JPH10511563A

JPH10511563A - 心臓弁枠組み上での三次元ヒト細胞培養物およびその使用

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Publication number: JPH10511563A
Application number: JP8510252A
Authority: JP
Inventors: ケー．ノートン，ゲイル; エー．ノートン，ブライアン; エフ．パーチオ，アンソニー; ケー．ランディーン，リー; ゼルティンガー，ジョーン; ディー．キャンベル，トッド
Original assignee: アドバンスドティシューサイエンシズ，インコーポレーテッド
Priority date: 1994-09-12
Filing date: 1995-09-08
Publication date: 1998-11-10
Also published as: AU700911B2; AU3585595A; EP0781116A1; NZ293419A; CA2199810A1; KR970705951A; IL115261A0; WO1996008213A1; EP0781116A4

Abstract

(57)【要約】本発明は、in vitroで培地中にヒトの線維芽細胞を用いる三次元培養によって多種の細胞及び組織を増殖させる方法に関する。本発明によれば、間質細胞（ヒトの皮膚及び心性線維芽細胞を含むがそれらに限定されるものではない）を三次元スカフォールド(scafold)又は枠組み構造上に接種し増殖させる。ヒト線維芽細胞はヒトマトリックスタンパク質を分泌し、間質細胞で架橋された間隙空間を有する三次元構造として形成されている細胞からなるものではない心臓弁又は大動脈壁および葉状器官で構成されている、ブタのマトリックスを補いかつ置換する。そのように形成された支質組織は支持体となり、培地中での細胞の長期間の生存の維持と増殖に必要な、および／またはin vivoでインプラントされた培養物の生着と増殖に必要な、成長因子、及び調節因子を供給する。この三次元系で増殖させた場合、増殖した細胞が成熟し、適正に分離してin vivoで対応する同種の組織構成成分を形成する。

Description

【発明の詳細な説明】心臓弁枠組み上での三次元ヒト細胞培養物およびその使用１．序論本発明は、線維芽細胞などのヒト細胞を、ブタ大動脈葉状器官および壁、無傷の心臓弁、弁または弁成分を再建するのに適したその他の生物学的足場(scaffol ding)（例えば、それらに限定されないが、心膜または小腸粘膜下組織など）、ならびに生物分解可能な枠組みを含む三次元足場(scaffold)上で in vitro 増殖させて、該足場が正常な機能を有する生存可能なヒト細胞とともに定着できるようにすることに関し、線維芽細胞は刺激を受けると、該足場上の既存マトリックスを補い、置換するためのヒトマトリックスタンパク質を産生する。その結果得られる三次元組織構築物は、１つの弁成分または心臓弁全体の置換および／または再建のための in vivo移植(transplantationまたはimplantation )から、細胞毒性化合物および薬剤化合物の in vitro スクリーニングまで種々の適用がある。２．発明の背景弁置換による外科的治療は、それらに限定されないが、大動脈弁狭窄、大動脈弁逆流、僧帽弁狭窄、僧帽弁逆流、肺動脈弁疾患、三尖弁疾患、多弁膜症、マルファン症候群および人工弁疾患などの種々の心臓弁膜症の治療に必要である。一般的な２種類の弁置換が利用できる。すなわち、人工の機械的プロテーゼまたは弁、および組織生物学的プロテーゼまたは弁である。機械的プロテーゼには、ボール弁、ティルティングディスク（tilting disk）およびセントラルフローディスク(central flow disk)など数種類がある。また、組織プロテーゼにも、保存された同種移植片およびステントを取り付けたブタ弁異種移植片などいくつかある。機械的プロテーゼの主な利点は耐久性であるが、欠点は、患者が血栓塞栓症の合併症を起こす危険を少なくするために抗凝固療法による治療を受ける必要があることである。これは、人工の機械的心臓弁だと、血栓による閉塞を起こしやすく、また、機械的破損を受けやすいからである。再手術および患者の死の原因は、血栓塞栓症および抗凝固薬による出血がまだなお多い。さらに、機械的破損は、警告なく突然発生し、その結果、装置を取り替えるための緊急外科的手術が介入する可能性がある。生物学的プロテーゼの利点は、血栓塞栓合併症を起こす危険性が低いことであるが、状況によっては、抗凝固療法がやはり必要である。さらに、現在使用されている生物学的移植片は、突然の不全が起こることはあまりない。しかし、生物学的組織移植片も、多くの理由により限界がある。同種異系のヒト弁（同じ種のドナーに由来）は、提供されるヒトの心臓の供給による制限があるし、レシピエントは、拒絶反応を避けるために、免疫抑制療法を受けなければならない。異種弁（異なる種のドナーに由来）は十分あるが、それに必要な処置は時間とともにカルシウム沈着を生じ、徐々に分解を招くので、置換を必要とする。例えば、同種異系で移植される心臓弁は、新鮮なものが得られ、または、細胞成分の生存力を維持するために低温保存することができる。同種異系移植片を得た患者は、通常は、免疫抑制療法を受けなければならない。そのような治療にもかかわらず、多くの移植片は炎症を起こし、５〜１０年のうちに不全となる。さらに、同種異系弁は、異種弁のように容易には入手できない。異種の生物学的弁（通常はブタまたはウシ起源）は、設計および構造が、置換される弁と同一であるという利点があるが、グルタルアルデヒドによって固定されるので、生存していない。グルタルアルデヒド処理した組織は、時間とともにカルシウム沈着を起こし、再造形に必要な宿主細胞による浸潤およびコロニー化ができない。その結果、これらの異種弁は、時間とともに分解し、最後には機能不全となる。ヒトの自己の組織（すなわち、レシピエント由来）は、冠状および末梢バイパス法、III 度熱傷ならびに骨および軟骨移植に係る再建法に使用される。そのような使用は、免疫拒絶の合併症が排除され、その結果、移植のより良好な生存が得られる。不幸なことに、自己の心臓弁移植片によって起こる合併症がある。例えば、移植後の血栓症および閉塞ならびに移植組織の瘢痕の形成である。既存の心臓弁技術である、抗凝固薬の一定使用を必要とする機械的弁および最終的にはカルシウム沈着を招くグルタルアルデヒド固定した組織弁を改良するという不適合患者の要求により、移植のための、組織をベースとする別の心臓弁の開発が必要である。人工の組織および器官を作るという以前の試みは、成功に限界があった。Orto n の米国特許 No．5,192,312は、外因性の基本的線維芽細胞成長因子（ＢＦＧＦ）により移植組織サンプルを処理し、その組織を、細胞、好ましくは同種異系または自己の線維芽細胞によって再定着させ、表面的に免疫学的拒絶反応を回避することを記載している。心臓弁および心臓葉状器官は、致死用量のＸ−線、または抗生物質、抗菌剤および細胞毒性物質で滅菌することができる。Orton によれば、ＢＦＧＦの組織への in vitro 添加は、この系では重要であり、移植片が定着する細胞を組織に移動させ、成長因子に応答して増殖させ、組織を定着させるために必須である。しかし、Orton は、その系をペトリ皿に固定した弁の小片に対してのみ例示し、機能性心臓弁の製造または in vivo移植した場合の利点、例えば免疫学的拒絶反応の回避ならびに弁移植片の硬化および／または瘢痕形成の減少については示していない。 Livesey らの米国特許 No．5,336,616は、移植のための、コラーゲンをベースとする無細胞組織マトリックスを処理し、保存するための、移植可能な組織移植片を製造する方法に関する。記載された方法は、生物学的組織を安定化溶液で処理して、浸透性、低酸素、自己分解およびタンパク質加水分解による分解を防止し、汚染を制御することに係るものであった。組織は、ＥＤＴＡ、ＣＨＡＰＳまたは両イオン性界面活性剤、ＳＤＳまたは陰イオン／非イオン界面活性剤で細胞除去した(decellularize)後、ＤＭＳＯ、プロピレングリコール、ブタンジオール、ラフィノース、ポリビニルピロリドン、デキストランまたはショ糖などの凍結保護物質で処理し、液体窒素中でガラス状にした。その後、組織を、窒素ガス下での分子蒸留乾燥を含む乾燥安定化法にかけ、次いで、緩衝溶液により再水和を行った。それらの方法は各々、限界があり、従って、材料の生物学的性質を保持し、処理中に使用した試薬から生じる毒性を回避するために、非常に厳しい処置を取ることが必須である。３．発明の要旨本発明は、三次元の枠組み、足場またはマトリックス上で増殖させたヒト細胞で構成される移植可能な心臓組織または生物プロテーゼ移植片、ヒト細胞の該枠組みでの培養方法および該三次元細胞培養物の使用に関する。本発明によれば、それに限定されないがヒト線維芽細胞などの間質細胞を接種し、三次元枠組み、例えば無傷の心臓弁、大動脈壁および葉状器官、または弁もしくは弁成分を再建するのに適した他の生物学的足場（例えば、それらに限定されないが、心膜または小腸粘膜下組織など）、または生物分解可能な枠組みもしくはマトリックスなどで増殖させる。好ましい三次元枠組みは、細胞除去された（−20℃〜−70℃で、または界面活性剤および酵素による）および滅菌された無傷のブタの心臓弁、大動脈壁組織または葉状器官から作ることができる。滅菌は、酸化エチレンおよび過酢酸など（それらに限定されない）の化学的方法；γおよび電子ビームなど（それらに限定されない）の照射；ならびにオートクレーブなど（それに限定されない）の蒸気滅菌により行う。細胞除去された／滅菌された組織サンプルには生きた細胞が残っていないので、間質細胞を培養するための足場または枠組みとして使用される。足場上に接種される間質細胞としては、皮膚もしくは心臓の線維芽細胞および／またはＩ型および III型のコラーゲンおよび場合によってはエラスチンを産生することができる細胞（典型的には、心臓弁で産生される）を挙げることができる（表Ｉ参照）。間質細胞および間質細胞によって自然に分泌される結合組織タンパク質は、間質細胞によって架橋される間質空間を有する三次元の枠組みまたは構築物に結合し、実質的にそれを包囲する。そうして形成された生きた基質組織は、in vivo 移植された培養物における間質細胞の長期にわたる活発な増殖を保持するためのに必要な支持体、成長因子および調節因子を提供する。この三次元系で増殖させると、増殖細胞が成熟し、適切に分離して、in vivo の同等物に類似した成熟組織の成分を形成する。本発明の別の態様では、間質細胞を遺伝子操作して、成功および／または改善された移植に有益な遺伝子産物を発現させることができる。例えば、間質細胞を遺伝子操作することにより、抗凝固遺伝子産物を発現させ、血栓塞栓症の危険性を減少させたり、抗炎症遺伝子産物を発現させて炎症反応による不全の危険性を減少させることができる。例えば、間質細胞を遺伝子操作して、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）、ストレプトキナーゼまたはウロキナーゼを発現させ、凝固の危険性を減少させることができる。あるいは、間質細胞を遺伝子操作して、抗炎症遺伝子産物、例えば腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）または他の炎症性サイトカインに対する中和抗体のイディオタイプに対応するペプチドまたはポリペプチドを発現させることができる。好ましくは、細胞を遺伝子操作して、手術後の回復期に一時的に、および／または誘導可能なコントロール下で該遺伝子産物を発現させ、あるいは、間質細胞に固定されたキメラ融合タンパク質、例えば、受容体または受容体様分子の細胞内および／または膜内外ドメインで構成され、該遺伝子産物に細胞外ドメインとして融合したキメラ分子として発現させる。別の態様では、間質細胞を遺伝子操作して、凝固または拒絶反応を促進する因子または表面抗原の発現を「ノックアウト」させることができる。例えば、フィブリノーゲン、フォン・ビルブランド因子または血小板α２Ｂβ−３受容体に結合する細胞表面分子の発現を間質細胞でノックアウトして、血餅形成の危険性を減少させることができる。同様に、移植片の拒絶反応の危険性を減少させるために、ＭＨＣクラスII分子の発現をノックアウトすることができる。本発明のさらに別の態様では、本発明の三次元培養系により、移植の結果を助け、または改善し、および／または遺伝子治療で使用するために、遺伝子および遺伝子産物を in vivo導入するためのビヒクルが提供される。例えば、血栓の形成、炎症反応、線維症およびカルシウム沈着などの弁膜疾患の症状を防ぎ、または改善する遺伝子を、疾患状態において過少発現または過剰発現させることができる。すなわち、患者の遺伝子活性のレベルを、遺伝子操作される間質細胞での活性遺伝子産物のレベルを調整することによる遺伝子置換治療により、各々、増加または減少させることができる。下記第６節の実施例によって例示する特定の態様では、ヒトの皮膚線維芽細胞を本発明の三次元培養系で増殖させた。現在、心臓弁の置換治療で使用されていることから、ブタの大動脈壁および葉状器官を選択した。ヒト線維芽細胞の増殖が生じ、大動脈壁および葉状器官でヒトマトリックスタンパク質に類似した組織の産生が検出されたブタの大動脈壁および葉状器官の培養物で特に利点が達成された。これらの特徴は、細胞を再付着した(recellularized)または改造した構築物の細胞分布（組織学的分析）、細胞生存度（ＭＴＴアッセイ）、細胞増殖（³ Ｈ−チミジン標識または BrdU の取り込み）、タンパク質産生（³Ｈ−プロリン標識、³⁵Ｓ−システイン／メチオニン標識）およびタンパク質免疫組織化学を分析することによりモニターした。これらの研究から得られた結果は、ヒトの皮膚線維芽細胞が、数回の時間的間隔、例えば、それらに限定されないが２、４、８および１８週間にわたって培養され、増殖して葉状器官、大動脈壁生検および無傷の弁のブタの足場にコロニーを形成することができることを示した。すなわち、本発明は、ブタの大動脈壁および葉状器官をヒト線維芽細胞によって再定着させて、ブタの大動脈葉状器官および壁が過酢酸（もしくは酸化エチレンなどの他の化学手段）によって、または電子ビーム照射（もしくはγ−照射）によって、または蒸気（オートクレーブ）によって最初に滅菌されるヒトマトリックスタンパク質を産生する方法に関する。下記の実施例では、ヒト線維芽細胞を、細胞除去し、滅菌したブタの大動脈弁、壁および葉状器官で構成される枠組みまたは構築物上で培養して増殖させた。 in vivo 移植すると、そのような枠組みまたは構築物は、移植部位に移植および血管新生が生じるまで細胞への十分な栄養およびガス交換を可能にする。三次元の、細胞除去したブタの足場または生物分解可能な構築物にヒト線維芽細胞を添加することの利点は、ブタの足場にコロニーを形成し、その結果、宿主細胞を刺激して移植片を内皮とすることができ、宿主心臓線維芽細胞を刺激して移植片に組み込ませることができる生物学的因子を産生する生きた細胞を有する弁移植片が得られるということである。最終的には、宿主−移植片の生着が高まる。ヒト線維芽細胞を添加することの別の利点は、ヒト線維芽細胞の増殖を阻害することなく、滅菌条件下で培養物を維持することができることであり、ヒト線維芽細胞は、通常、界面活性剤または酵素で前処理され、過酢酸または電子ビームによる照射で滅菌した種々のタイプの枠組みまたは構築物において増殖する。さらに、機能性ヒト細胞によってコロニーが形成された心臓弁は、免疫学的拒絶反応をあまり受けないので、置換治療で使用するために作られる異種細胞で被覆した心臓弁よりも優れている。本発明の目的は、ヒト包皮または心臓線維芽細胞ならびにブタの心臓弁および／または大動脈壁および葉状器官から心臓弁を構築することであり、該心臓弁は、もはやブタ細胞を含むものではなく、ヒトに適応させたブタ心臓弁またはヒトでの移植に適する、細胞を再付着させた心臓弁となる。そのような方法は、ヒト線維芽細胞を in vitro で増殖させ、移植するための足場として、大動脈壁および葉状器官、無傷の心臓弁、弁または弁成分を再建するのに適したその他の生物学的足場（例えば、心膜、小腸粘膜下組織など）、および生物分解可能な枠組みを設計し、構築し、利用する改善された方法および手段を提供する。本発明のさらに別の目的は、ヒト細胞およびヒトの皮膚または心臓線維芽細胞によって造られるヒト組織マトリックスタンパク質から成る心臓弁ならびに種々の形状の弁または弁成分、例えば、それらに限定されないが、大動脈弁、肺動脈弁、僧帽弁および三尖弁などの完全またはほぼ完全な生体分解吸収可能／生体適合可能なポリマー足場を構築することである。そのような方法により、ヒトの患者の変質し、機能不全性の心臓弁を置換または再建するための、in vitroおよび in vivoの両方での細胞増殖に利用できる、生体プロテーゼまたは移植可能な組織が提供される。本発明のさらに別の目的は、ヒトの皮膚または心臓線維芽細胞を使用してブタの大動脈葉状器官および壁生検または弁もしくは弁成分を再建するのに適したその他の生物学的足場（例えば、心膜、小腸粘膜下組織など）にコロニーを形成し、代謝的に生きたままにして、その結果、葉状器官および壁組織またはその他の生物学的足場本来の全てのブタ細胞を除去（細胞除去）し、あるいは生存させなくする（死なせる）ことである。そのような方法により、ヒト線維芽細胞の、正常には、大動脈壁および葉状器官または無傷の心臓弁または肺動脈弁、僧帽弁および三尖弁の細胞によって体内に産生する生物活性分子の分泌に対する形態および細胞機能を保持する in vitro 系が提供される。本発明は、それらに限定されないが、大動脈弁狭窄、大動脈弁逆流、僧帽弁狭窄、僧帽弁逆流、肺動脈弁疾患、三尖弁疾患、多弁膜症、三尖弁疾患、マルファン症候群および人工弁疾患などの心臓弁膜症を治療するための方法ならびに生物学的組織プロテーゼまたは弁に関する。４．図面の簡単な説明図１は、ブタの大動脈葉状器官および壁上に接種した後のヒト皮膚線維芽細胞によって合成したタンパク質のオートラジオグラフィーによる写真である。図２は、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した組織片の写真であり、ａ）新鮮なブタ大動脈葉状器官（その組織本来の心臓線維芽細胞核は紫色に見える）；ｂ）界面活性剤および／または酵素で抽出したブタ大動脈葉状器官（ブタ細胞核は、化学処理した後は検出されない）；ｃ）ヒト線維芽細胞とともに 18 週間培養したブタ大動脈葉状器官の界面活性剤および／または酵素抽出物（ブタマトリックスにヒト皮膚線維芽細胞が存在する）（ヘマトキシリン／エオシンで染色）（10ｘ）である。図３は。ヒト皮膚線維芽細胞を接種し、４週間培養したブタ大動脈葉状器官の写真である（ヘマトキシリン／エオシンで染色）。図４は、界面活性剤および／または酵素抽出した大動脈葉状器官の３組のサンプル（＃１〜３）の線維芽細胞を含む場合および含まない場合で、線維芽細胞ととともに増殖させた葉状器官のみが、線維芽細胞の増殖を示す³Ｈ−チミジンの取り込みがあることを示す棒グラフである。図５は、タンパク質バンドを示すＳＤＳゲルオートラジオグラフ分析であり、ヒト線維芽細胞を接種した生きていないブタ大動脈葉状器官（レーン１）および大動脈壁生検（レーン２）はタンパク質の合成を示すが、接種しなかった生きていないブタ大動脈葉状器官（レーン３）およびブタ大動脈壁生検（レーン４）は、活性を示さない。ヒト線維芽細胞を接種した、生きた新鮮なブタ大動脈葉状器官（レーン５）およびブタ大動脈壁生検（レーン６）は、接種しなかった、生きた新鮮なブタ大動脈葉状器官（レーン７）およびブタ大動脈壁生検（レーン８）と同様のパターンを有する。図６：血清のみで染色したブタ大動脈葉状器官および壁（陰性の対照）（各々、ａおよびｂ）は、バックグランド染色は示さなかった。ヒトテネイシン(tenas cin)で染色したブタ葉状器官（ｃ）およびヒト線維芽細胞抗体で染色したブタ大動脈壁（ｄ）は共に、種交差反応を示さない。ヒトに適合させたブタの弁構築物全体を、動的流動下で４週間培養すると、ヒトテネイシンに対しては、葉状器官、壁および筋肉バー（ｅ、ｇ、ｉ）において陽性の染色を示し、ヒト線維芽細胞に対しては、葉状器官、壁および筋肉バー（ｆ、ｈ、ｊ）において陽性の染色を示した。図７は、ブタの大動脈葉状器官に対する動的培養後のヒト線維芽細胞のタンパク質の取り込みのオートラジオグラフィー写真である。図８は、予め界面活性剤および／または酵素処理によって細胞除去したブタマトリックス上でのヒト線維芽細胞の増殖を示す写真である。増殖細胞は Brdu で標識し、Brdu に対する抗体および可視化キットを使用して検出した。組織上で増殖する標識細胞は、動的流動条件下で増殖させた。４週間の培養期間の最後の 72 時間の間に Brdu 標識が現れた。図９は、パルスタイル(pulstile)（左）および非パルスタイル(non-pulstile) （右）動的流動条件下でヒト線維芽細胞を接種した、細胞除去（界面活性剤および／または酵素）し、電子ビーム照射した弁を示す写真である。どちらの弁も１週間、動的に培養した後、ＭＴＴで染色した。パルスタイル流動条件で接種した弁は、線維芽細胞の付着がより多く、より均一であった。５．発明の詳細な説明本発明は、三次元枠組み構造中で増殖させた、移植可能な心性組織構築物又は生物性人工器官の移植片、そのような枠組み構造上でヒト細胞を培養する方法、及び培地中で増殖させて再細胞を定着させた（recellularized）三次元組織構築物の使用に関する。本発明によれば、間質細胞（ヒトの線維芽細胞を含むがそれに限定されるものではない）を、三次元枠組み構造又はインタクトの心臓弁、大動脈壁及び葉状器官（leaflets）、又はその他の弁又は弁の構成成分を再構築するのに適した生物学的なスカホールディング（scaffolding）（例えば、心膜、小腸粘膜下組織あるいは生分解性の枠組み構造を含むがそれらに限定されるものではない）などの構築物上に接種して増殖させる。本発明によれば、三次元枠組み構造上で増殖させた細胞は、細胞性の組織マトリックスを形成するが、それは既に知られているものよりもはるかにin vivo の組織によく似たものである。ヒトの間質細胞で処理した三次元細胞培養系は、異なるタイプの細胞の増殖及び多くの異なる組織（大動脈壁及び葉状器官またはインタクトな心臓弁、肺動脈弁、僧帽弁及び三尖弁を含むがそれらに限定されるものではない）を形成するために応用することができる。さらに、この系で増殖させた間質細胞を遺伝子操作して、移植に有益な遺伝子産物、例えば、抗凝固因子（例えばTPA、ストレプトキナーゼなど）又は抗炎症因子（例えば抗TNF、抗IL-2など）を産生させることができる。また、間質細胞を、例えば、フィブリノゲンやフォン・ヴィルブランド因子などの血小板結合及び凝集塊（clot）形成を促進する天然の遺伝子産物の発現を「ノックアウト」するか、または拒絶反応の危険性を下げるためにMHCの発現を「ノックアウト」するために遺伝子操作を行なうこともできる。さらに、患者の遺伝子の活性レベルを調節して、移植の成績を助けるか向上させるために、間質細胞を遺伝子操作を行なって、遺伝子治療のために使用することもできる。三次元組織構築物にヒトの包皮線維芽細胞を用いることには、さまざまな利点や応用性がある。例えば、ブタ心臓弁、大動脈壁及び葉状器官、僧帽弁及び三尖弁の腱索、皮膚、靭帯、腱などの多様な細胞や組織について、三次元組織構築物を迅速に製造することができ、それ自体を生体内へ甚だしい遅滞なく、移植又はインプラントすることができる。三次元組織構築物は、in vitroで医薬品の有効性又は細胞毒性を試験し、凝集塊形成又は血栓塞栓症の治療において、抗凝固剤、抗炎症剤、抗石灰化剤、又は内皮化剤として使用する化合物をスクリーニングするためにも用いることができる。他の応用としては、この三次元組織構築系は、バイオリアクター中で細胞を付着させて(cellularize)、葉状器官の可動性及び完全な弁の機能を有する弁又は弁の構成物を製造することができる。例えば、壁に付着した葉状器官からなるインタクトな弁は、ヒトの間質細胞を接種しペリスタティックポンプや呼吸器(pne umatic)ポンプで調節して再循環させた培地中で維持することにより三次元枠組み構造として組み立てることができる。この培地中で、葉状器官または組織シート／パッチを動的状態に保つこともできる。バイオリアクターは、滅菌、接種、培養、輸送、及び／又は弁の機能試験などの各工程中における汚染の問題のない閉鎖系を提供する。弁あるいは弁の構築物を再構成するために適した、大動脈壁上のヒトの皮膚線維芽細胞、葉状器官の細胞またはインタクトの心臓弁、又は他の生物学的スカフォールディング（例えば、心膜又は小腸粘膜下組織又は、生分解性の枠組み構造であるがそれらに限定されるものではない）を、本発明によれば使用可能な三次元の生物学的なまたは合成の枠組み構造または構築物として培養する方法については、本出願の出願人によって共に出願中の、出願番号第08/304,062号（1994年 9月12日出願）に記載されている。この出願は1994年6月6日出願の出願番号第08 /254,096号の一部継続出願であり、出願番号第08/254,096号はさらに1993年10月 4日出願の出願番号第08/131,361号、米国特許番号第5,041,138号（Vacantiら）、および1990年 4月16日出願の出願番号第07/509,952号（Vacantiら）の一部継続出願である。これらは本出願に参考文献としてその全文が取り込まれている。大動脈弁狭窄、大動脈弁閉鎖不全、僧帽弁狭窄、僧帽弁閉鎖不全、肺動脈弁疾患、三尖弁疾患、多弁疾患、マルファン症候群、及び人工弁疾患など（それらに限定されるものではない）を含む心臓弁疾患の治療法について記載する。 5.1 三次元枠組み構造の確立本発明に用いる三次元枠組み構造は、 (a) 細胞がその枠組み構造に付着しうる（又は細胞を改変してその枠組み構造に付着させうる）；及び、 (b) 細胞が一層以上に増殖しうるいかなる材質、及び／又は形状から製造することができる。弁及び弁の構成成分を再構成するのに適した同種異系又は異種の大動脈壁及び葉状器官、インタクトな心臓弁、又は他の生物学的骨組み（例えば、各種の哺乳類、ヒト、ブタ、ウシ、ヒツジ、又はイヌなど、ただしそれらに限定されるものではない）から得られた心膜又は小腸粘膜下組織又は生分解性の枠組み構造（ただしそれらに限定されるものではない）を使用することが好ましい。ブタの葉状器官及び大動脈生検採取物は次の形のものを用いうる：放射線照射、化学的処理、又は蒸気処理（滅菌）したもの；細胞を除去したもの（例えば、界面活性剤、及び／又は酵素処理にて）、抽出及び滅菌したもの；死細胞および他の生物学的組織（例えば、これらに限定されるものではないが心膜又は小腸粘膜下組織）を有する弁組織（-20℃ から-70℃で凍結するか、又は凍結融解を繰り返して製造する）。弁及び弁の構築物を再構成するのに適した大動脈壁及び葉状器官、又はインタクトの弁、または他の生物学的スカホールディングは、本発明に従って用いうるものであるが、それらの細胞を除去する方法は米国特許第No.5,336,616号及び第 . 4,776,853号に記載の方法を含むが、それらに限定されるものではない（これらの特許は本出願に参考文献としてその全文が取り込まれている）。例えば、組織は、EDTA、CHAPS、又は両性界面活性剤で細胞を除去した後、DMSO、プロピレングリコール、ブタンジオール、ラフィノース、ポリビニルピロリドン、デキストラン又はショ糖などの凍結保護剤で処理し、液体窒素中でガラス状とした。別の方法としては、組織サンプルを酵素消化に供し、及び／又は細胞膜を破砕して細胞の内容物を除去するような薬剤で処理を行うことができる。界面活性剤の例としては、非イオン性界面活性剤(例えば、TRITON X-100、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール(Rohm and Hass)、BRIJ-35、ポリエトキシエタノールラウリルエーテル(Atlas Chemical Co.)、TWEEN 20、モノラウリル酸ポリエトキシエタノールソルビタン(Rohm and Hass)、LUBROL-PX、またはポリエチレンラウリルエーテル(Rohm and Hass)など)、及びイオン性界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、高級脂肪族アルコールの硫酸エステル、スルホン化アルカン、及び炭素原子数７〜２２の分枝鎖又は非分枝鎖のスルホン化アルキルアレーン）がある。用いる酵素は、ヌクレアーゼ（例えば、デオキシリボヌクレアーゼ及びリボヌクレアーゼ）、プロテアーゼ、ホスホリパーゼ及びリパーゼを含むことができる。本発明で用いる組織はまた、物理的手法、例えば、超音波処理あるいは浸透圧ショック、又は過酢酸を用いる化学的処理によっても細胞を除去しうる。三次元的枠組み構造は、各種の異なるタイプの弁（大動脈弁、肺動脈弁、僧帽弁及び三尖弁、及びそれらの各タイプの弁の構成成分）の形状中にある、完全に又はほぼ完全に生体吸収性／生体適合性ポリマーのスカホールディングで構成することもできる。生分解性のスカホールディング、構築物、枠組み構造、又はマトリックス（例えば、ポリグリコール酸、腸線縫合材、ヒアルロン酸、セルロース、（スポンジ、組み紐、編んだ糸などの形態の）コラーゲン、ゲラチン、又はその他の自然界に存在する生分解性材料又は合成材料（例えば、各種のポリヒドロキシアルカノエートを含む）で構成することができる。このような枠組み構造又は構築物はヒトの細胞を接種する前に、心臓弁の形状または修復用シート／パッチの形状に成型され得る。しかし、可能ならば、元の組織の三次元構築物、例えば、大動脈壁及び葉状器官、又はインタクトな心臓弁を用いることが最も好ましい。本発明は、in vivoで認められる同種の組織の類似体の構成成分をin vitroで形成させるために、三次元培養系によって、培養液中での細胞の増殖、移動、分化及び分離が支持されるという発見に、一部基づいたものである。スカフォールディングに加えられたヒト細胞は、外部から成長因子を加えることなくブタの弁に定着する。このことは、bFGFで処理していない葉状器官の組織は無細胞のままであるというOrtonの教示とは反対である。成長因子（例えば、αFGF,βFGF,インシュリン様成長因子、又はTGF-βだがそれらに限定されるものではない）、天然のあるいは改変した血液産物（blood products）又はその他の生理活性な生物学的分子（例えば、ヒアルロン酸又はホルモンが上げられるががそれらに限定されるものではない）は、本発明において絶対的に必要というわけではないが、ブタあるいはその他の生物学的スカフォールディングの再構成をより促進するために用いうる。出願人には本発明が機能するメカニズムについて説明する義務はないが、この三次元培養系に固有の多数の要素によってそれがうまく働いている： (a) 三次元枠組み構造はタンパク質の付着に対してより大きい表面積を与え、その結果、間質細胞が付着する際に大きい表面積を与えている。 (b) その枠組み構造の三次元性によって、間質細胞は活発な増殖を継続できる。これは、コンフルエンスとなるまで増殖し、接触阻害を示し、成長及び分裂を停止するという単層培養における多くの細胞とは対照的である。支質細胞を複製して細胞外マトリックスタンパク質を作り、成長因子や調節因子を分泌することは、おそらく部分的には、培養中の細胞の増殖を刺激すること、正常組織分化を維持すること及び細胞分化の調節に応答していると考えられる。 (c) 三次元枠組み構造は細胞性エレメントの空間的な分布を可能にし、そのことは、対応する組織のin vivoで認められる状況に、より一層類似したものとなる。 (d) 三次元培養システム内での細胞増殖の容積の増加は細胞の成熟を導局在化された微小環境を確立することとなる。 (e) 三次元枠組み構造は移動性の細胞の動きをより大きく可能にする性ことにより細胞間相互作用を最大限にする。 (f) 分化した細胞の表現系の維持には成長因子／分化因子のみならず適当な細胞間相互作用が必要であることが認められている。本発明は組織の微小環境を効果的に再作成する。三次元の支質細胞の支持体、培養系自体、その系の維持、及びその三次元培養の各種の使用について次のサブセクションでより詳細に述べる。 5.2 三次元支質組織の確立線維芽細胞からなる支質細胞を、下記の他の支質細胞及びエレメントとともにまたはこれらなしで、三次元枠組み構造上に接種する。ヒトの線維芽細胞をその他の支質細胞を接種する前、接種中あるいは後に添加してもよい。培養液中で維持される線維芽細胞の濃度をモニターすることができ、適当に調整して増殖を最適にし、そしてスカフォールディングへの細胞の定着を調節することができる。また別の方法として、遺伝子操作を行ない、心臓弁の細胞が産生するのと同様な因子を発現し産生するようにした支質細胞を接種物に含めることも可能である。これらの細胞は培養液中でタンパク性因子の源として働くはずである。その因子の遺伝子又はコード配列は調節されたプロモーターの制御下にあり、培養液中の因子の産生をコントロールできることが好ましい。遺伝子操作を行なった細胞は次の各種のタイプの細胞を選択するためのスクリーニングを受ける：1)in vivo での血塊形成、凝固、血栓塞栓症、及び炎症反応を改善するもの、及び2)免疫学的な監視と拒絶反応を逃れるもの。皮膚線維芽細胞、心性線維芽細胞、及びコラーゲンタイプI及びIII、エラスチン及び他の心臓弁マトリックスタンパク質（例えば、フィブロネクチンやグリコサミノグリカン、があるがそれらに限定されるものではない）を産生可能な細胞からなる支質組織は、in vitroで移植可能な組織又は人工心臓弁を増殖させるために用いられる。線維芽細胞などの支質細胞は、皮膚、ヒト包皮、心臓組織又は他の適当な器官からかなり容易に定量的に得られる。胎児又は新生児の線維芽細胞は、種々の異なる細胞及び／又は組織の増殖をサポートする「汎用」三次元支質組織構築物を作成するために用いうる。線維芽細胞は、その供給源となる適当な器官又は組織を解離させることにより、容易に単離しうる。これは、当業者の手法を用いれば容易に成し遂げられる。例えば、機械的処理、及び／又は消化酵素処理、及び／又はキレート剤を用いることにより隣接する細胞の結合を弱めて解離させ、細胞を壊すことなく組織を個々の細胞を分散させて懸濁液とすることができる。酵素を用いる解離は、組織をミンスし、ミンスした組織を数多くの消化酵素を、単独あるいは複数で用いることによって行いうる。酵素としては、トリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、プロナーゼなどが含まれるがそれらに限定されない。機械的な解離についても、グラインダー、ブレンダー、ふるい、ホモジナイザーの使用または細胞を加圧することなど種々の方法が挙げられるがそれらに限定されない。組織解離の技術を概観するためには、Freshney，Culture of Animal Cells．A Manual of Basic T echnique，2nd Ed.，A.R.Liss，Inc.，New York，1987，ch.9，pp.107-126を参照せよ。組織を、個々の細胞が分散された懸濁液とした後、懸濁液を分画してサブポピュレーションとし、そこから線維芽細胞、及び／又はその他の支質細胞、及び／又はエレメントが得られる。懸濁液の分画はまた、次の方法（それらに限定されない）によって行いうる：特定の細胞タイプのクローニングと選択、不必要な細胞の選択的破壊（ネガティブセレクション）、混合状態で細胞の凝集性の差に基づく分離、凍結−融解操作、混合状態での細胞の付着（粘着性）の差に基づく分離、ろ過、従来の遠心法及びゾーン遠心法、遠心エルトリエーション（向流遠心）、ユニット重力分離(unit gravity separation)、向流分配、電気泳動及び蛍光活性化細胞分離法。クローン選択及び細胞分離技術を概観するためには、Fres hney，Culture of Animal Cells．A Manual of Basic Technique，2nd Ed.，A. R.Liss，Inc.，New York，1987，Ch.11-12，pp.137-168を参照せよ。線維芽細胞の単離は一例として次のように行われる：新鮮な組織サンプルを完全に洗い、血清を除去するためHanks balanced salt solution(HBSS)中でミンスする。ミンスした組織を1-12時間、例えば、トリプシンなどの解離酵素の溶液（用時調製したもの）中でインキュベートする。インキュベート後、解離した細胞を懸濁し、遠心してペレットとし培養皿上に置く。線維芽細胞は他の細胞より先に付着するので、適当な支質細胞が選択的に単離され増殖される。単離した線維芽細胞は増殖させてコンフルエントにし、コンフレント培養から取り出して三次元支持体上に接種する（Naughtonら、1987，J.Med．18(3&4):219-250参照）。三次元マトリックスに高濃度の支質細胞（例えば、約10⁶から5 x 10⁷個/ml）を接種すると、より短期間で三次元支質細胞構築物を確立しうる。培養細胞をin vivoの移植又はインプラントに用いる場合は、患者自身の組織から支質細胞を得ることが好ましい。しかしながら、同種異系に適合するヒトの細胞を、移植後の重篤な拒絶反応を起こさずに用いることも可能である。三次元支質細胞支持体マトリックスの存在下での細胞の増殖は、特定のアミノ酸、タンパク質、糖タンパク質、グリコサミノグリカン、細胞性のマトリックス、及び/ 又はその他の材料をマトリックスに添加するかこれらで被覆することによって増強しうる。支質細胞を接種した後、三次元マトリックスを適当な栄養培地中でインキュベートする。多数の市販の培地、例えば、DMEM，RPMI 1640，Fisher's 培地、Isco ve's培地，McCoy's 培地及びそれらに類似のものが使用に適している。増殖能を最大限にするため、三次元支質細胞マトリックスをインキュベーション期間中培地に懸濁又は浮遊させておくことが好ましい。このプロトコールで用いる容器は、インキュベーター中で安定に、すなわち静的状態（還流や流動させない）に保たれる。さらに、培養液を定期的に「補充」して、消費した培地を除去し、遊離される細胞数を減らし、新鮮な栄養素を添加する。線維芽細胞の濃度はこの工程中で調節される。これらの操作は、支質細胞を接種した三次元枠組み構造を納めた閉鎖系であるバイオリアクターを用いる場合には非常に容易である。バイオリアクターは汚染の可能性を減じ、その培養液を継続的な培地の還流状態とし、葉状器官を開閉させることによって動的状態を保つ。さらに具体的には、"Apparat us and Method for Sterilizing，Seeding，Culturing，Storing，shipping，an d Testing Tissue，Synthetic or Mechanical Heart Valves or Valve Segments "と題する米国特許出願（本出願の出願人により本出願と同時に出願された）中で、バイオリアクターの動作について述べており、その特許出願は参考文献として本出願に含まれている。インキュベート期間中に、支質細胞はマトリックスの深部に移動し始める前に三次元枠組み構造に沿って増殖し付着する。目的の一つは、細胞をin vivoの組織に存在する支質細胞の量を反映する程度に適度に増殖させることである。第二の目的は、接種物中及び／又はスカフォールディング上での細胞数を調整し、スカフォールディング上への定着量を望ましい量にし、及び再現性をもつようにすることである。非組織性の枠組み構造又は構築物の開口部は、その開口を通って支質細胞が伸長できるような適当な大きさでなければならない。枠組み構造上を伸長していく活発に増殖する支質細胞を維持することによって、支質細胞から生じる成長因子の産生を促進し、長期間の培養ができることとなる。例えば、開口が小さすぎると、支質細胞は急速にコンフルエンスとなり、メッシュから容易には抜けることができなくなってしまう；捕捉された細胞は接触阻止を示し、増殖に必要で長期間の培養を可能とする因子の産生を停止してしまう。もし開口が大き過ぎれば、その開口部を横切って支質細胞が伸長することが不可能になる。このことも支質細胞での、増殖に必要で長期培養を維持する因子の産生を減少させる。メッシュタイプのマトリックスを用いる場合には、ここに例示したごとく、開口部が約15 0μmから約220μmの範囲が満足しうるものである。しかし、三次元構造及び枠組み構造の入り組み方に応じて、その他のサイズの開口部も同様にうまく働く。事実、支質細胞が伸長して複製し続け、長期間にわたって増殖するようなものであれば、いかなる形状及び構造でも本発明はうまく働く。ヒト皮膚線維芽細胞は、ブタの組織マトリックスのいろいろなタイプのものに対し、さまざまな親和性を示す。界面活性剤、及び／又は酵素抽出で作製したブタのマトリックスを用いた場合、線維芽細胞の定着が最大である。さらに、線維芽細胞のブタ組織への定着は時間と相関している。枠組み構造上に付着した種々のタイプのコラーゲンの比率を変えることができる。例えば、移植可能なあるいは生物学的な人工器官である心臓弁の増殖を最適とするためには、タイプI及びIIIのコラーゲンを最初のマトリックスに付着させることが好ましい。付着するコラーゲンのタイプの比率は、線維芽細胞及び適切なコラーゲンのタイプを産生する細胞を選択することにより、操作が可能でありそして改善が可能である。このことは、補体活性化能を有し、それがコラーゲンの特定のタイプを決定する、適切なアイソタイプ又はサブクラスに対するモノクローナル抗体を用いることにより可能である。これらの抗体や補体は望ましいコラーゲンを発現している線維芽細胞を、ネガティブに選択することに用いうる。また別な方法としては、マトリックスに接種する支質細胞を、適当なコラーゲンのタイプを合成する細胞との混合物とすることもできる。５つのタイプのコラーゲンの分布と起源とを表Iに示した。上述のとおり、本発明の心臓弁の調製と増殖には線維芽細胞が好ましい。三次元支質構築物のインキュベーション中は、増殖した細胞が枠組み構造から放出されうる。これらの遊離された細胞は培養用容器の壁に付着し、そこで引き続き増殖し、コンフルエントな単層を形成しうる。このことは、例えば、遊離された細胞を培地補給の際に除去すること、培養容器をシリコンなどの物質で被覆して細胞の付着を減少させること、又は三次元支質枠組み構造を新しい培養容器に移すことなどを行うことにより、防止又は最小限にしうる。容器内にコンフルエントな単層が存在すると、三次元枠組み構造中及び／又は培養液中の細胞の増殖を「停止」させてしまう。コンフルエントな単層の除去又は枠組み構造を新しい培養液の入った容器に移し換えることにより、この三次元培養系の増殖能が回復する。このような除去または移し換えは、いかなる培養容器においても支質細胞の単層が25％のコンフルエンシーを超える場合には行わなければならない。また別の方法としては、放出された細胞が付着するのを防止するために培養系を攪拌することや、定期的に培地補給をする代わりに、連続的に新鮮な培地が系中を流れるように培養系をセットすることもできる。流速は三次元培養中での増殖を最大とし、かつマトリックスから放出される細胞を洗い流し除去することにより遊離された細胞が容器の壁に付着しコンフルエンスまで増殖してしまわないように調節することができるはずである。 5.3 三次元培養系で増殖させた、移植可能な、ヒト細胞を定着させた心臓弁及びシートの使用本発明の三次元培養系は多方面に応用可能である。その応用としては、枠組み構造から得られた培養組織又は培養したマトリックスそれ自体のin vivo での移植又はインプラント、医薬品、血液関連の天然及び改変化合物、成長／調節因子などのin vitroでの有効性と細胞毒性のスクリーニング、疾病メカニズムの解明、どのような医薬品、及び／又は成長因子が作用を及ぼすか調べることによるその疾病メカニズムの研究、遺伝子治療、生物学的活性物質の製造などが挙げられるがそれらに限定されない。 5.3.1. in vivo での移植本発明の三次元培養系で製造した生物学的心臓弁は、大動脈弁狭窄、大動脈弁閉鎖不全、僧帽弁狭窄、僧帽弁閉鎖不全、肺動脈弁疾患、三尖弁疾患、多弁疾患マルファン症候群、及び人工弁疾患の治療に用いうる。大動脈弁狭窄は左心室収縮期拍出時に大動脈弁を通る流れの阻害である。これは先天性の一尖弁または二尖弁、リウマチ熱、又は老人性の弁の石灰化変性によって起こりうる。二尖弁の発生率は1000件の出生に対して４件と見積もられ、男性対女性比は4:1と男性がはるかに高くなっている(Campbell，M．及び Kauntze, R.，1953，Br．Heart J.15:179)。葉状器官は40才までにはしばしば肥厚し、50 才までにはほぼ必ず肥厚しているが、カルシウムの沈着は40才以前ではほとんど認められない。通常は症状は大動脈弁狭窄の病状の進行の後期に現れるが、3〜5 %の患者では無症状の時期に突然死亡する。重篤な大動脈弁狭窄があり、うっ血性心不全、狭心症、労作性失神の徴候を示す患者に対しては大動脈弁の置換を迅速に行うべきである。さらに、重篤な大動脈弁狭窄があるが無症候の患者に対しては弁の置換治療を受けるよう忠告すべきである。大動脈弁閉鎖不全は血液の大動脈から左心室への逆流である。これは弁尖の固有な疾病又は大動脈に影響を及ぼす疾病の結果、大動脈弁の閉鎖能力が失われることによって起こる。後天性の大動脈弁の固有の疾患には、リウマチ又は細菌感染が起因している。マルファン症候群では大動脈弁の不全の基礎となるものは通常は大動脈側にあるが、粘液腫性の変化による大動脈弁尖の脱出が認められることもある。リウマチ性関節炎、全身性紅斑性狼瘡、及び外傷の患者では変化の頻度は低い(Oh，W.M.C.，Taylor，T.R.及びOlsen，E.G.J.，1974，Br．Heart J．3 6:413)。慢性的な大動脈弁閉鎖不全を有し、症状のある患者には手術を受けるよう勧告する。疾患が弁に限局されている患者に対しては、手術は基本的には上記の大動脈弁狭窄と同じである。僧帽弁の狭窄は、左心室が拡張する際の僧帽弁装置を通過する流れの抵抗を示す。拡張期に僧帽弁を通過する流れに対する抵抗は、リウマチ性弁膜症、先天性狭窄、血栓形成、動脈粘液腫、細菌性疣腫、弁及び線維輪における石灰化を生じる。僧帽弁狭窄患者に対して侵襲的な手術を行うか否かの決定は、その患者が今後弁の置換が必要となるか、弁の再構築療法を必要とするようになるかで決められる。僧帽弁閉鎖不全は、僧帽弁装置の異常の結果として左心室の収縮によって血液が左心房に押し出されることによって起こる。急性僧帽弁閉鎖不全は、腱索の機械的な破壊、乳頭筋の断裂、又は葉状器官の穿孔によって起こりうる。リウマチ熱、僧帽弁尖脱出、及び左心室拡張、僧帽弁輪の石灰化、遺伝性の障害（マルファン症候群、エーラー・ダンロス症候群、骨形成不全）、先天性心疾患、全身性紅斑性痕瘡、乳頭筋の断裂及び葉状器官の穿孔が僧帽弁の不全の主要なメカニズムである。リウマチの関与によって重篤な僧帽弁閉鎖不全が起こった場合、弁葉の柔軟性の減少のある僧帽弁狭窄、その他の種々の原因（例えば、感染性心内膜炎による僧帽弁閉鎖不全、及び慢性心疾患症例）の内のいくらかの例では、僧帽弁、弁の構成成分、及び／又はその他の影響を受けた部分、例えば、腱索を置換することが必要となる。弁葉の石灰化と可動性の消失も弁置換術の指標となる。肺動脈弁の狭窄はその弁を通過する収縮期の流れの阻害であり、最も一般的には先天的なものである。それは通常は肺動脈弁閉鎖不全をもたらす。カルチノイド性心疾患や感染性心内膜炎などの後天性のものに対しては、肺動脈弁置換術を行いうる。三尖弁の閉鎖不全は、右心室の収縮時に血液が三尖弁を通過して右心房に入ってしまうことによって起こる。三尖弁の狭窄は、拡張期に右心室に血液が弁を通過して流れ込むことの障害として現される。三尖弁及び僧帽弁の閉鎖不全の主因は、乳頭筋の破壊及び腱索の断裂のある、一つ以上の張筋装置の断裂である。弁葉及び弁の下部機構の変化が進行したり、重篤な閉鎖不全が弁輪の穿孔術でも改善をみないときは弁の置換が必要である。多弁疾患は、大動脈弁、僧帽弁、三尖弁の障害及び／又は無力化を示している。リウマチ熱、結合組織疾患、マルファン症候群、高齢患者における僧帽弁の石灰化及び細菌性心内膜炎は、依然として僧帽弁と大動脈弁との合併症に重要な役割を果たしている。重篤で進行性の症状のある患者で僧帽弁、大動脈弁の双方に病変がある場合は、両方の弁を手術で置き換える。人工弁疾患とは、病変のある心臓弁と置換した、外科的にインプラントした器具の異常である。人工弁疾患は、機能不全、血栓形成、感染、線維化又は石灰化によって起こる(Roberts，W.C.，1973，Prog．Cardiovasc．Dis．15:539)。機械的な弁の機能不全によって起こるうっ血性心不全は人工弁の置換術の主たる適応である。症状が内科的にコントロールできなかったり、進行性の心室機能不全が認められる場合には人工器官の置換が適応となる。成人で第二番目に多いのは大動脈弁あるいは僧帽弁の置換である。本発明の弁は当業者によく知られた外科的技術と全く同一ではないかもしれないが同様な技術で移植しうるものである。大動脈弁の置換術は正中胸骨分離切開によって行われる。心肺バイパスを開始した後、血管のクランプを遠位上行動脈に装着する。排液吸引カニューレを、左心を減圧するために、右上肺静脈の切開部位を通して左心房に取り付ける。近位大動脈を横断切開し、病変のある弁を切除する。水平さし縫い縫合を三交連の箇所に牽引するために行った。単純ラジアル縫合糸を弁輪に沿って牽引縫合糸間に置き、それを挿入する際に弁の縫合リングに次々に通す。全ての縫合糸を縫合リングに通した後、弁を下げて所定の位置に置き、縫合糸を結び切断する。大動脈切除部位は連続縫合糸で閉じる。単一弁の置換術で60分間又はそれ以内で完了する場合には、冠状動脈灌流は通常は必要ない。開心の開始前に全身を30℃の低体温下に置き、上行大動脈に心臓麻痺溶液を注入し、氷冷した等張溶液で心臓を灌注することにより十分な心筋保護が行われる。僧帽弁、三尖弁、肺動脈弁の置換術ではそれらに応じてやり方は変更するが、上記と同様の技術的操作を含む。外科的手術の詳細は、P.F．Nora，ed.，Operat ive Surgery Principles and Techniques，2nd ed.（1980）326-327; J.W．Kirk lin 及びB.G．Barratt-Boyes，eds.，Cardiac Surgery Morphology，Diagnostic Criteria，Natural History，Techniques，Results，and Indications，2nd ed .(1993)498-507; 及びJ.W.Hurst及びR.C．Schlant，eds.，The Heart，Arteries and Veins，7th ed.（1990）795-876 に記載されている。 in vivoで移植又はインプラントを行うときは、そこで用いている組織によって、培養物の一部又は三次元培養の全部をインプラントしうる。例えば、三次元心臓弁培養はin vitroで長期間維持しうる。組織の切片又は三次元組織構造の全体を、新しい心臓弁を必要としている患者にin vivoで移植しうる。本発明により、三次元組織培養インプラントは、現存の組織を増大させたり現存組織と置換するため、新規又は改造した組織を導入するため、人工器官を改変するため、又は生体内の組織や構造をまとめるために用いられる。 5.3.2. in vitro での化合物の有効性及び細胞毒性のスクリーニング三次元培養はin vitroで多様な化合物の、医薬品、成長/調節因子、天然及び改変血液製剤、抗凝固剤、凝固剤(clotting agents)、又は抗石灰化剤などとしての有効性と細胞毒性をスクリーニングするために用いる。このためには、培養物をin vitroで維持し、供試化合物にさらす。細胞毒性化合物の活性はその培養液中の細胞を傷害又は殺滅する能力を測定することによって調べる。これは生体染色技術によって容易に行える。成長/調節因子の効果はマトリックスの細胞性成分の含量を分析すること、例えば総細胞数、及び分化細胞数の分析によって評価しうる。これは標準的な細胞学的、及び/又は組織学的手法（型特異的細胞性抗原に対する抗体を用いる免疫細胞化学的手法を含む）によって分析しうる。三次元系で培養された正常細胞に対する各種薬剤の効果も調べることができる。 5.3.3. 遺伝子治療本発明の三次元培養系はin vivoで遺伝子及び遺伝子産物の導入に助力するヴィヒクルを提供する。そのヴィヒクルは移植結果の向上及び/又は遺伝子治療に用いるものである。例えば、間質細胞を遺伝子的に工作して抗凝固性の遺伝子産物を発現させ、血栓塞栓症の危険性を低減することができ、また抗炎症性の遺伝子産物を発現させて炎症反応による失敗の危険性を低減することができる。この観点から、血塊形成の危険性を低減するために、間質細胞を遺伝子的に工作しTP A、ストレプトキナーゼ又はウロキナーゼを発現させることができる。また別の方法として、間質細胞を抗炎症性の遺伝子産物、例えばTNF，IL-2 又はその他の炎症性サイトカインの中和抗体のイディオタイプに対応するペプチド又はポリペプチドを発現するように工作しうる。細胞は上記のような遺伝子産物を一時的に及び／又は手術後の回復期間中に誘導されるような制御の下で発現するか、あるいは間質細胞に入り込んだキメラ融合タンパク質、例えばレセプター又はレセプター様分子の細胞内及び/又は膜貫通ドメインから成り、遺伝子産物を細胞外ドメインとして融合させたキメラ分子を発現するように工作することが好ましい。別の実施態様においては間質細胞を遺伝子的に工作して患者に欠損している遺伝子かあるいは治療効果を現す遺伝子、例えばHDLやアポリポプロテインE などを発現させるようにしうる。間質細胞に組み込まれる当該遺伝子は心疾患に関連したものである必要がある。例えば、血液によって運搬される遺伝子産物、例えばセレブレダーゼ、アデノシンデアミナーゼ、α-1-アンチトリプシンなどを発現するように間質細胞を工作できる。ある実施態様においては、肺動脈弁の置換のために埋め込まれた遺伝子的に工作された弁培養物は、α-1-アンチトリプシンのような遺伝子産物を肺に供給しうる；このようなアプローチにおいて、その遺伝子産物を構成遺伝子として発現させることが好ましい。間質細胞は宿主細胞をトランスフォーム又はトランスフェクトするために用いた遺伝子を含む組替えＤＮＡ構築物を用いて工作しうる。その宿主細胞はクローン化され、三次元培養系中でクローンを増殖させたものである。活性を有する遺伝子産物を発現している三次元培養物を、その産物が欠如しているヒトに直接インプラントすることができる。例えば、各種の心臓弁疾患の症状を防止するかあるいは改善する遺伝子は疾病条件下では発現が押さえられているか又はダウンレギュレートされている可能性がある。特に、例えば、血栓形成、炎症反応、弁の線維化及びカルシウム沈着のような病理学的状態を防止することに関連する遺伝子はダウンレギュレートされている可能性がある。また、遺伝子産物の活性が減弱され、それによって上記の病理学的状態の全て又はいくらかが現れ、やがて弁疾患の症状の発現となる可能性がある。このように、遺伝子の活性レベルは、存在する遺伝子産物のレベルを増加させるか又は三次元培養系中に存在する活性遺伝子産物のレベルを増加させることにより、増加させうる。そして、活性を有する標的遺伝子産物を発現している三次元培養物を、その産物の欠如している弁疾患の患者にインプラントすることができる。ここで用いている「標的遺伝子」という語は、標的遺伝子の発現レベル又は標的遺伝子産物の活性のモジュレーションが弁疾患の症状を改善するように働くのと同様に弁疾患に関与する遺伝子を指す。さらに、患者は移植後の回復期間中に遺伝子置換療法を受けることができる。心臓弁の構成物やシートは個々の患者の要求にあうように特別に設計しうるもので、例えば、間質細胞は遺伝子的に工作して１種又はそれ以上の遺伝子を調節しうる；又は遺伝子発現調節は一時的でも長期間でもよい；又は遺伝子活性を誘導不可能なものにも誘導可能なものにもできる。例えば、１個又はそれ以上の正常な標的遺伝子のコピー、あるいは正常な標的遺伝子タンパク質産物の産生を指示する遺伝子の部分であって標的遺伝子の機能を有するものを、三次元構成物に付着するヒトの細胞に、他の粒子でＤＮＡを細胞中に導入するもの、例えばリポゾームや直接ＤＮＡ注入や金粒子などに加えて、誘導不能のベクター（アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、及びレトロウイルスベクターが挙げられるがそれらに限定しない）、あるいは誘導可能なプロモーター（メタロチオネイン、又はヒートショックタンパク質）を用いて挿入しうる。例えばヒトの相補体調節タンパク質は移植片の宿主による拒絶を防止するが、そのタンパク質をコードする遺伝子をヒトの繊維芽細胞中に挿入しうる（Nature 375:89(5,1995)）。このような遺伝子的に工作した間質細胞を含有する三次元培養物は、例えばそれぞれ異なる望ましい遺伝子産物を発現している間質細胞の混合物かまたは数種の特異的な遺伝子を発現するように工作された１種の間質細胞が挙げられるが、それを患者にインプラントし、弁疾患の症状を改善させることができる。遺伝子の発現は誘導不能な（すなわち構造的な）又は誘導可能なプロモーターの制御下におくことができる。遺伝子発現レベル及び調節される遺伝子のタイプは個々の患者に対して行われる治療の様相によって調節しうる。遺伝子治療に三次元培養物を用いることには多くの利点がある。第一に、培養物は真核細胞を含むので遺伝子産物は培養中で活性を有する産物となるよう正しく発現されプロセスされる。第二に、遺伝子治療技術はトランスフェクトされた細胞数が十分に増加して臨床的に価値を有し、適切かつ有用になったときのみ有益である；本発明の三次元培養によってトランスフェクトされた細胞数の増加とトランスフェクトされた細胞の増幅（細胞分裂を経て）が可能である。間質細胞に工作を加えて遺伝子産物の構造的あるいは一時的な発現を得るために種々の方法を用いることができる。例えばSeldon，R.F.ら、1987，Science 23 6:714-718に述べられている核移行性(Transkaryotic)のインプラント技術を用いうる。ここで「核移行性(Transkaryotic)」とは、安定又は一時的トランスフェクションでＤＮＡ配列を加えることにより、インプラントされた細胞の核に改変を加えることを意味する。細胞は多様なベクターのうちのいずれか（組み込まれるウイルスベクター若しくは例えばレトロウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、又は組み込まれない複製ベクター、例えば乳頭腫ウイルスベクター、SV40ベクター、アデノウイルスベクター；又は複製能を欠如したウイルスベクターが挙げられるがそれらに限定されない）を用いて工作できる。一時的な発現が望ましい場合には組み込まれないベクター及び複製能欠如ベクターが好ましい。なぜならば、誘導可能な又は構成プロモーターのどちらかがこれらの系で当該遺伝子の発現を制御することに用いうるからである。また別に、組み込まれるベクターも、当該遺伝子が誘導可能なプロモーターで制御されている限りは、一時的発現を得るのに用いることができる。好ましくは、用いられる発現をコントロールするエレメントは、in vivoで必要なときにのみ産物を合成するような遺伝子の調節された発現を可能とすべきである。プロモーターの選択は培養する細胞及び組織のタイプに一部依存する。タンパク質を分泌しうる細胞及び組織（例えば粗面小胞体やゴルジ体が豊富なことを特徴とする）が好ましい。宿主細胞は適当な発現コントロールエレメント（例えばプロモーター、エンハンサー、配列、トランスクリプションターミネーター、ポリアデニル化部位など）及び選択可能なマーカーによってコントロールされているＤＮＡで形質転換することができる。外来のＤＮＡを導入した後、改変された細胞を栄養の豊富な培地中で増殖させ、次いで選択的培地に切り替える。組換えプラスミド中の選択可能なマーカーは、選択に対して抵抗性を与え、細胞が安定的にプラスミドを染色体中に組み込むことができるようにし、増殖してフォーカスを形成し、それがクローン化され細胞系に拡大される。この方法は遺伝子産物タンパク質を発現する細胞系を改変するために有利に用いうる。挿入された遺伝子を発現させるためにいかなるプロモーターも用いうる。例えば、ウイルスプロモーターとしてCMVプロモータ/エンハンサー、SV 40、乳頭腫ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、エラスチン遺伝子プロモーター、及び β-グロビンがあるが、それらに限定されない。一時的な発現が望ましい場合には、組み込まれない及び/又は複製能を欠いたベクター中に構造的なプロモーターを用いることが好ましい。また、必要ならば誘導可能なプロモーターを挿入された遺伝子を発現させるために用いることができるであろう。例えば、誘導可能なプロモーターとしては、メタロチオネイン及びヒートショックタンパク質が挙げられるがこれらに限定されない。結合組織に特異的な組織を呈する転写調節領域でこれまでに記述され、またここで用いうるものの例としては、エラスチン又は膵臓の胞状細胞中で活性を有するエラスターゼI遺伝子調節領域があるがこれらに限定されない(Swit ら，1984 ，Cell 38:639-646; Ornitz ら、1986，Cold Spring Harbor Symp．Quant．Biol ．50:399-409;MacDonald，1987，Heptology 7:425-515)。エラスチンの沈着は、心臓弁を含む種々の組織での特異的な生理学的及び発達上の事象に関連している。例えば房室弁の尖頭は、胚の時は最初は厚く肉に富んでいるが、後の発達過程において、薄く線維素性の尖頭に変わる。発達過程の動脈では、エラスチンの沈着は動脈圧及び動脈の機械的な活動における変化と整合しているようにみえる。弁及び伸縮性のある靭帯構造をもつ動物はエラスチンを含んでいる。機械的活動とエラスチン発現とを結ぶ変換メカニズムは、細胞表面のレセプターが関係する。エラスチン合成細胞が細胞表面のレセプターを介してエラスチンに付着すると、さらなるエラスチン及び他のマトリックスタンパク質の合成が、ストレス又は機械的な力に組織中で曝されることによって（例えばバイオリアクター中での構築物の一定な動き）又は細胞の形態に影響を与える他の因子によって影響を受ける。いったん遺伝子的に改変された細胞が個々の患者に移植されると、TPA,ストレプトキナーゼ，又はウロキナーゼ活性の存在により、血小板凝集、血液凝固又は血栓塞栓症の改善がもたらされる。この活性は限られた時間のみ維持される。例えば弁移植後早期に通常現れる、例えば血小板凝集、血液凝固、凝固又は血栓塞栓症などの起こりうる合併症を防ぐために、この活性は限られた時間のみ維持される。また、いったん遺伝子的に改変した細胞を患者に移植した後、抗炎症性の遺伝子産物、例えばTNF，IL-2 又はその他の炎症性サイトカインに対する中和抗体のイディオタイプに対応するペプチド又はポリペプチドによって、弁疾患に関連する炎症性の反応の改善がもたらされる。本発明の三次元培養システムに用いられる間質細胞は遺伝子的に改変して、血液凝固や移植部位での拒絶反応を促進する因子や表面抗原を「ノックアウト」することができる。標的遺伝子の発現レベルの低減又は標的遺伝子産物の活性レベルを低減させるための負のモジュレーション操作について次に述べる。ここでいう「負のモジュレーション」とは標的遺伝子産物のレベル及び/又は活性が、調節処理を施していない場合のそれと比較して低減していることをいう。間質細胞が本来持っている遺伝子の発現を、数々の手法、例えば相同組換え法を用いてその遺伝子を完全に不活化し（通常これを「ノックアウト」と呼んでいる）発現を阻害する方法により、低減させる又はノックアウトさせることができる。通常、タンパク質の重要な領域をコードするエクソン（又はその領域の5'側のエクソン）は、ポジティブな選択可能なマーカー（例えばneo）によって妨害され、標的遺伝子からの正常なｍＲＮＡの産生を妨げられるとともに、遺伝子の不活化がもたらされる。ある遺伝子はその一部を切除するかあるいはその全体を切除することによっても不活化される。標的遺伝子の２つの領域に相同の構築物（その２つの領域はゲノム中で非常に離れた位置にある）を用いて、その２つの領域に挟まれた配列を切除することができる(Mombaerts，P.ら，1991，Proc．Nat．Acad．Sci．U. S.A．88:3084-3087)。標的遺伝子の発現を阻害するアンチセンス及びリボザイム分子も本発明に従って標的遺伝子活性を低減するために用いうる。例えば、主要組織適合性抗原遺伝子複合体(HLA)の発現を阻害するアンチセンスＲＮＡ分子は、免疫応答に関して最も多目的に用いうることが示されている。さらに、三重らせん分子を標的遺伝子活性レベルの低減に用いうる。これらの技法はL.G.Davisら編，Basic Methods in Molecular Biology，2 版，Appleton & Lange，Norwalk，Conn．1994に詳細に述べられている。前述の手法のいずれかを用いて、フィブリノーゲン、フォン・ウィルブラント因子、V因子又は血小板のα2Bβ-3レセプターに結合するいずれかの細胞表面分子を間質細胞内でノックアウトし、弁での血塊形成の危険性を低減させることができる。同様に、移植片に対する拒絶反応の危険性を低減させるために、MHCクラスII分子の発現をノックアウトすることができる。本発明の他の態様においては、三次元培養システムを、in vitroで生物学的産物を高収率で産生させるために用いることもできる。例えば、特定の生物学的産物（例えば成長因子、調節因子、ペプチドホルモン、抗体など）を天然に大量に産生する細胞、又は外来遺伝子産物を産生するように遺伝子的に改変させた宿主細胞を、三次元培養システムを用いてin vitroでクローン化して拡大させることができる。形質転換された細胞がその遺伝子産物を栄養培地中に分泌するならば、消費した、又は調節された培地から標準的な分離手法（例えばＨＰＬＣ，カラムクロマトグラフィー、電気泳動法など）を用いて容易に単離することができる。「バイオリアクター」はin vitroでの三次元培養物を供給するための流動法の利点を取り入れて案出された。新鮮な培地が三次元培養を通過する際、遺伝子産物が培養液から放出された細胞と共に洗い出される。遺伝子産物は消費された、又は調節された培地の流出液から単離される（例えばHPLCカラムクロマトグラフィー、電気泳動などを用いる）。６．実施例：三次元心臓弁培養系本発明の三次元培養によって、模擬的なin vivo 生理学的条件に設計された系において、繊維芽細胞のような間質細胞(stromal cell)のin vitroにおける細胞除去心臓弁上での成長が可能となる。重要なことに、この系で繰り返し培養された細胞は、正常な大動脈壁及び葉状器官の細胞によって産生されるタンパク質に類似したタンパク質を合成する。心臓弁細胞外マトリックスは、主にエラスチン並びにコラーゲンＩ型及びII型から構成される。以下の実施例では、大動脈壁及び葉状器官に基づく外因性源由来の間質細胞を植え付けた培養物中で、移植可能又は生体人工的である心臓弁組織を成長させるための方法、並びに三次元構造上で増殖した形態学的及び機能的に正常なヒト細胞を得るための方法について説明する。 6.1. 材料と方法 6.1.1. 細胞及びブタ組織ブタ大動脈壁及び葉状器官を、リン酸塩で緩衝液化した生理的食塩水を用いて洗浄して新鮮なうちに用いるか、滅菌水中に -20℃から -70℃の温度で冷凍した後に用いるか、洗剤及び／又は酵素抽出後に用いるか、あるいは上述の組織のいずれかを米国特許第4,776,85に記載されているような滅菌操作と組み合わせて用いる。第5.1 節参照。皮膚包皮繊維芽細胞をin vitroで常法によって培養した。この実験で用いた繊維芽細胞は、8回継代させてからブタ組織に植え付けた。 6.1.2. ブタ大動脈壁及び葉状器官のin vitroでの 4週間の培養ブタ大動脈壁及び葉状器官を 1×10⁵ヒト皮膚繊維芽細胞とともに 8個のウェルディッシュに植え付けて、1日間培養した。大動脈壁及び葉状器官を新しいウェルディッシュに移植して、さらに 4週間成長させた。その 8個の培養物は、(1 )ヒト繊維芽細胞とともに植え付けた、予め冷凍させた葉状器官；(2)ヒト繊維芽細胞とともに植え付けた、予め冷凍させた壁；(3)植え付けずに予め冷凍させた葉状器官；(4)植え付けずに予め冷凍させた壁；(5)ヒト繊維芽細胞とともに植え付けた新鮮な葉状器官；(6)ヒト繊維芽細胞とともに植え付けた新鮮な壁；( 7)植え付けない新鮮な葉状器官；及び(8)植え付けない新鮮な壁、からなる。その培養物を、[³⁵Ｓ]-メチオニン及び[³⁵Ｓ]-システイン(Tran ³⁵Ｓ-Label,ICN) を用いて 4時間ラベルした。そのサンプルをβ- メルカプトエタノールを含有するLaemmli サンプル緩衝液中で煮沸し、SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動(S DS・PAGE)によって細分し、オートラジオグラフィーによって分析した。 6.1.3. ブタ大動脈壁及び葉状器官の1 週間未満から18週間のin vitro培養上述の第6.1.2.節のように、細胞除去ブタ葉状器官又は壁組織を多ウェルディッシュに入れた(1ウェル当たり組織 1片)。ヒト皮膚繊維芽細胞を栄養分の豊富な成長培地中に懸濁させ、特定の種類のブタ葉状器官又は壁組織、例えば、1)冷凍させた葉状器官及び壁; 2)電子ビーム処理した葉状器官; 3)洗剤及び/ 又は酵素抽出した葉状器官及び壁; 並びに4)洗剤及び/ 又は酵素抽出＋電子ビーム処理した葉状器官、に植え付ける。それぞれの培養ディッシュを無菌、静止培養条件下（培地は流さない）で37℃ に保った。これらのヒト繊維芽細胞−ブタ組織組成物は組織培養ディッシュ中で成長し、心臓弁構成物となる。この構成物を以下の事項に関して分析した。ａ）細胞分布ヒト皮膚繊維芽細胞のブタ組織マトリックス中への分布及び移動を追跡するために、抗体(ヒト抗プロリル-4- ヒドロキシラーゼ)(DAKO-O-繊維芽細胞,5B5,コード番号 M877)を用いて、コロニー化後の細胞を同定する。抗体は、ブタ組織と交差反応しない。図５参照。ｂ）細胞生存力ｉ）MTT アッセイ：このアッセイを用いて、ブタマトリックス上で成長した後の細胞の生存力を評価することができる。代謝的に活性な(生きている)繊維芽細胞は、細胞内でMTT 基質(0.5mg/ml)を紫色の不可溶性沈殿物に転換する。この紫色の沈殿物は裸眼で見ることでき、このことは、生存している繊維芽細胞がブタマトリックス上に分布していることを反映している。MTT 反応は、Triglia,D. ら.,1991,Toxic.in Vitro 5:573-578 に記載れているように、イソプロパノールでの抽出後に分光光度計(540nm)を用いて光学密度を測定することによって定量することができる。 ii）グルコース消費：繊維芽細胞生存力の指標として、組織構成物中に含有される栄養分消費（グルコース）及び代謝排泄物（乳酸エステル）を、Halberstad t,C.R.ら.,1994,Biotechnology及びBioengineering 43:740-746 に記載されているように測定する。生存する繊維芽細胞は時間とともにグルコース濃度を減少させ、乳酸エステルの濃度を増加させる。ｃ）細胞増殖ｉ）チミジン[³Ｈ-thy]の取り込み：放射性チミジン（10μCi）を栄養分の豊富な培地に添加し、組織構成物を24-72 時間培養する。構成物中の繊維芽細胞は分裂して、さらなる細胞を産生すると、その細胞のＤＮＡ中にはある程度の³Ｈ- thyが取り込まれる。過剰の、取り込まれない³Ｈ-thyを、ラベル化した構成物を 1%トリトン-X-100で 2時間洗浄しPBS ですすいだ後に除去する。取り込まれた³ Ｈ-thyをシンチレーションカウンターを用いて測定することができる。 ii）BrdU の取り込み：組織構成物中の繊維芽細胞の増殖を測定するための別の方法としては、5-ブロモデオキシウリジン(BrdU)を培養培地に添加する方法がある。BrdUは非放射性チミジン類似体であり、分裂する繊維芽細胞の新しく合成されたＤＮＡ中に取り込まれる。組織をBrdU含有培地中で24-48 時間インキュベートする。BrdUを含有する繊維芽細胞は、BrdUに対するモノクローナル抗体を用いた後、Zymed Kit(ZYMED Laboratories,Inc.San Francisco,Ca)を用いた酵素−色原体検出系を用いることによって、組織構成物の組織構造断片中に肉眼で見ることができる。ｄ）タンパク質アッセイこれらの方法は、組織培養工程で栄養分の豊富な培地に添加される放射性標識アミノ酸を用いる。放射性標識アミノ酸は、組織構成物中の新しく合成されたタンパク質中へ取り込まれ、シンチレーションカウンターを用いて測定することができ、及び／又は分子量に従ってポリアクリルアミド(10%)ゲルで抽出及び分離することができる。ゲルはサリチル酸(1M)で洗浄した後、Ｘ線フィルム(4-25 ℃ で4-16時間)に暴露し、現像して放射性標識タンパク質の像を検出する。ｉ） ³ Ｈ- プロリンラベル化：プロリンは組織構成物中のコラーゲンタンパク質の主要アミノ酸構成要素である。放射性プロリンの取り込み量（10μCi/ml 中で24-72 時間インキュベーション）は、シンチレーションカウンターによって定量すると、新しく合成されたコラーゲンの量を反映している。過剰の、取り込まれないラベルを、1%トリトンX-100 でラベル化構成物を洗浄した後、除去する。プロピル14- ヒドロキシラーゼ酵素の活性化によるコラーゲン合成の正の誘導物質として、アスコルビン酸(25-50μg/ml)を用いることができる。 ii） ³⁵ Ｓ−システイン／メチオニン標識化：構成物をシステインとメチオニンを含まない培地中で0.5 時間インキュベートし、続いて標識化システインと標識化メチオニン(0.2mCi/ml)とを含む培地中で４時間インキュベートする。放射性同位体が新たに合成されたタンパク質中に取り込まれる。そして、その標識化組織は（β- メルカプトエタノールによる）還元的条件下、ラエメリサンプル緩衝液中で消化され、SDS-PAGEによって分離することができる。特異的タンパク質はウェスタンブロッティングによる定量が可能である。ｅ）タンパク質免疫組織化学この手法によると、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を使用して、組織の組織学的区分中の特異的タンパク質が検出される。これらの抗体を特異的に使用すると、ヒトのタンパク質が検出され、1)ヒト繊維芽細胞（プロリル−４ −ヒドロキシラーゼ）；2)（弁壁及び葉状組織中の）ヒト弾性繊維の少量成分；及び3)ヒトのテナシン（細胞間質糖タンパク質）；と反応する。その標的タンパク質に対する抗体を、脱パラフィン化した区分又は凍結した区分に加える。第１の抗体を認識する第２の抗体を、酵素−クロモゲン可視化系に共役させる。 6.1.4. in vitro における動的条件下での大動脈性壁及び葉状器官のコロニー化ブタの葉状器官を（組織を固定化する）表面に沿って、又は端において（幾らか動かしてもよい）、電子ビーム放射（Ｅ−ビーム）によって滅菌したポリカーボネートカセットに接着した。ヒト繊維芽細胞をこれらの組織上に動的に（流速 5 ml/min）接種し、３日間培養した。その組織をカセットから摘出し、４時間かけて［³⁵Ｓ］−メチオニン及び［³⁵Ｓ］−システインで標識化した。組織をラエメリサンプル緩衝液中で煮沸し、不溶物をペレット化し、上澄み液をSDS-PAGEによって分画して、オートラジオグラフィーにより可視化した。 6.1.5. in vitro における動的条件下での全大動脈性弁のコロニー化全ブタ弁をＥ−ビーム放射によって滅菌するか、又は抗生物質／抗菌物質の溶液によって殺菌した。弁はＥ−ビーム滅菌した「バイオリアクター」中に入れ、再循環富栄養培地中、流速15〜50ml/minで40〜50×10⁶の細胞を接種した。毎週栄養交換しながら、４週間（又は８週間）にまで培養した後、その構成物の組織学的染色及び免疫組織化学的性質をＭＴＴアッセイにより評価した。 6.2. 結果 6.2.1. ブタ大動脈性葉状器官及び壁凍結、解凍、無接種大動脈性葉状器官及び壁が適量の標識を取り込まないのに対し（それぞれ図１、レーン３と４）、ヒト繊維芽細胞を接種した葉状器官及び壁は放射性アミノ酸前駆体（³⁵Ｓ−cys/met）を取り込んで、約29,000から200,0 00 ダルトンの範囲の分子量を持つタンパク質を合成する（それぞれ図１、レーン１と２）。レーン５〜８は、新鮮無凍結葉状器官及び壁について得られた対応する結果を示す。レーン５及び６から分かるように、新鮮無凍結大動脈性葉状器官及び壁にヒト繊維芽細胞を接種すると、取り込まれる放射能量が増加した。この増加はそれぞれレーン１及び２における増加に似ている。レーン７及び８は、それぞれ無接種の新鮮無凍結大動脈性葉状器官及び壁に関する結果を示しており、内在性存在可能細胞によるタンパク質合成を実証した。大動脈性壁は葉状器官よりも代謝的活性が少なかった。特に興味深いのは、レーン７に示されたタンパク質プロフィールがレーン１のタンパク質プロフィールに似ているという事実であり、これは、凍結ブタ葉状器官に接種された繊維芽細胞によって合成されるタンパク質が、通常の内在的細胞、即ち新鮮ブタ葉状器官によって合成されるタンパク質と似ていることを示す。 6.2.2. ８〜１８週間における大動脈性壁及び葉状器官のコロニー化ヒト皮膚繊維芽細胞は表IIに示される全ての時間区間に渡って、大動脈性葉状器官及び壁の生体組織検査でみられる全ての組織型をコロニー化することができた。ブタ細胞間質の最も顕著な繊維芽細胞浸透は、葉状器官、特に界面活性剤及び／又は酵素で抽出した葉状器官中で起こった（図２）。全てにおいて、８〜１８週間培養した界面活性剤及び／又は酵素抽出葉状器官中の細胞分布は、新鮮ブタ葉状器官に典型的な細胞密度に近づくようであった。図３は４週間培養した界面活性剤及び／又は酵素抽出葉状器官中の細胞分布を表す。細胞生存評価（MTT アッセイ）は、ヒト繊維芽細胞が１８週間たっても代謝的に生きたままであることを実証した。その繊維芽細胞は培養プロセス中に増殖している（³H-thy導入アッセイ）ことも示された（図４）。コラーゲン合成として測定された（³Ｈ−プロリン標識化）タンパク質生産は、ヒト皮膚繊維芽細胞がブタ葉状器官中に存在するコラーゲン及び幾つかのタンパク質を生産していることを示した（³⁵Ｓ−システイン／メチオニン標識化）（図５）。心臓弁組織に典型的なタンパク質は、特異的抗体を用いる免疫組織化学により特定された。繊維芽細胞は存在するブタのスカフォールディングを補うためにヒトのテナシンを生産した（図６）。 6.2.3. 動的条件下における大動脈性壁及び葉状器官のコロニー化表面全体に沿って接着され、流動的に培養されたブタ葉状器官のサンプルを含むレーン１及び２（図７）には、はっきりとした着色は見られなかった。レーン３及び４は、端に接着され、はっきりとした量の放射能を持つブタ葉状器官が、接種後３日間の成長の後に取り込まれたことを示す；ブタ葉状器官が表面全体に沿って接着されると、最小量の［³⁵Ｓ］がタンパク質に取り込まれた。対照として使用された無接種のＥ−ビーム滅菌葉状器官（レーン５）は、放射能を取り込まなかった。従って、ブタ大動脈性葉状器官及び壁には、静的又は動的にヒト繊維芽細胞を接種することができる。これらのヒト繊維芽細胞は大動脈性葉状器官及び壁スカフォールドを接合してコロニー化し、細胞外細胞間質分子を分泌することによって代謝的活性を維持する。 6.2.4. in vitro における動的条件下での全大動脈性弁のコロニー化ヒト繊維芽細胞は動的条件下で、界面活性剤及び／又は酵素処理により予め細胞除去されたブタ細胞間質上で成長する。増殖細胞はブロモデオキシウリジンで標識化されブロモデオキシウリジン抗体を用いて検出される。図８参照。ヒト繊維芽細胞が、界面活性剤及び／又は酵素処理＋電子ビーム放射により予め細胞除去されたブタ細胞間質上で成長すると、動的、脈動的流動条件下で接種された前記細胞間質は、MTT アッセイ（上記第6.1.3 節(b)で述べた細胞生存の指標）によって示されるように、静的条件下で成長した細胞間質よりも、より顕著で均一な繊維芽細胞接合を起こす。図９参照。本発明は特異的な態様の表示によりその範囲を限定されるものではなく、特異的態様は単に本発明のそれぞれの見地を説明するためのものであり、機能的に等価な手法及び構成物は本発明の範囲内にあり、本明細書中に示され記載されたものへの追加は、先の記述及び添付した図面により当業者にとって明らかであろう。このような改良は、添付した請求の範囲の範囲内となるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ノートン，ブライアンエー. アメリカ合衆国 92021 カリフォルニア州エルカジョン，クウェイルキャニオンロード 10461番地 (72)発明者パーチオ，アンソニーエフ. アメリカ合衆国 92077 カリフォルニア州カーディフ，オックスフォードアベニュー 2202番地 (72)発明者ランディーン，リーケー. アメリカ合衆国 92103 カリフォルニア州サンディエゴ，ファーストアベニュー＃406 3677番地 (72)発明者ゼルティンガー，ジョーンアメリカ合衆国 92122 カリフォルニア州サンディエゴ，カミノティチノ 4136番地 (72)発明者キャンベル，トッドディー. アメリカ合衆国 55110 ミネソタ州ホワイトベアーレーク，バーチレークサークル 4951番地

Claims

【特許請求の範囲】１．in vitroで調製され、間質細胞及び間質細胞から自然に分泌される結合組織タンパク質からなり、その間質細胞は、心臓弁に生細胞が再び生着し支質細胞で架橋された間隙空間を有する三次元構造を形成するために心臓弁上に接種されたものである、生間質細胞を定着させた心臓弁。２．間質細胞が線維芽細胞である請求項１に記載の生きた間質細胞を定着させた心臓弁。３．間質細胞が人の皮膚の線維芽細胞である請求項１に記載の生間質細胞を定着させた心臓弁。４．間質細胞がヒトの心性線維芽細胞である請求項１に記載の生間質細胞を定着させた心臓弁。５．心臓弁がブタ由来である請求項１に記載の生間質細胞を定着させた心臓弁。６．心臓弁は、間質細胞接種前には細胞からなるものではない請求項５に記載の生きた間質細胞を定着させた心臓弁。７．心臓弁が、酵素処理的及び界面活性剤処理によって細胞からなるものではないか、又は凍結／融解によって生細胞ではないものとされたものである請求項６に記載の生間質細胞を定着させた心臓弁。８．心臓弁が生分解性材料から構成される請求項１に記載の生間質細胞を定着させた心臓弁。９．生分解性材料が、ポリグリコール酸、腸線縫合糸、コラーゲン、セルロース、ゲラチン、ヒアルロン酸、またはポリヒドロキシアルカノエートからなる請求項８に記載の生間質細胞を定着させた心臓弁。１０．培地中で心臓弁上に接種した間質細胞を培養することによって間質細胞及び間質細胞から自然に分泌される結合組織のヒトマトリックスタンパク質が心臓弁に付着して三次元構築物を形成する、生間質細胞被覆心臓弁のin vitro製造方法。１１．間質細胞が線維芽細胞である請求項１０に記載の方法。１２．間質細胞がヒトの皮膚線維芽細胞である請求項１０に記載の方法。１３．間質細胞がヒトの心性線維芽細胞である請求項１０に記載の方法。１４．心臓弁がブタ由来である請求項１０に記載の方法。１５．心臓弁は、間質細胞接種前には細胞からなるものではない請求項１４に記載の方法。１６．心臓弁が酵素処理及び界面活性剤処理によって細胞からなるものでないか、又は凍結／融解によって生細胞でないものとされている請求項１５に記載の方法。１７．心臓弁が生分解性材料から構成される請求項１０に記載の方法。１８．生分解性材料が、ポリグリコール酸、腸線縫合糸、コラーゲン、セルロース、ゲラチン、ヒアルロン酸、またはポリヒドロキシアルカノエートからなる請求項１７に記載の方法。１９．培地を静止状態で維持される請求項１０に記載の方法。２０．培地を再循環させることによって培地を動的状態で維持する請求項１０に記載の方法。２１．培地中で、成長因子、天然の又は改変された血液製造物又は生物活性を有する分子をさらに用いる請求項１０に記載の方法。２２．生間質細胞を定着させた心臓弁の移植又はインプラントの方法であって、 (a)細胞からなるものではない心臓弁上に間質細胞を接種する工程； (b)間質細胞を培養してin vitroで増殖させる工程；及び (c)間質細胞被覆ヒト化心臓弁構築物をin vivoでのインプラントする工程からなる移植またはインプラント方法。