ES2831756T3

ES2831756T3 - Uso de hígado descelularizado por perfusión para la recelularización de células de islotes

Info

Publication number: ES2831756T3
Application number: ES14721618T
Authority: ES
Inventors: Jeffrey Ross
Original assignee: Miromatrix Medical Inc
Current assignee: Miromatrix Medical Inc
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-03-13
Publication date: 2021-06-09
Anticipated expiration: 2034-03-13
Also published as: US20230293770A1; SG10201906304TA; JP2016513465A; BR112015023642A2; KR20160026839A; KR102577616B1; CA2907161A1; US20190381212A1; US11452797B2; AU2014236952B2; KR20230061578A; EP2970891A1; AU2014236952A1; KR20210090299A; CN105164250A; JP6781352B2; US10213525B2; US20160030638A1; MX2015013154A; KR102278652B1

Abstract

Un método in vitro para preparar un injerto que comprende una matriz extracelular recelularizada de un hígado de mamífero, lóbulo hepático o porción de este, que comprende: (i) seleccionar una matriz extracelular descelularizada por perfusión de un hígado de mamífero, lóbulo hepático o porción de este, que es > 8 cm3, una primera población de células de mamífero que incluya células endoteliales y una segunda población de células de mamífero que incluya células de islotes o células beta, o células madre o células iPS capaces de diferenciarse en células de islotes o células beta; y (ii) poner en contacto la matriz extracelular descelularizada por perfusión y las dos poblaciones de células bajo condiciones y durante un período de tiempo que permitan la reendotelización de la vasculatura de la matriz extracelular descelularizada por perfusión con las células endoteliales y la recelularización de la matriz extracelular descelularizada por perfusión con las células de islotes o células beta o recelularización y diferenciación y maduración funcional de las células madre o iPS en células de islotes o células beta.

Description

DESCRIPCIÓN

Uso de hígado descelularizado por perfusión para la recelularización de células de islotes

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica el beneficio de la fecha de presentación de la solicitud de los Estados Unidos No. de serie 61/789,927, presentada el 15 de marzo de 2013.

Antecedentes

La manipulación de tejidos es un campo en rápido crecimiento que busca reparar o regenerar tejidos y órganos dañados o enfermos mediante la implantación de combinaciones de células, armazones y mediadores solubles. La diferenciación actual de células madre y el cultivo de células primarias se logra generalmente bajo condiciones de cultivo bidimensionales (2D). Ese sistema permite la expansión de poblaciones celulares específicas, pero tiene una capacidad limitada para retener fenotipos celulares funcionales, para respaldar el cultivo celular de alta densidad y la función celular primaria o diferenciada a largo plazo. Por ejemplo, en contraste con la disponibilidad limitada de un gran número de células primarias necesarias para ciertas terapias celulares, el número de células madre se puede expandir enormemente mientras se conserva la capacidad de diferenciarse en linajes específicos. El control del destino de las células madre (por ejemplo, diferenciación), ya sea in vivo o in vitro, se ha atribuido principalmente a mediadores genéticos y moleculares (por ejemplo, factores de crecimiento y factores de transcripción). Aunque la diferenciación de células madre y progenitoras puede dar como resultado células con expresión génica específica de linaje o tejido apropiadas, las células diferenciadas pueden carecer de las propiedades funcionales necesarias para aplicaciones in vitro o in vivo.

Sumario de la invención

La invención proporciona un método in vitro para preparar un injerto que comprende una matriz extracelular recelularizada de un hígado de mamífero, un lóbulo hepático o porción de este como se reivindica en la reivindicación 1. En una realización, la porción es un volumen total inflado mayor o igual a aproximadamente 15 cm3. El método incluye seleccionar una matriz extracelular descelularizada por perfusión de un hígado de mamífero, un lóbulo hepático o una porción de este y dos poblaciones de células. La primera población de células de mamífero incluye células endoteliales y la segunda población de células de mamífero incluye células de islotes, células beta o células madre o células iPS capaces de diferenciarse en células de islotes o células beta. La matriz extracelular descelularizada por perfusión y las dos poblaciones de células se ponen en contacto bajo condiciones y durante un período de tiempo que permiten la reendotelización de la vasculatura de la matriz extracelular descelularizada por perfusión y la recelularización de la matriz extracelular descelularizada por perfusión con las células de islotes o células beta o recelularización y diferenciación y maduración funcional de las células madre o células iPS en células de islotes o células beta en la matriz extracelular descelularizada por perfusión. En una realización, las células de la primera y segunda poblaciones son xenogénicas para la matriz extracelular descelularizada. En una realización, las células de la primera y la segunda poblaciones son alogénicas a la matriz extracelular descelularizada. En una realización, las células de la segunda población incluyen células iPS. En una realización, las células de los islotes o las células beta están encapsuladas. En una realización, las células de la primera población, la segunda población o ambas, son células primarias. En una realización, las células de la segunda población son células madre embrionarias. En una realización, la primera población, la segunda población, o ambas, comprenden una pluralidad de diferentes tipos de células. En una realización, la matriz extracelular descelularizada por perfusión contiene una red de matriz extracelular vascular intacta. En una realización, la primera población de células se pone en contacto con la matriz extracelular por inyección o perfusión, o una combinación de estas. En una realización, la segunda población de células se pone en contacto con la matriz extracelular por inyección o perfusión, o una combinación de estas.

En una realización, la matriz extracelular es útil para implantación en un mamífero.

La matriz producida por la invención es útil para potenciar el control de la insulina en un mamífero que carece o tiene un control reducido de la insulina. La matriz reendotelizada puede prepararse introduciendo células endoteliales de mamífero y una población de células que incluye células de islotes o células beta o células madre o células progenitoras capaces de diferenciarse en células de islotes o células beta en una matriz extracelular descelularizada del hígado de los mamíferos, lóbulo del hígado o porción de este. La matriz reendotelizada que tiene la población de células que incluye células de islotes o células beta o células madre o células iPS capaces de diferenciación en células de islotes o beta, se puede introducir en un mamífero que carece o tiene un control de insulina reducido para proporcionar control de glucosa en sangre en el mamífero.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1A muestra una fotografía de un hígado porcino que fue descelularizado por perfusión.

Las Figuras 1B-C muestran una fotografía de microscopio electrónico de barrido (SEM) de un vaso y la matriz parenquimatosa, respectivamente, del hígado porcino descelularizado por perfusión.

La Figura 2 proporciona una vista general de un hígado de rata descelularizado por inmersión, en el que se puede ver el deshilacliado de la matriz con un aumento bajo (izquierda) y alto (derecha).

La Figura 3 muestra fotografías SEM de hígado de rata descelularizado por inmersión (A y B) e hígado de rata descelularizado por perfusión (C y D).

La Figura 4 muestra la histología del hígado descelularizado por inmersión (A, tinción H&E; B, tinción tricrómica) y el hígado descelularizado por perfusión (C, tinción H&E; D, tinción tricrómica)

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona la manipulación de células y ECM que, a través de interacciones físicas como también moleculares, controlan directamente el comportamiento celular controlando el entorno de esas células. En particular, la presente invención proporciona órganos y tejidos manipulados que tienen ECM de hígado descelularizado por perfusión implantado con una población de células, incluidas combinaciones de células, y sometidas a condiciones de cultivo, por ejemplo, que incluyen perfusión de mediadores solubles, cuya estructura de ECM y condiciones de cultivo dan como resultado células funcionales. En particular, la invención proporciona el crecimiento y mantenimiento funcional de células primarias, incluidas las células derivadas del feto, por ejemplo, células específicas de órganos obtenidas de células fetales o células de neonatos (por ejemplo, células que están comprometidas con un linaje específico pero que no están diferenciadas terminalmente). En contraste con el uso de la transplantación in vivo para la diferenciación de células hES en células productoras de insulina, la presente invención proporciona el uso de ECM hepática para proporcionar una estructura para células productoras de insulina o para lograr la diferenciación en células beta funcionales capaces de regular la insulina en respuesta a la estimulación de la glucosa. En una realización, las células diferenciadas de la invención tienen al menos el 20 % de la función de las células normales correspondientes in vivo.

La invención proporciona matriz extracelular (ECM) descelularizada por perfusión de hígado, lóbulo hepático o porción de este y sistemas útiles para soportar células de islotes, células beta o células tipo islotes o el mantenimiento, o diferenciación y/o maduración de células madre o iPS, a células de islotes o células beta, o cualquier combinación de estas, en las matrices. Las células primarias son células obtenidas de un organismo que luego pueden cultivarse in vitro, aunque esas células no proliferan indefinidamente. Las células diferenciadas incluyen células primarias y células que se han diferenciado in vitro, por ejemplo, células madre o células progenitoras, en una matriz descelularizada por perfusión de la invención. En una realización, al menos el 5 %, 10 % o 20 %, o más, de las células diferenciadas tienen un fenotipo funcionalmente maduro. Un tejido es un grupo de células con una estructura y función comunes, por ejemplo, tejido epitelial, tejido conectivo, tejido muscular (músculo esquelético, cardíaco o liso) y tejido nervioso, e incluye una lámina flexible que cubre, o recubre o conecta órganos. Un órgano es una colección de tejidos (dos o más) unidos en una unidad estructural para cumplir una función común. Como se usa aquí, una porción de un hígado, un lóbulo hepático y un hígado incluyen estructuras vascularizadas.

En una realización, la presente invención proporciona el uso de un armazón de ECM 3D derivado del hígado para células de islotes, células tipo islotes o células beta, células madre y/o mantenimiento de células iPS, y para células madre y tipos de células iPS, diferenciación y/o maduración en células de islotes, células tipo islotes o células beta. La diferenciación es un proceso mediante el cual las células adquieren un nuevo fenotipo que es distinto de la población celular original, por ejemplo, expresión y/o función o funciones de proteínas y/o genes celulares distintos. La maduración aclara aún más que el fenotipo de la población celular tiene la capacidad funcional madura normal de una célula en una población celular in vivo. En una realización, el armazón es un lóbulo hepático ECM descelularizado por perfusión, por ejemplo, una porción de una ECM hepática. En otra realización, el armazón es un hígado ECM descelularizado por perfusión. Dichos armazones pueden emplearse para manipular sistemas de administración de tipos de células heterólogas para terapia.

La ECM descelularizada por perfusión de órganos o tejidos como el hígado o los lóbulos del hígado retiene más de la microestructura nativa, incluido un sistema vascular y/o microvascular intacto, en comparación con otras técnicas de descelularización como la descelularización a base de inmersión. Por ejemplo, la ECM descelularizada por perfusión de hígado o lóbulos del hígado conserva el contenido de colágeno y otros factores de enlace y señalización y estructura de vasculatura, proporcionando así un entorno para la reendotelización de células introducidas. En una realización, la ECM descelularizada por perfusión del hígado, el lóbulo del hígado o una porción de este se perfunde con células endoteliales en el medio utilizando la vasculatura de la ECM descelularizada por perfusión bajo condiciones apropiadas, que incluyen la presión y el flujo apropiados para imitar las condiciones que normalmente se encuentran en el organismo. Las presiones normales de los órganos de tamaño humano están entre aproximadamente 20 y aproximadamente 200 mm Hg, y la rata de flujo resultante depende del diámetro del vaso de perfusión entrante.

En una realización, la invención proporciona un método para preparar un injerto de órgano o tejido in vitro a partir de una matriz y células descelularizadas por perfusión, por ejemplo, células que se diferencian en tipos celulares funcionales específicos. El método incluye seleccionar una matriz descelularizada por perfusión de un órgano o tejido, por ejemplo, de un mamífero no humano, y poblaciones de células, por ejemplo, células xenogénicas o alogénicas, incluidas las células progenitoras capaces de diferenciarse a tipos celulares presentes en un órgano o tejido nativo. La matriz descelularizada por perfusión seleccionada se pone en contacto con la población o poblaciones de células que pueden incluir células progenitoras bajo condiciones y durante un período de tiempo que proporcionan la recelularización de la matriz descelularizada por perfusión y diferenciación de células en la población a células funcionales.

El método de la invención puede verse como un método para preparar un sistema de administración que contiene células de islotes que tiene una matriz descelularizada por perfusión de un hígado, lóbulo del hígado o porción de este y células de islotes, células tipo islotes o células beta, o células que se diferencian en células de islotes, células tipo islotes o células beta. La matriz descelularizada por perfusión se pone en contacto con una población de células endoteliales y células que incluyen células de islotes, células beta, células tipo islotes, células iPS y/o células madre bajo condiciones y durante un período de tiempo que proporcionan la reendotelización y funcionamiento de células de islotes en la matriz. En una realización, las células madre son células madre embrionarias (ES), por ejemplo, células ES humanas. En una realización, las células madre son células madre adultas.

En una realización, en los métodos de la invención se emplea una porción de una ECM de hígado o lóbulo hepático. En una realización, la porción tiene un espesor de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 mm. En una realización, la porción tiene un espesor de aproximadamente 70 a aproximadamente 100 mm.

En una realización, las células madre o iPS se siembran en un armazón de ECM de hígado descelularizado por perfusión y se cultivan durante un tiempo y bajo condiciones que dan como resultado la reendotelización. En una realización, las células endoteliales se siembran sobre un armazón de ECM de hígado descelularizado por perfusión durante un tiempo y bajo condiciones que dan como resultado la reendotelización. En otra realización, se siembran células pancreáticas parcialmente diferenciadas derivadas de células ES o iPS en un armazón de ECM de hígado descelularizado por perfusión y se cultivan durante un tiempo y bajo condiciones que dan como resultado células alfa, células PP, células delta, células épsilon y/o células beta, completamente funcionales, por ejemplo, donde las células alfa producen glucagón, células beta producen insulina y amilina, células delta producen somatostatina, células PP producen polipéptido pancreático, células épsilon producen grelina. En otra realización, las células pancreáticas diferenciadas se siembran en un armazón de ECM hepático descelularizado por perfusión durante un tiempo y bajo condiciones que dan como resultado células alfa, células PP, células delta, células épsilon y/o células beta completamente funcionales, por ejemplo, donde células alfa producen glucagón, células beta producen insulina y amilina, células delta producen somatostatina, células PP producen polipéptido pancreático, células épsilon producen grelina. En una realización, el cultivo da como resultado que más del 35 % de las células expresen insulina en respuesta a la estimulación de glucosa. En otra realización, células de islotes o células beta se encapsulan en alginato antes de la administración al injerto de hígado reendotelizado.

Las matrices descelularizadas por perfusión de órganos con un sistema vascular sustancialmente cerrado son particularmente útiles porque la descelularización por perfusión preserva la matriz y el microambiente intactos, incluido un sistema vascular y microvascular intacto, que el sistema vascular puede utilizarse para administrar células, así como nutrientes y/o diferenciación o factores de mantenimiento, a las células in vitro. Un sistema de vasculatura "sustancialmente cerrado" con respecto a un órgano significa que, tras la perfusión con un líquido, la mayor parte del líquido está contenido dentro del órgano sólido y no se escapa del órgano sólido, asumiendo que los vasos principales están canulados, ligados, o de otra manera restringidos. A pesar de tener un sistema de vasculatura "sustancialmente cerrado", los órganos tienen vasos de "entrada" y "salida" definidos que son útiles para introducir y mover el líquido por todo el órgano durante la perfusión. Las células y nutrientes y/u otros factores pueden administrarse por otros medios, por ejemplo, inyección o medios pasivos, o una combinación de estos. En una realización, se perfunde una población de células de interés en la ECM del órgano descelularizado por perfusión que permite la siembra en el espacio intersticial o la matriz fuera de los conductos vasculares. Esto incluye la migración activa y/o la conducción de células a su microestructura nativa, por ejemplo, la conducción de las células endoteliales a la vasculatura. En una realización, una población de células endoteliales se perfunde en el ECM descelularizado por perfusión de hígado, lóbulo del hígado o una porción de este seguido de una segunda población de células, por ejemplo, una población de células beta, donde las células endoteliales permanecen en los conductos vasculares como en su microambiente nativo. En otra realización, se combinan y perfunden juntas dos o más poblaciones de células. En otra realización, se introducen en serie dos o más poblaciones de células distintas mediante perfusión, inyección directa o una combinación de ambas. Por ejemplo, células de islotes o células tipo islotes pueden introducirse en una matriz hepática descelularizada por perfusión, ya sea mediante perfusión o inyección seguida de la siembra de células endoteliales. En otra realización, la matriz de hígado descelularizada por perfusión se siembra con células endoteliales fetales. En otra realización, células endoteliales se siembran en la matriz seguidas de las células de islotes.

Las células pueden introducirse en medios que apoyen la proliferación, metabolismo y/o diferenciación de las células. Alternativamente, después de que las células hayan poblado la ECM, el medio se cambia a uno que apoye la proliferación, metabolismo y diferenciación de las células. Las células cultivadas pueden existir en la ECM a densidades celulares fisiológicas y, en presencia de medios que apoyan la proliferación, metabolismo y/o diferenciación de las células y/o el microambiente apropiado en la ECM, permiten el mantenimiento y/o diferenciación funcional de las células.

En una realización, las células beta parcialmente diferenciadas cultivadas en una matriz hepática descelularizada por perfusión dan como resultado células capaces de regular y liberar insulina con respecto a diversos activadores eléctricos o de glucosa.

Las células y la ECM pueden ser xenogénicas o alogénicas. En una realización, se pueden combinar células humanas parcial o completamente diferenciadas y un órgano o tejido descelularizado por perfusión de un animal pequeño, por ejemplo, un mamífero no humano tal como un cerdo inmaduro. En un ejemplo, una matriz de hígado descelularizada por perfusión de un ser humano o un cerdo se siembra con células de islotes derivadas de ES humano parcialmente diferenciadas que proporcionan matrices sembradas de células alogénicas o xenogénicas, respectivamente. En una realización, las células beta diferenciadas de la matriz liberan insulina en respuesta a la estimulación de la glucosa. En una realización, las células y el órgano o tejido descelularizado por perfusión son alogénicos. En una realización, las células y la matriz descelularizada por perfusión son xenogénicas. En una realización, las dos poblaciones de células, por ejemplo, células endoteliales y células de islotes, son del mismo organismo. En una realización, las dos poblaciones de células, por ejemplo, células endoteliales y células de islotes, son alogénicas. En una realización, las dos poblaciones de células, por ejemplo, células endoteliales y células de islotes, son xenogénicas. En una realización, las células de la matriz incluyen células humanas y la matriz descelularizada por perfusión es de un mamífero no humano.

En una realización, la invención proporciona un método para proporcionar células maduras in vitro. El método incluye proporcionar una matriz recelularizada de la invención; y permitir la diferenciación o maduración de las células en la matriz. En una realización, la matriz es de un hígado, lóbulo hepático o porción de este de un porcino, bovino, equino, canino, felino, caprino, primate no humano o humano. En una realización, las células de la matriz son células beta funcionales. En una realización, las células beta diferenciadas de la matriz liberan insulina en respuesta a la estimulación de la glucosa. En una realización, las células y el órgano o tejido descelularizado por perfusión son alogénicos. En una realización, las células y la matriz descelularizada por perfusión son xenogénicas. En una realización, las células de la matriz incluyen hepatocitos humanos y la matriz descelularizada por perfusión es de un mamífero no humano.

ECM descelularizada por perfusión

Los estudios han demostrado que las células del tejido conectivo se comportan de manera muy diferente en los cultivos 3D a diferencia de los cultivos 2D (Cukierman et al., Science, 294:1708 (2001)). Por ejemplo, el cultivo de fibroblastos en sustratos planos induce una polaridad que no ocurre in vivo. Además, cuando los fibroblastos y otros tipos de células se cultivan en matrices derivadas de tejido 3D, desarrollan en minutos, complejos de adhesión focal maduros que contienen integrinas que se asemejan a los complejos encontrados in vivo, mientras que solo los complejos de adhesión primitivos se desarrollan en cultivos 2D o incluso geles de colágeno o Matrigel de tipo I 3D simple. Estos complejos de adhesión son necesarios para la señalización adecuada del receptor activado por factor de crecimiento y el inicio rápido (en 5 minutos) de la síntesis de sus propios componentes de ECM y factores que alteran la ECM (Cukierman et al., 2001; Abbott, Nature, 424:870 (2003)). Además, las células en cultivo de ^eC^mdepositan factores de crecimiento autocrinos en matrices derivadas de tejidos, un proceso que puede ser necesario para la presentación adecuada del factor de crecimiento a células diana. Estos factores se secretan principalmente al medio de cultivo en cultivos 2D.

Como se mencionó anteriormente, las interacciones físicas con la ECM, además de factores químicos, moleculares (por ejemplo, mediadores solubles) o genéticos (tipo celular), pueden regular el destino celular. Por ejemplo, el control de la célula con base en la ECM puede ocurrir a través de múltiples mecanismos físicos, como la geometría de la ECM a micro y nanoescala, elasticidad de la ECM o señales mecánicas transmitidas desde la ECM a las células.

La invención incluye el uso de ECM hepáticas manipuladas descelularizadas por perfusión que permiten una estructura altamente vascularizada para soportar células de islotes, células beta o células tipo islotes, por ejemplo, de células madre adultas o embrionarias. Las matrices descelularizadas por perfusión de la invención imitan la naturaleza intrincada y altamente ordenada de la vasculatura ECM nativa y la probable interacción recíproca entre células y la ECM. En particular, la ECM puede proporcionar señales vasculares específicas a células madre o progenitoras. En particular, distintas proteínas de matriz pueden ser importantes para la especificidad de ECM a través de su contribución a la arquitectura de la ECM o mediante su capacidad para interactuar con factores de crecimiento y/o las propias células residentes.

La descelularización por perfusión de ECM de tejido u órgano proporciona una ECM intacta que tiene la capacidad de proporcionar las propiedades estructurales, bioquímicas y mecánicas para permitir la diferenciación y mantenimiento celular funcional. Por lo tanto, la descelularización por perfusión de órganos permite que los órganos sirvan como un biorreactor específico de tejido/órgano para la diferenciación de células madre o progenitoras. Además, la descelularización por perfusión de ECM de órganos o tejidos es superior a la inmersión en términos de preservar una matriz intacta con señales estructurales y bioquímicas, incluida la vasculatura intacta. Además, la descelularización por perfusión proporciona ventajas con respecto a la descelularización por inmersión cuando el grosor del tejido u órgano excede aproximadamente 2 mm de grosor.

Descelularización de órganos o tejidos

La descelularización generalmente incluye las siguientes etapas: estabilización del órgano sólido, por ejemplo, una estructura vascularizada del mismo, o tejido, descelularización del órgano o tejido sólido, renaturalización y/ o neutralización del órgano o tejido sólido, lavado del órgano sólido, degradación de cualquier ADN que quede en el órgano, desinfección del órgano o tejido y homeostasis del órgano.

La etapa inicial para descelularizar una estructura o tejido vascularizado de un órgano es canular el órgano o tejido. Los vasos, conductos y/o cavidades de un órgano o tejido pueden canularse usando métodos y materiales conocidos en la técnica. A continuación, el órgano canulado, estructura vascularizada o tejido se perfunden con un medio de alteración celular. La perfusión a través de un órgano puede ser multidireccional (por ejemplo, anterógrada y retrógrada).

La perfusión de Langendorff de un corazón es rutinaria en la técnica, al igual que la perfusión fisiológica (también conocida como perfusión en modo de funcionamiento de cuatro cámaras). Véase, por ejemplo, Dehnert, The Isolated Perfused Warm-Blooded Heart According to Langendorff, In Methods in Experimental Physiology and Pharmacology: Biological Measurement Techniques V. Biomesstechnik-Verlag March GmbH, West Germany, 1988.

Brevemente, para la perfusión de Langendorff, la aorta se canula y se une a un depósito que contiene una solución fisiológica para permitir que el corazón funcione fuera del cuerpo durante un período de tiempo especificado. Para lograr la descelularización por perfusión, el protocolo se ha modificado para perfundir un medio de alteración celular administrado en una dirección retrógrada hacia abajo de la aorta a una rata de flujo constante administrado, por ejemplo, por una infusión o una bomba de rodillo o por una bomba de presión hidrostática constante. En ambos casos, las válvulas aórticas se cierran a la fuerza y el fluido de perfusión se dirige hacia los orificios coronarios (perfundiendo, por vía anterógrada, toda la masa ventricular del corazón), que luego drena hacia la aurícula derecha a través del seno coronario. Para la perfusión en modo de trabajo, se conecta una segunda cánula a la aurícula izquierda y la perfusión se puede cambiar a retrógrada.

En una realización, una solución fisiológica incluye regulador fosfato salino (PBS). En una realización, la solución fisiológica es un regulador fisiológicamente compatible suplementado con, por ejemplo, suplementos nutricionales (por ejemplo, glucosa). Para el hígado, la solución fisiológica puede ser regulador Krebs-Henseleit que tiene NaCl 118 mM, KCl 4.7 mM, MgSO4 1.2 mM, KH2PO4 1.2 mM, NaHCO3 26 mM, glucosa 8 mM y CaCh 1.25 mM suplementado con BSA al 2 %. Para injertos de hígado reendotelizados con islotes o células beta, la solución fisiológica puede ser medio 1 Miami modificado suplementado con o sin prolactina o medio de cultivo de tejidos CMRL 1066 modificado que contenga: suero bovino fetal al 10 %, HEPES 25 mM, 100 unidades/ml de penicilina y 100 |jg/ml de estreptomicina, pH 7.4 con o sin VEGF.

Se conocen en la técnica métodos para perfundir otros órganos o tejidos. A modo de ejemplo, las siguientes referencias describen la perfusión de pulmón, hígado, riñón, cerebro y extremidades. Van Putte et al., Ann. Thorac. Surg., 74(3):893 (2002); den Butter et al., Transpl. Int., 8:466 (1995); Firth et al., Clin. Sci. (Lond.), 77(6):657 (1989); Mazzetti et al., Brain Res., 999(1):81 (2004); Wagner et al., J. Artif. Organs, 6(3):183 (2003).

Se pueden usar uno o más medios de alteración celular para descelularizar un órgano o tejido. Un medio de alteración celular generalmente incluye al menos un detergente tal como, pero sin limitarse a, SDS, PEG, CHAPS o Triton X. Un medio de alteración celular puede incluir agua de manera que el medio sea osmóticamente incompatible con las células. Alternativamente, un medio de alteración celular puede incluir un regulador (por ejemplo, PBS) para compatibilidad osmótica con las células. Los medios de alteración celular también pueden incluir enzimas tales como, sin limitación, una o más colagenasas, una o más dispasas, una o más DNasa o una proteasa tal como tripsina. En algunos casos, los medios de alteración celular también o alternativamente pueden incluir inhibidores de una o más enzimas (por ejemplo, inhibidores de proteasa, inhibidores de nucleasa y/o inhibidores de colegenasa).

En determinadas realizaciones, un órgano o tejido canulado puede perfundirse secuencialmente con dos medios de alteración celular diferentes. Por ejemplo, el primer medio de alteración celular puede incluir un detergente aniónico como SDS y el segundo medio de alteración celular puede incluir un detergente iónico como Triton X. Después de la perfusión con al menos un medio de alteración celular, se puede perfundir un órgano o tejido canulado, por ejemplo, con soluciones de lavado y/o soluciones que contienen una o más enzimas como las divulgadas aquí.

La alternancia de la dirección de perfusión (por ejemplo, anterógrada y retrógrada) puede ayudar a descelularizar todo el órgano o tejido. La descelularización generalmente descelulariza el órgano de adentro hacia afuera, lo que da como resultado muy poco daño a la ECM. Un órgano o tejido puede descelularizarse a una temperatura adecuada entre 4 y 40 ° C. Dependiendo del tamaño y peso de un órgano o tejido y del detergente o detergentes particulares y de la concentración de detergente o detergentes en el medio de alteración celular, un órgano o tejido generalmente se perfunde de aproximadamente 0.05 horas a aproximadamente 5 horas, por gramo de órgano o tejido sólido (generalmente > 50 gramos), o aproximadamente 2 horas a aproximadamente 12 horas, por gramo de órgano sólido o tejido para órganos (generalmente < 50 gramos), con medio de alteración celular. Incluyendo lavados, se puede perfundir un órgano durante aproximadamente 0.75 horas a aproximadamente 10 horas por gramo de órgano o tejido sólido (generalmente > 50 gramos), o aproximadamente 12 horas a aproximadamente 72 horas, por gramo de tejido (generalmente < 50 gramos). El tiempo de descelularización depende de la densidad vascular y celular del órgano o tejido con escalado limitado para la masa general. Por lo tanto, como orientación general, se proporcionan los intervalos de tiempo y las masas anteriores. La perfusión generalmente se ajusta a condiciones fisiológicas, incluido el flujo pulsátil, rata y presión.

Un órgano o tejido descelularizado tiene el componente de matriz extracelular (ECM) de todas o la mayoría de las regiones del órgano o tejido, incluidos los componentes de ECM del árbol vascular. Los componentes de la ECM pueden incluir cualquiera o todos los siguientes: fibronectina, fibrilina, laminina, elastina, miembros de la familia del colágeno (por ejemplo, colágeno I, III y IV), proteínas de crecimiento asociadas a ECM que incluyen factores de crecimiento y citocinas, glicosaminoglicanos, sustancia de base, fibras reticulares y trombospondina, que pueden permanecer organizadas como estructuras definidas como la lámina basal. La descelularización exitosa se define como la ausencia de miofilamentos, células endoteliales, células de músculo liso y núcleos detectables en cortes histológicos mediante procedimientos de tinción histológica estándar o eliminación de más del 97 % del ADN detectable medido por ensayo fluorimétrico. Los restos de células residuales pueden eliminarse del órgano o tejido descelularizado.

La morfología y la arquitectura de la ECM se mantienen durante y después del proceso de descelularización. "Morfología", como se usa aquí, se refiere a la forma general del órgano, tejido o de la ECM, mientras que "arquitectura", como se usa aquí, se refiere a la superficie exterior, la superficie interior y la ECM entre ellas.

La morfología y arquitectura de la ECM se pueden examinar visual y/o histológicamente. Por ejemplo, la lámina basal de la superficie exterior de un órgano sólido o dentro de la vasculatura de un órgano o tejido no debe eliminarse ni dañarse significativamente debido a la descelularización por perfusión. Además, las fibrillas de la ECM deben ser similares a o sin cambios significativos, de las de un órgano o tejido que no ha sido descelularizado.

Se pueden aplicar uno o más compuestos en o sobre un órgano o tejido descelularizado para, por ejemplo, preservar el órgano descelularizado, o para preparar el órgano o tejido descelularizado para recelularización y/o para ayudar o estimular las células durante el proceso de recelularización. Dichos compuestos incluyen, pero no se limitan a, uno o más factores de crecimiento (por ejemplo, VEGF, DKK-1, FGF, BMP-1, BMP-4, SDF-1, IGF, HGF, activina A, ácido retinoico y bFGF,), agentes inmunomoduladores (por ejemplo, citocinas, glucocorticoides, antagonista de IL2R, antagonistas de leucotrieno), químicos (N-óxido de clozapina, inhibidor de fosfoinositido-3-quinasa y nicotinamida) y/o factores que modifican la cascada de coagulación (por ejemplo, aspirina, proteínas de enlace a heparina y heparina). Además, un órgano o tejido descelularizado puede tratarse adicionalmente con, por ejemplo, irradiación (por ejemplo, UV, gamma) para reducir o eliminar la presencia de cualquier tipo de microorganismo que permanezca sobre o en un órgano o tejido descelularizado.

Ejemplo de descelularización por perfusión del corazón

Protocolo de descelularización PEG

Los corazones se lavan en 200 ml de PBS que contienen 100 U/ml de penicilina, 0.1 mg/ml de estreptomicina, 0.25 |jg/ml de anfotericina B, 1000 U de hepatina y 2 mg de Adenocard sin recirculación. Luego, los corazones se descelularizan con 35 ml de polietilenglicol (PEG; 1 g/ml) durante hasta 30 minutos con recirculación manual. A continuación, se lava el órgano con 500 ml de PBS durante un máximo de 24 horas utilizando una bomba para recirculación. La etapa de lavado se repite al menos dos veces durante al menos 24 horas cada vez. Los corazones se exponen a 35 ml de DNasa I (70 U/ml) durante al menos 1 hora con recirculación manual. Los órganos se lavan de nuevo con 500 ml de PBS durante al menos 24 horas.

Protocolo de descelularización con Triton X y tripsina

Los corazones se lavan en 200 ml de PBS que contiene 100 U/ml de penicilina, 0.1 mg/ml de estreptomicina, 0.25 jg/ml de anfotericina B, 1000 U de hepatina y 2 mg de adenocard durante al menos aproximadamente 20 minutos sin recirculación. A continuación, los corazones se descelularizan con tripsina al 0.05 % durante 30 minutos seguido de perfusión con 500 ml de PBS que contiene Triton-X al 5 % e hidróxido de amonio al 0.1 % durante aproximadamente 6 horas. Los corazones se perfunden con agua desionizada durante aproximadamente 1 hora y luego se perfunden con PBS durante 12 horas. A continuación, los corazones se lavan 3 veces durante 24 horas cada vez en 500 ml de PBS utilizando una bomba para recirculación. Los corazones se perfunden con 35 ml de DNasa I (70 U/ml) durante 1 hora con recirculación manual y se lavan dos veces en 500 ml de PBS durante al menos aproximadamente 24 horas cada vez usando una bomba para recirculación.

Protocolo de descelularización con SDS al 1 %

Los corazones se lavan en 200 ml de PBS que contiene 100 U/ml de penicilina, 0.1 mg/ml de estreptomicina, 0.25 |jg/ml de anfotericina B, 1000 U de hepatina y 2 mg de adenocard durante al menos aproximadamente 20 minutos sin recirculación. Los corazones se descelularizan con 500 ml de agua que contiene SDS al 1 % durante al menos aproximadamente 6 horas usando una bomba para recirculación. A continuación, los corazones se lavan con agua desionizada durante aproximadamente 1 hora y se lavan con PBS durante aproximadamente 12 horas. Los corazones se lavan tres veces con 500 ml de PBS durante al menos aproximadamente 24 horas cada vez usando una bomba para recirculación. A continuación, el corazón se perfunde con 35 ml de DNasa I (70 U/ml) durante aproximadamente 1 hora usando recirculación manual y se lava tres veces con 500 ml de PBS durante al menos aproximadamente 24 horas cada vez usando una bomba para recirculación.

Protocolo de descelularización con Triton X

Los corazones se lavan con 200 ml de PBS que contiene 100 U/ml de penicilina, 0.1 mg/ml de estreptomicina, 0.25 jg/ml de anfotericina B, 1000 U de hepatina y 2 mg de adenocard (adenosina) durante al menos aproximadamente 20 minutos sin recirculación. Luego, los corazones se descelularizan con 500 ml de agua que contiene Triton X al 5 % e hidróxido de amonio al 0.1 % durante al menos 6 horas utilizando una bomba para recirculación. A continuación, los corazones se perfunden con agua desionizada durante aproximadamente 1 hora y luego con PBS durante aproximadamente 12 horas. Los corazones se lavan mediante perfusión con 500 ml de PBS 3 veces durante al menos 24 horas cada vez utilizando una bomba para recirculación. A continuación, los corazones se perfunden con 35 ml de DNasa I (70 U/ml) durante aproximadamente 1 hora usando recirculación manual y se lavan tres veces en 500 ml de PBS durante aproximadamente 24 horas cada vez.

Los corazones se pueden perfundir a una presión de perfusión coronaria de 60 cm H2O. Aunque no es necesario, los corazones pueden montarse en una cámara de descelularización y sumergirse por completo y perfundirse con PBS que contenga antibióticos durante 72 horas en modo de recirculación a un flujo continuo de 5 ml/minuto para enjuagar tantos componentes celulares y detergente como sea posible.

Detección de descelularización

La descelularización exitosa puede medirse por la falta de ácido nucleico en secciones histológicas. La preservación exitosa de estructuras vasculares puede evaluarse mediante perfusión con azul de Evans al 2 % antes de incrustar secciones de tejido. Se puede observar una descelularización altamente eficiente cuando un órgano se perfunde primero en sentido anterógrado con un detergente iónico (sodio-dodecil-sulfato al 1 % (SDS), aproximadamente 0.03 M) disuelto en H2O desionizada a una presión de perfusión coronaria constante y luego se perfunde en sentido anterógrado con un detergente no iónico (Triton X-100 al 1%) para eliminar el SDS y presumiblemente para renaturalizar las proteínas de la matriz extracelular (ECM). De manera intermitente, el órgano puede perfundirse en sentido retrógrado con solución regulada con fosfato para limpiar los capilares y vasos pequeños obstruidos.

Para demostrar estructuras vasculares intactas después de la descelularización, se puede teñir un órgano descelularizado mediante perfusión Langendorff con azul de Evans para teñir la membrana basal vascular y cuantificar la densidad macro y microvascular. Además, las partículas de poliestireno se pueden perfundir en y a través de un órgano para cuantificar el volumen, el nivel de fuga del vaso y evaluar la distribución de la perfusión mediante el análisis de efluentes y secciones de tejido. Se evalúa una combinación de tres criterios y se compara con un órgano aislado no descelularizado: 1) una distribución uniforme de partículas de poliestireno, 2) un cambio significativo en la filtración en algún nivel 3) densidad microvascular.

Ejemplo de descelularización por perfusión del hígado

Para el aislamiento del hígado, la vena cava se expone a través de una laparotomía media, se diseca y se canula utilizando una cánula aórtica de ratón (Radnoti Glass, Monrovia, CA). La arteria y la vena hepáticas y el conducto biliar se seccionaron y el hígado se extrajo cuidadosamente del abdomen y se sumergió en PBS estéril (Hyclone, Logan, Utah) para minimizar la fuerza de tracción en la vena porta. 15 minutos de perfusión de PBS heparinizado son seguidos de 2-12 horas de perfusión con SDS al 1 % (Invitrogen, Carlsbad, CA) en agua desionizada y 15 minutos de Triton-X al 1 % (Sigma, St. Louis, MO) en agua desionizada. A continuación, el hígado se perfunde continuamente con antibiótico que contiene PBS (100 U/ml de penicilina-G (Gibco, Carlsbad, CA), 100 U/ml de estreptomicina (Gibco, Carlsbad, CA), 0.25 jg/ml de anfotericina B (Sigma, St. Louis, MO)) durante 124 horas. 120 minutos de perfusión SDS seguidos de perfusión con Triton-X 100 son suficientes para generar un hígado completamente descelularizado. La tinción con pentacromo Movat del hígado descelularizado confirma la retención de la organización hepática característica con la vena central y espacio portal que contiene la arteria hepática, conducto biliar y vena porta.

Recelularización de órganos o tejidos

Un órgano o tejido descelularizado se pone en contacto con una población de células, ya sean células diferenciadas (maduras o primarias), células madre o células parcialmente diferenciadas. Por lo tanto, las células pueden ser células totipotentes, células pluripotentes o células multipotentes, y pueden no estar comprometidas o comprometidas, y pueden ser células de un solo linaje. Las células pueden ser células indiferenciadas, células parcialmente diferenciadas o células completamente diferenciadas, incluidas células derivadas de fetos. Las células pueden incluir células progenitoras, células precursoras o células madre derivadas de "adultos" que incluyen células del cordón umbilical y células madre fetales. Las células útiles en las matrices de la invención incluyen células madre embrionarias y células iPS.

Los ejemplos de células que se pueden usar para recelularizar un órgano o tejido incluyen, sin limitación, células madre embrionarias, células sanguíneas del cordón umbilical, células madre o progenitoras derivadas de tejido, células madre o progenitoras derivadas de médula ósea, células madre o progenitoras derivadas de sangre, células madre mesenquimales (MSC), células derivadas del músculo esquelético, células progenitoras adultas multipotentes (MAPC) o células iPS. Las células adicionales que se pueden utilizar incluyen células madre cardíacas (CSC), células madre derivadas de cardíacas adultas multipotentes, fibroblastos cardíacos, células endoteliales de microvasculatura cardíaca, células endoteliales aórticas, células endoteliales coronarias, células endoteliales microvasculares, células endoteliales venosas, células endoteliales arteriales, células del músculo liso, cardiomiocitos, hepatocitos, células beta, queratinocitos, fibras de Purkinji, neuronas, célula epitelial del conducto biliar, células de islotes, neumocitos, células clara, células del borde en cepillo o podocitos. Las células madre derivadas de la médula ósea, como células mononucleares de la médula ósea (BM-MNC), células madre o progenitoras endoteliales o vasculares, y células madre derivadas de la sangre periférica, como células progenitoras endoteliales (EPC), también se pueden utilizar como células.

El número de células que se introducen en y sobre un armazón descelularizado por perfusión puede depender tanto del órgano (por ejemplo, cual órgano, el tamaño y peso del órgano) o tejido y el tipo y etapa de desarrollo de las células regenerativas. Los diferentes tipos de células pueden tener diferentes tendencias en cuanto a la densidad de población que alcanzarán esas células. De manera similar, se pueden celularizar diferentes órganos o tejidos a diferentes densidades. A modo de ejemplo, un órgano o tejido descelularizado se puede "sembrar" con al menos aproximadamente 1,000 (por ejemplo, al menos 10,000, 100,000, 1,000,000, 10,000,000 o 100,000,000) células; o puede tener desde aproximadamente 1,000 células/mg de tejido (peso húmedo, por ejemplo, antes de la descelularización) hasta aproximadamente 10,000,000 células/mg de tejido (peso húmedo) unidas al mismo.

Las células se pueden introducir ("sembrar') en un órgano o tejido descelularizado mediante inyección en una o más ubicaciones. Además, se puede introducir más de un tipo de célula en un órgano o tejido descelularizado. Por ejemplo, se puede inyectar una población de tipos de células diferenciadas en múltiples posiciones en un órgano o tejido descelularizado o se pueden inyectar diferentes tipos de células en diferentes porciones de un órgano o tejido descelularizado. Alternativamente, o además de la inyección, se pueden introducir células o un cóctel de células mediante perfusión en un órgano o tejido descelularizado canulado. Por ejemplo, las células se pueden perfundir en un órgano descelularizado usando un medio de perfusión, que luego se puede cambiar a un medio de expansión y/o diferenciación para inducir el crecimiento y/o diferenciación de las células. La diferenciación específica de la ubicación se puede lograr colocando células en las diversas ubicaciones dentro del órgano, por ejemplo, en regiones del corazón, tales como auricular, ventricular o nodal.

Durante la recelularización, un órgano o tejido se mantiene bajo condiciones en las que al menos algunas de las células pueden multiplicarse y/o diferenciarse dentro y sobre el órgano o tejido descelularizado. Esas condiciones incluyen, sin limitación, la temperatura y/o presión apropiadas, actividad eléctrica y/o mecánica, fuerza, las cantidades apropiadas de O2 y/o CO2, una cantidad apropiada de humedad y condiciones estériles o casi estériles. Durante la recelularización, el órgano o tejido descelularizado y las células regenerativas unidas al mismo se mantienen en un entorno adecuado. Por ejemplo, las células pueden requerir un suplemento nutricional (por ejemplo, nutrientes y/o una fuente de carbono como glucosa), hormonas exógenas o factores de crecimiento y/o un pH particular.

Las células pueden ser alogénicas para un órgano o tejido descelularizado (por ejemplo, un órgano o tejido descelularizado humano sembrado con células humanas), o las células pueden ser xenogénicas para un órgano o tejido descelularizado (por ejemplo, un órgano o tejido descelularizado de cerdo sembrado con células humanas). "Alogénico" como se usa aquí se refiere a células obtenidas de la misma especie de la que se originó el órgano o tejido (por ejemplo, individuos emparentados o no emparentados), mientras que "xenogénico" como se usa aquí se refiere a células obtenidas de una especie diferente a la de que originó el órgano o tejido.

El medio madre o progenitor puede contener una variedad de componentes que incluyen, por ejemplo, medio KODMEM (medio de Eagle modificado de Knockout Dulbecco), DMEM, medio F12 de Ham, FBS (suero bovino fetal), FGF2 (factor de crecimiento de fibroblastos 2), KSR o hLIF (factor inhibidor de leucemia humana). Los medios de diferenciación celular también pueden contener suplementos como L-Glutamina, NEAA (aminoácidos no esenciales), P/S (penicilina/estreptomicina), N2, B27 y beta-mercaptoetanol. Se contempla que se pueden añadir factores adicionales a los medios de diferenciación celular, incluidos, pero no limitándose a, fibronectina, laminina, heparina, sulfato de heparina, ácido retinoico, miembros de la familia del factor de crecimiento epidérmico (EGF), miembros de la familia del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) que incluye FGF2, FGF7, FGF8 y/o FGF10, miembros de la familia del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento transformante (TGF)/proteína morfogenética ósea (BMP)/factor de crecimiento y diferenciación (GDF) factor antagonistas de familia que incluyen, pero no se limitan a, nogina, folistatina, cordina, gremlina, proteínas de la familia cerberus/DAN, ventropina, activina en dosis altas y sin amnios o variantes o fragmentos funcionales de los mismos. También podrían añadirse antagonistas de t Gf/BMP/GDF en forma de quimeras Fc de receptor de TGF/BMP/GDF. Otros factores que pueden añadirse incluyen moléculas que pueden activar o inactivar la señalización a través de la familia de receptores Notch, incluidas, pero no limitándose a, proteínas de las familias tipo Delta y Jagged, así como inhibidores del procesamiento o escisión de Notch, o variantes o fragmentos funcionales de los mismos. Otros factores de crecimiento pueden incluir miembros de la familia del factor de crecimiento tipo insulina (IGF), insulina, la familia del factor relacionado wingless (WNT) y la familia del factor hedgehog o variantes o fragmentos funcionales de la misma. Se pueden agregar factores adicionales para promover la proliferación y supervivencia de madre/progenitor del mesendodermo, madre/progenitor del endodermo, madre/progenitor del mesodermo o madre/progenitor definitivo del endodermo, así como la supervivencia y diferenciación de los derivados de estos progenitores.

En una realización, las matrices descelularizadas de perfusión se combinan con células iPS o ES diferenciadas usando el método de cuerpo embrioide (EB). Por ejemplo, se utilizan líneas celulares iPS humanas reprogramadas por transducción, por ejemplo, transducción mediada por lentivirales, de factores de transcripción (OCT4, SOX2, NANOG y LIN28; Oct3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc; o Oct3/4, Sox2, y Klf4). Pueden emplearse clones de iPS de origen fetal o de origen de recién nacido. También se pueden emplear líneas de células ES humanas. Las células iPS y células ES pueden mantenerse en fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) irradiados a una densidad de 19,500 células/cm2 en placas de cultivo de 6 pozos (Nunc) en medio de cultivo DMEM/F12 complementado con un sustituto de suero KnockOut al 20 % (Invitrogen), 0.1 mmol/L de aminoácidos no esenciales, 1 mmol/L de L-glutamina y 0.1 mmol/L de p-mercaptoetanol (Sigma). Además, el medio puede complementarse con 100 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos básico de pez cebra para células iPS y con 4 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos básico recombinante humano (Invitrogen) para células hES. Las líneas de células iPS y ES también se pueden mantener en placas gelatinizadas de 100 mm en DMEM (Sigma-Aldrich) que contiene suero de ternero fetal al 15 % (FCS; Sigma-Aldrich), 0.1 pmol/L de 2-mercaptoetanol (2ME) y 1,000 unidades/ml de LIF (Chemicon International). Para la diferenciación, estas células pueden tratarse con tripsina al 0.25 %/ácido etilendiaminotetraacético (GIBCO) y transferirse a placas gelatinizadas de 6 pozos en medio esencial a-mínimo (GIBCO) complementado con FCS al 10 % y 0.05 pmol/L de 2ME, a una concentración de 3 x 104 células/pozo.

Las colonias pueden separarse de las placas de cultivo incubando con 1 mg/ml de solución de dispasa (Gibco) a 37 ° C durante 8 a 15 minutos y colocadas en placas de fijación ultrabaja en cultivo en suspensión, por ejemplo, durante 4 días. Durante el cultivo en suspensión, el medio puede cambiarse el día 1 seguido de cultivo durante otros 3 días sin cambio de medio. A continuación, los EB se siembran en placas de cultivo recubiertas de gelatina al 0.1 %, por ejemplo, a la densidad de 50 a 100 EB por pozo, o en la ECM descelularizada por perfusión y se cultivan en medio de diferenciación (por ejemplo, se cambian diariamente).

En algunos casos, un órgano o tejido generado por los métodos descritos aquí es adecuado para ser trasplantado a un paciente. En esos casos, las células utilizadas para recelularizar un órgano o tejido descelularizado pueden obtenerse del paciente de manera que las células sean "autólogas" para el paciente. Las células de un paciente se pueden obtener, por ejemplo, de sangre, médula ósea, tejidos u órganos en diferentes etapas de vida (por ejemplo, prenatal, neonatal o perinatalmente, durante la adolescencia o como adulto) usando métodos conocidos en la técnica. Alternativamente, las células utilizadas para recelularizar un órgano o tejido descelularizado pueden ser singénicas (es decir, de un gemelo idéntico) al paciente, las células pueden ser células compatibles con el antígeno linfocitario humano (HLA) de, por ejemplo, un pariente del paciente o un individuo compatible con HLA no relacionado con el paciente, o las células pueden ser alogénicas para el paciente de, por ejemplo, un donante no compatible con HLA.

Independientemente de la fuente de las células (por ejemplo, autólogas o no), el órgano sólido descelularizado puede ser autólogo, alogénico o xenogénico para un paciente.

El progreso de las células se puede monitorizar durante la recelularización. Por ejemplo, el número de células sobre o en un órgano o tejido puede evaluarse tomando una biopsia en uno o más puntos de tiempo durante la recelularización. Además, la cantidad de diferenciación que han experimentado las células se puede monitorizar determinando si están presentes o no diversos marcadores en una célula o una población de células. Los marcadores asociados con diferentes tipos de células y diferentes etapas de diferenciación para esos tipos de células se conocen en la técnica y pueden detectarse fácilmente usando anticuerpos e inmunoensayos estándar. Véase, por ejemplo, Current Protocols in Immunology, 2005, Coligan et al., Eds., John Wiley & Sons, Capítulos 3 y 11. Pueden usarse ensayos de ácido nucleico, así como evaluación morfológica y/o histológica para monitorizar la recelularización.

Ejemplo de diferenciación del linaje de células pancreáticas

Tras la activación de Pdx1 y Ptfla, los progenitores del endodermo inducen el destino pancreático. Los progenitores pancreáticos dan lugar a progenitores ductales, acinos y endocrinos (estos últimos dan lugar a células secretoras de £ (grelina), PP (péptido pancreático), p, a (glucagón) y 8 (somatastatina)). A continuación, los progenitores endocrinos se diferencian (Ngn3, Hnf6 y Hnfl) en diferentes células secretoras de hormonas, a, p, 8, PP y £. Los factores de transcripción clave involucrados en las diferentes etapas de la formación de células beta son Pax4, Arx, Nkx2.2, Nkx6.1, Pdx1 y Mafa.

Las ES humanas son capaces de diferenciación parcial, por ejemplo, en linajes de endodermo pancreático o epitelio pancreático temprano o fetal, caracterizados por la coexpresión de PDX1, FOXA2, HNF6 y NKX6-1, por ejemplo, el día 12, de diferenciación in vitro.

Para obtener un sistema de vasculatura "sustancialmente cerrado" con respecto a un órgano significa que, tras la perfusión con un líquido, la mayor parte del líquido está contenido dentro del órgano sólido y no se escapa del órgano sólido, asumiendo que los vasos principales se canulan, ligan o se restringen de otro modo. A pesar de tener un sistema de vasculatura "sustancialmente cerrado", muchos de los órganos enumerados anteriormente tienen vasos de "entrada" y "salida" definidos que son útiles para introducir y mover el líquido a través del órgano durante la perfusión, cultivo celular y trasplante. Se emplean células beta funcionales, armazón de ECM pancreático perfundible para apoyar la diferenciación de células beta en un entorno de cultivo 3D definido. La matriz descelularizada perfundida permite la perfusión a través de la red vascular intacta, mientras que otras tecnologías de descelularización interrumpen la red vascular y la matriz extracelular, por lo que no permiten la perfusión.

El protocolo de diferenciación de células beta puede ser como se describe en D'Amour et al, Nat. Biotech., 24:1392 (2006), pero con modificaciones en dos de las etapas. La primera modificación elimina la ciclopamina (inhibidor de Hedgehog) y sustituye a KGF por FGF10 durante la etapa 2 (días 4-6). La otra modificación, en la etapa 3, sustituye a Noggin por FGFlO. El protocolo de diferenciación completo es el siguiente. Iniciado en los días 4-6 después del pase (dependiendo de la densidad del cultivo), se realizan cambios de medio diarios secuenciales para todo el protocolo de diferenciación. Después de un breve lavado en PBS (con Mg/Ca), las células se cultivan en RPMI (sin FBS), activina A (100 ng/ml) y Wnt3a (25 ng/ml) durante el primer día. Al día siguiente, el medio se cambia a RPMI con FBS al 0.2 % vol/vol y activina A (100 ng/ml), y las células se cultivan durante 2 días adicionales. A continuación, las células se lavan brevemente con PBS (con Mg/Ca) y luego se cultivan en RPMI con FBS al 2 % vol/vol y KGF (25-50 ng/mL) durante 3 días. El medio se cambia a DMEM con suplemento de B27 al 1 % vol/vol, ciclopamina KAAD (0.25 M), ácido retinoico todo trans (RA, 2 M) y nogina (50 ng/ml) durante 3 días. El medio se cambia a DMEM con suplemento de B27 al 1 % vol/vol durante 3 días.

Alternativamente, se emplean líneas de células ES humanas de referencia H1 y H9 y fibroblastos embrionarios de ratón. El medio de cultivo de células ES humanas incluye DMEM/F12 (Invitrogen) con remplazo de suero Knockout (KSR) al 20 % (Invitrogen) que contiene 8 ng/ml de bFGF (Invitrogen), aminoácidos no esenciales (1:100, Invitrogen), 1-Glutamina 4 mM, 2-mercaptoetanol 0.1 mM (Invitrogen), penicilina/estreptomicina (1:100, Invitrogen); almacenar a 4 ° C.

El medio de diferenciación de células ES humanas incluye (a) Medio químico definido (CDM): IMDM al 50 % (Invitrogen) más mezcla de nutrientes F12 al 50 % (Invitrogen), complementado con insulina-transferrina-selenio-A (1:100, Invitrogen), monotioglicerol 450 mM (Sigma) y 5 mg/ml de fracción V de albúmina (Sigma). (b) Medio de maduración de islotes (IMM):DMEM/F12, Insulina-Transferrina-Selenio-A fracción V (Sigma). Los factores para la diferenciación de células ES humanas a células productoras de insulina son: Activina A (Sistema de R&D) 50-100 ng/ml, ácido retinoico todo trans (Sigma) 10-6M, 10 ng/ml de bFGF (Invitrogen) y Nicotinamida (Sigma) 10 mM.

Las líneas celulares de hES de referencia se mantienen siguiendo un protocolo típico. Antes de la inducción, las células hES se dividen, por ejemplo, como 1;3 (60 % de confluencia) y se vuelven a sembrar en placas de cultivo de tejidos, por ejemplo, placas de cultivo de tejidos recubiertas con Matrigel al 1 %, o se introducen en ECM. Las células hES se incuban con medio de cultivo hES durante la noche para su unión.

Las células ES humanas de referencia indiferenciadas se cultivan en primer lugar en CDM que contiene activina A durante 4 días. Luego, las células diferenciadas se indujeron adicionalmente con RA en CDM durante 4 días y se transfirieron del medio de cultivo CDM al medio de maduración de islotes DMEM/F12 con bFGF añadido como un factor de maduración de células pancreáticas durante 3 días. Finalmente, las células diferenciadas se cambian a medio de maduración de islotes DMEM/F12 que contiene bFGF y nicotinamida durante otros 5 días. Para inducir la diferenciación de las células ES humanas en células endodérmicas definitivas, el medio se cambia a medio CDM o DMEM/F12 con 50-100 ng/ml de activina A. Después de una diferenciación de 4 días, las células ES humanas se inducen adicionalmente con 10'6M RA en medio CDM o DMEM/F12 durante otros 4 días para células específicas de linaje pancreático. Para las células productoras de insulina, las células específicas del linaje pancreático se tratan con activina A y RA y luego se transfieren del medio CDM o DMEM/F12 a ⁱM^mque contiene 10 ng/ml de bFGF como un factor de maduración de células pancreáticas durante 3 días. Las células diferenciadas se cambian a IMM que contiene nicotinamida 10 mM y 10 ng/ml de bFGF durante otros 3-7 días para la maduración de las células productoras de insulina.

Sistema controlado para descelularizar y/o recelularizar un órgano o tejido

Un sistema (por ejemplo, un biorreactor) para descelularizar y/o recelularizar un órgano o tejido generalmente incluye al menos un dispositivo de canulación para canular un órgano o tejido, un aparato de perfusión para perfundir el órgano o tejido a través de la cánula o cánulas, y medios (por ejemplo, un sistema de contención) para mantener un ambiente estéril para el órgano o tejido. La canulación y perfusión son técnicas bien conocidas en la técnica. Un dispositivo de canulación incluye generalmente un tubo hueco de tamaño apropiado para introducirlo en un vaso, conducto y/o cavidad de un órgano o tejido. Normalmente, uno o más vasos, conductos y/o cavidades se canulan en un órgano. Un aparato de perfusión puede incluir un recipiente para contener el líquido (por ejemplo, un medio de alteración celular) y un mecanismo para mover el líquido a través del órgano (por ejemplo, una bomba, presión de aire, gravedad) a través de una o más cánulas. La esterilidad de un órgano o tejido durante la descelularización y/o recelularización se puede mantener usando una variedad de técnicas conocidas en la técnica tales como controlar y filtrar el flujo de aire y/o perfundir con, por ejemplo, antibióticos, antifúngicos u otros antimicrobianos para prevenir el crecimiento de microorganismos no deseados.

Un sistema para descelularizar y recelularizar órganos o tejidos como se describe aquí puede poseer la capacidad de monitorizar ciertas características de perfusión (por ejemplo, presión, volumen, patrón de flujo, temperatura, gases, pH), fuerzas mecánicas (por ejemplo, movimiento de la pared ventricular y estrés) y estimulación eléctrica (por ejemplo, medida de pasos). Como el lecho vascular coronario cambia durante el curso de descelularización y recelularización (por ejemplo, resistencia vascular, volumen), un aparato de perfusión regulado por presión es ventajoso para evitar grandes fluctuaciones. La eficacia de la perfusión se puede evaluar en el efluente y en secciones de tejido. El volumen de perfusión, patrón de flujo, temperatura, presiones parciales de O2 y CO2 y pH se pueden monitorizar mediante métodos estándar.

Se pueden usar sensores para monitorizar el sistema (por ejemplo, biorreactor) y/o el órgano o tejido. Las mediciones de sonomicromentría, micromanometría y/o conductancia se pueden utilizar para adquirir información de presión-volumen o el trabajo sistólico reclutable por precarga relativa al movimiento y rendimiento de la pared del miocardio. Por ejemplo, se pueden usar sensores para monitorizar la presión de un líquido que se mueve a través de un órgano o tejido canulado; la temperatura ambiente en el sistema y/o la temperatura del órgano o tejido; el pH y/o la rata de flujo de un líquido que se mueve a través del órgano o tejido canulado; y/o la actividad biológica de un órgano o tejido recelularizante. Además de tener sensores para monitorizar tales características, un sistema para descelularizar y/o recelularizar un órgano o tejido también puede incluir medios para mantener o ajustar tales características. Los medios para mantener o ajustar tales características pueden incluir componentes tales como un termómetro, un termostato, electrodos, sensores de presión, válvulas de rebose, válvulas para cambiar la rata de flujo de un líquido, válvulas para abrir y cerrar conexiones de fluido a soluciones utilizadas para cambiar el pH de una solución, un globo, un marcapasos externo y/o una cámara de cumplimiento. Para ayudar a garantizar condiciones estables (por ejemplo, temperatura), las cámaras, depósitos y tubos se pueden tener una camisa exterior de agua.

Un sistema para generar un órgano o tejido puede ser controlado por un medio de almacenamiento legible por ordenador en combinación con un procesador programable (por ejemplo, un medio de almacenamiento legible por ordenador como se usa aquí tiene instrucciones almacenadas en el mismo para hacer que un procesador programable realice etapas particulares). Por ejemplo, tal medio de almacenamiento, en combinación con un procesador programable, puede recibir y procesar información de uno o más de los sensores. Dicho medio de almacenamiento, junto con un procesador programable, también puede transmitir información e instrucciones al biorreactor y/o al órgano o tejido.

Se puede monitorizar la actividad biológica de un órgano o tejido sometido a recelularización. La actividad biológica puede ser la del propio órgano o tejido tal como tejido cardíaco, actividad eléctrica, actividad mecánica, presión mecánica, contractilidad y/o tensión de la pared del órgano o tejido. Además, la actividad biológica de las células unidas al órgano o tejido puede monitorizarse, por ejemplo, para la actividad de transporte/intercambio de iones, división celular y/o viabilidad celular. Véase, por ejemplo, Laboratory Textbook of Anatomy and Physiology (2001, Wood, Prentice Hall) y Current Protocols in Cell Biology (2001, Bonifacino et al., Eds, John Wiley & Sons). Como se mencionó anteriormente, puede ser útil simular una carga activa en un órgano durante la recelularización. Se puede usar un medio de almacenamiento legible por ordenador de la invención, en combinación con un procesador programable, para coordinar los componentes necesarios para monitorizar y mantener una carga activa en un órgano o tejido.

En una realización, el peso de un órgano o tejido puede introducirse en un medio de almacenamiento legible por ordenador como se describe aquí, que, en combinación con un procesador programable, puede calcular los tiempos de exposición y las presiones de perfusión para ese órgano o tejido particular. Dicho medio de almacenamiento puede registrar la precarga y la postcarga (la presión antes y después de perfusión, respectivamente) y la rata de flujo. En esta realización, por ejemplo, un medio de almacenamiento legible por ordenador en combinación con un procesador programable puede ajustar la presión de perfusión, la dirección de perfusión y/o el tipo de solución de perfusión mediante una o más bombas y/o controles de válvula.

La invención se describirá adicionalmente en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones.

Ejemplo 1

Comparación de perfusión frente a inmersión

La Figura 1A muestra una fotografía de un hígado porcino que fue descelularizado por perfusión, y las Figuras 1B y 1C muestran el SEM de un vaso y la matriz parenquimatosa, respectivamente, del hígado porcino descelularizado por perfusión. Estas fotografías muestran los conductos vasculares y la integridad de la matriz de un órgano descelularizado por perfusión. Por otro lado, la Figura 2 muestra una vista general de un hígado de rata descelularizado por inmersión, en el que se puede ver el deshilachado de la matriz con un aumento tanto bajo (izquierda) como alto (derecha).

La Figura 3 muestra el SEM de hígado de rata descelularizado por inmersión (A y B) e hígado de rata descelularizado por perfusión (C y D). Estos resultados indican claramente que la descelularización por inmersión comprometió significativamente la cápsula del órgano (cápsula de Glisson), mientras que la descelularización por perfusión retuvo la cápsula. Además, la Figura 4 muestra la histología del hígado descelularizado por inmersión (A, tinción H&E; B, tinción tricrómica) e hígado descelularizado por perfusión (C, tinción H&E; D, tinción tricrómica). El hígado de rata descelularizado por inmersión no retuvo células ni pigmento tras la inyección.

Ejemplo 2

Las células de islotes se han trasplantado al hígado o riñón a través de la vena porta o debajo de la cápsula, respectivamente, para proporcionar un lecho vascularizado para las células de islotes. Sin embargo, la eliminación de esas células, por ejemplo, después de que dejan de producir insulina o son objeto de rechazo, no es factible. Las ventajas de preparar los injertos descritos aquí incluyen, pero no se limitan a, la fácil extracción del injerto, el injerto se puede preparar ex vivo, lo que permite la caracterización de la preimplantación del injerto y el uso de diversas células madre y condiciones de los medios de cultivo celular que se pueden utilizar para impulsar aún más la diferenciación y/o maduración para lograr un resultado (función) deseado.

Puede emplearse un hígado, un lóbulo hepático o una porción de este descelularizado por perfusión para administrar y mantener células de islotes y/o células beta in vivo. Por ejemplo, un hígado, un lóbulo del hígado o porción de este, descelularizado por perfusión, se reendoteliza antes o después de la inyección de células de islotes o células tipo islote, donde las células tipo islote expresan marcadores tempranos relacionados con los islotes pero no son completamente funcionales y requieren maduración adicional, incluidas células regenerativas con el potencial de convertirse en una célula que responde a la insulina, incluidas las células de islotes, células tipo islotes, células beta, células tipo células beta. La siembra se puede lograr mediante inyección, perfusión o una combinación de estas. Las células productoras de insulina pueden encapsularse, por ejemplo, pero sin limitarse a, en alginato, nanorrecubrimientos biocompatibles, PEG, polisulfona, alcohol polivinílico, sulfato de dextrano de bajo peso molecular, polímeros modificados químicamente para la modificación de superficie o fotopolímeros, para evitar el rechazo inmunológico tras el trasplante con el injerto de hígado reendotelizado proporcionando apoyo vascular inmediato para la supervivencia. Puede emplearse cualquier tipo de célula endotelial y el injerto resultante trasplantarse al huésped. Además, la siembra se puede realizar antes o después del trasplante. Un injerto de hígado revascularizado proporciona un entorno bien vascularizado para las células de islotes, células tipo islotes o las células beta, proporcionando así soporte vascular y permite la regulación de insulina.

Para la reendotelización, en la divulgación, las células endoteliales y células progenitoras endoteliales se obtienen cultivando células madre embrionarias (ESC) o células madre pluripotentes inducidas (iPSC) bajo condiciones apropiadas para dirigir las células madre hacia un linaje endotelial. Las células progenitoras endoteliales son células que han comenzado a diferenciarse en células endoteliales o que tienen el potencial de hacerlo (por ejemplo, multipotentes; por ejemplo, linaje restringido; por ejemplo, células que están destinadas a convertirse en células endoteliales) pero que no se consideran células endoteliales completamente diferenciadas. Por ejemplo, las células endoteliales típicamente expresan la molécula 1 de adhesión de células endoteliales plaquetarias (PECAM1; también conocido como CD31) y también pueden expresar uno o más de los siguientes marcadores: VEGFR-1 (también conocido como Flt-1), VEGFR-2 (también conocido como Flk-1), proteína de enlace de guanilato-1 (GBP-1), trombomodulina (también conocida como CD141), VE-cadherina (también conocida como CD144), factor de von Willebrand (vWF) y molécula de adhesión intercelular 2 (ICAM-2). Generalmente, las células progenitoras endoteliales también pueden absorber LDL acetiladas y, además, pueden migrar hacia VEGF y/o formar tubos en un Matrigel.

Las ESC o iPSC se pueden cultivar adicionalmente bajo condiciones que den como resultado células endoteliales completamente diferenciadas. Adicional o alternativamente, las células endoteliales se pueden obtener de cualquier número de fuentes tales como sangre, piel, hígado, corazón, pulmón, retina y cualquier otro tejido u órgano que albergue células endoteliales. Por ejemplo, las células endoteliales representativas incluyen, sin limitación, células endoteliales sanguíneas, células endoteliales de la médula ósea, células endoteliales circulantes, células endoteliales de aorta humana, células endoteliales microvasculares del cerebro humano, células endoteliales microvasculares dérmicas humanas, células endoteliales microvasculares intestinales humanas, células endoteliales microvasculares pulmonares humanas, células endoteliales microvasculares humanas, células endoteliales sinusoidales hepáticas, células endoteliales de la vena safena humana, células endoteliales de la vena umbilical humana, células endoteliales linfáticas, células endoteliales de microvasos, células endoteliales microvasculares, células endoteliales de la arteria pulmonar, células endoteliales capilares retinianas, células endoteliales microvasculares retinianas, células endoteliales vasculares, células endoteliales de sangre de cordón umbilical y combinaciones de las mismas. Como comprenderán las personas experimentadas en la técnica, no se pretende que sea una lista exhaustiva de células endoteliales.

Las células endoteliales se pueden obtener, por ejemplo, de uno de los muchos depósitos de material biológico de todo el mundo. Véase, por ejemplo, la American Type Culture Collection (ATCC.org en la red de extensión mundial) o la International Depositary Authority of Canada (¡DAC; nml-lnm.gc.ca en la red de extensión mundial). Las células endoteliales o las células progenitoras endoteliales también pueden obtenerse del individuo que será el receptor de la matriz del tejido u órgano trasplantado. Estas células se considerarían autólogas del receptor. Además, bajo determinadas circunstancias, la relación entre la matriz de tejido u órgano y las células endoteliales o células progenitoras endoteliales puede ser alogénica (es decir, diferentes individuos de la misma especie); en otros casos, la relación entre la matriz de tejido u órgano y las células endoteliales o células progenitoras endoteliales puede ser xenogénica (es decir, individuos de diferentes especies).

Una composición que incluye células endoteliales o células progenitoras endoteliales se administra típicamente a una matriz de tejido u órgano en una solución que es compatible con las células (por ejemplo, en una composición fisiológica) bajo condiciones fisiológicas (por ejemplo, 37 ° C). Una composición fisiológica, como se menciona aquí, puede incluir, sin limitación, reguladores, nutrientes (por ejemplo, azúcares, carbohidratos), enzimas, medio de expansión y/o diferenciación, citocinas, anticuerpos, represores, factores de crecimiento, soluciones salinas o proteínas derivadas de suero. Como se usa aquí, una composición que "consiste esencialmente en” células endoteliales o células progenitoras endoteliales es una composición que está sustancialmente libre de células distintas de las células endoteliales o células progenitoras endoteliales, pero aún puede incluir cualquiera de los componentes que podrían encontrarse en una composición fisiológica (por ejemplo, reguladores, nutrientes, etc.).

Las células endoteliales o células progenitoras endoteliales pueden introducirse en un órgano o matriz de tejido mediante perfusión. Como se describe en el documento WO 2007/025233, la perfusión se produce a través de la vasculatura o estructura de tipo vasculatura del órgano o matriz tisular. La perfusión para reendotelizar una matriz de órgano o tejido debe realizarse a una rata de flujo suficiente para hacer circular la composición fisiológica de las células a través de la vasculatura; sin embargo, la perfusión para reendotelizar una matriz de tejido u órgano se realiza típicamente bajo poca o ninguna presión (por ejemplo, menos presión que la que se usa en la etapa de perfusión precelular para expandir y lavar el lecho vascular). La perfusión con las células endoteliales o células progenitoras endoteliales puede ser multidireccional (por ejemplo, anterógrada y retrógrada) para optimizar aún más la reendotelización.

El número de células endoteliales o células progenitoras endoteliales que se introducen en la vasculatura de una matriz de tejido u órgano para la reendotelización depende tanto del órgano como del tejido (por ejemplo, que órgano o tejido, el tamaño y peso del órgano o tejido, la etapa de desarrollo del órgano o tejido y/o el grado de vascularización del órgano o tejido) y el tipo y etapa de desarrollo de las células endoteliales o células progenitoras endoteliales. Además, se puede introducir más de un tipo de célula endotelial o célula progenitora endotelial (por ejemplo, un cóctel de células endoteliales o células progenitoras endoteliales) en la vasculatura de una matriz de órgano o tejido.

Las células endoteliales se pueden sembrar a una densidad conocida o estimada, o se pueden sembrar a una densidad más baja y dejar que proliferen in vitro o in vivo para alcanzar un nivel confluente. Los diferentes tipos de células endoteliales o células progenitoras endoteliales pueden tener diferentes tendencias en cuanto a la densidad de población que alcanzarán esas células y, de manera similar, diferentes matrices de órganos o tejidos pueden reendotelizarse a diferentes densidades. Simplemente a modo de ejemplo, al menos aproximadamente 100 (por ejemplo, al menos aproximadamente 103, 104, 105, 106, 107, 109 o 1010) células endoteliales o células progenitoras endoteliales, o células madre, se pueden introducir en una matriz de órgano o tejido.

Se pueden introducir otros tipos de células en la matriz extracelular junto con las células endoteliales o las células de islotes, por ejemplo, células madre mesenquimales (MSC) pueden ser útiles para estabilizar la matriz para las células endoteliales o para la sensibilización de las células de islotes sembradas en el paciente para evitar el rechazo inmunológico de islotes o células beta desprotegidas.

Para determinar si un injerto reendotelizado ha obtenido una población suficiente de células endoteliales, la densidad de las células endoteliales se puede medir controlando el medio de cultivo celular después de un tiempo específico para el consumo o acumulación de aminoácidos, vitaminas clave solubles en agua, glucosa/lactosa y oligoelementos.

Las células de islotes y/o beta o células madre o iPS se pueden inyectar y/o perfundir en un injerto de hígado completamente reendotelizado. La reendotelización después de la introducción de células de islotes o beta en la matriz descelularizada puede lograrse mediante la perfusión o inyección de células endoteliales en la matriz, por ejemplo, matriz de vasculatura, seguida de un tiempo de cultivo definido, donde la rata de proliferación, rata de crecimiento o densidad de las células endoteliales se puede monitorizar para determinar cuando el injerto está listo para la implantación.

Para introducir células de islotes o células beta en un injerto reendotelizado, las células se inyectan o perfunden en el injerto de hígado mientras se perfunde continuamente a una presión que proporciona una concentración suficiente de nutrientes a las células inyectadas. Para la introducción in vivo de células de islotes o beta en un mamífero, un mamífero puede recibir al menos 10,000 "equivalentes" de islotes por kilogramo de peso corporal.

Para determinar la funcionalidad de las células de islotes sembradas o células beta en un mamífero injertado con las células descritas anteriormente o un injerto producido ex vivo como se describió anteriormente, se mide la producción total de insulina en respuesta a una prueba de glucosa. Además, la producción de péptido C y urea puede medirse en función de las células de islotes o células beta dentro del injerto.

El injerto se puede trasplantar en cualquier parte del cuerpo, por ejemplo, para un injerto de hígado en el que la vena hepática o porta se anastomosa a una irrigación arterial y la vena hepática o portal resultante se anastomosa a una vena. Alternativamente, la arteria hepática se podría anastomosar a una irrigación arterial y la vena hepática y porta se anastomosan a una vena. En una realización, el injerto se anastomosa a un hígado.

En una realización, un hígado, lóbulo hepático o porción de este descelularizado por perfusión se reendoteliza ex vivo, por ejemplo, mediante inyección o perfusión, durante aproximadamente 1 a 6 semanas, antes de la inyección ex vivo o perfusión de células de islotes, células beta o células tipo islotes en la matriz, durante aproximadamente 1 a 2 semanas, para proporcionar un injerto. El injerto es adecuado para implantarse en un mamífero huésped. Otras células, por ejemplo, células madre mesenquimales, pueden incluirse con las células empleadas para reendotelizar el hígado, lóbulo del hígado o una porción de este, descelularizado, o incluirse con las células de islotes, células beta o células tipo islotes, o proporcionar sensibilización inmunitaria al huésped trasplantado. El injerto se prueba para determinar la producción de insulina, por ejemplo, ex vivo o in vivo, desde aproximadamente 1 a 2 semanas después de que las células de islotes o células beta se introduzcan en el injerto.

En una realización, las células de islotes, células tipo islotes o células beta se introducen ex vivo en un hígado, lóbulo hepático o porción de este descelularizado por perfusión, por ejemplo, mediante inyección o perfusión, antes de la inyección o perfusión ex vivo de células endoteliales, y el injerto recelularizado y reendotelizado resultante es adecuado para implantarse en un mamífero huésped.

Después de la introducción de células de islotes o células beta o células que son capaces de diferenciarse en esas células en la matriz, el injerto puede probarse para la producción de insulina, amilina, glucagón, somatostatina, polipéptido pancreático y/o grelina, por ejemplo, ex vivo o in vivo.

En una realización, las células se pueden sembrar utilizando la matriz extracelular de vasculatura descelularizada. Por ejemplo, se puede emplear la arteria o vena hepática o ambas para introducir células en un hígado descelularizado por perfusión.

El injerto productor de insulina reendotelizado resultante puede permitir el control de la glucosa en sangre en mamíferos que tienen una deficiencia de insulina, por ejemplo, como resultado de una enfermedad autoinmune tal como diabetes de tipo I o diabetes de tipo II donde hay una insuficiencia relativa de insulina.

Aunque en la especificación anterior, esta invención se ha descrito en relación con ciertas realizaciones preferidas de la misma, y se han establecido muchos detalles con fines ilustrativos, resultará evidente para las personas experimentadas en la técnica que la invención es susceptible a realizaciones adicionales y que algunos de los detalles aquí pueden variar considerablemente sin apartarse de las reivindicaciones.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método in vitro para preparar un injerto que comprende una matriz extracelular recelularizada de un hígado de mamífero, lóbulo hepático o porción de este, que comprende:

(i) seleccionar una matriz extracelular descelularizada por perfusión de un hígado de mamífero, lóbulo hepático o porción de este, que es > 8 cm3, una primera población de células de mamífero que incluya células endoteliales y una segunda población de células de mamífero que incluya células de islotes o células beta, o células madre o células iPS capaces de diferenciarse en células de islotes o células beta; y

(ii) poner en contacto la matriz extracelular descelularizada por perfusión y las dos poblaciones de células bajo condiciones y durante un período de tiempo que permitan la reendotelización de la vasculatura de la matriz extracelular descelularizada por perfusión con las células endoteliales y la recelularización de la matriz extracelular descelularizada por perfusión con las células de islotes o células beta o recelularización y diferenciación y maduración funcional de las células madre o iPS en células de islotes o células beta.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la matriz extracelular descelularizada por perfusión seleccionada es una matriz extracelular descelularizada por perfusión de un hígado.

3. El método de la reivindicación 1, en donde la matriz extracelular descelularizada por perfusión seleccionada es una matriz extracelular descelularizada por perfusión de un lóbulo hepático o una porción de este.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde las células de la primera y segunda poblaciones son xenogénicas o alogénicas a la matriz extracelular descelularizada, por ejemplo, en donde la matriz extracelular es de un mamífero no humano y está poblada con células humanas.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde las células de la segunda población comprenden las células iPS.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la matriz extracelular descelularizada por perfusión contiene una red vascular intacta.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde las condiciones incluyen perfundir la matriz con medios, en donde el medio contiene opcionalmente activadores o inhibidores de las rutas de diferenciación seleccionadas para proporcionar la diferenciación específica de células que incluyen activina A, ácido retinoico, bFGF, clozapina-N-óxido, inhibidor de fosfoinositido-3-quinasa, nicotinamida o una combinación de estos.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la primera población de células se pone en contacto con la matriz extracelular por inyección o perfusión, o una combinación de estas.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la segunda población de células se pone en contacto con la matriz extracelular ya sea por inyección o perfusión, o una combinación de estas.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la segunda población comprende una pluralidad de diferentes tipos de células.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde las células de islotes o beta, o las células madre o iPS están encapsuladas.

12. Una matriz recelularizada in vitro formada a partir de una matriz extracelular descelularizada por perfusión de un hígado de mamífero, lóbulo hepático o porción de este, que es > 8 cm3, siendo la vasculatura de dicha matriz reendotelizada con células endoteliales y dicha matriz siendo recelularizada para comprender células de islotes o células beta, proporcionando así células que producen insulina.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde las células de islotes son células tipo islote.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde las células beta son células tipo beta.

15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde las células madre o las células iPS son capaces de diferenciarse en células tipo islotes.

16. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde las células madre o las células iPS son capaces de diferenciarse en células tipo beta.