KR20230061578A - 섬 세포 재세포화를 위한 관류 탈세포화된 간의 용도 - Google Patents
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Abstract
본 발명은 관류 기재의 섬 세포 함유 간의 세포외 매트릭스, 섬 세포 재세포화된 세포외 매트릭스의 제조 방법, 및 이러한 재세포화된 매트릭스의 사용 방법을 제공한다.
Description
관련 출원의 상호-참조
본 출원은 2013년 3월 15일에 출원된 미국 출원 제61/789,927호의 출원일의 이익을 주장하며, 상기 출원의 개시내용은 본원에 참고로 도입된다.
조직 유전자조작은 세포, 스캐폴드 및 가용성 매개자의 조합물의 이식을 통해 손상되거나 질환에 걸린 조직 및 기관을 복구 또는 재생하는 것을 추구하는 급속하게 성장하고 있는 분야이다. 현재 줄기 세포 분화 및 일차 세포 배양은 일반적으로 2차원 (2D) 배양 조건 하에서 달성된다. 그 시스템은 특정 세포 집단의 확대를 허용하지만, 고밀도 세포 배양 및 장기 일차 또는 분화된 세포 기능을 지원하기 위해 기능적 세포 표현형을 보유하는 그의 능력에 있어서 제한된다. 예를 들어, 특정 세포 요법에 필요한 다수의 일차 세포의 제한된 이용가능성과 대조적으로, 줄기 세포의 수는 특정 혈통으로 분화되는 능력을 보유하면서 크게 확대될 수 있다. 생체내 또는 시험관내에서의 줄기 세포 거동 (예를 들어, 분화)의 제어는 주로 유전적 및 분자 매개자 (예를 들어, 성장 인자 및 전사 인자)에 기인되었다. 줄기 및 전구 세포 분화는 적절한 혈통- 또는 조직-특이적 유전자 발현을 갖는 세포를 초래할 수 있지만, 분화된 세포는 시험관내 또는 생체내 적용에 필요한 기능적 특성이 결핍될 수 있다.
[선행기술문헌]
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ㆍ BASAK E. UYGUN ET AL, "Decellularization and Recellularization of Whole Livers", JOURNAL OF VISUALIZED EXPERIMENTS, (2011-02-04), no. 48
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발명의 요약
본 발명은 포유동물 간, 간엽(liver lobe) 또는 그의 일부분의 재세포화된 세포외 매트릭스를 포함하는 이식편의 제조 방법을 제공한다. 일 실시양태에서, 상기 일부분은 약 15 cm3 이상의 총 팽창 부피이다. 상기 방법은 포유동물 간, 간엽 또는 그의 일부분의 관류 탈세포화된 세포외 매트릭스 및 2개의 세포 집단을 선택하는 것을 포함한다. 포유동물 세포의 제1 집단은 내피 세포 또는 내피 세포로 분화될 수 있는 줄기 또는 전구 세포를 포함하며, 포유동물 세포의 제2 집단은 섬 세포(islet cell), 베타 세포, 인슐린 유사 세포, 또는 섬 세포 또는 베타 세포로 분화될 수 있는 줄기 세포 또는 전구 세포를 포함한다. 관류 탈세포화된 세포외 매트릭스 및 2개의 세포 집단은 관류 탈세포화된 세포외 매트릭스의 혈관구조의 재-내피화, 및 섬 세포, 베타 세포 또는 인슐린 유사 세포를 사용한 관류 탈세포화된 세포외 매트릭스의 재세포화, 또는 관류 탈세포화된 세포외 매트릭스에서의 줄기 또는 전구 세포의 섬 세포, 베타 세포 또는 인슐린 유사 세포로의 재세포화 및 분화 및 기능적 성숙을 제공하는 조건 하에서 및 기간 동안 접촉된다. 일 실시양태에서, 제1 및 제2 집단에서의 세포는 탈세포화된 세포외 매트릭스에 대해 이종발생성이다. 일 실시양태에서, 제1 및 제2 집단에서의 세포는 탈세포화된 세포외 매트릭스에 대해 동종이형성이다. 일 실시양태에서, 제1 집단, 제2 집단 또는 둘 다에서의 세포는 iPS 세포를 포함한다. 일 실시양태에서, 섬 세포, 베타 세포 또는 인슐린 유사 세포는 캡슐화된다. 일 실시양태에서, 제1 집단, 제2 집단 또는 둘 다에서의 세포는 일차 세포이다. 일 실시양태에서, 제1 집단, 제2 집단 또는 둘 다에서의 세포는 배아 줄기 세포이다. 일 실시양태에서, 제1 집단, 제2 집단 또는 둘 다는 복수의 상이한 세포 유형을 포함한다. 일 실시양태에서, 관류 탈세포화된 세포외 매트릭스는 무손상 혈관 세포외 매트릭스 망상체를 함유한다. 일 실시양태에서, 세포의 제1 집단은 주입 또는 관류 또는 이들의 조합에 의해 세포외 매트릭스와 접촉된다. 일 실시양태에서, 세포의 제2 집단은 주입 또는 관류 또는 이들의 조합에 의해 세포외 매트릭스와 접촉된다.
일 실시양태에서, 상기 방법은 세포외 매트릭스를 포유동물에 이식하는 것을 포함한다. 일 실시양태에서, 세포외 매트릭스는 제1 집단, 제2 집단 또는 둘 다와 접촉하기 전에 포유동물에 이식된다. 일 실시양태에서, 세포외 매트릭스는 제1 집단과 접촉한 후이지만 제2 집단과 접촉하기 전에 포유동물에 이식된다. 일 실시양태에서, 세포외 매트릭스는 제2 집단과 접촉한 후이지만 제1 집단과 접촉하기 전에 포유동물에 이식된다. 일 실시양태에서, 세포외 매트릭스는 제1 집단 및 제2 집단과 접촉한 후에 포유동물에 이식된다.
또한, 인슐린 제어가 결핍되거나 감소된 포유동물에서 인슐린 제어를 향상시키는 방법이 제공된다. 상기 방법은 섬 세포, 베타 세포, 섬 유사 세포, 또는 섬 세포 또는 베타 세포로 분화될 수 있는 줄기 세포 또는 전구 세포를 포함하는 포유동물 세포의 집단을 갖는 포유동물 간, 간엽 또는 그의 일부분의 재-내피화된 세포외 매트릭스를 제공하는 것을 포함한다. 재-내피화된 매트릭스는 포유동물 내피 세포 또는 포유동물 내피 세포 및 집단으로 분화될 수 있는 세포를 포유동물 간, 간엽 또는 그의 일부분의 탈세포화된 세포외 매트릭스로 도입함으로써 제조될 수 있다. 섬 세포, 베타 세포, 섬 유사 세포, 또는 섬 또는 베타 세포로 분화될 수 있는 줄기 세포 또는 전구 세포를 포함하는 세포의 집단을 갖는 재-내피화된 매트릭스는 포유동물에서 혈당의 제어를 제공하기 위해 인슐린 제어가 결핍되거나 감소된 포유동물에 도입된다.
또한, 인슐린 제어가 결핍되거나 감소된 포유동물에서 인슐린 제어를 향상시키는 방법이 제공된다. 상기 방법은 포유동물 내피 세포 또는 포유동물 내피 세포로 분화될 수 있는 세포를 포유동물 간, 간엽 또는 그의 일부분의 탈세포화된 세포외 매트릭스에 도입함으로써 제조된 포유동물 간, 간엽 또는 그의 일부분의 재-내피화된 세포외 매트릭스를 제공하는 것을 포함한다. 재-내피화된 매트릭스는 인슐린 제어가 결핍되거나 감소된 포유동물에 도입되며, 세포의 집단은 포유동물에서 혈당의 제어를 제공하는 데 유효한 양으로, 섬 세포, 베타 세포, 섬 유사 세포, 또는 섬 또는 베타 세포로 분화될 수 있는 줄기 세포 또는 전구 세포를 포함하는 포유동물에 도입된다.
본 발명은 또한 인슐린 제어가 결핍되거나 감소된 포유동물에서 인슐린 제어를 향상시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 인슐린 제어가 결핍되거나 감소되고, 포유동물 간, 간엽 또는 그의 일부분의 이식된 재-내피화된 매트릭스를 갖는 포유동물을 제공하는 것을 포함한다. 재-내피화된 매트릭스는 포유동물 내피 세포를 포유동물 간, 간엽 또는 그의 일부분의 탈세포화된 세포외 매트릭스에 도입함으로써 제조될 수 있다. 세포의 집단은 포유동물에서 혈당의 제어를 제공하는 데 유효한 양으로, 섬 세포, 베타 세포, 섬 유사 세포, 또는 섬 세포로 분화될 수 있는 줄기 세포 또는 전구 세포를 포함하는 포유동물에 도입된다. 세포의 집단은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 물질 및 방법으로 캡슐화될 수 있다.
도 1a는 관류 탈세포화된 돼지 간의 사진을 나타낸다.
도 1b 내지 1c는 각각 관류 탈세포화된 돼지 간의 혈관 및 실질 매트릭스의 주사 전자 현미경 (SEM) 사진을 나타낸다.
도 2는 매트릭스의 해어짐이 저 (좌측) 및 고 (우측) 배율 둘 다에서 보여질 수 있는 침지 탈세포화된 래트 간의 전체도를 제공한다.
도 3은 침지 탈세포화된 래트 간 (A 및 B) 및 관류 탈세포화된 래트 간 (C 및 D)의 SEM 사진을 나타낸다.
도 4는 침지 탈세포화된 간 (A, H&E 염색; B, 트리크롬(Trichrome) 염색) 및 관류 탈세포화된 간 (C, H&E 염색; D, 트리크롬 염색)의 조직구조를 제공한다.
도 1b 내지 1c는 각각 관류 탈세포화된 돼지 간의 혈관 및 실질 매트릭스의 주사 전자 현미경 (SEM) 사진을 나타낸다.
도 2는 매트릭스의 해어짐이 저 (좌측) 및 고 (우측) 배율 둘 다에서 보여질 수 있는 침지 탈세포화된 래트 간의 전체도를 제공한다.
도 3은 침지 탈세포화된 래트 간 (A 및 B) 및 관류 탈세포화된 래트 간 (C 및 D)의 SEM 사진을 나타낸다.
도 4는 침지 탈세포화된 간 (A, H&E 염색; B, 트리크롬(Trichrome) 염색) 및 관류 탈세포화된 간 (C, H&E 염색; D, 트리크롬 염색)의 조직구조를 제공한다.
본 발명은 세포의 환경을 제어함으로써 물리적 및 분자 상호작용을 통해 세포 거동의 제어를 지정하는 세포 및 ECM의 유전자조작을 제공한다. 특히, 본 발명은 세포의 조합물을 포함하는 세포의 집단으로 이식되고, 예를 들어 가용성 매개자의 관류를 포함하는 배양 조건으로 처리되며, ECM 구조 및 배양 조건이 기능적 세포를 초래하는 관류 탈세포화된 간 ECM을 갖는 유전자조작된 기관 및 조직을 제공한다. 특히, 본 발명은 태아 유래된 세포를 포함하는 일차 세포, 예를 들어, 태아 세포 또는 신생아 세포로부터 수득된 기관-특이적 세포 (예를 들어, 특정 혈통으로 할당되지만 최종적으로 분화되지 않는 세포)의 성장 및 기능적 유지를 제공한다. hES 세포의 인슐린 생산 세포로의 분화에 대한 생체내 이식의 용도와 대조적으로, 본 발명은 인슐린 생산 세포에 대한 구조를 제공하거나, 글루코스 자극에 반응하여 인슐린 조절이 가능한 기능적 베타 세포로의 분화를 달성하기 위한 간 ECM의 용도를 제공한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 분화된 세포는 상응하는 생체내 정상적 세포의 기능의 적어도 20%를 갖는다.
본 발명은 매트릭스에서, 섬 세포, 베타 세포 또는 섬 유사 세포 유지, 또는 줄기 또는 전구 세포의 섬 세포, 베타 세포 또는 인슐린 유사 세포로의 분화 및/또는 성숙, 또는 이들의 임의의 조합을 지원하는 데 유용한 관류 탈세포화된 간, 간엽 또는 그의 일부분의 세포외 매트릭스 (ECM) 및 시스템을 제공한다. 일차 세포는 그 후 시험관내에서 배양될 수 있는 유기체로부터 수득된 세포이지만, 이들 세포는 무한정으로 증식하지는 않는다. 분화된 세포는 일차 세포 및 시험관내에서 분화된 세포, 예를 들어 본 발명의 관류 탈세포화된 매트릭스 내의 줄기 세포 또는 전구 세포를 포함한다. 일 실시양태에서, 적어도 5%, 10% 또는 20%, 또는 그 이상의 분화된 세포는 기능적으로 성숙한 표현형을 갖는다. 조직은 공통적인 구조 및 기능을 갖는 세포의 군, 예를 들어 상피 조직, 연결 조직, 근육 조직 (골격근, 심근 또는 평활근), 및 신경 조직이며, 기관을 덮거나 라이닝하거나 연결하는 유연한 시트를 포함한다. 기관은 공통적인 기능을 제공하는 구조 단위에 연결된 조직 (2개 이상)의 집합이다. 본원에 사용된 간의 일부분, 간엽 및 간은 혈관화된 구조를 포함한다.
일 실시양태에서, 본 발명은 섬 세포, 베타 세포, 섬 유사 세포, 줄기 세포, 및/또는 전구 세포 유지, 및 줄기 세포 및 전구 세포 유형, 섬 세포, 베타 세포 또는 섬 유사 세포로의 분화 및/또는 성숙을 위한 3D 간 유래된 ECM 스캐폴드의 용도를 제공한다. 분화는 세포가 원래 세포 집단과는 별개인 새로운 표현형, 예를 들어 별개의 세포 유전자 및/또는 단백질 발현 및/또는 기능(들)을 획득하는 과정이다. 성숙은 또한 생체내 세포 집단에서 세포의 정상적인 성숙한 기능적 능력을 갖는 것과 같이 세포 집단의 표현형을 명확하게 한다. 일 실시양태에서, 스캐폴드는 관류 탈세포화된 ECM 간엽, 예를 들어 간 ECM의 일부분이다. 또다른 실시양태에서, 스캐폴드는 관류 탈세포화된 ECM 간이다. 이러한 스캐폴드는 치료를 위한 이종 세포 유형에 대한 전달 시스템을 유전자조작하기 위해 채용될 수 있다.
간 또는 간엽과 같은 기관 또는 조직으로부터의 관류 탈세포화된 ECM은 침지 기재 탈세포화와 같은 다른 탈세포화 기술에 비해, 무손상 혈관 및/또는 미세혈관계를 포함하는 보다 많은 천연 미세구조를 보유한다. 예를 들어, 간 또는 간엽으로부터의 관류 탈세포화된 ECM은 콜라겐 함량 및 다른 결합 및 신호화 인자 및 혈관 구조를 보존하며, 따라서 도입된 세포의 재-내피화를 위한 환경을 제공한다. 일 실시양태에서, 간, 간엽 또는 그의 일부분으로부터의 관류 탈세포화된 ECM은 유기체에서 정상적으로 발견되는 조건을 모방하는 적절한 압력 및 유동을 포함하는 적절한 조건 하에서, 관류 탈세포화된 ECM의 혈관구조를 이용하여 배지 내의 내피 세포로 관류된다. 인간 크기의 기관의 정상적인 압력은 약 20 내지 약 200 mm Hg이며, 얻어진 유속은 도입되는 관류 혈관 직경에 의존한다.
일 실시양태에서, 본 발명은 관류 탈세포화된 매트릭스 및 세포, 예를 들어 특정 기능적 세포 유형으로 분화되는 세포로부터의 기관- 또는 조직 이식편의 제조 방법을 제공한다. 상기 방법은 예를 들어 비-인간 포유동물로부터의 기관 또는 조직의 관류 탈세포화된 매트릭스, 및 세포, 예를 들어 천연 기관 또는 조직에 존재하는 세포 유형으로 분화될 수 있는 전구 세포를 포함하는 이종발생성 또는 동종이형성 세포의 집단을 선택하는 것을 포함한다. 선택된 관류 탈세포화된 매트릭스는 관류 탈세포화된 매트릭스의 재세포화 및 집단 내의 세포의 기능적 세포로의 분화를 제공하는 조건 하에서 및 기간 동안 전구 세포를 포함할 수 있는 세포의 집단(들)과 접촉된다.
일 실시양태에서, 본 발명은 간, 간엽 또는 그의 일부분의 관류 탈세포화된 매트릭스 및 섬 세포, 베타 세포 또는 섬 유사 세포, 또는 섬 세포, 베타 세포 또는 섬 유사 세포로 분화되는 세포를 갖는 전달 시스템을 함유하는 섬 세포의 제조 방법을 제공한다. 관류 탈세포화된 매트릭스는 매트릭스에서 섬 세포의 재-내피화 및 기능화를 제공하는 조건 하에서 및 기간 동안, 내피 세포, 및 섬 세포, 베타 세포, 섬 유사 세포, 전구 세포 및/또는 줄기 세포를 포함하는 세포의 집단과 접촉한다. 일 실시양태에서, 줄기 세포는 유도 만능 줄기 (iPS) 세포이다. 일 실시양태에서, 줄기 세포는 배아 줄기 (ES) 세포, 예를 들어 인간 ES 세포이다. 일 실시양태에서, 줄기 세포는 성체 줄기 세포이다.
일 실시양태에서, 간 또는 간엽 ECM은 본 발명의 방법에서 채용된다. 일 실시양태에서, 일부분은 약 5 내지 약 10 mm 두께이다. 일 실시양태에서, 일부분은 약 70 내지 약 100 mm 두께이다.
일 실시양태에서, 줄기 또는 전구 세포는 관류 탈세포화된 간 ECM 스캐폴드 상으로 시딩되고, 재-내피화를 초래하는 시간 동안 및 조건 하에서 배양된다. 일 실시양태에서, 내피 세포는 재-내피화를 초래하는 시간 동안 및 조건 하에서 관류 탈세포화된 간 ECM 스캐폴드 상으로 시딩된다. 또다른 실시양태에서, ES 또는 iPS 세포로부터 유래된 부분적으로 분화된 췌장 세포는 관류 탈세포화된 간 ECM 스캐폴드 상으로 시딩되고, 완전히 기능적인 알파 세포, PP 세포, 델타 세포, 엡실론 세포 및/또는 베타 세포를 초래하는 시간 동안 및 조건 하에서 배양되며, 예를 들어 알파 세포는 글루카곤을 생산하고, 베타 세포는 인슐린 및 아밀린을 생산하고, 델타 세포는 소마토스타틴을 생산하고, PP 세포는 췌장 폴리펩티드를 생산하고, 엡실론 세포는 그렐린을 생산한다. 또다른 실시양태에서, 분화된 췌장 세포는 완전히 기능적인 알파 세포, PP 세포, 델타 세포, 엡실론 세포 및/또는 베타 세포를 초래하는 시간 동안 및 조건 하에서 관류 탈세포화된 간 ECM 스캐폴드 상으로 시딩되며, 예를 들어 알파 세포는 글루카곤을 생산하고, 베타 세포는 인슐린 및 아밀린을 생산하고, 델타 세포는 소마토스타틴을 생산하고, PP 세포는 췌장 폴리펩티드를 생산하고, 엡실론 세포는 그렐린을 생산한다. 일 실시양태에서, 배양은 글루코스 자극에 반응하여 인슐린을 발현하는 세포의 35% 초과를 초래한다. 또다른 실시양태에서, 섬 세포, 베타 세포 또는 인슐린 유사 세포는 재-내피화된 간 이식편으로 전달되기 전에 알기네이트에 캡슐화된다.
실질적으로 폐쇄된 혈관계를 갖는 기관의 관류 탈세포화된 매트릭스는, 관류 탈세포화가, 혈관계가 시험관내에서 세포, 및 영양분 및/또는 분화 또는 유지 인자를 세포로 전달하는 데 이용될 수 있는 무손상 혈관 및 미세혈관계를 포함하는 무손상 매트릭스 및 미세환경을 보존하기 때문에 특히 유용하다. 기관에 관해 "실질적으로 폐쇄된" 혈관구조계는 주요 혈관이 캐뉼러화되거나, 묶이거나, 또는 다르게는 제한되는 것을 가정하면, 액체를 사용한 관류시, 대부분의 액체가 고형 기관 내에 함유되고, 고형 기관 밖으로 누출되지 않는 것을 의미한다. "실질적으로 폐쇄된" 혈관구조계를 가짐에도 불구하고, 기관은 관류 동안 기관 전반에 걸쳐 액체를 도입 및 이동시키는 데 유용한 "입구" 및 "출구" 혈관을 한정한다. 세포 및 영양분 및/또는 다른 인자는 다른 수단, 예를 들어 주입, 또는 수동적 수단, 또는 이들의 조합에 의해 전달될 수 있다. 일 실시양태에서, 관심의 세포 집단은 관류 탈세포화된 기관 ECM 내로 관류되어, 혈관 도관 외부의 간질 공간 또는 매트릭스 내로 시딩된다. 이는 세포의 그의 천연 미세구조로의 능동적인 이동 및/또는 귀소화, 예를 들어 내피 세포의 혈관구조 내로의 귀소화를 포함한다. 일 실시양태에서, 내피 세포 집단은 관류 탈세포화된 ECM 간, 간엽 또는 그의 일부분 내로 관류된 후, 내피 세포가 그의 천연 미세환경에서와 같이 혈관 도관에 잔류하는 제2 세포 집단, 예를 들어 베타 세포 집단으로 관류된다. 또다른 실시양태에서, 2개 이상의 세포 집단은 조합되어 함께 관류된다. 또다른 실시양태에서, 2개 이상의 별개의 세포 집단은 관류, 직접 주입 또는 둘 다의 조합을 통해 연속적으로 도입된다. 예를 들어, 섬 세포 또는 섬 유사 세포는 관류 또는 주입을 통해 관류 탈세포화된 간 매트릭스로 도입된 후, 내피 세포의 시딩이 이어질 수 있다. 또다른 실시양태에서, 관류 탈세포화된 간 매트릭스는 태아 내피 세포로 시딩된다. 또다른 실시양태에서, 내피 세포는 매트릭스에 이어 섬 세포에 시딩된다.
세포는 세포의 증식, 대사 및/또는 분화를 지원하는 배지에 도입될 수 있다. 대안적으로, 세포가 ECM에 집단화된 후, 배지는 세포의 증식, 대사 및 분화를 지원하는 것으로 교환된다. 배양된 세포는 생리학적 세포 밀도로 ECM에 존재할 수 있으며, 세포의 증식, 대사 및/또는 분화 및/또는 ECM에서의 적절한 미세환경을 지원하는 배지의 존재 하에서 세포의 유지 및/또는 기능적 분화를 허용한다.
일 실시양태에서, 관류 탈세포화된 간 매트릭스 상에서 배양된 부분적으로 분화된 베타 세포는 다양한 글루코스 또는 전기 트리거에 관하여 인슐린 조절 및 방출이 가능한 세포를 초래한다.
세포 및 ECM은 이종발생성 또는 동종이형성일 수 있다. 일 실시양태에서, 부분적으로 또는 완전히 분화된 인간 세포, 및 작은 동물, 예를 들어 미성숙 돼지와 같은 비인간 포유동물로부터의 관류 탈세포화된 기관 또는 조직은 조합될 수 있다. 일 예에서, 인간 또는 돼지로부터의 관류 탈세포화된 간 매트릭스는 각각 동종이형성 또는 이종발생성 세포 시딩된 매트릭스를 제공하는 부분적으로 분화된 인간 ES 유래된 섬 세포로 시딩된다. 일 실시양태에서, 매트릭스 중의 분화된 베타 세포는 글루코스 자극에 반응하여 인슐린을 방출한다. 일 실시양태에서, 세포 및 관류 탈세포화된 기관 또는 조직은 동종이형성이다. 일 실시양태에서, 세포 및 관류 탈세포화된 매트릭스는 이종발생성이다. 일 실시양태에서, 세포의 2개의 집단, 예를 들어 내피 세포 및 섬 세포는 동일한 유기체로부터의 것이다. 일 실시양태에서, 세포의 2개의 집단, 예를 들어 내피 세포 및 섬 세포는 동종이형성이다. 일 실시양태에서, 세포의 2개의 집단, 예를 들어 내피 세포 및 섬 세포는 이종발생성이다. 일 실시양태에서, 매트릭스 중의 세포는 인간 세포를 포함하며, 관류 탈세포화된 매트릭스는 비인간 포유동물로부터의 것이다.
일 실시양태에서, 본 발명은 시험관내에서 성숙한 세포를 제공한다. 상기 방법은 본 발명의 재세포화된 매트릭스를 제공하고; 매트릭스 중의 세포의 분화 또는 성숙을 허용하는 것을 포함한다. 일 실시양태에서, 매트릭스는 돼지, 소, 말, 개, 고양이, 염소, 비-인간 영장류 또는 인간 간, 간엽 또는 그의 일부분으로부터의 것이다. 일 실시양태에서, 매트릭스 중의 세포는 기능적 베타-세포이다. 일 실시양태에서, 매트릭스 중의 분화된 베타 세포는 글루코스 자극에 반응하여 인슐린을 방출한다. 일 실시양태에서, 세포 및 관류 탈세포화된 기관 또는 조직은 동종이형성이다. 일 실시양태에서, 세포 및 관류 탈세포화된 매트릭스는 이종발생성이다. 일 실시양태에서, 매트릭스 중의 세포는 인간 간세포를 포함하며, 관류 탈세포화된 매트릭스는 비인간 포유동물로부터의 것이다.
관류 탈세포화된 ECM
연구들은 연결 조직 세포가 2D 배양물과는 대조적으로 3D에서 매우 상이하게 거동함을 나타내었다 (Cukierman et al., Science, 294:1708 (2001)). 예를 들어, 평평한 기질 상의 섬유모세포의 배양은 생체내에서 발생하지 않는 극성을 유도한다. 또한, 섬유모세포 및 다른 세포 유형이 3D 조직-유래된 매트릭스에서 배양되는 경우, 이는 생체내에서 발견되는 복합체와 닮은 성숙한 인테그린-함유 초점 부착 복합체로 수 분 내에 발달하는 반면, 단지 원시 부착 복합체만이 2D 배양물 또는 심지어 간단한 3D 유형 I 콜라겐 겔 또는 마트리겔(Matrigel)에서 발달한다. 이들 부착 복합체는 적절한 성장 인자-활성화된 수용체 신호화 및 그들 자신의 ECM 성분 및 ECM을 변경하는 인자의 합성의 급속한 (5분 내) 개시에 요구된다 (Cukierman et al., 2001; Abbott, Nature, 424:870 (2003)). 또한, ECM 배양물 중의 세포는 조직-유래된 매트릭스 내로 자가분비 성장 인자를 침착시키며, 이는 성장 인자의 표적 세포로의 적절한 제시에 요구될 수 있는 과정이다. 이러한 인자는 주로 2D 배양물 중의 배양 배지 내로 분비된다.
상기 언급된 바와 같이, 화학적, 분자 (예를 들어, 가용성 매개자) 또는 유전적 (세포-유형) 인자 이외에 ECM과의 물리적 상호작용은 세포 거동을 조절할 수 있다. 예를 들어, 세포의 ECM-기재 제어는 다수의 물리적 메커니즘, 예컨대 마이크로- 및 나노규모에서의 ECM 기하구조, ECM 탄성, 또는 ECM으로부터 세포로 전달되는 기계적 신호를 통해 발생할 수 있다.
본 발명은 예를 들어 성체 또는 배아 줄기 세포로부터의 섬 세포, 베타 세포 또는 섬 유사 세포를 지지하는 고도로 혈관화된 구조를 허용하는 유전자조작된 관류 탈세포화된 간 ECM의 용도를 포함한다. 본 발명의 관류 탈세포화된 매트릭스는 천연 ECM 혈관구조의 복잡하고 고도로 정돈된 성질, 및 세포와 ECM 사이의 가능성 있는 호혜적 상호작용을 모방한다. 특히, ECM은 줄기 또는 전구 세포에 대한 혈관-특이적 단서를 제공할 수 있다. 특히, 개별 매트릭스 단백질은 ECM의 구조에 대한 그들의 기여를 통해, 또는 성장 인자 및/또는 정주 세포 자신들과 상호작용하는 그들의 능력을 통해, ECM의 특이성을 위해 중요할 수 있다.
조직 또는 기관 ECM의 관류 탈세포화는 기능적 세포 분화 및 유지를 가능하게 하는 구조적, 생화학적 및 기계적 특성을 제공하는 능력을 갖는 무손상 ECM을 제공한다. 따라서, 기관의 관류 탈세포화는 기관이 줄기 또는 전구 세포 분화를 위한 조직/기관 특이적 생물반응기로서 기능하는 것을 허용한다. 또한, 기관 또는 조직 ECM의 관류 탈세포화는 무손상 혈관구조를 포함하는 구조적 및 생화학적 단서를 갖는 무손상 매트릭스를 보존하는 관점에서 침지에 비해 우수하다. 또한, 관류 탈세포화는 조직 또는 기관 두께가 약 2 mm 두께를 초과하는 경우, 침지 탈세포화에 비해 이점을 제공한다.
기관 또는 조직의 탈세포화
탈세포화는 일반적으로 하기 단계를 포함한다: 고형 기관, 예를 들어 그의 혈관화된 구조, 또는 조직의 안정화, 고형 기관 또는 조직의 탈세포화, 고형 기관 또는 조직의 복원 및/또는 중화, 고형 기관의 세척, 기관 상에 잔류하는 임의의 DNA의 분해, 기관 또는 조직의 소독 및 기관의 항상성.
기관 혈관화된 구조 또는 조직을 탈세포화하는 데 있어서 초기 단계는 기관 또는 조직을 캐뉼러화하는 것이다. 기관 또는 조직의 혈관, 도관 및/또는 강은 관련 기술분야에 공지된 방법 및 물질을 이용하여 캐뉼러화될 수 있다. 다음으로, 캐뉼러화된 기관 혈관화된 구조 또는 조직은 세포 파괴 배지로 관류된다. 기관을 통한 관류는 다중-방향성 (예를 들어, 선행성 및 역행성)일 수 있다.
심장의 랑겐도르프 관류는 생리학적 관류 (4 챔버 워킹 모드 관류로도 공지됨)에서와 같이 관련 기술분야에서 통상적이다. 예를 들어, 문헌 [Dehnert, The Isolated Perfused Warm-Blooded Heart According to Langendorff, In Methods in Experimental Physiology and Pharmacology: Biological Measurement Techniques V. Biomesstechnik-Verlag March GmbH, West Germany, 1988]을 참조한다.
간략하게, 랑겐도르프 관류를 위해, 대동맥은 캐뉼러화되고, 생리학적 용액을 함유하는 저장소에 부착되어, 심장이 특정한 기간 동안 신체 외부에서 기능하는 것을 허용한다. 관류 탈세포화를 달성하기 위해, 예를 들어 주입 또는 롤러 펌프에 의해 또는 일정한 정수압 펌프에 의해, 전달되는 일정한 유속으로 대동맥 아래로 역행성 방향으로 전달되는 세포 파괴 배지를 관류하도록 프로토콜이 변형되었다. 모든 예에서, 대동맥 판막은 폐쇄되고, 관류 유동액은 관상동맥 소공으로 향하며 (그에 의해 선행성을 통해, 심장의 전체 심실 질량을 관류함), 그 후 관상 정맥동을 통해 우심방으로 배수된다. 워킹 모드 관류를 위해, 제2 캐뉼러가 좌심방에 연결되고, 관류는 역행성으로 변경될 수 있다.
일 실시양태에서, 생리학적 용액은 인산염 완충 염수 (PBS)를 포함한다. 일 실시양태에서, 생리학적 용액은 예를 들어 영양학적 보충물 (예를 들어, 글루코스)로 보충된 생리학적 혼화성 완충액이다. 간에 대해, 생리학적 용액은 2% BSA로 보충된 118 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.2 mM MgSO4, 1.2 mM KH2PO4, 26 mM NaHCO3, 8 mM 글루코스 및 1.25 mM CaCl2를 갖는 크렙스-헨셀라이트(Krebs-Henseleit) 완충액일 수 있다. 섬, 베타-세포 또는 인슐린 유사 세포를 갖는 재-내피화된 간 이식편에 대해, 생리학적 용액은 프로락틴으로 보충되거나 없는 마이애미(Miami) 개질된 배지-1 또는 10% 소 태아 혈청, 25 mM HEPES, 100 유닛/ml 페니실린, 및 100 μg/ml 스트렙토마이신을 함유하는 pH 7.4의 VEGF가 있거나 없는 개질된 CMRL 1066 조직 배양 배지일 수 있다.
다른 기관 또는 조직을 관류하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예로써, 하기 참고문헌에는 폐, 간, 신장, 뇌 및 수족의 관류가 기재되어 있다. 문헌 [Van Putte et al., Ann. Thorac. Surg., 74(3):893 (2002)]; [den Butter et al., Transpl. Int., 8:466 (1995)]; [Firth et al., Clin. Sci. (Lond.), 77(6):657 (1989)]; [Mazzetti et al., Brain Res., 999(1):81 (2004)]; [Wagner et al., J. Artif. Organs, 6(3):183 (2003)].
하나 이상의 세포 파괴 배지는 기관 또는 조직을 탈세포화하는 데 사용될 수 있다. 세포 파괴 배지는 일반적으로 SDS, PEG, CHAPS 또는 트리톤(Triton) X와 같은 (이에 제한되지 않음) 적어도 1종의 세정제를 포함한다. 세포 파괴 배지는 배지가 세포와 삼투적으로 비혼화성이 되도록 물을 포함할 수 있다. 대안적으로, 세포 파괴 배지는 세포와의 삼투적 혼화성을 위한 완충액 (예를 들어, PBS)을 포함할 수 있다. 세포 파괴 배지는 또한 효소, 예컨대 1종 이상의 콜라게나제, 1종 이상의 디스파제, 1종 이상의 DNase, 또는 트립신과 같은 프로테아제 (이에 제한되지 않음)를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 세포 파괴 배지는 또한 또는 대안적으로 1종 이상의 효소의 억제제 (예를 들어, 프로테아제 억제제, 뉴클레아제 억제제 및/또는 콜라게나제 억제제)를 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 캐뉼러화된 기관 또는 조직은 실질적으로 2개의 상이한 세포 파괴 배지로 관류될 수 있다. 예를 들어, 제1 세포 파괴 배지는 SDS와 같은 음이온성 세정제를 포함할 수 있으며, 제2 세포 파괴 배지는 트리톤 X와 같은 이온성 세정제를 포함할 수 있다. 적어도 하나의 세포 파괴 배지로 관류 후, 캐뉼러화된 기관 또는 조직은 예를 들어 세척 용액 및/또는 본원에 개시된 것과 같은 1종 이상의 효소를 함유하는 용액으로 관류될 수 있다.
관류의 방향 (예를 들어, 선행성 및 역행성)을 교대하는 것은 전체 기관 또는 조직을 탈세포화하는 데 도움이 될 수 있다. 탈세포화는 일반적으로 안에서 밖으로 기관을 탈세포화하며, 이는 ECM에 거의 손상을 초래하지 않는다. 기관 또는 조직은 4 내지 40℃의 적합한 온도에서 탈세포화될 수 있다. 기관 또는 조직의 크기 및 중량, 및 세포 파괴 배지 중의 특정 세정제(들) 및 세정제(들)의 농도에 따라, 기관 또는 조직은 일반적으로 세포 파괴 배지로, 고형 기관 또는 조직의 그램 당 (일반적으로 50 그램 초과) 약 0.05시간 내지 약 5시간, 또는 기관에 대한 고형 기관 또는 조직의 그램 당 (일반적으로 50 그램 미만) 약 2시간 내지 약 12시간으로 관류된다. 세척제를 포함하여, 기관은 고형 기관 또는 조직의 그램 당 (일반적으로 50 그램 초과) 약 0.75시간까지 내지 약 10시간, 또는 조직의 그램 당 (일반적으로 50 그램 미만) 약 12시간 내지 약 72시간 관류될 수 있다. 탈세포화 시간은 전체 질량에 대해 제한된 스케일링으로 기관 또는 조직의 혈관 및 세포 밀도에 의존한다. 따라서, 일반적인 지침으로서 상기 시간 범위 및 질량이 제공된다. 관류는 일반적으로 맥박 유동, 속도 및 압력을 포함하는 생리학적 조건으로 조정된다.
탈세포화된 기관 또는 조직은 혈관 수상구조의 ECM 성분을 포함하는 기관 또는 조직의 모든 또는 대부분의 영역의 세포외 매트릭스 (ECM) 성분을 갖는다. ECM 성분은 하기: 피브로넥틴, 피브릴린, 라미닌, 엘라스틴, 콜라겐 과의 일원 (예를 들어, 콜라겐 I, III 및 IV), 성장 인자 및 사이토킨을 포함하는 ECM 회합된 성장 단백질, 글리코스아미노글리칸, 기저 물질, 망상 섬유 및 트롬보스폰딘 중 임의의 것 또는 모두를 포함할 수 있으며, 이는 기저판과 같은 한정된 구조로서 조직화되어 잔류할 수 있다. 성공적인 탈세포화는 표준 조직학적 염색 절차 또는 형광 어세이에 의해 측정된 바로 검출가능한 DNA의 97% 초과의 제거를 이용한 조직 절편 중 검출가능한 근필라멘트, 내피 세포, 평활근 세포, 및 핵의 부재로서 정의된다. 잔류의 세포 조직파편은 탈세포화된 기관 또는 조직으로부터 제거될 수 있다.
ECM의 형태 및 구조는 탈세포화의 과정 동안 및 후에 유지된다. 본원에 사용된 "형태"는 기관, 조직의 또는 ECM의 전체 형태를 지칭하는 반면, 본원에 사용된 "구조"는 외부 표면, 내부 표면, 및 그 사이의 ECM을 지칭한다.
ECM의 형태 및 구조는 시각적으로 및/또는 조직학적으로 검사될 수 있다. 예를 들어, 고형 기관의 외부 표면 상의 또는 기관 또는 조직의 혈관구조 내의 기저판은 관류 탈세포화로 인해 제거되거나 유의하게 손상되지 않아야 한다. 또한, ECM의 원섬유는 탈세포화되지 않은 기관 또는 조직의 그것과 유사하거나 그것으로부터 유의하게 변화되지 않아야 한다.
1종 이상의 화합물은 예를 들어 탈세포화된 기관을 보존하거나, 재세포화를 위해 탈세포화된 기관 또는 조직을 제조하거나, 및/또는 재세포화 과정 동안 세포를 보조 또는 자극하기 위해, 탈세포화된 기관 또는 조직 내에 또는 상에 적용될 수 있다. 이러한 화합물로는 1종 이상의 성장 인자 (예를 들어, VEGF, DKK-1, FGF, BMP-1, BMP-4, SDF-1, IGF, HGF, 액티빈 A, 레티노산 및 bFGF), 면역 조절제 (예를 들어, 사이토킨, 글루코코르티코이드, IL2R 길항제, 류코트린 길항제), 화학물질 (클로자핀-N-옥시드, 포스포이노시티드-3-키나제 억제제 및 니코틴아미드) 및/또는 응고 캐스케이드를 개질하는 인자 (예를 들어, 아스피린, 헤파린-결합 단백질 및 헤파린)를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 탈세포화된 기관 또는 조직은 탈세포화된 기관 또는 조직 상에 또는 내에 잔류하는 임의의 유형의 미생물의 존재를 감소시키거나 제거하기 위해 예를 들어 조사 (예를 들어, UV, 감마)로 더 처리될 수 있다.
예시적인 심장의 관류 탈세포화
PEG 탈세포화 프로토콜
심장을 100 U/mL 페니실린, 0.1 mg/mL 스트렙토마이신(Streptomycin), 0.25 μg/mL 암포테리신(Amphotericin) B, 1000 U의 헤파틴, 및 2 mg의 아데노카르드(Adenocard)를 함유하는 200 ml PBS에서 재순환 없이 세척한다. 그 후, 심장을 35 ml 폴리에틸렌글리콜 (PEG; 1 g/mL)로 최대 30분 동안 수동 재순환으로 탈세포화한다. 그 후, 기관을 500 mL PBS로 최대 24시간 동안 재순환용 펌프를 사용하여 세척한다. 세척 단계를 매 회 적어도 24시간 동안 적어도 2회 반복한다. 심장을 35 ml DNase I (70 U/mL)에 적어도 1시간 동안 수동 재순환으로 노출시킨다. 기관을 500 ml PBS로 적어도 24시간 동안 다시 세척한다.
트리톤 X 및 트립신 탈세포화 프로토콜
심장을 100 U/mL 페니실린, 0.1 mg/mL 스트렙토마이신, 0.25 μg/mL 암포테리신 B, 1000 U의 헤파틴, 및 2 mg의 아데노카르드를 함유하는 200 ml PBS에서 적어도 약 20분 동안 재순환 없이 세척한다. 그 후, 심장을 0.05% 트립신(Trypsin)으로 30분 동안 탈세포화한 후, 5% 트리톤-X 및 0.1% 수산화암모늄을 함유하는 500 mL PBS로 약 6시간 동안 관류한다. 심장을 탈이온수로 약 1시간 동안 관류한 후, PBS로 12시간 동안 관류한다. 그 후, 심장을 500 mL PBS에서 재순환용 펌프를 사용하여 매 회 24시간 동안 3회 세척한다. 심장을 35 ml DNase I (70 U/mL)로 1시간 동안 수동 재순환으로 관류하고, 500 mL PBS에서 재순환용 펌프를 사용하여 매 회 적어도 약 24시간 동안 2회 세척한다.
1% SDS 탈세포화 프로토콜
심장을 100 U/mL 페니실린, 0.1 mg/mL 스트렙토마이신, 0.25 μg/mL 암포테리신 B, 1000 U의 헤파틴, 및 2 mg의 아데노카르드를 함유하는 200 mL PBS에서 적어도 약 20분 동안 재순환 없이 세척한다. 심장을 1% SDS를 함유하는 500 mL 물로 적어도 약 6시간 동안 재순환용 펌프를 사용하여 탈세포화한다. 그 후, 심장을 탈이온수로 약 1시간 동안 세척하고, PBS로 약 12시간 동안 세척한다. 심장을 500 mL PBS로 재순환용 펌프를 사용하여 매 회 적어도 약 24시간 동안 3회 세척한다. 그 후, 심장을 35 ml DNase I (70 U/mL)로 약 1시간 동안 수동 재순환을 사용하여 관류하고, 500 mL PBS로 재순환용 펌프를 사용하여 매 회 적어도 약 24시간 동안 3회 세척한다.
트리톤 X 탈세포화 프로토콜
심장을 100 U/mL 페니실린, 0.1 mg/ml 스트렙토마이신, 0.25 μg/mL 암포테리신 B, 1000 U의 헤파틴, 및 2 mg의 아데노카르드 (아데노신)을 함유하는 200 mL PBS로 적어도 약 20분 동안 재순환 없이 세척한다. 그 후, 심장을 5% 트리톤 X 및 0.1% 수산화암모늄을 함유하는 500 mL 물로 적어도 6시간 동안 재순환용 펌프를 사용하여 탈세포화한다. 그 후, 심장을 탈이온수로 약 1시간 동안, 그 후 PBS로 약 12시간 동안 관류한다. 심장을 500 mL PBS로 재순환용 펌프를 사용하여 매 회 적어도 24시간 동안 3회 관류함으로써 세척한다. 그 후, 심장을 35 ml DNase I (70 U/mL)로 약 1시간 동안 수동 재순환을 사용하여 관류하고, 500 ml PBS에서 매 회 약 24시간 동안 3회 세척한다.
심장을 60 cm H2O의 관상동맥 관류압에서 관류할 수 있다. 요구되지는 않지만, 심장을 탈세포화 챔버에 실장하고, 항생제를 함유하는 PBS로 72시간 동안 재순환 모드에서 5 mL/분의 연속적 유동으로 완전히 침지 및 관류하여 가능한 한 많은 세포 성분 및 세정제를 세척한다.
탈세포화의 검출
성공적인 탈세포화는 조직 절편 중의 핵산의 결핍에 의해 측정될 수 있다. 혈관 구조의 성공적인 보존은 조직 절편을 포매하기 전에 2% 에반스 블루(Evans Blue)로 관류함으로써 평가될 수 있다. 매우 효과적인 탈세포화는 기관을 먼저 탈이온화된 H2O에 용해된 이온성 세정제 (1% 나트륨-도데실-술페이트 (SDS), 대략 0.03 M)로 일정한 관상동맥 관류압으로 선행성으로 관류한 후, 비-이온성 세정제 (1% 트리톤 X-100)로 선행성으로 관류하여 SDS를 제거하고, 아마도 세포외 매트릭스 (ECM) 단백질을 복원하는 경우 관찰될 수 있다. 간헐적으로, 기관은 폐색된 모세혈관 및 소혈관을 청소하기 위해 인산염 완충 용액으로 역행성으로 관류될 수 있다.
탈세포화 후 무손상 혈관 구조를 입증하기 위해, 탈세포화된 기관을 랑겐도르프 관류를 통해 에반스 블루로 염색하여 혈관 기저 막을 염색하고, 거대- 및 미세-혈관 밀도를 정량화할 수 있다. 또한, 폴리스티렌 입자를 기관 내로 및 기관을 통해 관류하여 부피, 혈관 누출의 수준을 정량하고, 용출액 및 조직 절편을 분석함으로써 관류의 분포를 평가할 수 있다. 3가지 범주의 조합을 평가하고, 단리된 비-탈세포화된 기관과 비교한다: 1) 폴리스티렌 입자의 균등한 분포, 2) 일부 수준에서의 누출의 유의한 변화, 3) 미소혈관 밀도.
예시적인 간의 관류 탈세포화
간 분리를 위해, 대정맥을 중앙 개복술을 통해 노출시키고, 절개하고, 마우스 대동맥 캐뉼러 (래드노티 글래스(Radnoti Glass), 미국 캘리포니아주 몬로비아)를 사용하여 캐뉼러화한다. 간 동맥 및 정맥 및 담관을 횡단하고, 간을 주의깊게 복부로부터 제거하고, 멸균 PBS (하이클론(Hyclone), 미국 유타주 로간)에 침지시켜 간문맥 상의 인장력을 최소화하였다. 헤파린화된 PBS 관류의 15분 후, 탈이온수 중 1% SDS (인비트로젠(Invitrogen), 미국 캘리포니아주 칼스버드)로 2 내지 12시간의 관류 및 탈이온수 중 1% 트리톤-X (시그마(Sigma), 미국 미주리주 세인트 루이스)의 15분의 관류를 한다. 그 후, 간을 PBS (100 U/ml 페니실린-G (지브코(Gibco), 미국 캘리포니아주 칼스버드), 100 U/ml 스트렙토마이신 (지브코, 미국 캘리포니아주 칼스버드), 0.25 μg/ml 암포테리신 B (시그마, 미국 미주리주 세인트 루이스))를 함유하는 항생제로 124시간 동안 연속적으로 관류한다.
120분의 SDS 관류 후, 트리톤-X 100으로 관류하는 것은 완전히 탈세포화된 간을 생성하기에 충분하다. 탈세포화된 간의 모바트(Movat) 펜타크롬 염색은 중심 정맥 및 간 동맥, 담관 및 간문맥을 함유하는 문맥 공간으로 특징적인 간 조직화의 보유를 확인한다.
기관 또는 조직의 재세포화
탈세포화된 기관 또는 조직을 분화된 (성숙 또는 일차) 세포, 줄기 세포, 또는 부분적으로 분화된 세포 중 어느 하나의 세포의 집단과 접촉시킨다. 따라서, 세포는 전능성 세포, 다능성(pluripotent) 세포, 또는 다분화성(multipotent) 세포일 수 있고, 커미트되지 않은(uncommitted) 또는 커미트된(committed) 것일 수 있고, 단일-혈통 세포일 수 있다. 세포는 비분화된 세포, 부분적으로 분화된 세포, 또는 태아 유래된 세포를 포함하는 완전히 분화된 세포일 수 있다. 세포는 전구 세포(progenitor cell), 전구체 세포(precursor cell), 또는 제대 세포 및 태아 줄기 세포를 포함하는 "성체" 유래된 줄기 세포를 포함할 수 있다. 본 발명의 매트릭스에 유용한 세포로는 배아 줄기 세포 (미국 국립 보건원 (NIH)에 의해 정의된 바와 같음; 예를 들어 월드 와이드 웹 상의 stemcells.nih.gov에서의 용어해설을 참조한다) 및 iPS 세포를 들 수 있다.
기관 또는 조직을 재세포화하는 데 사용될 수 있는 세포의 예로는 배아 줄기 세포, 제대혈 세포, 조직-유래된 줄기 또는 전구 세포, 골수-유래된 줄기 또는 전구 세포, 혈액-유래된 줄기 또는 전구 세포, 중간엽 줄기 세포 (MSC), 골격근-유래된 세포, 다분화성 성체 전구 세포 (MAPC), 또는 iPS 세포를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 사용될 수 있는 추가의 세포로는 심장 줄기 세포 (CSC), 다분화성 성체 심장-유래된 줄기 세포, 심장 섬유모세포, 심장 미세혈관 내피 세포, 대동맥 내피 세포, 관상동맥 내피 세포, 미세혈관 내피 세포, 정맥 내피 세포, 동맥 내피 세포, 평활근 세포, 심장근육세포, 간세포, 베타-세포, 케라티노사이트, 푸르키니에 섬유, 뉴런, 담관 상피 세포, 섬 세포, 폐포세포, 세기관지 세포, 브러시 보더 세포(brush boarder cell) 또는 발세포를 들 수 있다. 골수-유래된 줄기 세포, 예컨대 골수 단핵 세포 (BM-MNC), 내피 또는 혈관 줄기 또는 전구 세포, 및 말초 혈액-유래된 줄기 세포, 예컨대 내피 전구 세포 (EPC)는 또한 세포로서 사용될 수 있다.
관류 탈세포화된 스캐폴드 내로 또는 상으로 도입되는 세포의 수는 기관 (예를 들어, 어느 기관인지, 기관의 크기 및 중량) 또는 조직 및 재생 세포의 유형 및 발달 단계 모두에 의존할 것이다. 상이한 유형의 세포는 이들 세포가 도달할 집단 밀도에 대해 상이한 경향을 가질 수 있다. 유사하게, 상이한 기관 또는 조직은 상이한 밀도로 세포화될 수 있다. 예로써, 탈세포화된 기관 또는 조직은 적어도 약 1,000 (예를 들어, 적어도 10,000, 100,000, 1,000,000, 10,000,000 또는 100,000,000)개 세포로 "시딩될" 수 있거나, 그에 부착된 약 1,000 세포/mg 조직 (습윤 중량, 예를 들어 탈세포화 전) 내지 약 10,000,000 세포/mg 조직 (습윤 중량)을 가질 수 있다.
세포는 하나 이상의 위치 내로 주입에 의해 탈세포화된 기관 또는 조직 내로 도입될 ("시딩될") 수 있다. 또한, 하나 초과의 유형의 세포는 탈세포화된 기관 또는 조직 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 분화된 세포 유형의 집단은 탈세포화된 기관 또는 조직 중의 다중 위치에 주입될 수 있거나, 상이한 세포 유형은 탈세포화된 기관 또는 조직의 상이한 부분 내로 주입될 수 있다. 대안적으로, 또는 주입 외에, 세포 또는 세포의 칵테일은 캐뉼러화된 탈세포화된 기관 또는 조직 내로 관류에 의해 도입될 수 있다. 예를 들어 세포는 탈세포화된 기관 내로 관류 배지를 사용하여 관류될 수 있으며, 이는 그 후 세포의 성장 및/또는 분화를 유도하는 확대 및/또는 분화 배지로 교환될 수 있다. 위치 특이적 분화는 기관 내의 다양한 위치 내로, 예를 들어 심장의 영역, 예컨대 심방, 심실 또는 결절 내로 세포를 정치시킴으로써 달성될 수 있다.
재세포화 동안, 기관 또는 조직은 적어도 일부의 세포가 탈세포화된 기관 또는 조직 내 및 상에서 다중화 및/또는 분화될 수 있는 조건 하에서 유지된다. 그 조건으로는 적절한 온도 및/또는 압력, 전기적 및/또는 기계적 활성, 힘, 적절한 양의 O2 및/또는 CO2, 적절한 양의 습도, 및 멸균 또는 멸균-부근 조건을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 재세포화 동안, 탈세포화된 기관 또는 조직 및 그에 부착된 재생 세포는 적합한 환경에서 유지된다. 예를 들어, 세포는 영양학적 보충물 (예를 들어, 영양분 및/또는 글루코스와 같은 탄소 공급원), 외인성 호르몬 또는 성장 인자, 및/또는 특정 pH를 요구할 수 있다.
세포는 탈세포화된 기관 또는 조직 (예를 들어, 인간 세포로 시딩된 인간 탈세포화된 기관 또는 조직)에 대해 동종이형성일 수 있거나, 세포는 탈세포화된 기관 또는 조직 (예를 들어, 인간 세포로 시딩된 돼지 탈세포화된 기관 또는 조직)에 대해 이종발생성일 수 있다. 본원에 사용된 "동종이형성"은 기관 또는 조직이 기원되는 것 (예를 들어, 관련된 또는 비관련된 개체)과 동일한 종으로부터 수득된 세포를 지칭하는 반면, 본원에 사용된 "이종발생성"은 기관 또는 조직이 기원되는 것과는 상이한 종으로부터 수득된 세포를 지칭한다.
줄기 또는 전구 배지는 예를 들어 KODMEM 배지 (넉아웃 둘베코 변형 이글 배지(Knockout Dulbecco's Modified Eagle's Medium)), DMEM, 햄(Ham) F12 배지, FBS (소 태아 혈청), FGF2 (섬유모세포 성장 인자 2), KSR 또는 hLIF (인간 백혈병 억제 인자)를 포함하는 다양한 성분을 함유할 수 있다. 세포 분화 배지는 또한 L-글루타민, NEAA (비-필수 아미노산), P/S (페니실린/스트렙토마이신), N2, B27 및 베타-머캅토에탄올과 같은 보충물을 함유할 수 있다. 피브로넥틴, 라미닌, 헤파린, 헤파린 술페이트, 레티노산, 표피 성장 인자 과 (EGF)의 일원, FGF2, FGF7, FGF8, 및/또는 FGF10을 포함하는 섬유모세포 성장 인자 과 (FGF)의 일원, 혈소판 유래 성장 인자 과 (PDGF)의 일원, 노긴, 폴리스타틴, 코르딘, 그렘린, 케르베루스/DAN 과 단백질, 벤트로핀, 고 용량 액티빈, 및 암니온리스(amnionless) 또는 그의 변이체 또는 기능적 단편을 포함하나 이에 제한되지 않는 전환 성장 인자 (TGF)/골 형태형성 단백질 (BMP)/성장 및 분화 인자 (GDF) 인자 과 길항제를 포함하나 이에 제한되지 않는 추가의 인자가 세포 분화 배지에 첨가될 수 있음이 고려된다. TGF/BMP/GDF 길항제는 또한 TGF/BMP/GDF 수용체-Fc 키메라의 형태로 첨가될 수 있다. 첨가될 수 있는 다른 인자로는 델타-유사 및 재기드(Jagged) 과의 단백질, 및 노치(Notch) 프로세싱 또는 절단의 억제제, 또는 그의 변이체 또는 기능적 단편을 포함하나 이에 제한되지 않는 노치 수용체 과를 통한 신호전달을 활성화 또는 불활성화시킬 수 있는 분자를 들 수 있다. 다른 성장 인자로는 인슐린 유사 성장 인자 과 (IGF), 인슐린, 윙리스 관련 (WNT) 인자 과, 및 헤지호그 인자 과의 일원 또는 그의 변이체 또는 기능적 단편을 들 수 있다. 추가의 인자는 중내배엽 줄기/전구체, 내배엽 줄기/전구체, 중배엽 줄기/전구체, 또는 진정 내배엽 줄기/전구체 증식 및 생존, 및 이들 전구체의 유도체의 생존 및 분화를 촉진시키기 위해 첨가될 수 있다.
일 실시양태에서, 관류 탈세포화된 매트릭스는 배양체 (EB) 방법을 이용하여 분화된 iPS 또는 ES 세포와 조합된다. 예를 들어, 형질도입, 예를 들어 전사 인자 (OCT4, SOX2, NANOG 및 LIN28; Oct3/4, Sox2, Klf4, 및 c-Myc; 또는 Oct3/4, Sox2, 및 Klf4)의 렌티바이러스-매개된 형질도입에 의해 재프로그래밍된 인간 iPS 세포주가 채용된다. 태아 기원 또는 신생아 기원의 iPS 클론이 채용될 수 있다. 인간 ES 세포주가 또한 채용될 수 있다. iPS 세포 및 ES 세포는 20% 넉아웃 혈청 리플레이서 (인비트로젠), 0.1 mmol/L 비필수 아미노산, 1 mmol/L L-글루타민, 및 0.1 mmol/L β-머캅토에탄올 (시그마)로 보충된 DMEM/F12 배양 배지 중 6-웰 배양 플레이트 (눈크(Nunc)) 중 19,500 세포/cm2의 밀도로 조사된 마우스 배아 섬유모세포 (MEF) 상에 유지될 수 있다. 또한, 배지는 iPS 세포에 대해 100 ng/mL, 제브라피쉬 염기성 섬유모세포 성장 인자로, 및 hES 세포에 대해 4 ng/mL 인간 재조합 염기성 섬유모세포 성장 인자 (인비트로젠)로 보충될 수 있다. iPS 및 ES 세포주는 또한 15% 송아지 태아 혈청 (FCS: 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)), 0.1 μmol/L 2-머캅토에탄올 (2ME), 및 1,000 유닛/ml LIF (케미콘 인터내셔널(Chemicon International))를 함유하는 DMEM (시그마-알드리치) 중 젤라틴화된 100-mm 디쉬 상에서 유지될 수 있다. 분화를 위해, 이들 세포를 0.25% 트립신/에틸렌디아민테트라아세트산 (지브코)로 처리하고, 10% FCS 및 0.05 μmol/L 2ME로 보충된 α-최소 필수 배지 (지브코) 중 젤라틴화된 6-웰 플레이트에 3 × 104 세포/웰의 농도로 옮길 수 있다.
콜로니를 1 mg/mL 디스파제 (지브코) 용액으로 37℃에서 8 내지 15분 동안 인큐베이션함으로써 배양 플레이트로부터 분리하고, 현탁 배양물 중 초저 부착 플레이트에 예를 들어 4일 동안 정치할 수 있다. 현탁 배양 동안, 배지를 1일에 교환한 후, 배지 교환 없이 추가의 3일 동안 배양할 수 있다. 그 후, EB를 0.1% 젤라틴-코팅된 배양 플레이트 상에, 예를 들어 웰 당 50 내지 100 EB의 밀도로, 또는 관류 탈세포화된 ECM 내에 플레이팅하고, 분화 배지에서 (예를 들어, 매일 교환됨) 배양한다.
일부 예에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 기관 또는 조직은 환자 내로 이식된다. 그 경우에, 탈세포화된 기관 또는 조직을 재세포화하는 데 사용되는 세포는 세포가 환자에 대해 "자가성"이도록 환자로부터 수득될 수 있다. 환자로부터의 세포는 관련 기술분야에 공지된 방법을 이용하여, 예를 들어 생명의 상이한 단계 (예를 들어, 태아기, 신생아기 또는 주산기, 청소년기 동안, 또는 성인으로서)에서의 혈액, 골수, 조직 또는 기관으로부터 수득될 수 있다. 대안적으로, 탈세포화된 기관 또는 조직을 재세포화하는 데 사용되는 세포는 환자에 대해 동계 (즉, 일란성 쌍생아로부터)일 수 있거나, 세포는 예를 들어 환자의 친척 또는 환자와 관련되지 않은 HLA-매칭된 개체로부터의 인간 림프구 항원 (HLA)-매칭된 세포일 수 있거나, 세포는 예를 들어 비-HLA-매칭된 공여자로부터 환자에 대해 동종이형성일 수 있다.
세포의 공급원에 관계없이 (예를 들어, 자가성 또는 아님), 탈세포화된 고형 기관은 환자에 대해 자가성, 동종이형성 또는 이종발생성일 수 있다.
세포의 진행은 재세포화 동안 모니터링될 수 있다. 예를 들어, 기관 또는 조직 상의 또는 내의 세포의 수는 재세포화 동안 하나 이상의 시점에서 생검을 취함으로써 평가될 수 있다. 또한, 세포가 겪은 분화의 양은 다양한 마커가 세포 또는 세포의 집단에 존재하는지 여부를 측정함으로써 모니터링될 수 있다. 상이한 세포 유형과 회합되는 마커 및 이들 세포 유형의 상이한 분화 단계는 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 항체 및 표준 면역어세이를 이용하여 용이하게 검출될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Current Protocols in Immunology, 2005, Coligan et al., Eds., John Wiley & Sons, Chapters 3 and 11]을 참조한다. 핵산 어세이 및 형태학적 및/또는 조직학적 평가는 재세포화를 모니터링하는 데 이용될 수 있다.
예시적인 췌장 세포 혈통 분화
Pdx1 및 Ptf1a의 활성화시, 췌장 거동은 내배엽 전구체로부터 유도된다. 췌장 전구체는 관, 소핵 및 내분비 전구체를 발생시킨다 (후자는 ε (그렐린), PP (췌장 펩티드), β, α (글루카곤), 및 δ (소마타스타틴) 분비 세포를 발생시킴). 그 후, 내분비 전구체는 상이한 호르몬-분비 세포, α, β, δ, PP 및 ε로 분화된다 (Ngn3, Hnf6 및 Hnf1). 베타-세포 형성의 상이한 단계에 관련되는 중요한 전사 인자는 Pax4, Arx, Nkx2.2, Nkx6.1, Pdx1 및 Mafa이다.
인간 ES는 PDX1, FOXA2, HNF6 및 NKX6-1의 공동발현에 의해 특징화되는 바와 같이, 예를 들어 시험관내 분화의 12일까지, 예를 들어 초기 또는 태아 췌장 내배엽 또는 췌장 상피 혈통으로 부분적으로 분화될 수 있다.
기관에 관해 "실질적으로 폐쇄된" 혈관구조계를 얻는다는 것은 주요 혈관이 캐뉼러화되거나, 묶이거나, 또는 다르게는 제한되는 것을 가정하면, 액체로 관류시 대부분의 액체가 고형 기관 내에 함유되고, 고형 기관으로부터 누출되지 않는 것을 의미한다. "실질적으로 폐쇄된" 혈관구조계를 가짐에도 불구하고, 상기 열거된 많은 기관은 관류, 세포 배양 및 이식 동안 기관 전반에 걸쳐 액체를 도입 및 이동시키는 데 유용한 한정된 "입구" 및 "출구" 혈관을 갖는다. 기능적 베타-세포, 관류성 췌장 ECM 스캐폴드는 한정된 3D 배양 환경에서 베타-세포 분화를 지원하기 위해 채용된다. 관류된 탈세포화된 매트릭스는 무손상 혈관 망상체를 통해 관류를 허용하는 반면, 다른 탈세포화 기술은 혈관 망상체 및 세포외 매트릭스를 방해하고, 따라서 관류를 허용하지 않는다.
베타-세포 분화 프로토콜은 문헌 [D'Amour et al, Nat. Biotech., 24:1392 (2006)]에 기재된 바와 같을 수 있지만, 2개의 단계에서 변형을 갖는다. 제1 변형은 시클로파민 (헤지호그의 억제제)을 생략하고, 단계 2 동안 (4 내지 6일) FGF10을 KGF로 치환한다. 다른 변형은 단계 3에서 FGF10을 노긴(Noggin)으로 치환한다. 전체 분화 프로토콜은 하기와 같다. 통과 후 4 내지 6일에 개시하여 (배양 밀도에 따라), 순차적인 매일의 배지 교환이 전체 분화 프로토콜에 대해 이루어진다. PBS (Mg/Ca를 가짐) 중에서 간단히 세척한 후, 세포를 RPMI (FBS 없음), 액티빈 A (100 ng/ml) 및 Wnt3a (25 ng/ml)에서 제1일 동안 배양한다. 다음 날 배지를 0.2% 부피/부피 FBS 및 액티빈 A (100 ng/mL)를 갖는 RPMI로 교환하고, 세포를 추가의 2일 동안 배양한다. 다음으로, 세포를 PBS (Mg/Ca 가짐)로 간단히 세척한 후, 2% 부피/부피 FBS 및 KGF (25 내지 50 ng/mL)를 갖는 RPMI에서 3일 동안 배양한다. 배지를 1% 부피/부피 B27 보충물, KAAD-시클로파민 (0.25 M), 올-트랜스 레티노산 (RA, 2 M) 및 노긴 (50 ng/mL)을 갖는 DMEM으로 3일 동안 교환한다. 배지를 1% 부피/부피 B27 보충물을 갖는 DMEM으로 3일 동안 교환한다.
대안적으로, 인간 ES 세포주 H1 및 H9 및 마우스 배아 섬유모세포를 채용한다. 인간 ES 세포 배양 배지는 8 ng/mL의 bFGF (인비트로젠), 비필수 아미노산 (1:100, 인비트로젠), 4 mM 1-글루타민, 0.1 mM 2-머캅토에탄올 (인비트로젠), 페니실린/스트렙토마이신 (1:100, 인비트로젠)을 함유하는 20% 넉아웃 혈청 대체물 (KSR) (인비트로젠)을 갖는 DMEM/F12 (인비트로젠)을 포함하며, 4℃에서 저장한다.
인간 ES 세포 분화 배지는 (a) 화학 한정 배지(Chemical Defined Medium (CDM)): 인슐린-트랜스페린-셀레늄-A (1:100, 인비트로젠), 450 mM 모노티오글리세롤 (시그마), 및 5 mg/mL 알부민 분획(Albumin Fraction) V (시그마)로 보충된 50% IMDM (인비트로젠) 플러스 50% F12 영양분 혼합물(Nutrient Mixture) (인비트로젠)을 포함한다. (b) 섬 성숙 배지 (IMM):DMEM/F12, 인슐린-트랜스페린-셀레늄-A 분획 V (시그마). 인간 ES 세포를 위한 인슐린-생산 세포 분화에 대한 인자는 액티빈 A (알앤디 시스템(R&D System)) 50 내지 100 ng/mL, 올-트랜스 레티노산 (시그마) 10-6M, bFGF (인비트로젠) 10 ng/mL, 및 니코틴아미드 (시그마) 10 mM이다.
hES 세포주는 전형적인 프로토콜에 따라 유지된다. 유도 전, hES 세포를 예를 들어 1;3 (60% 합류)로서 스플릿하고, 조직 배양 디쉬, 예를 들어 1% 마트리겔-코팅된 조직 배양 디쉬 상으로 리플레이팅하거나, 또는 ECM으로 도입한다. hES 세포를 hES 배양 배지로 밤새 부착을 위해 인큐베이션한다.
비분화된 인간 ES 세포를 먼저 액티빈 V를 함유하는 CDM에서 4일 동안 배양한다. 그 후, 분화된 세포를 추가로 CDM 중 RA로 4일 동안 유도하고, CDM 배양 배지로부터 췌장 세포 성숙 인자로서 첨가된 bFGF를 갖는 DMEM/F12 섬 성숙 배지로 3일 동안 옮긴다. 마지막으로, 분화된 세포를 bFGF 및 니코틴아미드를 함유하는 DMEM/F12 섬 성숙 배지에 추가의 5일 동안 스위칭한다. 진정 내배엽 세포로 분화하는 인간 ES 세포를 유도하기 위해, 배지를 50 내지 100 ng/mL 액티빈 A를 갖는 CDM 또는 DMEM/F12 배지로 교환한다. 4-일 분화 후, 인간 ES 세포를 추가로 췌장 혈통-특이적 세포를 위한 추가의 4일 동안 CDM 또는 DMEM/F12 배지 중 10-6M RA로 유도한다. 인슐린 생산 세포에 대해, 췌장 혈통-특이적 세포를 액티빈 A 및 RA로 처리한 후, CDM 또는 DMEM/F12 배지로부터 췌장 세포 성숙 인자로서 10 ng/mL bFGF를 함유하는 IMM으로 3일 동안 옮긴다. 분화된 세포를 10 mM 니코틴아미드 및 10 ng/mL bFGF를 함유하는 IMM으로 추가의 3 내지 7일 동안 인슐린-생산 세포 성숙을 위해 스위칭한다.
기관 또는 조직을 탈세포화 및/또는 재세포화하기 위한 제어된 시스템
기관 또는 조직을 탈세포화 및/또는 재세포화하기 위한 시스템 (예를 들어, 생물반응기)은 일반적으로 기관 또는 조직을 캐뉼러화하기 위한 적어도 하나의 캐뉼러화 장치, 기관 또는 조직을 캐뉼러(들)를 통해 관류하기 위한 관류 장치, 및 기관 또는 조직을 위한 멸균 환경을 유지하기 위한 수단 (예를 들어, 격납 시스템)을 포함한다. 캐뉼러화 및 관류는 관련 기술분야에 널리 공지된 기술이다. 캐뉼러화 장치는 일반적으로 조직 또는 기관의 혈관, 도관 및/또는 강 내로 도입하기 위한 크기-적절한 공동 튜브를 포함한다. 전형적으로, 하나 이상의 혈관, 도관 및/또는 강은 기관에서 캐뉼러화된다. 관류 장치는 액체를 위한 보유 용기 (예를 들어, 세포 파괴 배지) 및 하나 이상의 캐뉼러를 통해 기관을 통해 액체를 이동시키기 위한 메커니즘 (예를 들어, 펌프, 기압, 중력)을 포함할 수 있다. 탈세포화 및/또는 재세포화 동안 기관 또는 조직의 멸균은 관련 기술분야에 공지된 다양한 기술, 예컨대 공기 유동의 제어 및 여과, 및/또는 원하지 않는 미생물의 성장을 방지하기 위한 예를 들어 항생제, 항-진균제 또는 다른 항-미생물제를 사용한 관류를 이용하여 유지될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 기관 또는 조직을 탈세포화 또는 재세포화하기 위한 시스템은 특정 관류 특징 (예를 들어, 압력, 부피, 유동 패턴, 온도, 기체, pH), 기계적 힘 (예를 들어, 심실벽 운동 및 스트레스), 및 전기적 자극 (예를 들어, 페이싱)을 모니터링하는 능력을 가질 수 있다. 관상동맥 혈관 베드가 탈세포화 및 재세포화의 과정에 걸쳐 변화함에 따라 (예를 들어, 혈관 저항성, 부피), 압력-조절된 관류 장치는 큰 변동을 피하는 것이 유리하다. 관류의 유효성은 용출액 중에서 및 조직 절편 중에서 평가될 수 있다. 관류 부피, 유동 패턴, 온도, O2 및 CO2 분압 및 pH는 표준 방법을 이용하여 모니터링될 수 있다.
센서는 시스템 (예를 들어, 생물반응기) 및/또는 기관 또는 조직을 모니터링하는 데 사용될 수 있다. 소노마이크로멘트리(Sonomicromentry), 미세압력측정 및/또는 전도도 측정은 심근벽 운동 및 성능에 대한 압력-부피 또는 전부하 동원가능 스트로크 작업 정보를 얻기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 센서는 캐뉼러화된 기관 또는 조직을 통해 이동하는 액체의 압력; 시스템 내의 주위 온도 및/또는 기관 또는 조직의 온도; pH 및/또는 캐뉼러화된 기관 또는 조직을 통해 이동하는 액체의 유속; 및/또는 기관 또는 조직의 재세포화의 생물학적 활성을 모니터링하는 데 사용될 수 있다. 이러한 특징을 모니터링하기 위한 센서를 갖는 것 외에, 기관 또는 조직의 탈세포화 및/또는 재세포화를 위한 시스템은 또한 이러한 특징을 유지 또는 조정하기 위한 수단을 포함할 수 있다. 이러한 특징을 유지 또는 조정하기 위한 수단은 온도계, 온도조절기, 전극, 압력 센서, 오버플로우 밸브, 액체의 유속을 변화시키기 위한 밸브, 용액의 pH를 변화시키기 위해 사용되는 용액에의 유체 연결을 개방 및 폐쇄하기 위한 밸브, 벌룬, 외부 조율기 및/또는 컴플라이언스 챔버와 같은 성분을 포함할 수 있다. 안정한 조건 (예를 들어, 온도)을 보장하는 것을 돕기 위해, 챔버, 저장기 및 튜브는 물-재킷화될 수 있다.
기관 또는 조직을 생성하기 위한 시스템은 프로그램화가능한 프로세서와 조합된 컴퓨터-판독가능한 저장 매체 (예를 들어, 본원에 사용된 컴퓨터-판독가능한 저장 매체는 특정 단계를 수행하기 위한 프로그램화가능한 프로세서를 유발하기 위한 그안에 저장된 지시를 가짐)에 의해 제어될 수 있다. 예를 들어, 이러한 저장 매체는 프로그램화가능한 프로세서와 조합으로 하나 이상의 센서로부터 정보를 받고 가공할 수 있다. 이러한 프로그램화가능한 프로세서와 조합된 저장 매체는 또한 생물반응기 및/또는 기관 또는 조직에 정보 및 지시를 다시 전달할 수 있다.
재세포화를 겪은 기관 또는 조직은 생물학적 활성에 대해 모니터링될 수 있다. 생물학적 활성은 기관 또는 조직 자체의 것, 예컨대 심장 조직, 전기적 활성, 기계적 활성, 기계적 압력, 수축성 및/또는 기관 또는 조직의 벽 스트레스일 수 있다. 또한, 기관 또는 조직에 부착된 세포의 생물학적 활성은 예를 들어 이온 수송/교환 활성, 세포 분열 및/또는 세포 생존성에 대해 모니터링될 수 있다. 예를 들어 문헌 [Laboratory Textbook of Anatomy and Physiology (2001, Wood, Prentice Hall)] 및 [Current Protocols in Cell Biology (2001, Bonifacino et al., Eds, John Wiley & Sons)]을 참조한다. 상기 논의된 바와 같이, 재세포화 동안 기관 상에 활성 부하를 자극하는 것이 유용할 수 있다. 본 발명의 컴퓨터-판독가능한 저장 매체는 프로그램화가능한 프로세서와 조합으로 기관 또는 조직 상의 활성 부하를 모니터링 및 유지하는 데 필요한 성분을 조정하는 데 사용될 수 있다.
일 실시양태에서, 기관 또는 조직의 중량은 프로그램화가능한 프로세서와 조합으로 특정 기관 또는 조직에 대한 노출 시간 및 관류 압력을 계산할 수 있는 본원에 기재된 바와 같은 컴퓨터-판독가능한 저장 매체에 도입될 수 있다. 이러한 저장 매체는 전부하 및 후부하 (각각 관류 전 및 후의 압력) 및 유속을 기록할 수 있다. 본 실시양태에서, 예를 들어 프로그램화가능한 프로세서와 조합된 컴퓨터-판독가능한 저장 매체는 관류 압력, 관류의 방향, 및/또는 하나 이상의 펌프 및/또는 밸브 컨트롤을 통한 관류 용액의 유형을 조정할 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에서 더욱 설명될 것이며, 이는 청구범위에 기재된 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
실시예 1
관류 대 침지의 비교
도 1a는 관류 탈세포화된 돼지 간의 사진을 보여주며, 도 1b 및 1c는 각각 관류 탈세포화된 돼지 간의 혈관 및 실질 매트릭스의 SEM을 보여준다. 이들 사진은 관류 탈세포화된 기관의 혈관 도관 및 매트릭스 보전성을 보여준다. 한편, 도 2는 매트릭스의 해어짐을 저 (좌측) 및 고 (우측) 배율로 볼 수 있는, 침지 탈세포화된 래트 간의 전체도를 보여준다.
도 3은 침지 탈세포화된 래트 간 (A 및 B) 및 관류 탈세포화된 래트 간 (C 및 D)의 SEM을 보여준다. 이들 결과는 침지 탈세포화는 기관 캡슐 (글리슨(Glisson) 캡슐)을 상당히 손상시킨 반면, 관류 탈세포화는 캡슐을 유지하였음을 명백히 나타낸다. 또한, 도 4는 침지 탈세포화된 간 (A, H&E 염색; B, 트리크롬 염색) 및 관류 탈세포화된 간 (C, H&E 염색; D, 트리크롬 염색)의 조직구조를 보여준다. 침지 탈세포화된 래트 간은 주입시 세포 또는 염료를 유지하지 않았다.
실시예 2
섬 세포를 간 또는 신장으로 각각 문맥을 통해 또는 캡슐하에 이식하여 섬 세포를 위한 혈관화층을 제공해 왔다. 그러나, 예를 들어 이들 세포가 인슐린 생산을 중지하거나, 거부반응의 대상체가 된 후에 이들 세포를 제거하는 것은 실현 가능하지 않다. 본원에 기재된 이식편 제조의 이점으로는 비제한적으로 이식편을 용이하게 제거할 수 있고, 이식편을 생체외에서 제조할 수 있어 이식편의 이식전 특성화가 가능하고, 분화 및/또는 성숙화를 더 유도하도록 사용될 수 있는 다양한 줄기 세포 및 세포 배양 배지 조건을 사용하여 원하는 결과 (기능)을 얻을 수 있다는 점이 있다.
섬 세포 및/또는 베타 세포를 생체내에서 전달 및 유지하기 위해 관류 탈세포화된 간, 간엽 또는 그의 일부분을 사용할 수 있다. 예를 들어, 관류 탈세포화된 간, 간엽 또는 그의 일부분은 섬 세포 또는 섬 유사 세포의 주입 전후에 재-내피화되며, 여기서 섬 유사 세포는 초기에 췌도 관련 마커를 발현하지만, 완전히 기능적인 것은 아니며, 섬 세포, 섬 유사 세포, 베타 세포, 베타 세포 유사 또는 인슐린 유사 세포 베타 세포 등을 비롯한 인슐린 반응성 세포가 될 가능성이 있는 재생성 세포를 포함하여 추가의 성숙화가 요구된다. 시딩은 주입, 관류 또는 그의 조합을 통해 달성될 수 있다. 인슐린 생산 세포는 예를 들어 비제한적으로 알기네이트, 생체적합성 나노코팅, PEG, 폴리술폰, 폴리비닐 알콜, 저분자량 텍스트란 술페이트, 표면 개질용 화학 개질 중합체, 또는 광중합체에 캡슐화되어, 재-내피화된 간 이식편으로 이식시에 생존을 위한 즉각적 혈관 지지체를 제공하는 면역 거부를 피할 수 있다. 임의 유형의 내피 세포를 사용할 수 있으며, 얻어진 이식편을 숙주에 이식할 수 있다. 더욱이, 시딩은 이식 전후에 수행할 수 있다. 재혈관화된 간 이식편은 섬 세포, 베타 세포 또는 섬 유사 세포를 위한 양호한 혈관화 환경을 제공함으로써 혈관 지지체를 제공하며, 인슐린 조절을 가능하게 한다.
재-내피화를 위해, 한 실시양태에서, 줄기 세포의 내피 계통을 하향하게 하는 적당한 조건하에 배아 줄기 세포 (ESC) 또는 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)를 배양함으로써 내피 세포 및 내피 전구 세포를 수득한다. 내피 전구 세포는 내피 세포로 분화하기 시작하거나, 또는 내피 세포 (예, 다기능: 예, 계통-제한된; 예, 내피 세포로 될 운명인 세포)로 될 가능성은 있지만 , 완전히 분화된 내피 세포라고는 여겨지지 않는 세포이다. 예를 들어, 내피 세포는 전형적으로 혈소판 내피 세포-부착 분자-1 (PECAM1; 일명 CD31)을 발현하고, 또한 하나 이상의 다음의 마커: VEGFR-1 (일명 Flt-1), VEGFR-2 (일명 Flk-1), 구아닐레이트-결합 단백질-1 (GBP-1), 트롬보모둘린 (일명 CD141), VE- 카드헤린 (일명 CD144), 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand factor (vWF)), 및 세포간 부착 분자 2 (ICAM-2)를 발현할 수 있다. 일반적으로, 내피 전구 세포는 또한 아세틸화 LDL을 흡수할 수 있고, 또한 VEGF를 향해 이동할 수 있고/거나 마트리겔에 튜브를 형성할 수 있다.
ESC 또는 iPSC를 완전히 분화된 내피 세포를 얻을 수 있는 조건하에서 더 배양할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 내피 세포는 혈액, 피부, 간, 심장, 폐, 신장 및 내피 세포의 온상인 임의의 다른 조직 또는 기관과 같은 많은 공급원으로부터 수득할 수 있다. 예를 들어, 대표적인 내피 세포에는 비제한적으로 혈액 내피 세포, 골수 내피 세포, 순환 내피 세포, 인간 대동맥 내피 세포, 인간 뇌 미세혈관 내피 세포, 인간 피부 미세혈관 내피 세포, 인간 장 미세혈관 내피 세포, 인간 폐 미세혈관 내피세포, 인간 미세혈관 내피 세포, 간 정맥 내피 세포, 인간 복재 정맥 내피 세포, 인간 제대 정맥 내피 세포, 림프 내피 세포, 미세혈관 내피 세포, 미세혈관 내피 세포, 폐동맥 내피 세포, 망막 모세혈관 내피 세포, 망막 미세혈관 내피 세포, 혈관 내피 세포, 제대 혈액 내피 세포, 및 그의 조합을 들 수 있다. 관련 기술분야의 숙련자는 이해하겠지만, 이것이 내피 세포의 완전한 목록임을 의도하는 것은 아니다.
내피 세포는 예를 들어 세상 주변의 많은 생체물질의 보고 중 하나로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렌션 (월드 와이드 웹상 ATCC.org) 또는 캐나다의 국제 기탁 기관 (IDAC; 월드 와이드 웹상 nml-lnm.gc.ca)을 참조한다. 내피 세포 또는 내피 전구 세포는 또한 이식된 조직 또는 기관 매트릭스의 수용자가 될 개체로부터 수득할 수도 있다. 이들 세포는 수용자에게 자가조직으로 여겨질 것이다. 추가로, 특정 상황하에서, 조직 또는 기관 매트릭스와 내피 세포 또는 내피 전구 세포 간의 관계는 동종 (즉, 동일한 종으로부터의 상이한 개체)이거나, 다른 경우, 조직 또는 기관 매트릭스와 내피 세포 또는 내피 전구 세포 간의 관계는 이종 (즉, 상이한 종으로부터의 개체)일 수 있다.
내피 세포 또는 내피 전구 세포를 포함하는 조성물은 전형적으로 생리학적 조건 (예, 37℃)하에서 (예, 생리학적 조성물 중의) 세포와 상용성인 용액으로 조직 또는 기관 매트릭스에 전달된다. 본원에서 언급된 생리학적 조성물은 비제한적으로 완충제, 영양소 (예, 당, 탄수화물), 효소, 팽창 및/또는 분화 배지, 시토카인, 항체, 리프레서, 성장 인자, 염 용액, 또는 혈청-유도 단백질을 들 수 있다. 본원에서 사용된 대로, 내피 세포 또는 내피 전구 세포를 "본질적으로 구성하는" 조성물은 생리학적 조성물에서 발견될 수 있는 임의의 성분 (예, 완충제, 영양소 등)은 여전히 포함할 수 있지만, 내피 세포 또는 내피 전구 세포 이외의 세포는 실질적으로 없는 조성물이다.
내피 세포 또는 내피 전구 세포는 관류에 의해 기관 또는 조직 매트릭스에 도입될 수 있다. WO 2007/025233에 기재되어 있는 바와 같이, 관류는 기관 또는 조직 매트릭스의 혈관계 또는 혈관계-유형 구조를 통해 일어난다. 기관 또는 조직 매트릭스를 재-내피화하기 위한 관류는 혈관계를 통해 세포의 생리학적 조성물을 순환시키기에 충분한 유속이어야 한다; 그러나, 기관 또는 조직 매트릭스를 재-내피화하기 위한 관류는 전형적으로 낮은 압력이거나 압력이 없는 상태 (예, 혈관층을 확장 또는 플러싱하기 위해 세포형성전 관류 단계에서 사용된 압력보다 낮은 압력)에서 수행된다 . 내피 세포 또는 내피 전구 세포로의 관류는 재-내피화에 더욱 더 적합화하도록 멀티-방향성 (예, 순행성 및 역행성)일 수 있다.
재-내피화를 위해 조직 또는 기관 매트릭스의 혈관계에 도입되는 내피 세포 또는 내피 전구 세포의 수는 기관 또는 조직 (예, 어느 기관 또는 조직, 기관 또는 조직의 크기 및 중량, 기관 또는 조직의 발달 단계, 및/또는 기관 또는 조직의 혈관화 정도) 및 내피 세포 또는 내피 전구 세포의 유형 및 발달 단계 모두에 좌우된다. 또한, 한가지 이상의 유형의 내피 세포 또는 내피 전구 세포 (예, 내피 세포 또는 내피 전구 세포의 칵테일)이 기관 또는 세포 매트릭스의 혈관계로 도입될 수도 있다.
내피 세포는 공지된 또는 추정된 밀도로 시딩되거나, 또는 저밀도로 시딩되어 전면생장 레벨까지 도달하도록 시험관내 또는 생체내에서 증폭되게 할 수 있다. 상이한 유형의 내피 세포 또는 내피 전구 세포는 이들 세포가 도달하게 되는 개체수 밀도에 대해 다른 경향을 가질 수 있으며, 마찬가지로 상이한 기관 또는 조직 매트릭스는 상이한 밀도로 재-내피화될 수 있다. 간단히 예를 들어, 적어도 약 100개 (예, 적어도 약 103, 104, 105, 106, 107, 109 또는 1010개)의 내피 세포 또는 내피 전구 세포, 또는 줄기 세포가 기관 또는 세포 매트릭스에 도입될 수 있다.
다른 유형의 세포가 내피 세포 또는 섬 세포와 함께 세포외 매트릭스에 도입될 수 있는데, 예를 들어 중간엽 줄기 세포 (MSC)는 내피 세포를 위한 매트릭스의 안정화나, 또는 비보호된 섬 세포 또는 베타 세포의 면역 거부 반응을 피하도록 환자에게 시딩된 섬 세포의 민감화에 도움이 될 수 있다.
재-내피화된 이식편이 내피 세포의 충분한 개체수를 수득하였는지를 판단하기 위해, 아미노산, 주요 수용성 비타민, 글루코스/락토오스 및 미량 원소의 소모 또는 축적에 대해 소정 시간 후에 세포 배양 배지를 모니터링함으로써 내피 세포 밀도를 측정할 수 있다.
섬 세포 및/또는 베타 세포 또는 줄기 또는 전구 세포를 완전히 재-내피화된 간 이식편에 주입 및/또는 관류시킬 수 있다. 섬 세포 또는 베타 세포를 탈세포화된 매트릭스에 도입한 후의 재-내피화는 내피 세포를 매트릭스, 예를 들어 혈관계 매트릭스로 관류 또는 주입하고, 이어서 소정의 배양 시간에 의해 수행될 수 있으며, 여기서 이식편이 이식 준비가 될 때를 판단하기 위해, 증식 속도, 성장 속도, 또는 내피 세포의 밀도를 모니터링할 수 있다.
섬 세포 또는 베타 세포를 재-내피화된 이식편에 도입하기 위해, 충분한 농도의 영양소를 주입된 세포로 제공하는 압력으로 계속해서 관류시키면서, 세포들을 간 이식편으로 주입 또는 관류시킨다. 섬 세포 또는 베타 세포의 포유동물로의 생체내 도입의 경우, 포유동물은 체중 1 kg당 10,000 이상의 섬 "당량"을 수용할 수 있다.
상기한 세포로 이식된 포유동물 또는 상기한 대로 생체외 제조된 이식편에서의 시딩된 섬 세포 또는 베타 세포의 기능성을 판단하기 위해, 글루코스 챌린지에 대한 반응으로서의 총 인슐린 생산량을 측정한다. 또한, 이식편 내에서의 섬 세포 또는 베타 세포의 기능으로서 C-펩티드 및 우레아 생성량을 측정할 수도 있다.
이식편은 체내 어디에나 이식될 수 있는데, 예를 들어 간 이식편의 경우, 간 정맥 또는 문맥을 동맥 서플라이에 문합시키고, 얻어진 간 정맥 또는 문맥을 정맥에 문합시킨다. 대안적으로, 간 동맥을 동맥 서플라이에 문합시키고, 간 정맥 및 문백을 정맥에 문합시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 이식편을 간에 문합시킨다.
한 실시양태에서, 관류 탈세포화된 간, 간엽 또는 그의 일부분을 예를 들어 주입 또는 관류를 통해, 예를 들어 약 1 내지 6주 동안 생체외 재-내피화시킨 후, 섬 세포, 베타 세포 또는 섬 유사 세포를 매트릭스로 약 1 내지 2주 동안 생체외 주입 또는 관류시키고, 얻어진 이식편을 숙주 포유동물에게 이식시킨다. 다른 세포, 예를 들어 중간엽 줄기 세포를 탈세포화된 간, 간엽 또는 그의 일부분을 재-내피화하기 위해 사용되는 세포에 포함시키거나, 또는 섬 세포, 베타 세포 또는 섬 유사 세포에 포함시켜 이식되는 숙주에 대한 면역 민감성을 부여할 수 있다. 한 실시양테에서, 관류 탈세포화된 간, 간엽 또는 그의 일부분을 생체외 재-내피화시킨 후 이식하고, 섬 세포, 베타 세포 또는 섬 유사 세포를 이식된 재-내피화된 이식편으로 생체내 주입한다. 한 실시양태에서, 관류 탈세포화된 간, 간엽 또는 그의 일부분을 숙주에 이식하고, 이후 이식편을 재-내피화하고, 약 1 내지 6주 후 섬 세포, 베타 세포 또는 섬 유사 세포를 재혈관화 이식편에 주입 또는 관류한다. 섬 세포, 베타 세포 또는 섬 유사 세포를 이식편에 도입한지 약 1 내지 2주 후에 이식편을 인슐린 생산에 대해 예를 들어 생체외 또는 생체내에서 시험한다.
한 실시양태에서, 섬 세포, 베타 세포 또는 섬 유사 세포를 예를 들어 주입 또는 관류를 통해 관류 탈세포화된 간, 간엽 또는 그의 일부분에 생체외 도입한 후, 내피 세포를 생체외 주입 또는 관류하고, 얻어진 재세포화 및 재-내피화된 이식편을 숙주 포유동물에게 이식한다. 한 실시양태에서, 섬 세포, 베타 세포 또는 섬 유사 세포를 예를 들어 주입 또는 관류를 통해 관류 탈세포화된 간, 간엽 또는 그의 일부분에 생체외 도입한 후, 내피세포의 이식편으로의 이식 및 후속적인 생체내 주입 또는 관류를 수행한다. 한 실시양태에서, 관류 탈세포화된 간, 간엽 또는 그의 일부분을 숙주에게 이식하고, 이후 이식편에 섬 세포, 베타 세포 또는 섬 유사 세포를, 이후 내피 세포를 예를 들어 주입 또는 관류에 의해 이식한다.
섬 세포, 베타 세포, 인슐린 유사 세포, 또는 그들 세포로 분화될 수 있는 세포를 매트릭스로 도입한 후, 이식편을 인슐린, 아밀린, 글루카곤, 소마토스타틴, 췌장 폴리펩티드 및/또는 그렐린 생성에 대해, 예를 들어 생체외 또는 생체내에서 시험할 수 있다.
한 실시양태에서, 탈세포화된 혈관계 세포외 매트릭스를 이용하여 세포를 시딩할 수 있다. 예를 들어, 간 동맥 또는 정맥 또는 이들 둘 다를 사용하여 세포를 관류 탈세포화된 간에 도입할 수 있다.
얻어진 재-내피화된 인슐린 생산 이식편은 예를 들어 인슐린이 상대적으로 불충분한 제I형 당뇨병 또는 제II형 당뇨병과 같은 자가면역 질환의 결과로서의 인슐린 결핍증을 갖는 포유동물에서 혈당이 조절되도록 할 수 있다.
모든 문헌, 특허 및 특허 출원은 본원에 참조로 포함된다. 상기 명세서에서는 본 발명을 그의 특정 바람직한 실시양태와 관련하여 기재하였으나, 많은 세부사항은 예시의 목적으로 기재한 것이며, 관련 기술분야의 숙련자에게는 본 발명이 추가의 실시양태를 허용하며, 본원에서의 특정 세부사항은 본 발명의 기본 원칙을 벗어나지 않는 한 상당히 변경될 수 있음이 명백할 것이다.
Claims (4)
- 인슐린 제어가 결핍되거나 감소된 포유동물에서 인슐린 제어를 향상시키기 위한 조성물로서,
섬 세포, 베타 세포, 섬 유사 세포, 또는 섬 세포 또는 베타 세포로 분화될 수 있는 줄기 세포 또는 전구 세포를 포함하는 포유동물 세포의 집단을 가지며, 간, 간엽 또는 그의 일부분이 아닌 포유동물 기관 또는 8cm3를 초과하는 그의 일부분의 재내피화된 세포외 매트릭스를 포함하며,
여기서 섬 세포, 베타 세포, 섬 유사 세포, 또는 섬 세포 또는 베타 세포로 분화될 수 있는 줄기 세포 또는 전구 세포를 포함하는 세포의 집단을 갖는 재-내피화된 매트릭스가, 포유동물 내피 세포 또는 포유동물 내피 세포로 분화될 수 있는 세포 및 상기 집단을 간, 간엽 또는 그의 일부분이 아닌 포유동물 기관 또는 그의 일부분의 탈세포화된 세포외 매트릭스로 도입함으로써 제조되는 것인 조성물. - 인슐린 제어가 결핍되거나 감소된 포유동물에서 인슐린 제어를 향상시키기 위한 조성물로서,
간, 간엽 또는 그의 일부분이 아닌 포유동물 기관 또는 8cm3를 초과하는 그의 일부분의 재-내피화된 세포외 매트릭스; 및
포유동물에서 혈당의 제어를 제공하는데 유효한 양의 섬 세포, 베타 세포, 섬 유사 세포, 또는 섬 세포 또는 베타 세포로 분화될 수 있는 줄기 세포 또는 전구 세포를 포함하는 세포의 집단
을 포함하며,
여기서 간, 간엽 또는 그의 일부분이 아닌 포유동물 기관의 재-내피화된 세포외 매트릭스는 포유동물 내피 세포 또는 포유동물 내피 세포로 분화될 수 있는 세포를 간, 간엽 또는 그의 일부분이 아닌 포유동물 기관 또는 그의 일부분의 탈세포화된 세포외 매트릭스에 도입함으로써 제조되고,
간, 간엽 또는 그의 일부분이 아닌 포유동물 기관 또는 그의 일부분의 재-내피화된 세포외 매트릭스는 인슐린 제어가 결핍되거나 감소된 포유동물에게 도입되고, 섬 세포, 베타 세포, 섬 유사 세포, 또는 섬 세포 또는 베타 세포로 분화될 수 있는 줄기 세포 또는 전구 세포를 포함하는 세포의 집단이 재-내피화된 세포외 매트릭스를 갖는 포유동물에 도입되는 것인 조성물. - 인슐린 제어가 결핍되거나 감소된 포유동물에서 인슐린 제어를 향상시키기 위한 조성물로서,
포유동물에서 혈당의 제어를 제공하는데 유효한 양의 섬 세포, 베타 세포, 섬 유사 세포, 또는 섬 세포로 분화될 수 있는 줄기 세포 또는 전구 세포를 포함하는 세포의 집단을 포함하며,
여기서 상기 포유동물은 인슐린 제어가 결핍되거나 감소되어 있고, 간, 간엽 또는 그의 일부분이 아닌 포유동물 기관의 재-내피화된 이식된 매트릭스를 가지며,
상기 간, 간엽 또는 그의 일부분이 아닌 포유동물 기관 또는 8cm3를 초과하는 그의 일부분의 재-내피화된 매트릭스는, 포유동물 내피 세포를 간, 간엽 또는 그의 일부분이 아닌 포유동물 기관의 탈세포화된 세포외 매트릭스에 도입함으로써 제조되는 것인 조성물. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 포유동물에 정맥내로 도입되는 것인 조성물.
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