CN102448476A - 器官和组织的脱细胞化和再细胞化 - Google Patents

器官和组织的脱细胞化和再细胞化 Download PDF

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Abstract

本发明提供了对器官或其部分脱细胞化和使这种脱细胞化的器官或其部分再细胞化，从而产生器官或其部分的方法。

Description

器官和组织的脱细胞化和再细胞化
技术领域
本发明涉及器官和组织，更具体地涉及器官和组织脱细胞化和再细胞化的方法和材料。
背景技术
对于组织工程和再生开发了生物衍生的基质。然而，迄今开发的基质通常具有受损的基质结构和/或不显示能有效重建器官或组织的血管床。本文描述了器官和组织脱细胞化和再细胞化的方法。
发明概述
本文提供了器官或组织脱细胞化的方法和材料，以及使脱细胞组织或器官再细胞化的方法和材料。
在一个方面，提供了脱细胞的哺乳动物心脏。脱细胞的哺乳动物心脏包括具有外表面的心脏脱细胞胞外基质。脱细胞心脏的胞外基质基本保持脱细胞前胞外基质的形状，胞外基质的外表面基本完整。
具有代表性的心脏包括但不限于：啮齿类的心脏、猪的心脏、家兔的心脏、牛的心脏、绵羊的心脏或狗的心脏。另一种具代表性的心脏是人的心脏。所述脱细胞心脏可以是尸体的心脏。一些实施方式中，所述脱细胞心脏是完整心脏的一部分。例如，完整心脏的一部分包括而不限于：心肌片层、主动脉瓣、左房室瓣、肺动脉瓣、右房室瓣、右心房、左心房、右心室、左心室、隔膜、冠状动脉、肺动脉或肺静脉。
在另一方面，本发明提供了一种实体器官。本文所述的实体器官包括上述脱细胞心脏和附于其上的再生细胞群。在一些实施方式中，所述再生细胞是多能细胞。一些实施方式中，所述再生细胞是胚胎干细胞、脐带细胞、成体干细胞或祖细胞、骨髓衍生的细胞、血衍生细胞、间质干细胞(MSC)、骨骼肌衍生的细胞、多能成体祖细胞(MAPC)、心脏干细胞(CSC)或多能成体心脏干细胞。一些实施方式中，所述再生细胞是心脏成纤维细胞、心脏微血管细胞或主动脉内皮细胞。在一些实施方式中，细胞是组织衍生的或皮肤衍生的细胞。
一般来讲，附于脱细胞心脏上的再生细胞的数量至少有约1,000。在一些实施方式中，附于脱细胞心脏上的再生细胞的数量约为1,000-10,000,000个细胞/毫克组织(湿重；即，脱细胞前的重量)。在一些实施方式中，所述再生细胞与所述脱细胞心脏是异源的。在另一些实施方式中，也将所述实体器官移植入患者体内，所述再生细胞与该患者自体同源。
还有另一个方面，本发明提供了制备实体器官的方法。这种方法通常包括提供本文所述的脱细胞心脏，使所述脱细胞心脏在一定条件下接触再生细胞群，该条件下，所述再生细胞能植入所述脱细胞心脏，并在其内和上增殖和/或分化。在一个实施方式中，将所述再生细胞注射或灌注进所述脱细胞心脏中。
还有另一个方面，本发明提供了使心脏脱细胞的方法。这种方法包括提供心脏，在一个或多个空腔、血管和/或管道处插管得到插管心脏，用第一细胞破裂介质通过一个或多个套管对所述插管心脏进行灌注。例如，所述灌注可以从每个插管的空腔、血管和/或导管处多方向进行。一般来讲，所述细胞破裂介质含有至少一种去污剂，如SDS、PEG或Triton X。
这种方法还可以包括用第二细胞破裂介质通过多个套管对插管心脏进行灌注。
一般来讲，所述第一细胞破裂介质可以是阴离子去污剂，如SDS，所述第二细胞破裂介质可以是离子去污剂，如Triton X-100。这种方法中，所述灌注可以持续约2-12小时/克(湿重)心脏组织。
在一个方面，提供了一种实体器官。这种实体器官包括脱细胞器官和附于其上的再生细胞群。这类脱细胞器官包含所述器官的脱细胞胞外基质，其中胞外基质含有外表面，其中包括血管树的外表面基本保留脱细胞前胞外基质的形态，且其中外表面基本完整。
代表性的实体器官包括心脏、肾脏、肝脏或肺。在一个实施方式中，实体器官是肝脏或肝的一部分。在另一个实施方式中，实体器官是心脏(例如啮齿类的心脏、猪心、家兔心脏、牛心、绵羊心脏或狗的心脏；例如显示收缩活性的心脏)。代表性的心脏是人的心脏。心脏可以是完整心脏的一部分(例如主动脉瓣、左房室瓣、肺动脉瓣、右房室瓣、右心房、左心房、右心室、左心室、心肌片层、隔膜、冠状动脉、肺动脉和肺静脉)。在另一个实施方式中，实体器官是肾脏。本文所述的实体器官通常包括多种组织学构造，包括血管。
在一些实施方式中，附于脱细胞心脏上的再生细胞的数量至少有约1,000。在一些实施方式中，附于脱细胞心脏上的再生细胞的数量约为1,000-10,000,000个细胞/毫克组织。再生细胞可以是多能细胞。另外，再生细胞可以是胚胎干细胞或其亚组，脐带细胞或其亚组，骨髓细胞或其亚组，外周血细胞或其亚组，成体衍生的干或祖细胞或其亚组，组织衍生的干细胞或祖细胞或其亚组，间质干细胞(MSC)或其亚组，骨骼肌衍生的干细胞或祖细胞或其亚组，多能成体祖细胞(MAPC)或其亚组，心脏干细胞(CSC)或其亚组，或多能成体心脏衍生的干细胞或其亚组。再生细胞的例子包括心脏成纤维细胞，心脏微管内皮细胞，主动脉内皮细胞或肝细胞。在一些实施方式中，再生细胞与脱细胞器官是异源或异种的。
在一些实施方式中，将所述实体器官移植入患者体内，所述再生细胞与该患者自体同源。在其它实施方式中，将所述实体器官移植入患者体内，所述脱细胞器官与该患者是异源或异种的。
在另一个方面，提供了制备器官的方法。这类方法通常包括提供脱细胞器官，其中所述脱细胞器官包含器官的脱细胞胞外基质，其中所述胞外基质包含外表面，其中所述包括血管树的胞外基质基本维持脱细胞前的所述胞外基质的形态，其中所述外表面基本完整；使所述脱细胞器官在一定条件下接触再生细胞群，该条件下，所述再生细胞能植入所述脱细胞器官，并在其内和上增殖和/或分化。在一个实施方式中，将所述再生细胞注射入所述脱细胞器官中。代表性的脱细胞器官包括心脏、肾脏、肝脏、脾脏、胰脏或肺。
除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解同样的含义。虽然在本发明的实施或测试中可以采用类似于或等同于本文所述的那些方法和材料，但是下面描述了合适的方法和材料。此外，材料、方法和实施例都仅是说明性，并不构成限制。本文中述及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都通过引用全文纳入本文。在抵触的情况下，以本说明书(包括定义在内)为准。
在附图和以下描述中详细说明了本发明的一种或多种实施方式。本发明的其它特征、目的和优点通过附图、详述部分以及权利要求书可显而易见。
附图简要说明
图1图示了心脏脱细胞化的初步准备。对主动脉、肺动脉和上腔静脉进行插管(分别为A、B和C)，结扎下腔静脉、头肱动脉、左颈总动脉和左锁骨下动脉。箭头表示顺行和逆行的灌注方向。
图2图示了脱细胞化/再细胞化设备的一个实施方式。
图3A是脱细胞肝脏和肾脏的照片，图3B是脱细胞心脏和肺的照片。左侧的照片显示组织的组织学染色，描述了尸体器官中剩余核酸的定量，而右侧的照片显示脱细胞基质的组织学染色以及灌注脱细胞的器官中剩余的核酸定量。
图4显示了灌注脱细胞的猪肾(左侧)和大鼠肾(中央；小图显示用伊文思蓝染料的灌注)的照片以及肾小管包围的肾小球和灌注脱细胞化后的收集管的EM照片。
图5是整只从下腹至头脱细胞的大鼠照片。
图6是显示肝脏再细胞化的照片。图6A显示了灌注脱细胞的大鼠肝脏；图6B显示了通过门静脉导管将原代肝细胞注入单个脱细胞大鼠肝叶。
图7显示了再细胞化可以定向。图7A显示了原代大鼠肝细胞被递送入脱细胞肝尾叶；图7B显示了原代大鼠肝细胞被递送入脱细胞大鼠肝右外侧下/上叶。
图8是显示脱细胞大鼠肝脏的再细胞化的SEM照片。通过门静脉递送了40x106个原代大鼠肝细胞，培养1周(A-D)。
图9显示了在尾状突中注入原代大鼠肝细胞后1周的再细胞化大鼠肝脏染色。图9A是马氏三色染色(10X)，图9B是H&E染色(10X)。
图10显示了在尾状突中用原代大鼠肝细胞再细胞化后1周的肝脏TUNEL分析。图10A是TUNEL染色，显示活细胞和凋亡细胞混合物(10X)，图10B显示了马氏三色染色(10X)。
图11显示了体外灌注脱细胞化大鼠肝脏1周后人HepG2细胞的马氏三色染色。图11A显示了尾状突，图11B显示了上/下右外侧叶。两者都是10倍放大；V＝基质中的容器。
图12是细胞保留效率。该图显示了注射后保留的原代大鼠肝细胞(1-6)或HepG2(7和8)细胞。在注射前后对细胞进行计数。基于原初数量减去保留细胞计算保留百分数。
图13显示了HepG2细胞在脱细胞器官中保持存活。阿拉马蓝代谢显示HepG2细胞(注射日约30x106)在注入尾状突(菱形)和肝右外侧上/下叶(方块)后仍然存活并增殖到一定限度。
图14显示再细胞化后原代大鼠肝细胞产尿素的时间过程(约35x106个细胞，7日)。
图15显示再细胞化后原代大鼠肝细胞每日产白蛋白的时间过程(约35x106个细胞，7日)。
图16显示了注入肝尾叶的原代大鼠肝细胞的乙氧基异吩唑酮-O-脱乙基酶(EROD)活性的时间过程(23x106个细胞，8日)。
图17显示了在脱细胞化心脏、肺、肝脏和肾脏上增殖至少3周的胚胎和成体衍生的干/祖细胞。
图18显示了小鼠胚胎干细胞(mESC)和增殖性成体干细胞(骨骼肌成肌细胞；SKMB)在脱细胞的心脏、肺、肝脏和肾脏上存活。
图19是尸体(左侧)和脱细胞化(右侧)心脏的SEM照片。LV，左心室；RV，右心室。
图20是尸体(左侧)和再细胞化大鼠肝脏(右侧)的组织学(顶部)和SEM(底部)比较。
图21是显示(A)完全脱细胞的猪肝脏基质的照片，以及显示(B)血管和(C)间充质基质完整性的灌注脱细胞化猪肝脏的SEM。
图22的照片显示了浸润脱细胞肝脏全视图。尽管有完整肝脏的外观，在下面(A)和上面(B)的放大图中可见基质剥落和囊的缺失。
图23的SEM照片显示浸润脱细胞化后(A和B)，器官缺乏格利森氏囊，而1％SDS灌注脱细胞后(C和D)，器官保留囊。
图24的照片显示浸润脱细胞的大鼠肝脏的组织学(A，H&E；B，马氏三色)和1％SDS灌注脱细胞后的组织学(C，H&E；D，马氏三色)。
图25的照片显示大鼠心脏浸润脱细胞化(顶栏)和灌注脱细胞化(底栏)之间的比较。左栏，完整器官；中间栏，H&E组织染色；右栏，SEM。
图26的照片显示大鼠肾脏浸润脱细胞化(顶栏)和灌注脱细胞化(底栏)之间的比较。左栏，完整器官；中间栏，H&E组织染色；右栏，SEM。
图27是灌注脱细胞的肾脏(图27A)和浸润脱细胞的肾脏(图27B)的SEM照片。
图28是灌注脱细胞的心脏(图28A)和浸润脱细胞的心脏(图28B)的SEM照片。
图29是浸润脱细胞肝脏的SEM照片。
各图中的相同标记符号表示相同的元件。
发明详述
实体器官通常由3种主要组分组成，即胞外基质(ECM)、包埋进所述胞外基质的细胞、和血管床。如本文所述使实体器官脱细胞化可除去大部分或全部细胞组分而基本上保留胞外基质(ECM)和血管床。然后可以将脱细胞实体器官用作再细胞化的支架。可以从中获得实体器官的哺乳动物包括但不限于：啮齿动物、猪、家兔、牛、绵羊、犬和人。用于本文所述方法中的器官和组织可以来自尸体，或可以是胎儿，新生儿或成人。
本文所指的实体器官包括但不限于：心、肝、肺、骨骼肌、脑、胰、脾、肾、胃、子宫和膀胱。本文所用的实体器官指具有“基本上封闭”的血管系统的器官。涉及器官的“基本上封闭”的血管系统是指，假设对主血管插管、结扎或用其它方式进行限制，用液体灌注时，所述实体器官能够容纳大部分液体，所述液体不会漏到实体器官以外。尽管具有“基本上封闭”的血管系统，上面列出的许多实体器官仍然确定了“入口”和“出口”脉管，其可以用来引入和除去在灌注期间通过器官的液体。
除了上述实体器官外，其它类型的有血管的器官或组织，例如所有或部分关节(如，膝、肩、髋或脊髓)、气管、皮肤、肠系膜或肠道、小和大肠、食道、卵巢、阴茎、睾丸、脊索、或单一或分枝脉管也可以用本文所公开的方法进行脱细胞。而且，本文公开的方法还可用来使无血管(或相对无血管)组织脱细胞化，例如，软骨或角膜。
可以用本文所述的有或没有再细胞化的脱细胞器官或组织(如，心或肝)或其任何部分(如，主动脉瓣、左房室瓣、肺动脉瓣、右房室瓣、肺静脉、肺动脉、冠状动脉、隔膜、右心房、左心房、右心室、左心室或肝叶)移植进患者体内。或者，可以用本文所述的再细胞化器官或组织来检测，例如，经历分化的细胞和/或器官或组织的细胞组成。
器官或组织的脱细胞化
本发明提供了使哺乳动物器官或组织脱细胞化的方法和材料。如有可能，对器官或组织脱细胞的第一步是对器官或组织插管。可以采用本领域已知的方法和材料对器官或组织的血管、导管和/或空腔进行插管。对器官或组织脱细胞的下一步是用细胞破裂介质对插管器官或组织进行灌注。器官灌注可以是多方向的(如，顺行和逆行)。
本领域对心脏常规采用兰道夫(Langendorff)灌注，即生理学灌注(也称为四腔工作模式灌注)。参见例如，Methods in Experimental Physiology andPharmacology：Biological Measurement Techniques V(《实验生理学和药理学方法：生物检测技术第V版》)中的Dehnert，The Isolated Perfused Warm-BloodedHeart According to Langendorff(依据兰道夫的分离灌注温血动物心脏)，Biomesstechnik-Verlag March GmbH，西德，1988。简单来讲，兰道夫灌注就是对主动脉插管并与含有细胞破裂介质的贮液器相连。可例如通过输注或滚子泵或通过恒定的流体静压以恒定流速将细胞破裂介质沿主动脉逆行向下进行递送。在两种方式下，主动脉瓣都被硬性关闭，灌注液直接进入冠状动脉口(从而灌满心脏的整个心室)，然后通过冠状窦排入右心房。为了进行工作模式灌注，第二套管与左心房相连，可以将灌注从逆行变为顺行。
灌注其它器官或组织的方法在本领域已知。例如，以下参考文献描述了对肺、肝、肾、脑和四肢进行灌注的方法。Van Putte等，2002，心胸外科杂志(Ann.Thorac.Surg.)，74(3)：893-8；den Butter等，1995，国际移植杂志(Transpl.Int.}，8：466-71；Firth等，1989，临床科学(Clin.Sci.)(Lond.)，77(6)：657-61；Mazzetti等，2004，脑研究(Brain Res.)，999(1)：81-90；Wagner等，2003，人工器官杂志(J.Artif.Organs)，6(3)：183-91。
可以使用一种或多种细胞破裂介质来使器官或组织脱细胞。细胞破裂介质通常包括至少一种去污剂，如SDS、PEG或Triton X。细胞破裂介质可以包括水，使该介质与细胞渗透性不相容。或者，细胞破裂介质可以包括缓冲液(如，PBS)以使之与细胞渗透性相容。细胞破裂介质还可以包括酶，例如但不限于：一种或多种胶原酶、一种或多种分散酶、一种或多种DNA酶，或蛋白酶如胰蛋白酶。一些情况下，细胞破裂介质还(或者可以)包括一种或多种酶的抑制剂(如，蛋白酶抑制剂、核酸酶抑制剂和/或胶原酶抑制剂)。
在某些实施方式中，可以用两种不同的细胞破裂介质对插管器官或组织连续灌注。例如，所述第一细胞破裂介质可以包括阴离子去污剂，如SDS，所述第二细胞破裂介质可以包括离子去污剂，如Triton X-100。用至少一种细胞破裂介质进行灌注后，可以例如用洗液和/或含有如本文所公开的一种或多种酶的溶液对插管器官或组织进行灌注。
改变灌注方向(如，顺行和逆行)可促进有效地对整个器官或组织脱细胞。本文所述的脱细胞化基本上是从里到外对器官脱细胞，对ECM损伤非常小。可以在4-40℃的合适温度对器官或组织脱细胞。根据器官或组织的大小和重量、和细胞破裂介质中的具体去污剂和去污剂浓度，一般用细胞破裂介质对器官或组织灌注约2-12小时/克实体器官或组织。包括洗涤在内，可以对器官灌注高达约12-72小时/克组织。通常将灌注调整到适应生理条件，包括搏动血流、速度和压力。
如本文所述，脱细胞器官或组织主要由全部或大部分器官或组织的胞外基质(ECM)组分组成，包括血管网络的ECM组分。ECM组分可以包括以下任何或所有：纤连蛋白、原纤维蛋白、层粘连蛋白，弹性蛋白、胶原家族成员(如，胶原I、III和IV)、氨基葡聚糖、基质、网状纤维和血小板反应蛋白，它们可以组织成规定的结构如基底层。成功脱细胞的定义是不存在可检测的肌丝、内皮细胞、平滑肌细胞，和采用标准的组织学染色方法在组织学切片中看不到胞核。优选但不是必须地，还要从脱细胞器官或组织中除去残留的细胞碎片。
在脱细胞过程中和之后维持ECM的形态和构造(即，基本上保持完整)对有效再细胞化和产生器官或组织而言非常重要。本文所采用的“形态”指器官或组织或ECM的整体形状，而本文采用的“构造”指外表面、内表面和它们之间的ECM。
可以目测和/或用组织学方法检测ECM的形态和构造。例如，脱细胞时不宜去除或严重破坏实体器官外表面上或器官或组织血管内的基底层。此外，ECM的原纤维应该与未脱细胞的器官或组织的类似或没有显著改变。除非另外说明，本文所用的脱细胞指灌注脱细胞，除非另外说明，本文所述的脱细胞器官或基质是用本文所述的灌注脱细胞法获得的。本文所述的灌注脱细胞可与美国专利号6,753,181和6,376,244等所述的浸润脱细胞比较。
可以将一种或多种化合物用于脱细胞器官或组织内部或表面，以例如保存脱细胞器官、或为脱细胞器官或组织的再细胞化作准备和/或在再细胞化过程中帮助或刺激细胞。这类化合物包括但不限于：一种或多种生长因子(如，VEGF、DKK-1、FGF、BMP-1、BMP-4、SDF-1、IGF和HGF)、免疫调节剂(如，细胞因子、糖皮质激素类、IL2R拮抗剂、白细胞三烯拮抗剂)和/或调节凝血级联反应的因子(如，阿斯匹林、肝素结合蛋白和肝素)。此外，还可以进一步用例如辐照(如，UV、γ)处理脱细胞器官或组织来减少或消除残留在脱细胞器官或组织内部或表面上的任何类型的微生物。
器官或组织的再细胞化
本发明提供了产生器官或组织的材料和方法。可以通过如本文所述使脱细胞器官或组织接触再生细胞群来产生器官或组织。本文采用的再生细胞是用来使脱细胞器官或组织再细胞化的任何细胞。再生细胞可以是全能细胞(totipotentcells)、多潜能性细胞(pluripotent cells)或多能细胞(multipotent cells)，可以是未定型或定型的。再生细胞还可以是单谱系细胞。此外，再生细胞可以是未分化细胞、部分分化细胞或完全分化细胞。本文采用的再生细胞包括胚胎干细胞(据美国国立卫生研究院(NIH)所定义；参见例如，http://www.stemcells.nih.gov上的术语表)。再生细胞还包括祖细胞、前体细胞，和包括脐带细胞和胎儿干细胞的“成体”干细胞。
可用于使器官或组织再细胞化的再生细胞示例包括但不限于：胚胎干细胞、脐带血细胞、组织干细胞或祖细胞、骨髓干细胞或祖细胞、血液干细胞或祖细胞、脂肪组织干细胞或祖细胞、间质干细胞(MSC)、骨骼肌细胞或多能成体祖细胞(MAPC)。可以采用的其它再生细胞包括心脏干细胞(CSC)、多能成体心脏干细胞、心脏成纤维细胞、心脏微血管内皮细胞或主动脉内皮细胞。骨髓干细胞如骨髓单核细胞(BM-MNC)、内皮细胞或血管干细胞或祖细胞，和外周血干细胞如内皮祖细胞(EPC)也可以用作再生细胞。
引入脱细胞器官内部和表面来产生器官或组织的再生细胞的数量取决于器官(如，哪种器官、器官的大小和重量)或组织和再生细胞的类型和发育阶段。不同的细胞类型可能倾向达到的群落密度也不同。类似地，不同的器官或组织可以不同的密度进行再细胞化。举例来说，脱细胞器官或组织可以被“接种”上至少约1,000(如，至少10,000、100,000、1,000,000、10,000,000或100,000,000)个再生细胞；或者可以有约1,000-10,000,000个细胞/毫克组织(湿重，即，脱细胞前)附于其上。可以通过注射进一个或多个位置将再生细胞引入(“接种”)到脱细胞器官或组织内部。此外，可以将一种以上的细胞类型(即，混合细胞)引入脱细胞器官或组织内部。例如，可以将混合细胞注射到脱细胞器官或组织的多个部位，或者可以将不同类型的细胞注射到脱细胞器官或组织的不同部位。或者，或除了注射以外，可以将再生细胞或混合细胞通过灌注引入插管的脱细胞器官或组织内部。例如，可以使用灌注介质将再生细胞灌注进脱细胞器官内部，然后换用扩增和/或分化介质诱导再生细胞的生长和/或分化。
再细胞化期间，使器官或组织维持在至少有些再生细胞能在脱细胞器官或组织内部或表面增殖和/或分化的条件下。这些条件包括但不限于：合适的温度和/或压力、电和/或机械作用、外力、合适的O2和/或CO2量、合适的湿度、和无菌或接近无菌的条件。再细胞化期间，使脱细胞器官或组织和附于其上的再生细胞维持在合适的环境中。例如，再生细胞可能需要营养补充剂(如，营养物和/或碳源，如葡萄糖)、外源性激素或生长因子，和/或特定pH。
再生细胞可以与脱细胞器官或组织(如，用人的再生细胞接种的人脱细胞器官或组织)同种，或者再生细胞可以与脱细胞器官或组织(如，接种人的再生细胞的猪脱细胞器官或组织)异种。本文采用的“同种”是指来自与器官或组织来源相同的物种的细胞(如，自体(即自体同源)相关或不相关的个体)，而本文采用的“异种”是指来自与器官或组织来源不同的物种的细胞。
一些情况下，需要将通过本文所述方法产生的器官或组织移植进患者体内。那些情况下，用于使脱细胞器官或组织再细胞化的再生细胞可以来自该患者，从而所述再生细胞与患者“自体同源”。患者的再生细胞可以采用本领域已知方法获自，例如，不同生命阶段的血液、骨髓、组织或器官(如，出生前、新生期或围产期、青春期或成年期)。或者，用于使脱细胞器官或组织再细胞化的再生细胞可以是与患者同基因型的(即，来自同卵双胞胎)，再生细胞可以是来自例如，患者亲属或与患者无亲属关系的HLA匹配个体的人淋巴细胞抗原(HLA)匹配细胞，或者再生细胞可以来自例如，非HLA匹配的与患者同种的供体。
不考虑再生细胞的来源(如，自体或非自体)，脱细胞实体器官可以是患者的自体、同种或异种器官。
某些情况下，脱细胞器官可以在体内用细胞进行再细胞化(如，将器官或组织移植入个体之后)。可以如上所述(如，注射和/或灌注)用例如，本文所述的任何再生细胞进行体内再细胞化。另外，用内源细胞对脱细胞器官或组织进行体内接种可能天然发生或者受递送到再细胞化组织中的因子所介导。
再细胞化期间可以监控再生细胞的发展。例如，可以通过在再细胞化期间的一个或多个时间点进行生物活检来评估器官或组织表面或内部的细胞数量。此外，可以通过确定细胞或细胞群中是否存在各种标记物来监控再生细胞所经历的分化次数。本领域已知与不同类型的细胞和这些细胞类型的不同分化阶段有关的标记物，并可采用抗体和标准免疫试验轻易地进行检测。参见例如，Current Protocolsin Immunology(《最新免疫试验方法》)，2005，Coligan等人编，John Wiley & Sons，第3和11章。核酸试验以及形态学和/或组织学评估可用来监控再细胞化过程。也可评估再细胞化器官的功能分析。例如，可在再细胞化的心脏内评估收缩和血管压力；可在再细胞化肝脏中评估白蛋白生产、尿素生产和细胞色素p450活性；可在再细胞化肾脏中评估血液或介质滤过和尿素生产；可在再细胞化胰脏中评估血液、葡萄糖和胰岛素；可在再细胞化肌肉中评估力产生或对刺激的响应；还可在再细胞化脉管中评估致血栓性。
器官或组织脱细胞化和/或再细胞化的控制系统
本发明还提供一种对器官或组织进行脱细胞化和/或再细胞化的系统(如，生物反应器)。这类系统通常包括至少一插管装置用于对器官或组织插管，一灌注设备用于通过套管对器官或组织进行灌注，和使器官或组织维持在无菌环境中的工具(如，密封系统)。插管和灌注均为本领域熟知的技术。插管装置通常包括大小合适的中空管，用来插进器官或组织的血管、导管和/或空腔内。通常，要在器官内的一个或多个血管、导管和/或空腔内插管。灌注设备可以包括手持液体(如，细胞破裂介质)容器和将液体通过一个或多个套管灌进器官的机械装置(如，泵、气压、重力)。可以采用本领域已知的各种技术使器官或组织在脱细胞化和/或再细胞化期间维持无菌状态，如控制和过滤气流和/或一同灌注进例如，抗生素、抗真菌药或其它抗微生物药来阻止有害微生物的生长。
本文所述使器官或组织脱细胞化和再细胞化的系统具有监控某些灌注性质(如，压力、体积、气流型态、温度、气体、pH)、机械力(如，室壁运动和压力)和电刺激(如，起搏)的能力。由于冠状血管床会随脱细胞化和再细胞化的进程而改变(如，血管阻力、体积)，可调节压力的灌注设备能够有利地避免大压力波动。可以用流出物和组织学切片来评估灌注效果。可以用标准方法监控灌注体积、气流型态、温度、局部O2和CO2压力和pH。
可以使用传感器来监控该系统(如，生物反应器)和/或器官或组织。可以使用超声测微法、微量测压法和/或电导测量法来获得压力-体积或与心肌壁运动和表现有关的前负荷可恢复搏出功信息。例如，可以使用传感器来监控液体流经插管器官或组织时的压力；系统的环境温度和/或器官或组织的温度；液体流经插管器官或组织时的pH和/或流速；和/或再细胞化的器官或组织的生物学活性。除了具有能监控这类特性的传感器外，使器官或组织脱细胞化和/或再细胞化的系统还可以包括维持或调节这类特性的工具。维持或调节这类特性的工具可以包括以下部件，如温度计、恒温器、电极、压力传感器、溢流阀、改变液体流速的阀门、打开和关闭流体与溶液的连接来改变溶液pH的阀门、气室、体外起搏器和/或柔软的空腔。为了有助于确保稳定的条件(如温度)，所述空腔，储液器和管道可以具有水套。
再细胞化期间对器官和附于其上的细胞施加机械负荷是有益的。例如，可以使用经由左心房插入左心室的气室来对心脏施加机械压力。可以将能够调节体积和速率的活塞泵与气室相连来刺激左心室壁运动和压力。为了监测壁运动和压力，可以采用微量测压法、超声测微法、压力体积变化或心脏超音波来测量左心室壁运动和压力。在一些实施方式中，可以将外部起搏器与活塞泵相连来提供与每次心室气室放气(与收缩期等效)同步化的刺激。可以从心脏表面记录外周ECG来调节起搏电压，监测去和复极化，和提供简化的再细胞化时和再细胞后的心脏的表面图。
还可以通过将蠕动泵与经由左心房插入左心室内的套管连接，而实现机械性心室扩张。与上述有关气室的方法类似，通过流经套管的周期性液体运动(如，搏动血流)实现的心室扩张可以与电刺激同步化。
采用本文所公开的方法和材料，可以对哺乳动物心脏进行脱细胞化和再细胞化，当维持于合适条件时，可以产生具有收缩功能和对起搏刺激和/或药剂作出反应的有功能的心脏。可以将该再细胞化的有功能心脏移植入哺乳动物体内在一段时间内起作用。
图2显示了使器官或组织脱细胞化和/或再细胞化的系统的一实施方式(如，生物反应器)。所示实施方式是使心脏脱细胞化和再细胞化的生物反应器。该实施方式具有可调节速率和体积的蠕动泵(A)；与心室内气室相连的可调节速率和体积的活塞泵(B)；可调节电压、频率和振幅的体外起搏器(C)；ECG记录仪(D)；‘动脉管路’中的压力传感器(其等于冠状动脉压)(E)；‘静脉’管路中的压力传感器(其等于冠状窦压)(F)；和起搏器和活塞泵间的同步仪(G)。
计算机可读的存储介质结合可编程处理器(如，本文采用的计算机可读存储介质具有存储于其上的指令，能使可编程处理器执行具体的步骤)可以控制产生器官或组织的系统。例如，这类存储介质，结合可编程处理器，可以接收和处理来自一个或多个传感器的信息。这类存储介质结合可编程处理器还可以将信息和指令传回生物反应器和/或所述器官或组织。
可以监控经历再细胞化的器官或组织的生物学活性。所述生物学活性可以是器官或组织本身的生物学活性，如器官或组织的电学活性、机械活性、机械压、收缩性和/或壁压。此外，还可以监控附于器官或组织上的细胞的生物学活性，例如，离子运输/交换活性、细胞分裂和/或细胞存活率。参见例如，《LaboratoryTextbook of Anatomy and Physiology(解剖和生理学实验室手册)》(2001，Wood，Prentice Hall)和《Current Protocols in Cell Biology(细胞生物学的最新实验方法)》(2001，Bonifacino等编，John Wiley & Sons)。如上所述，在再细胞化期间在器官上模拟活性负荷是有用的。本发明的计算机可读存储介质，结合可编程处理器，可用于协调监控和维持对器官或组织所加的活性负荷所需的部件。
在一个实施方式中，可以将器官或组织的重量输入本文所述的计算机可读存储介质内，它与可编程处理器结合，可以计算针对具体器官或组织的接触次数和灌注压。这类存储介质可以记录前负荷和后负荷(分别是灌注前和后的压力)和流速。在此实施方式中，例如，计算机可读存储介质结合可编程处理器通过一个或多个泵和/或控制阀门，可以调节灌注压、灌注方向和/或灌注液种类。
根据本发明，可以采用本领域技术范围内的常规分子生物学、微生物学、生物化学和细胞生物学技术。这些技术在文献中已有充分描述。以下实施例进一步描述了本发明，这些实施例不限制权利要求书所述的本发明范围。
实施例
A组.脱细胞化(I部分)
实施例1-制备用于脱细胞化的实体器官
为了避免形成死后血栓，用400U的肝素/千克供体的剂量对供体大鼠进行全身肝素化。肝素化后，仔细摘下心脏和邻近的大血管。
将心脏置于含有肝素(2000U/ml)的生理盐水溶液(0.9％)中，保存于5℃直到下一步处理。在无菌条件下，将结缔组织与心脏和大血管分离。用不可吸收的单丝结扎线结扎右和左心房远端的下腔静脉和左和右肺静脉。
实施例2-对实体器官进行插管和灌注
将所述心脏固定在脱细胞设备上进行灌注(图1)。对下行胸腔动脉插管以便进行逆行冠状(动脉)灌注(图1，插管A)。结扎胸腔动脉的分支(如，头臂干、左颈总动脉、左锁骨下动脉)。在肺动脉分成左和右肺动脉之前对其插管(图1，插管B)。对上腔静脉插管(图1，插管C)。该配置下能够进行逆行和顺行冠状(动脉)灌注。
当对主动脉插管(A)施加正压时，发生从冠状动脉经过毛细血管床到达冠状静脉系统再到达右心房和上腔静脉(C)的灌注。当对上腔静脉插管(C)施加正压时，发生从右心房、冠状窦和冠状静脉经过毛细血管床到达冠状动脉和主动脉插管(A)的灌注。
实施例3-脱细胞化
将心脏固定于脱细胞设备后，用含有1-5毫摩尔腺苷/升输注液的冷的肝素化的脱钙磷酸缓冲液开始顺行灌注，来重建持续的冠状(动脉)流。通过测定冠状(动脉)输注压和流量来评估冠状(动脉)流，并计算冠状阻力。15分钟的稳定冠状流之后，开始进行基于去污剂的脱细胞处理。
具体的处理方法如下所述。然而，简单来讲，就是用去污剂对心脏进行顺行灌注。灌注后，用缓冲液(如，PBS)逆行冲洗心脏。然后，用含有抗生素的PBS灌注心脏，再然后用含有DNA酶I的PBS灌注。然后，用1％苯扎氯铵灌注心脏来减少微生物污染和预防将来的微生物污染，然后用PBS灌注洗涤器官，以除去任何残留细胞组分、酶或去污剂。
实施例4-对已死亡大鼠心脏脱细胞
取下8只雄性裸大鼠的心脏(250-300g)。取下后立即对主动脉弓插管，用所示去污剂进行逆行灌注。比较4种不同的基于去污剂的脱细胞方法(如下)的可行性和(a)除去细胞组分和(b)保留血管结构的效力。
脱细胞化通常包括以下步骤：稳定实体器官、对实体器官脱细胞、复性和/或中和实体器官，洗涤实体器官、降解留在器官上的任何DNA、对器官消毒和建立器官稳态。
A)脱细胞方法#1(PEG)
用含有100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素和0.25μg/ml两性霉素B的200ml PBS不回流地洗涤心脏。然后用35ml聚乙二醇(PEG；1g/ml)进行长达30分钟的手动回流脱细胞。然后在用泵进行回流的情况下，用500ml PBS洗涤器官长达24小时。重复所述洗涤步骤至少两次，每次至少24小时。使心脏在手动回流下接触35mlDNA酶I(70U/ml)至少1小时。再次用500ml PBS洗涤器官至少24小时。
B)脱细胞方法#2(Triton X和胰蛋白酶)
用含有100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素和0.25μg/ml两性霉素B的200ml PBS不回流地洗涤心脏至少约20分钟。然后用0.05％胰蛋白酶对心脏进行30分钟脱细胞，接着用含有5％Triton-X和0.1％氢氧化铵的500ml PBS灌注约6小时。用去离子水灌注心脏约1小时，然后用PBS灌注12小时。然后在用泵进行回流下，用500mlPBS洗涤心脏3次，每次24小时。在手动回流下，用35ml DNA酶I(70U/ml)灌注心脏1小时，在用泵进行回流下，用500ml PBS洗涤心脏2次，每次至少约24小时。
C)脱细胞方法#3(1％SDS)
用含有100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素和0.25μg/ml两性霉素B的200ml PBS不回流地洗涤心脏至少约20分钟。在用泵进行回流下，用含有1％SDS的500ml水对心脏进行至少约6小时的脱细胞。然后用去离子水洗涤心脏约1小时，且用PBS洗涤约12小时。在用泵进行回流下，用500ml PBS洗涤心脏3次，每次至少约24小时。然后在手动回流下，用35ml DNA酶I(70U/ml)灌注心脏约1小时，在用泵进行回流下，用500ml PBS洗涤心脏3次，每次至少约24小时。
D)脱细胞方法#4(Triton X)
用含有100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素和0.25μg/ml两性霉素B的200ml PBS不回流地洗涤心脏至少约20分钟。然后，在用泵进行回流下，用含有5％Triton X和0.1％氨水的500ml水对心脏进行至少6小时的脱细胞。然后用去离子水灌注心脏约1小时，然后用PBS灌注约12小时。在用泵进行回流下，用500ml PBS洗涤心脏3次，每次至少约24小时。然后，在手动回流下，用35ml DNA酶I(70U/ml)灌注心脏约1小时，用500ml PBS洗涤心脏3次，每次至少约24小时。
对首次实验而言，将脱细胞设备设在层流净化罩内。以60cm H2O的冠状动脉灌注压对心脏进行灌注。尽管不是必须的，可以将上述实验中所述的心脏固定于脱细胞室内，完全浸没于含有抗生素的PBS中，并在回流模式下以5毫升/分钟的持续流量用其灌注72小时，尽可能多地洗去细胞组分和去污剂。
将在组织学切片中没有肌丝和胞核定义为脱细胞成功。通过在包埋组织学切片前用2％的伊文思蓝进行灌注来评估是否成功保留了血管结构。
当首先用溶于去离子水中的离子去污剂(1％十二烷基磺酸钠(SDS)，约0.03M)以持续冠状动脉灌注压顺行灌注，然后用非离子去污剂(1％Triton X-100)顺行灌注心脏来除去SDS，和大概使胞外基质(ECM)蛋白复性时，脱细胞效力极高。间歇地，用磷酸缓冲液逆行灌注心脏来疏通梗阻的毛细管和小血管。
实施例5-评估脱细胞器官
为了证明在脱细胞后血管结构完整，采用兰道夫灌注法使用伊文思蓝对脱细胞心脏染色，以染色血管基底膜和定量大血管和微血管密度。另外，可以将聚苯乙烯颗粒灌注进入和通过心脏来定量冠状动脉的容积、容器泄漏水平和通过分析冠状动脉流出物和组织学切片来评估灌注分布。组合评估3个标准，与分离的非脱细胞心脏进行比较：1)聚苯乙烯颗粒的平均分布，2)某些水平的泄漏显著变化，3)微血管密度。
用可实时运用于单轴或双轴应力下的样品的Tower等人(2002，Fiberalignment imaging during mechanical testing of soft tissues(《软组织机械测试期间的纤维对齐图像》)，生物医学工程年评(Ann Biomed Eng.)，30(10)：1221-33)的偏振光镜检技术来评估纤维定向。兰道夫灌注期间，记录下脱细胞ECM的基本机械属性(柔度、弹性、爆裂压力)，与新鲜分离的心脏作比较。
B组.脱细胞(II部分)
实施例1-对大鼠心脏脱细胞
腹腔注射100mg/kg氯胺酮(菲尼克斯制药有限公司(Phoenix Pharmaceutical，Inc.)，密苏里州圣约瑟市)和10mg/kg赛拉嗪(菲尼克斯制药有限公司，密苏里州圣约瑟市)，麻醉12周大的雄性F344费歇尔大鼠(印第安纳州46229，印第安纳波利斯，第29176邮箱，哈伦实验室(Harlan Labs))。通过左侧股静脉全身施用肝素(美国制药股份有限公司(American Pharmaceutical Partners，Inc.)，伊利诺斯州司康博格市)后，进行正中胸骨切开术打开围心膜。去除胸骨后脂肪体，切开上行胸主动脉，将其分支结扎。横切腔静脉和肺静脉、肺动脉和胸主动脉，从胸腔中取出心脏。将预装填的1.8mm主动脉套管(赖诺提玻璃制品公司(Radnoti Glass)，加利福尼亚州蒙罗维亚)插入上行主动脉以便进行逆行冠状动脉灌注(兰道夫)。用含有10μM腺苷的肝素化的PBS(哈龙公司(Hyclone)，犹他州洛根市)以75cm H2O的冠状动脉灌注压灌注心脏15分钟，接着用含有1％十二烷基磺酸钠(SDS)或1％聚乙二醇1000(PEG 1000)(EMD生物科学公司(EMD Biosciences)，德国，拉霍亚)或1％Triton-X 100(西格玛公司(Sigma)，密苏里州圣路易斯市)的去离子水溶液灌注2-15小时。接着用去离子水灌注15分钟和用含有1％Triton-X(西格玛，密苏里州圣路易斯市)的去离子水灌注30分钟。然后继续用含抗生素的PBS(100U/ml青霉素-G(几柯公司(Gibco)，加利福尼亚州卡尔斯巴德)，100U/ml链霉素(几柯公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德)和0.25μg/ml两性霉素B(西格玛，密苏里州圣路易斯市))灌注124小时。
用1％PEG、1％Triton-X 100或1％SDS、PEG和Triton-X 100灌注液逆行灌注420分钟后，外观呈现水肿和不透明，而SDS灌注获得更剧烈的改变，随着不透明物质被慢慢洗去，得到半透明的移植物。进行所有3种处理方法的心脏均能保持十分完整而不会在灌注过程中(在77.4mmHg的持续冠状动脉灌注压时)发生冠状动脉破裂或主动脉瓣机能不全。在所有3种方法中的首个60分钟灌注期内均会发生冠脉血流量减少，然后在SDS灌注期恢复正常，而在Triton-X 100和PEG灌注期间保持增加。SDS灌注使计算出的冠状动脉阻力首次增加最多(高达250mmHg.s.ml-1)，接着是Triton-X(高达200mmHg.s.ml-1)和PEG(高达150mmHg.s.ml-1)。
用经去污剂灌注的心脏组织的组织学切片，确定了在所观察时间间隔内，PEG和Triton-X 100处理心脏的脱细胞均不完全；苏木精-伊红(H&E)染色显示出胞核和交叉条纹状的细丝。相反，在SDS-灌注心脏的切片中未观察到胞核或收缩性细丝。然而，SDS-处理心脏中保留了血管结构和ECM纤维方向。
为了在首次脱细胞后从ECM上除去离子性SDS，用Triton-X 100灌注器官30分钟。此外，为了保证完全洗去所有去污剂和重建生理学pH，用去离子水和PBS大范围灌注脱细胞器官124小时。
实施例2-对大鼠肾脏脱细胞
为了分离肾脏，将整个腹腔内含物包裹在湿纱布中，小心移到边上，使腹膜后间隙露出。结扎并截断肠系膜血管。在肾动脉出发点下方结扎并截断腹主动脉。在隔膜正上方切断胸主动脉和用1.8mm主动脉套管(赖诺提玻璃制品公司，加利福尼亚州蒙罗维亚)插管。将肾脏从腹膜后腔中仔细的取出，浸入无菌PBS(哈龙公司，犹他州洛根市)使肾动脉上的牵引力减到最小。用肝素化PBS灌注15分钟，接着用含1％SDS(伊维创公司(Invitrogen)，加利福尼亚州卡尔斯巴德)的去离子水灌注2-16小时，和用含1％Triton-X(西格玛，密苏里州圣路易斯市)的去离子水灌注30分钟。然后继续用含抗生素的PBS(100U/ml青霉素-G(几柯公司(Gibco)，加利福尼亚州卡尔斯巴德)，100U/ml链霉素(几柯公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德)和0.25μg/ml两性霉素B(西格玛，密苏里州圣路易斯市))灌注肝脏124小时。
SDS灌注420分钟，接着用Triton-X 100灌注得到具有完整血管和器官结构的完全脱细胞的肾脏ECM支架。伊文思蓝灌注证实了其完整血管系统与脱细胞心脏ECM类似。对脱细胞肾脏皮质进行莫法(Movat)五色染色显示出没有任何完整细胞或胞核的完整的肾小球以及近端和远端肾曲小管基底膜。对脱细胞肾髓质染色显示出完整的小管和集合管基底膜。脱细胞肾皮质的SEM证实了完整的肾血管球和管基底膜。保留了特征结构，如从周围近端和远端小管和肾血管球勾画出肾小球的鲍氏囊和肾小球内的肾小球毛细血管基底膜。脱细胞肾髓质的SEM图像显示出直达肾盂的具有通向乳头的完整收集管基底膜的完整延髓锥体。因此，脱细胞后肾脏的所有主要超微结构均完整。
实施例3-对大鼠肺脱细胞
将肺(带有气管)仔细地从胸腔中取出，浸入无菌PBS(哈龙公司，犹他州洛根市)使肺动脉上的牵引力减到最小。用肝素化PBS灌注15分钟，接着用含1％SDS(伊维创公司(Invitrogen)，加利福尼亚州卡尔斯巴德)的去离子水灌注2-12小时，和用含1％Triton-X(西格玛，密苏里州圣路易斯市)的去离子水灌注15分钟。然后继续用含抗生素的PBS(100U/ml青霉素-G(几柯公司(Gibco)，加利福尼亚州卡尔斯巴德)，100U/ml链霉素(几柯公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德)和0.25μg/ml两性霉素B(西格玛，密苏里州圣路易斯市))灌注肺124小时。
SDS灌注180分钟，接着用Triton-X 100灌注得到具有完整气道和血管的完全脱细胞的肺ECM支架。对组织切片进行莫法五色染色显示肺部存在ECM组分，包括主要结构蛋白如胶原和弹性蛋白，还有可溶性成分如蛋白聚糖。然而，没有留下胞核或完整细胞。保留有从主要支气管到终末细支气管到呼吸性细支气管、肺泡小管和肺泡的气道。从肺动脉往下到达毛细管水平和肺静脉的血管床保持完整。脱细胞肺的SEM显微照片显示保留有支气管、肺泡和血管基底膜，而没有证据表明保留有细胞。为肺泡隔提供主要结构支撑的弹性和网状纤维的网状组织以及中隔基底膜(包括肺间质内的毛细血管致密网络)保持完整。
脱细胞气管的SEM显微照片显示出具有脱细胞透明软骨环和粗糙腔基底膜的完整ECM结构，而没有呼吸内皮细胞。
实施例4-对大鼠肝脏脱细胞
为了分离肝脏，进行正中剖开术使腔静脉露出，切开并用小鼠主动脉套管(赖诺提玻璃制品公司，加利福尼亚州蒙罗维亚)进行插管。切断肝动脉和静脉和胆管，将肝脏从腹部小心取出，浸入无菌PBS(哈龙公司，犹他州洛根市)使门静脉上的牵引力减到最小。用肝素化PBS灌注15分钟，接着用含1％SDS(伊维创公司(Invitrogen)，加利福尼亚州卡尔斯巴德)的去离子水灌注2-12小时，和用含1％Triton-X(西格玛，密苏里州圣路易斯市)的去离子水灌注15分钟。然后继续用含抗生素的PBS(100U/ml青霉素-G(基博公司(Gibco)，加利福尼亚州卡尔斯巴德)，100U/ml链霉素(几柯公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德)和0.25μg/ml两性霉素B(西格玛，密苏里州圣路易斯市))灌注肝124小时。
SDS灌注120分钟，接着用Triton-X 100灌注足以得到完全脱细胞的肝脏。对脱细胞肝脏进行莫法五色染色证实保留了具有中央静脉和含有肝动脉、胆管和门静脉的门腔的特征性肝脏组织。
实施例5-用于评估脱细胞器官的方法和材料
组织学和免疫荧光方法。按照厂商说明书(美国马斯特技术科学公司(American Mastertech Scientific)，加利福尼亚州洛代市)对包埋入石蜡中的脱细胞组织进行莫法五色染色。简单来讲，采用凡霍夫(Verhoeff)弹性染料对脱石蜡载玻片进行染色，冲洗，用2％三氯化铁分辨，冲洗，置于5％硫代硫酸钠中，冲洗，用3％冰醋酸封闭，用1％阿辛蓝溶液染色，冲洗，用藏花猩红-酸性品红染色，冲洗，浸没于1％冰醋酸中，用5％磷钨酸脱色，浸没于1％冰醋酸中，脱水，置于醇制藏红花溶液中，脱水，固定和盖上盖玻片。
对脱细胞组织进行免疫荧光染色。对石蜡包埋组织(再细胞化组织)但不对冷冻切片(脱细胞组织)进行以下抗原回收：通过将石蜡切片两次浸于二甲苯中，每次浸5分钟，接着浸于连续的醇梯度中，用冷的流动自来水冲洗来脱蜡和重新水化。然后，将该载玻片置于抗原回收溶液(2.94g柠檬酸三钠、22ml的0.2M盐酸溶液、978ml超纯水和pH调节到6.0)中煮沸30分钟。用流动的冷自来水冲洗10分钟后，开始进行免疫染色。染色前，用含4％低聚甲醛(电子显微科学公司(ElectronMicroscopy Sciences)，宾夕法尼亚州海特弗(Hatfield)市)的1X PBS(介质技术公司(Mediatech)，弗吉尼亚州赫恩登市)在室温下固定冰冻切片15分钟。用含4％胎牛血清(FBS；哈龙公司，犹他州洛根市)的1X PBS在室温下封闭载玻片30分钟。将样品在室温下与稀释的一和二抗(Ab)分别连续培育各1小时。每步之间，用1XPBS洗涤载玻片3次(每次5-10分钟)。使用用封闭缓冲液1∶40稀释的抗胶原I(山羊多克隆IgG(商品目录号：sc-8788)，圣克鲁斯生物技术有限公司(Santa CruzBiotechnology Inc.)，加利福尼亚州圣克鲁斯市)、胶原III(山羊多克隆IgG(商品目录号：sc-2405)，圣克鲁斯生物技术有限公司，加利福尼亚州圣克鲁斯市)、纤连蛋白(山羊多克隆IgG(商品目录号：sc-6953)，圣克鲁斯生物技术有限公司，加利福尼亚州圣克鲁斯市)和层粘连蛋白(家兔多克隆IgG(商品目录号：sc-20142)，圣克鲁斯生物技术有限公司，加利福尼亚州圣克鲁斯市)的一抗。使用用封闭缓冲液1∶80稀释的牛抗-山羊IgG藻红蛋白(商品目录号：sc-3747，圣克鲁斯生物技术有限公司，加利福尼亚州圣克鲁斯市)和牛抗-家兔IgG藻红蛋白(商品目录号：sc-3750，圣克鲁斯生物技术有限公司，加利福尼亚州圣克鲁斯市)二抗。对载玻片加盖盖玻片(费歇尔布兰德(Fisherbrand)22x 60，宾夕法尼亚州匹兹堡市)，滴入含有4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(载体实验室有限公司(Vectashield，Vector Laboratories，Inc.)，加利福尼亚州伯林格姆市)的硬化封固介质。用ImagePro+4.5.1软件(媒体控制公司(Mediacybernetics)，马里兰州西尔弗斯普林市)在尼康Eclipse TE200倒置显微镜(弗来尔有限公司(FryerCo.Inc.)，伊利诺斯州亨特来市(Huntley))上记录图像。
扫描电子显微术用含2.5％戊二醛(电子显微科学公司，宾夕法尼亚州海特弗市)的0.1M卡可酸盐缓冲液(电子显微科学公司，宾夕法尼亚州亨特来市)灌注固定正常和脱细胞组织15分钟。然后用0.1M卡可酸盐缓冲液冲洗组织两次，每次15分钟。用1％四氧化锇(电子显微科学公司，宾夕法尼亚州海特弗市)后固定60分钟。然后用浓度递增的EtOH(50％10分钟、70％10分钟两次、80％10分钟、95％10分钟两次、100％10分钟两次)对组织样品脱水。然后使组织样品在托斯米斯(Tousimis)Samdri-780A(托斯米斯公司(Tousimis)，马里兰州罗克维尔市)中进行临界点干燥。在登顿(Denton)DV-502A真空蒸发器(登顿真空(Denton Vacuum)，新泽西州穆尔镇)进行30秒金/钯溅射镀膜。使用日立公司的S4700场致发射电子显微镜(日立高技术美国公司，加利福尼亚州普莱森顿市)摄制扫描电子显微图像。
机械测试。从大鼠左心室切下十字形的心肌组织，中心区域约5mm x 5mm，十字的轴与心脏的周向和纵向对齐。用测微计测量得到十字形组织中央的原始厚度是3.59±0.14mm。还以相同的方向从脱细胞大鼠左心室组织中切下中心区域大小相同的十字形心肌。该脱细胞样品的原始厚度是238.5±38.9μm。此外，还检测了另一种构造血管和心脏组织的组织工程学支架，纤维蛋白凝胶的机械性能。将纤维蛋白凝胶制成十字交叉型，其终浓度是6.6毫克纤维蛋白/毫升。所述纤维蛋白凝胶的平均厚度是165.2±67.3μm。用镊子将所有样品贴到二轴机械测试机(英创公司(Instron Corporation)，马萨诸塞州诺伍德镇)上，浸没于PBS中，在二轴向上相等拉伸到应变40％。为了精确探究静压机械性能，拉伸样品使其增加4％的应变，每个应变值时休息至少60秒。通过将力值对特定轴向的截面积(5mm x原始厚度)定标，将力转换为工程应力。工程应力计算成根据原始长度标准化的位移。为了比较两个轴之间和样品组之间的数据，根据以下公式计算切线模量：
[T(ε＝40％应变)-T(ε＝36％应变)]/4％应变
其中T是工程应力，e是工程应变。将切线模量的值进行平均，比较两轴(周向和纵向)和组间的差异。
实施例6-评估脱细胞器官的生物相容性
为了评估生物相容性，将100,000个小鼠的胚胎干细胞(mESC)悬于1cc的标准扩增培养液(IMDM细胞培养基(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium)(基博(Gibco)，加利福尼亚州卡尔斯巴德)，10％胎牛血清(哈龙公司，犹他州洛根市)、100U/ml青霉素-G(基博，加利福尼亚州卡尔斯巴德)、100U/ml链霉素(基博，加利福尼亚州卡尔斯巴德)、2mmol/L L-谷胺酰胺(伊维创公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德)、0.1mmol/L 2-巯基乙醇(基博，加利福尼亚州卡尔斯巴德))中，接种到ECM切片上和不含特殊生长因子刺激物或饲养细胞支持物的对照板上。将浓度为10μg/ml的4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)加入细胞培养液中标记细胞核，以便定量附着和扩增的细胞。利用ImagePro+4.5.1(媒体控制公司，马里兰州西尔弗斯普林市)在尼康Eclipse TE200倒置显微镜(弗来尔有限公司，伊利诺斯州亨特来市)上记录UV光下的图像和在基线、24、48和72小时之后的相差。
所述脱细胞ECM与细胞存活、附着和增殖相容。将接种后的mESC移植到ECM支架上，在细胞接种72小时内即开始侵入该基质。
实施例7-对脱细胞器官进行评估
通过用2％伊文思蓝染料进行兰道夫灌注来评估SDS脱细胞大鼠心脏的动脉血管床的主动脉瓣的反应性和完整性。未观察到染料进入左心室，表明主动脉瓣完整。肉眼观察，确定了染料填充到冠状动脉高达第四分支点处却未发生染料泄漏。然后，在组织切片中根据被伊文思蓝染色的血管基底膜的红色荧光确定了灌注到达大(150μm)和小(20μm)动脉和静脉。
为了确定保留了主要的心脏ECM组分，对SDS脱细胞ECM支架进行免疫荧光染色。以此确定了存在主要的心脏ECM组分，如胶原I和III、纤连蛋白和层粘连蛋白，但没有证据表明保留有完整胞核或收缩成分，包括心肌球蛋白重链或肌原纤维的α肌动蛋白。
SDS脱细胞心脏ECM的扫描电子显微照片(SEM)证明了主动脉壁和主动脉瓣小叶中保留了纤维取向和组成，而整个组织厚度内均未发现细胞。脱细胞左和右心室壁保留了ECM纤维构造(交织、支柱、螺旋)和取向，而完全除去了肌原纤维。两心室保留的ECM内，可观察到直径不同的完整血管基底膜而未观察到内皮或平滑肌细胞。而且，在完整的心外膜基底层下还保留了薄层致密的心外膜纤维。
为了评估脱细胞心脏组织的机械特性，进行了二轴测试并与在心脏组织工程学中常用作人工ECM支架的纤维蛋白凝胶进行了比较。正常大鼠心室和脱细胞样品的应力-应变行为表现出高度各向异性。相反，纤维蛋白凝胶样品中，两个主要方向上的应力-应变特性极其相似。正常大鼠心室和脱细胞组中的所有样品中均出现方向依赖性应力-应变行为，纤维蛋白凝胶组中的所有样品的典型特性是应力-应变的各向同性。
为了比较这两组间以及心脏主轴间的应力-应变特性，计算周向和纵向在40％应变下的切线模量(参见实施例5的等式)。注意到在两个方向上，所述脱细胞样品组的模量显著高于正常大鼠心室和纤维蛋白凝胶样品组。然而，正常大鼠心室和脱细胞基质的两个方向上的模量间的差异显著，而纤维蛋白凝胶则不是这样。
就完整左心室组织而言，40％应变下的应力在纵向上是5-14kPa，在周向上是15-24kPa，与之前公开的数据吻合。在大鼠心室组织和脱细胞大鼠心室组织中，周向均比纵向僵硬，这极有可能是由心脏的肌肉纤维取向所决定的。尽管随心脏组织的厚度纤维朝向会有所改变，然而，大多数纤维均呈周向，因此，可以料想，在该方向上会较为僵硬。脱细胞组织较完整组织显著更僵硬。这也可以想到，因为胞外基质比细胞本身更加僵硬，ECM和细胞的组合可能不像单单ECM如此僵硬。尽管看起来脱细胞组织的切线模量值相当大，它们也只是略大于纯化弹性蛋白的杨氏模量(约600kPa)和小于单胶原纤维的杨氏模量(5Mpa)，从而本文所确定的值处于合理的范围内。
实施例8-对其它器官或组织脱细胞
除了大鼠心脏、肺、肾脏和肝脏外，将本文所述的灌注脱细胞方法应用于骨骼肌、胰腺、小和大肠、食管、胃、脾脏、脑、脊髓和骨骼中都可以获得类似的结果。
实施例9-对猪肾脏脱细胞
从施用过肝素的雄性动物分离猪肾脏。为了对分离器官进行灌注，对肾动脉插管，用PBS灌注15分钟以上洗掉血液。在50-100mmHg压力下，用27L含1％SDS的去离子水灌注35.5小时。用含1％Triton-X的去离子水开始灌注来除去ECM支架上的SDS。然后用含有抗生素的PBS灌注脱细胞肾120小时进行洗涤和缓冲，以除去去污剂，使pH具有生物相容性。
在开始灌注2小时内观察器官清晰度。灌注12小时内变为显著的清晰白色。当器官变成白色半透明状时终止脱细胞。
实施例10-对脱细胞心脏进行移植
准备工作是对F344大鼠心脏主动脉瓣远端的主动脉进行插管，除肺动脉干左支(其分支的远端)和下腔静脉(IVC)外结扎其它所有大血管和肺血管。采用兰道夫逆行动脉灌注方法，用2升1％SDS灌注12-16小时以上完成脱细胞。然后用35mL1％Triton-X-100灌注30-40分钟使心脏复性，然后用含有抗生素和抗真菌剂的PBS洗涤72小时。移植前结扎IVC。
准备一只大(380-400克)RNU大鼠用来移植入该脱细胞心脏。用钝角蚊式夹夹住宿主动物的IVC和腹主动脉来隔离吻合区。用8-0缝合丝线将脱细胞心脏的主动脉与宿主肾支近端和下方的腹主动脉吻合。将脱细胞心脏的肺干左支与宿主IVC最接近的部分吻合，使肺干的物理压力最小化。
当两血管均以缝合进宿主动物后，松开夹子，宿主动物的血液充盈到脱细胞心脏内。在脱细胞心脏和主动脉中目测观察受体动物的腹主动脉压。脱细胞心脏由于充入血液而变得膨胀和鲜红。吻合位点出血最少。松开夹子后3分钟(开始灌注)施用肝素，对心脏拍照和将其置于腹部以减小吻合部位的压力。以无菌方式闭合腹部，监控该动物直至其康复。移植后55小时时，使动物安乐死，外植出脱细胞心脏进行观察。进行解剖和评估后发现在LV中未接受肝素的动物形成巨大的血栓。在心脏右侧和左侧的冠状动脉中也观察到血块。
在其它移植实验中，在两血管均缝合进宿主动物后松开夹子，宿主动物的血液充盈到脱细胞心脏中。在脱细胞心脏和主动脉中目测观察受体动物的腹主动脉压。脱细胞心脏变得膨胀和鲜红，吻合位点出血最少。松开夹子后3分钟(开始灌注)经腹膜内注射施用肝素(3000U)。对心脏拍照和将其置于腹部以减小吻合部位的压力。以无菌方式闭合腹部，监控该动物直至其康复。约移植48小时后时发现动物死于出血。目前移植时间是55-70分钟。
C组.再细胞化
实施例1-心脏ECM切片再细胞化
为了评估脱细胞ECM的生物相容性，将1mm厚的脱细胞心脏切片与肌原性和内皮细胞系一起培养。将2x 105个大鼠的骨骼成肌细胞、C2C12小鼠的成肌细胞、人脐带内皮细胞(HUVEC)和牛肺内皮细胞(BPEC)接种到组织切片上，在标准条件下共培养7天。肌原性细胞在ECM内迁移和扩增，按照原始纤维取向排列。这些肌原性细胞表现为增殖增加和ECM切片中的大部分完全再生。内皮细胞系呈现出较少侵入性的生长模式，在移植物表面形成单层。在这些条件下未发现抗增殖作用。
实施例2-通过冠状动脉灌注使心脏ECM再细胞化
为了确定通过冠状动脉灌注将再生细胞接种到脱细胞心脏ECM表面或内部的效力，将脱细胞心脏转移到器官室内，在细胞培养条件下(5％CO2，60％湿度，37℃)，持续不断地用充氧的细胞培养液进行灌注。在40cm H2O冠状动脉灌注压下，灌注进120x 106个PKH标记的HUVEC(悬于50ml内皮细胞生长培养液中)。收集冠状动脉流出物对细胞计数。然后将流出物回流，再次灌注使细胞数量最大化。重复两次回流。第三次传代后，心脏中留有约90x 106个细胞。用500ml回流的充氧内皮细胞培养液持续灌注120小时。然后取出心脏，将其放入低温保持箱。使HUVEC仅限存在于心脏范围内残留的动脉和静脉中，而不完全弥散到血管外ECM中。
实施例3-用新生大鼠心脏细胞使脱细胞大鼠心脏再细胞化
分离和准备大鼠新生心肌细胞。第一天，通过使8-10只1-3天大的SPFFisher-344初生小狗(哈伦实验室，印第安纳州印第安纳波利斯)吸入5％异氟烷(艾博特实验室(Abbott Laboratories)，伊利诺斯州北芝加哥市)而对其进行麻醉，无菌情况下对其喷射70％EtOH，快速行胸骨切开术。摘下心脏，将其立即置于冰上的含HBSS(新生心肌细胞分离系统中的试剂#1(华盛顿生物化学公司(WorthingtonBiochemical Corporation))，新泽西州雷克伍德镇)的50ml锥形管内。除去上清液，通过剧烈搅拌用冷HSS将整个心脏洗涤一次。将心脏转移到含有5ml冷HBSS的100mm培养盘中，去除结缔组织，将余下组织切成小于1mm2的碎片。另外加入HBSS使总的板内体积达到9ml，加入1ml胰蛋白酶(试剂#2，华盛顿公司试剂盒)使终浓度达到50μg/ml。在5℃冷却器中将平板培育过夜。
第二天，从冷却器中取出平板，置于冰上的无菌盖上。用广口移液管将含有组织和胰蛋白酶的缓冲液转移到冰上的50ml锥形管内。将胰蛋白酶抑制剂(试剂#3)和1mlHBSS(试剂#1)重新组合，加入到50ml锥形管内，轻柔混合。通过在液体表面上方通过空气而使组织充氧60-90秒。然后将组织温热到37℃，缓慢加入用5ml莱博维茨(Leibovitz)L-15重建的胶原酶(300单位/毫升)。将该组织置于热(37℃)振荡浴中45分钟。接着，用10ml移液管滴定组织10次以释放细胞(3ml/秒)，然后滤过0.22μm的过滤器。另外用5ml L-15培养液洗涤组织，第二次滴定，收集于相同的50ml锥形管中。然后将细胞溶液在室温下培育20分钟，50xg离心5分钟沉淀细胞。轻柔地除去上清液，用新生心肌细胞培养液使细胞再悬于所需体积。
培养液和溶液。所有培养液均经无菌过滤并避光保存于5℃冷却器中。华盛顿公司的分离试剂盒(Worthington Isolation Kit)含有用于培养的所建议培养液：莱博维茨L-15。该培养液仅用于第二天的组织处理。平板接种时采用本文所述另选的含钙培养液。华盛顿公司(Worthington)的莱博维茨L-15培养液；用1L养细胞级水重建莱博维茨培养液粉末而成。莱博维茨L-15培养液含有140mg/ml CaCl、93.68mg/ml MgCl和97.67mg/ml MgS。新生心肌细胞培养液：补充有10％胎牛血清(哈伦)、100U/ml青霉素-G(基博)、100U/ml链霉素(基博)、2mmol/L L-谷胺酰胺(伊维创)和0.1mmol/L 2-巯基乙醇(基博，分类号：21985-023)的IMDM细胞培养基(基博，商品目录号：12440-053)，使用前进行无菌过滤。按需加入两性霉素-B(终浓度为0.25μg/ml)。该培养液可以用1.2mM CaCl(费歇尔科学，商品目录号：C614-500)和0.8mM MgCl(西格玛，商品目录号：M-0250)来增强。
体外分析再细胞化培养物。作为朝创建生物人工心脏一个进步，将分离的ECM用新生心脏细胞再细胞化。将50x 106个新鲜分离的大鼠新生心肌细胞、纤维细胞、内皮和平滑肌细胞的组合注射进完全脱细胞化的心脏(如本文所述构建)中。然后将心脏组织切片，体外培养所述切片来测试所述脱细胞ECM的生物相容性和所得到的构建物发育成心肌膜环的能力。
24小时后，在显微镜下观察到得到的环内发生最低限度收缩，证明了移植的细胞能够附着和嫁接到脱细胞ECM上。显微镜下，细胞沿着ECM纤维方向生长。免疫荧光染色证实了表达心肌球蛋白重链的心肌细胞已经存活和成功嫁接。4天内，在脱细胞基质上观察到收缩性细胞膜片群落，到第8日它们将发育成同步收缩组织环。
第10天时，将这些环固定在两个测量棒之间，测量其在不同的预载荷条件下的收缩力。所述环可以被电起搏到频率为4Hz，在预载荷高达0.65g时能产生高达3mN的收缩力。因此，采用所述体外组织培养方法进行再细胞化，能获得收缩组织，它能产生与用人造ECM构建物制成的优化工程化心脏组织环所产生的等效的力。
经灌注使脱细胞心脏再细胞化。无菌心脏组织培养条件下(5％CO2，60％H2O，37℃)，将再细胞化的(50x 106新鲜分离的大鼠新生心肌细胞、纤维细胞、内皮和平滑肌细胞)支架固定于可灌注生物反应器(n＝10)上，模拟大鼠心脏生理状态，包括具有梯度增加的预载荷和后载荷(第1天：预载荷4-12mmHg，后载荷3-7mmHg)的搏动的左心室扩张，搏动的冠状血流(第1天：7ml/分钟)和电刺激(第2天：1Hz)。经灌注的器官培养要持续1-4周。在整个培养期内，每15分钟记录下30秒的压力、流量和EKG数据。细胞接种后第4、6和10天记录下新生生物人造心脏的视频。
细胞接种后第10天，进行更深入的功能评估包括将压力探针插入左心室记录左心室压(LVP)，随着刺激频率从0.1-10Hz梯度增加而记录下室壁运动的视频，和用苯肾上腺素(PE)进行药物刺激。再细胞化心脏对单次起搏呈现收缩反应，该反应是在起搏收缩和相应的LVP增加之后自发性收缩。一次起搏后，心脏表现出3次自发性收缩，然后转换成原纤态。与受刺激收缩类似，自发性去极化也会引起相应的LVP增加和可记录的QRS复合波，这可能表示形成了发育中的稳定电导模式。
一旦将刺激频率增加到0.4Hz，则在每次诱导的收缩后会平均发生两次自发性收缩；当起搏频率高达1Hz时，只发生1次自发性收缩；起搏频率是5Hz时，不发生自发性收缩。最大俘获频率是5Hz，与成熟心肌膜的250ms不应期相一致。用100μMPE灌注后，当频率是1.7Hz时会发生规律的自发性去极化，同时伴有相应的LVP增加。
在第10天进行组织学分析揭示出细胞在左心室壁的整个厚度(0.5-1.2mm)内发生分散和植入。心肌细胞沿心室纤维取向排列，形成类似成熟心肌膜的致密的组织化移植物区域和类似于发育中的心肌膜的较低密度的未成熟移植物区域。对心肌球蛋白重链免疫荧光染色确定心肌细胞表型。在整个新发育的心肌膜内维持了高密度的毛细血管，毛细血管间的平均距离约为20μm，这与报道的成熟大鼠心肌膜类似。通过免疫荧光染色血管假性血友病因子(vWF)确定了内皮细胞表型。整个移植物厚度内均保持了细胞存活，表明通过冠状动脉灌注可以提供足够的氧气和营养物质。
D组-其它脱细胞和再细胞化
实施例1-大鼠肝脏分离程序
用75mg/kg体重的氯胺酮和10mg/kg体重的赛拉嗪麻醉各只大鼠。大鼠腹部剃毛并用聚维酮碘消毒。在大鼠胃静脉内输入大剂量肝素钠(100μL肝素(1,000UI/mL储液)/100g体重)。
当肝素起效时，装配生物反应器烧瓶。简单说，在250ml烧瓶上接入泰贡(tygon)管(装在底部一侧)，在管上接上变径管接头(在下文所述的洗涤步骤中用于排水)。当肝素起效时，装配具有橡皮塞的导管；在12cc针筒中装入PBS，在针筒上接上3通活塞。在针筒上装上18号针头，推过8号橡皮塞。为了确保肝脏在容器中平铺，优选针在橡皮塞底部保持平均(even)。侧缘融化的一小段聚乙烯管(例如PE160)用酒精消毒后滑入管道的自由端。在插管内推入少量PBS排出酒精，在10cm培养皿中倒入足量PBS以盖没分离的肝脏。
肝素循环后，切开腹部皮肤，露出下方的腹部肌肉。进行中段开腹术，然后侧面横向切开或沿腹壁中线切开，接着回缩露出肝脏。轻轻(格里森氏囊很脆弱)切除将肝脏与十二指肠、胃、隔膜和腹前壁相连的韧带。切除胆总管、肝动脉和门静脉，留下足够插管的长度，最后切除肝上下腔静脉。持剩余连结的肝上下腔静脉摘除肝脏，将其置于装有PBS的培养皿中。切除任何剩余的韧带。
实施例2-肝脏脱细胞化
将准备的插管插入门静脉，用普罗林缝线打结。确认线的完整性，用针筒内的PBS(不含Mg2+和Ca2+)灌注肝脏除去潜血。将肝脏-橡皮塞置于生物反应器中。烧瓶置于收集储器上，通过足够长的管线连接1％SDS容器(1.6L)，产生最高压为约20mmHg的柱。灌注2-4小时后，倒空1％SDS容器，重新再装入1.6L 1％SDS。通常用总共4批1.6L的1％SDS灌注肝脏。脱细胞后，肝脏外观呈透明白色，可看见血管。
在第2日，断开SDS储器，换成装有dH2O的60ml针筒。水漂，然后用60ml1％Triton X-100漂洗，然后再用60ml的dH2O漂洗。漂洗后的肝脏再进行洗涤，开始通过小泵(Masterflex，50％最大容量，约1.5ml/分钟)灌注含杀菌剂(例如青霉素-链霉素(例如Pen-Strep
Figure BPA00001479852700291
))的PBS。一定长度的泰贡管从生物反应器/烧瓶接出，排入PBS储器。一定长度的管线通过泵接到与烧瓶上3通活塞连接的0.8微米滤器上。在PBS储器中的管线中接有18号针，使其比进样管线低。6小时后，换用1X浓度的新鲜PBSw/Pen-Strep再次洗涤，更换0.8微米滤器，洗涤器官过夜。
在第3日，再更换1X浓度的500ml PBSw/Pen-Strep洗涤两次。每次更换PBS时也更换0.8微米滤器。早晨开始第3次洗涤，6小时后换液，最后再次过夜洗涤。第4日，肝脏准备再细胞化。
用1.6升1％SDS洗涤两次的肝脏平均还剩有14.27％的DNA，而用1.6升1％SDS洗涤四次的肝脏平均还剩有5.36％的DNA。即1％SDS洗涤两次除去约86％DNA(与尸体相比)，而1％SDS洗涤4次除去约95％的DNA(与尸体相比)。
图3A显示了大鼠肝脏和大鼠肾脏的脱细胞化，图3B显示了大鼠心脏和大鼠肺的脱细胞化。中间部分包括了进行中的脱细胞的照片，右侧和左侧的照片是脱细胞器官的SEM图像。
图4显示了用染料灌注的脱细胞猪肾和大鼠肾，还显示了脱细胞肾脏的肾小球和肾小管的EM照片。图5显示了如本文所述脱细胞的整只大鼠尸体。
实施例3-肝脏再细胞化
如下进行再细胞化：将细胞(40x106个原代肝脏衍生的细胞或HepG2人细胞)悬浮在加温的培养液(37℃)中，浓度为约8x106个细胞/毫升(通常为5ml)，将其装入针筒。细胞通过门静脉注入置于生物反应器或培养皿中的肝脏。注意到细胞也可以通过其它脉管入口注入，或直接注入间充质。
用沃明顿酶解试剂盒酶消化成年大鼠肝脏获得原代肝脏衍生的细胞。简单说，用1X无钙无镁的汉克斯平衡盐水(试剂盒1号管)以20ml/分钟通过门静脉灌注大鼠肝脏10分钟，然后从大鼠中摘下肝脏。然后，用100ml含有MOPS缓冲液的L-15(所述缓冲液含有来自试剂盒2号和3号管的酶(胶原酶(22,500单位)弹性酶(30单位)和核酸酶I(1,000单位)))以20ml/分钟再循环肝脏10-15分钟。然后，机械破碎器官，释放细胞。100g离心细胞，再悬浮在培养液中，重复2次，然后用于再细胞化。
根据过程中观察到的迹象(例如灌注肝叶的张力，细胞从肝脏逸出，和细胞在目标肝叶中的分布)控制灌注速度。再细胞化后，将生物反应器内的肝脏置于37℃，5％CO2的温箱内。接入含氧培养液储器(含有50ml培养液)；在储器中的培养液内鼓入湿润的卡波金(95％氧，5％二氧化碳)。用蠕动泵以2-10ml/分钟的速度使培养液(37℃)再循环通过肝脏。每日更换再细胞化大鼠肝脏的培养液，持续7日(虽然实验可在方便的时候简单终止)。每日换液时，采集培养液样品，储于-20℃，以测定白蛋白和尿素。在第7日，进行细胞色素P-450实验。
图6显示了脱细胞大鼠肝脏的再细胞化。用针筒将原代肝细胞通过门静脉插管注入一片肝叶。图7显示了原代大鼠肝细胞靶向递送入脱细胞大鼠肝脏的肝尾叶(A)或肝右外侧上/下叶(B)。
图8显示了培养1周的再细胞化大鼠肝脏的扫描电镜显微照片(SEM)。这些数据显示，尸体肝脏与再细胞化肝脏在微结构水平上的相似性。细胞整合入基质床，与尸体组织新鲜分离的细胞有相似的形状。图9显示了马氏三色染色(A)和H&E(B)染色，图10A显示了尾状突内注入大鼠肝细胞1周后的再细胞化大鼠肝脏的马氏三色染色。这些结果显示，肝细胞能被递送入并保留在基质内，而且能通过灌注营养存活。
图11显示了在尾状突(A)或上/下右外侧叶(B)注入人肝细胞系(HepG2)1周后的再细胞化大鼠肝脏的马氏三色染色。图12显示了原代大鼠肝细胞(1-6)和人HepG2细胞系(7和8)的细胞保留。注射前对细胞进行计数获得灌注入肝脏的细胞总数，对流过基质并最终出现在培养皿中的未结合细胞进行计数；其差表示保留在基质中的细胞。图13显示人HepG2保持活性，并在注入脱细胞大鼠肝脏后增殖。
实施例4-肝功能
如下评估脱细胞和再细胞化肝脏的功能。
在用原代大鼠肝细胞再细胞化的肝脏中评估尿素生产(图14)；铝生产(图15)；和细胞色素P-450IAI(乙氧基异吩唑酮-O-脱乙基酶(EROD))活性(图16)。用贝特洛t/比色实验试剂盒(波音特生物科技有限公司(Pointe Scientific Inc.))测定尿素生产，用根据组织工程细胞培养(Vunjak-Novakovic & Freshney编，2006，Wiley-Liss)改进的方法测定白蛋白生产和EROD活性。这些实验显示，肝脏衍生的细胞在培养期间保持肝特异性功能。
实施例5-再细胞化后的细胞存活率
图17显示了在脱细胞心脏、肺、肝和肾上至少增殖3周的胚胎和成体衍生的干/祖细胞。通过计数DAPI-染色的核/高倍视野来确定细胞增殖。图18显示小鼠胚胎干细胞(mESC)和增殖性成体肌肉祖细胞(骨骼肌成肌细胞；SKMB)在脱细胞的心脏、肺、肝和肾上增殖。用TUNEL实验检测3周后的凋亡程度对比总DAPI染色的细胞核数测定细胞存活率。
人胚胎干细胞(ES)和人诱导的多能干细胞(iPS)在脱细胞心脏基质上至少增殖1周。简单说，在脱细胞基质上比较人ES细胞(H9，来自WiCeIl研究院；WA09，来自国家干细胞库(NSCB))；人iPS细胞的IMR90亚克隆(用OCT4，SOX2，NANOG，和LIN28慢病毒转基因如Zhang等，2009，Circ.Res.，104：e30-e41所述生成，获自威斯康星大学的Timothy Kamp博士)。
分别将H9细胞和iPS细胞(含有20-50％心肌细胞，剩余为增殖的成纤维细胞)以200,000个细胞和90,000个细胞的密度铺在含有大鼠脱细胞心脏基质的腔室特异性(右或左心房或心室)部分的孔中，这些部分已经分离，露出基质内部。将细胞简单置于脱细胞的基质上。细胞在含有20％血清的培养液中培养3日，然后血清减到2％，再培养4日，与增殖的肌肉细胞在体外“转换”成搏动的肌细胞表型一致。将对照细胞置于相同的包裹有明胶(0.1％)的孔中，在同样条件下培养。细胞在EB20培养基中生长。每日显微镜检评估培养物，用摄像机记录搏动的细胞。培养1周后，进行活/死性实验，检测细胞存活率。另外，进行免疫组织化学染色，显示心脏相关蛋白的存在。观察到在脱细胞基质上生长的细胞至第3-4日时搏动，而明胶上的细胞不搏动。第5日，基质上的细胞已经扩散，观察到更大面积的搏动细胞。在明胶上以相同条件培养的细胞中搏动稀少，或不存在。
实施例6-再细胞化过程
细胞分离
用沃明顿法分离大鼠幼仔的LV和RV，大致在心脏中央切开。丢弃从底部到第二LAD分枝的部分，剩下的部分置于约10ml HBSS中。任选可将心脏的LV和RV部分在胰蛋白酶中5℃温育过夜，达18-22小时。将细胞吸入用于注射入脱细胞基质的针筒后，剩余的细胞用作对照(例如加入10ml培养液，平铺细胞)。
胞外基质
获得充分洗涤的脱细胞胞外基质(ECM)。例如，用至少2000ml PBS溶液洗涤心脏胞外基质3-4日。用18号插管(入：左心室通过心脏瓣膜，出：主动脉)对心脏进行插管，用4-0缝线缝合。LV插管推入至靠近LV腔内的心尖(例如LV插管的尖端离瓣膜约0.7cm)。检查结构是否不存在渗漏。任选地，可在引入细胞前，通过将泵开到[心前]流动探测(模式)，流速为25-28ml/分钟，至少5-10秒，进行“高速”测试来确保密封ECM连接。
细胞注射
将100-120ml培养液置于生物反应器内，在心尖下放置60mm培养板，以接住多余的细胞，避免冠状动脉阻塞以及捣乱细胞的凋亡信号传递。用27号针和1ccTB针筒注射细胞。每次注射用和正常条件下呈15度的针头进入角度在心室壁内注入约70微升细胞。在左心室前壁内注入细胞10-12次，在心尖内注入细胞3-4次。注射的细胞总体积应该为约1.3-1.5ml。预期会有一些回流和细胞损失。将心脏下降到生物反应器中，打开泵和罐(95％O2和5％CO2)，监视心脏中的渗流、流动问题和任何其它技术问题。翌日，打开反应器，接入起搏器电极线。起搏(连续)如下开始：频率：1Hz；延迟：170MS；持续：6MS；电压范围：45-60V；流动(入)：18-22mL/分钟；流动(出)：14-18mL/分钟；扩散约6-7mL/分钟。
培养液
下列配方是对于1升而言。在IMDM中加入100mL FBS 10％；5mL Pen Strep；10mL L-Glut；168μL Amp-B；1mL B-Mercap；20mL马血清；180mg Ca2+；96mgMg2+；和50mg维生素C。
NNCM(NEO)细胞
从沃明顿试剂盒制备物中获得新生心肌细胞(NNCM或NEO细胞)。NEO细胞对温度敏感；如果温度下降到低于约35℃，它们不会搏动。如果没有过度汇合，NEO细胞在2D板上24小时内就开始搏动。随着NEO细胞生长和搏动，它们开始在彼此顶部生长，并开始同步搏动；最终细胞自身机械限制并停止搏动，通常在第10-16日间。
实施例7-脱细胞和再细胞化器官与尸体器官的结构比较
图19是脱细胞心脏(右侧)和尸体心脏(左侧)的SEM照片。获得左心室(LV)和右心室(RV)的SEM照片。如照片所见，灌注脱细胞的心脏缺乏细胞成分，但保留包括血管在内的完整心肌的空间和结构特征。另外，在灌注脱细胞的基质中，可以看到基质内虽然完全丧失细胞，但仍然保留了结构特征，包括波纹(w)，卷曲(c)和层(s)。
图20显示了本文所述脱细胞和再细胞化的大鼠肝脏(右侧)与尸体大鼠肝脏(左侧)间的组织学(顶部)和SEM(底部)比较。这些结果说明来自完整肝脏的健康干细胞和培养或接种于脱细胞肝脏上的肝细胞之间的形态相似性和结构组织。H&E图像显示再细胞化肝脏中的细胞开始围绕血管组织成放射状，与新鲜分离的健康(尸体)肝脏中所观察到的构造相似。还说明细胞在整个间充质中分布和/或迁移，开始组织并且只要实验继续都维持在基质内。SEM图像证明尸体和再细胞化基质中甚至在超结构水平上细胞组织也是相似的。
E组.灌注脱细胞化相比浸润脱细胞化
实施例1-用浸润脱细胞化
用本文所述的灌注法对器官(大鼠肝脏、肾、心脏、肺、肌肉、皮肤、骨骼、大脑和脉管；猪肝脏、胆囊、肾脏和心脏)脱细胞。
用美国专利号6,753,181和6,376,244中所述的浸润方法对器官(大鼠肝脏、心脏和肾脏)脱细胞。简单说，将器官置于dH2O中，用100rpm旋转的磁性搅棒4℃搅拌48小时，然后将器官转移到氢氧化铵(0.05％)和Triton X-100(0.5％)溶液中，继续用磁性搅棒(100rpm)搅拌溶液48小时。更换溶液，如需要重复用氢氧化铵和Triton X-100浸润48小时，使器官脱细胞(通常目测无细胞的器官)。对肝脏大约要重复用5次氢氧化铵和Triton X-100，以产生目测无细胞的器官。脱细胞过程后，将器官转移到dH2O中，搅拌48小时(仍然在100rpm下搅拌)；最后，用PBS在4℃进行终洗涤并搅拌。
实施例2-灌注和浸润的比较
图21A显示了灌注脱细胞的猪肝脏的照片，图21B和21C分别显示了灌注脱细胞的猪肝脏的脉管和间充质基质的SEM。这些照片显示灌注脱细胞器官中血管和基质的完整性。另一方面，图22显示了浸润脱细胞的大鼠肝脏的全视图，其中在低倍(左侧)和高倍(右侧)放大下都可见基质剥落。
图23显示了浸润脱细胞的大鼠肝脏(A和B)和灌注脱细胞的大鼠肝脏(C和D)的SEM。这些结果清楚地表明浸润脱细胞使得器官囊(格里森氏囊)显著受损，而灌注脱细胞保留了囊。另外，图24显示浸润脱细胞肝脏(A为H&E染色；B为三色染色)和灌注脱细胞肝脏(C为H&E染色；D为三色染色)的组织学。浸润脱细胞的大鼠肝脏在注射后不能保留细胞或染料。
图25显示大鼠心脏浸润脱细胞化(顶栏)和灌注脱细胞化(底栏)之间的比较。左栏的照片显示完整器官。如这两张照片可见，灌注脱细胞器官(下左)比浸润脱细胞的器官(上左)透明得多，后者保留了尸体肌肉组织富含铁的“棕红”色，看上去仍然含有细胞。中栏的照片显示了脱细胞组织的H&E染色模式。染色显示，在浸润脱细胞后(上中)，保留了间充质和血管壁中的许多细胞，而灌注脱细胞(下中)后几乎所有细胞和细胞碎片都被去除，甚至未闭合的血管也很明显。另外，右栏中的扫描电子显微图显示浸润(上右)和灌注(下右)脱细胞化后基质的超结构中有显著差异。而且，在浸润脱细胞心脏的全部壁中均观察到心肌横截面中细胞成分的完全保留，而在灌注脱细胞的心脏中这些细胞成分几乎完全丧失，而且还保留了包括血管在内的完整心肌的空间和构造特征。例如，灌注脱细胞的基质保留了基质内的构造特征，包括波纹(w)、卷曲(c)和层(s)，而细胞却完全丧失。
图26显示用大鼠肾脏浸润脱细胞化(顶栏)和灌注脱细胞化(底栏)之间的比较。与心脏不同，浸润脱细胞的整个肾脏(上左)看起来和灌注脱细胞的整个肾脏(下左)基本相似，都相当透明。然而，在灌注脱细胞的肾脏中，灌注脱细胞器官内的血管网络更加明显，而且比浸润脱细胞的构造中可见的分枝程度更高。另外，灌注脱细胞的肾脏保留了完整器官囊，被系膜包围，如所示能够和附着的肾上腺一起进行脱细胞。中栏的照片显示了两种组织的H&E染色模式。染色显示细胞组分和/或碎片以及可能甚至完整的核(染成紫色)在浸润脱细胞后(上中)仍然保留，而灌注脱细胞(下中)后几乎每一个细胞和/或所有细胞碎片都被除去。同样，SEM照片显示浸润脱细胞的肾脏基质(上右)比灌注脱细胞的肾脏基质(下右)受损严重得多。在浸润脱细胞的肾脏中，器官囊缺失或受损，因此表面的“孔”或基质剥落很明显，而在灌注脱细胞的器官中囊是完整的。
图27显示了脱细胞肾脏的SEM照片。图27A显示了灌注脱细胞的肾脏，而图27B显示了浸润脱细胞的肾脏。图28A显示了灌注脱细胞的心脏SEM照片，而图28B显示了浸润脱细胞的心脏的SEM照片。图29显示了浸润脱细胞的肝脏的SEM照片。这些图像进一步证明浸润脱细胞对器官的超结构造成的损伤和灌注脱细胞后基质的存活。
其他实施方式
应理解，虽然本发明已结合其详述进行描绘，但以上描述是用于说明而不是限制本发明的范围，该范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优势和修改在以下权利要求的范围内。

Claims (16)

1.一种制造肝脏的方法，包括：
提供脱细胞肝脏，其中所述脱细胞肝脏包含所述肝脏的脱细胞胞外基质，其中所述胞外基质包含外表面，其中所述包括血管树的胞外基质基本维持脱细胞前的所述胞外基质的形态，其中所述胞外基质基本完整；使所述脱细胞肝脏在一定条件下与约40,000或更多的所述再生性细胞接触，在所述条件下所述细胞在所述脱细胞肝脏之内和上植入、增殖和/或分化。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述脱细胞肝脏与23x106或更多再生性细胞接触。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述脱细胞肝脏与30x106或更多再生性细胞接触。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述脱细胞肝脏与35x106或更多再生性细胞接触。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述再生性细胞是肝细胞。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述再生性细胞通过门静脉灌注入所述脱细胞肝脏。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述再生性细胞被注射入所述脱细胞肝脏。
8.一种制造肝叶的方法，包括：
提供脱细胞肝脏或含肝叶的部分，其中所述脱细胞肝脏或含肝叶的部分包含所述肝脏或含肝叶部分的脱细胞胞外基质，其中所述胞外基质包含外表面，其中所述包括血管树的胞外基质基本维持脱细胞前的所述胞外基质的形态，其中所述胞外基质基本完整；使所述脱细胞肝叶或含肝叶的部分在一定条件下与所述再生性细胞群接触，在所述条件下所述再生性细胞在所述脱细胞肝叶之内和上植入、增殖和/或分化。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述再生性细胞是原代肝细胞。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述再生性细胞通过门静脉灌注入所述肝叶。
11.一种使器官脱细胞的方法，包括：
提供所述器官；在所述器官的一个或多个空腔、血管和/或导管道插管，从而产生插管器官；用第一细胞破裂介质通过所述一个或多个插管对所述插管器官进行灌注；和确定与对应尸体器官相比留在脱细胞器官内的核酸量。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述灌注是约2-12小时/每克器官组织。
13.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述灌注步骤持续到在脱细胞器官中剩余5％或以下的核酸。
14.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述细胞破裂介质含有1％SDS。
15.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述灌注是从每个插管的空腔、血管和/或导管处多方向进行。
16.一种脱细胞的哺乳动物肾上腺，包括：
所述肾上腺的脱细胞胞外基质，其中所述胞外基质含有外表面，其中包括血管树的所述外表面基本保持脱细胞前的所述胞外基质的形态，和其中所述外表面基本完整。
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