成骨显微硬度检测结果分别为592.98±82.33（HV）、609.19±99.36（HV）、623.26±78.81（HV）、581.95±72.43（HV）、608.42±75.78（HV），表明不同冻存时间形成的组织工程骨在力学上未见到明显差异，均具有良好的力学特性（P>0.05）（图7）。

裸鼠皮下新骨形成面积观察：冻存1个月、3个月、6个月、12个月不同时间以及新鲜骨来源的成骨细胞复合β-TCP植入裸鼠体内后均有明显的新骨形成，其面积分别40.75±10.49%、36.04±9.21%、50.94±9.52%，34.53±10.23%、42.21±9.74%，支架材料的球形空隙中被新骨充填，局部可以见到较为成熟的板层骨结构，组间差异无统计学意义（P>0.05）（图8）。

犬上颌窦提升同期种植体植入组织学观察：根据12个月取材后非脱钙组织标本光镜观察种植体周围骨结合（BIC）情况，其中A组为46.36±6.27%，B组为50.61±4.96%，C组为42.37±5.88% 其差异无统计学意义（P>0.05），3组的骨结合均高于D组的29.84±5.65%（P<0.05）。表明组织工程骨能够较自体骨更有利于维持上颌窦提升的效果，进而提高了种植体和周围骨组织的结合。1个月和3个月不同冻存时间冻存骨来源的成骨细胞与新鲜骨来源的成骨细胞3组种植体骨的结合差异无统计学意义（P>0.05）（图9）。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，例如扩大可冻存的组织范围（包括软骨、肌肉、神经、血管、脂肪、肝脏、肾脏、心脏、牙齿等），这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种冻存骨来源的成骨细胞在骨组织再生中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

（1）冻存：收集碎骨颗粒放入冻存管中，加入配方为DMSO：血清：DMEM体积比1：3：6的冻存液，先置于-75℃—-85℃冰箱中，30-40分钟后放入-196℃液氮中冻存；

（2）复温：取出冻存骨，快速复温，洗去冻存液，进行组织块培养，所述快速复温指37℃复温1—2分钟；

（3）构建组织工程化骨：将步骤（2）得到的细胞、生物支架材料复合构建组织工程化骨。

2. 根据权利要求1所述的一种冻存骨来源的成骨细胞在骨组织再生中的应用，其特征在于，步骤（1）冻存中，先置于-80℃冰箱中，30分钟后放入-196℃液氮中冻存。

3.一种冻存骨来源的成骨细胞，其特征在于，所述成骨细胞来源于冻存骨，且保持增殖与成骨分化能力。

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