JP2019134723A - 臓器および組織を脱細胞化および再細胞化する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
組織工学および再生のために、生物学的に誘導されたたマトリックス開発されてきた。しかし、これまで開発されてきたマトリックスは、概して、マトリックス構造が損なわれ、および/または臓器または組織を有効に再構成させる血管床を示さない。本開示は、臓器および組織の脱細胞化および再細胞化の方法を記載する。
本開示は、臓器または組織を脱細胞化するための方法および材料、ならびに脱細胞化臓器または組織を再細胞化するための方法および材料を提供する。
固形臓器は、一般的に、3つの主要構成要素、すなわち、細胞外マトリックス(ECM)、そこに埋め込まれた細胞、および血管床、を有する。本明細書に記載する固形臓器の脱細胞化は、細胞外マトリックス(ECM)および血管床を実質的に保存しつつ、細胞成分のほとんどまたは全てを除去する。そのため、脱細胞化した固形臓器は再細胞化のための足場(scaffold)として使用できる。固形臓器を得ることができる哺乳動物としては、齧歯動物、ブタ、ウサギ、ウシ、ヒツジ、イヌ、およびヒトが挙げられるがこれらに限定されない。本明細書に記載する方法において使用される臓器および組織は、死体であっても、または胎仔、新生仔、もしくは成体であってもよい。
本発明は、哺乳動物臓器または組織を脱細胞化する方法および材料を提供する。臓器または組織を脱細胞化するための最初の工程は、可能であれば、臓器または組織にカニューレを挿入することである。臓器または組織の管、導管、および/または空洞には、当該分野で公知の方法および材料を使用してカニューレを挿入できる。臓器または組織を脱細胞化するための次の工程は、カニューレ挿入した臓器または組織に細胞破壊培地を灌流させることである。臓器にわたる灌流は、多方向(例えば、順行および逆行)であり得る。
本発明は、臓器または組織を生成するための材料および方法を提供する。本明細書に記載する脱細胞化臓器または組織を再生細胞の集合と接触させることにより、臓器または組織を生成できる。本明細書で使用する再生細胞は、脱細胞化臓器または組織を再細胞化するために使用される任意の細胞である。再生細胞は、全能細胞、多能性細胞、または多分化能細胞であってもよく、非分化増殖性(uncommitted)であっても、または分化増殖性(committed)であってもよい。再生細胞はまた、単一系統(single-lineage)細胞であってもよい。さらに、再生細胞は未分化細胞、一部分化細胞、または完全分化細胞であってもよい。本明細書で使用する再生細胞としては、胚幹細胞(国立衛生研究所(NIH)により定義されるもの;例えば、ワールドワイドウェブ上のstemcells.nih.govの用語集を参照のこと)が挙げられる。再生細胞としてはまた、始原細胞、前駆細胞、ならびに臍帯細胞および胎仔幹細胞を含む「成体」由来幹細胞が挙げられる。
本発明はまた、臓器または組織を脱細胞化および/または再細胞化するシステム(例えば、バイオリアクター)も提供する。このようなシステムは、一般的に、臓器または組織にカニューレ挿入するための少なくとも1つのカニューレ挿入デバイス、(1つ以上の)カニューレを介して臓器または組織に灌流させるための灌流装置、および臓器または組織の滅菌環境を維持するための手段(例えば、格納システム)を含む。カニューレ挿入および灌流は、当該分野で周知の技術である。カニューレ挿入デバイスは、一般的に、臓器または組織の管、導管、および/または空洞に導入するための適切な大きさの空洞配管を含む。典型的に、臓器において1つ以上の管、導管、および/または空洞にカニューレ挿入する。灌流装置は、液体(例えば、細胞破壊培地)用の支持コンテナ、および1つ以上のカニューレを介して液体を臓器中で移動させるための機構(例えば、ポンプ、空気圧、重力)を含み得る。脱細胞化および/または再細胞化の間の臓器または組織の滅菌性は、気流の制御および濾過、ならびに/または例えば、抗生物質、抗真菌剤もしくは他の抗菌剤での灌流により望ましくない微生物の成長を防ぐ等、当該分野において公知の様々な技術を用いて維持することができる。
実施例1-脱細胞化のための固形臓器の調製
死後血栓の形成を避けるために、ドナーラットを、400Uのヘパリン/kg(ドナー)で全身ヘパリン化した。ヘパリン化の後、心臓および隣接する大血管を完全に取り除いた。
心臓を、灌流のために脱細胞化装置上に載置した(図1)。下行胸動脈にカニューレ挿入して、逆行冠灌流を可能にした(図1、カニューレA)。胸動脈の枝(例えば、腕頭幹、左総頸動脈、左鎖骨下動脈)を結紮した。肺動脈が、左および右肺動脈に分かれる手前でカニューレ挿入した(図1、カニューレB)。上大静脈にカニューレ挿入した(図1、カニューレC)。この構成により、逆行および順行冠灌流の両方が可能になる。
心臓を脱細胞化装置に載置した後、灌流液1L当たり1〜5mmolのアデノシンを含む冷たいヘパリン化カルシウム非含有リン酸緩衝液で順行灌流を開始し、一定の冠血流を再構築した。冠灌流圧および流量を測定し、冠抵抗を計算することによって、冠血流を評価した。15分間の安定した冠血流後、界面活性剤に基づく脱細胞化プロセスを開始した。
心臓を、8匹の雄ヌードラット(250〜30Og)から単離した。切開直後、大動脈弓にカニューレ挿入し、心臓に表示の界面活性剤を逆行灌流させた。4つの異なる界面活性剤に基づく脱細胞化プロトコル(以下参照)を、(a)細胞成分の除去、ならびに(b)血管構造の保存における実現可能性および有効性について比較した。
心臓を、100U/mlペニシリン、0.1mg/mlストレプトマイシン、および0.25μg/mlアンホテリシンBを含有する200ml PBS中で、再循環させずに洗浄した。次いで、35 mlポリエチレングリコール(PEG;1g/ml)で、最長30分間、手動で再循環させながら、心臓を脱細胞化した。次に、500ml PBSで、最長24時間、再循環用のポンプを使用して臓器を洗浄した。洗浄工程は、少なくとも2回、それぞれ少なくとも24時間繰り返した。心臓を、35ml DNアーゼI(70 U/ml)に、手動で再循環させながら、少なくとも1時間晒した。500ml PBSで臓器を再度少なくとも24時間洗浄した。
心臓を、100U/mlペニシリン、0.1mg/mlストレプトマイシン、および0.25μg/mlアンホテリシンBを含有する200 ml PBS中で、少なくとも約20分間、再循環させずに洗浄した。次いで、0.05%トリプシンで30分間、その後5%Triton-Xおよび0.1%水酸化アンモニウムを含有する500ml PBSで約6時間灌流して、心臓を脱細胞化した。心臓を、脱イオン水で約1時間灌流した後、PBSで12時間灌流した。次いで、再循環用ポンプを使用して、心臓を、500ml PBSで3回、それぞれ24時間洗浄した。心臓を、35ml DNアーゼI(70U/ml)で手動で再循環させながら1時間灌流し、500ml PBS中で2回、それぞれ少なくとも約24時間、再循環用ポンプを使用して洗浄した。
心臓を、100U/mlペニシリン、0.1mg/mlストレプトマイシン、および0.25μg/mlアンホテリシンBを含有する200ml PBS中で、少なくとも約20分間、再循環せずに洗浄した。心臓を、1%SDSを含有する500ml水で、少なくとも約6時間、再循環用ポンプを使用して脱細胞化した。次いで、心臓を、脱イオン水で約1時間洗浄し、PBSで約12時間洗浄した。心臓を、500ml PBSで3回、それぞれ少なくとも約24時間、再循環用ポンプを使用して洗浄した。次いで、心臓を、35ml DNアーゼI(70 U/ml)で約1時間、手動で再循環させながら灌流し、500ml PBSで3回、それぞれ少なくとも約24時間、再循環用ポンプを使用して洗浄した。
心臓を、100U/mlペニシリン、0.1mg/mlストレプトマイシン、および0.25μg/mlアンホテリシンBを含有する200 ml PBSで、少なくとも約20分間、再循環させずに洗浄した。次いで、心臓を、5%Triton Xおよび0.1%水酸化アンモニウムを含有する500mlの水で、少なくとも6時間、再循環用ポンプを使用して脱細胞化した。次いで、心臓に、脱イオン水を約1時間灌流させた後、PBSを約12時間灌流させた。心臓を、500ml PBSで3回、それぞれ少なくとも24時間、再循環用ポンプを使用して環流させることにより洗浄した。次いで、心臓に、35ml DNアーゼI(70 U/ml)を約1時間手動で再循環させながら灌流させ、500ml PBSで3回、それぞれ約24時間洗浄した。
脱細胞化後の無傷な血管構造を実証するために、脱細胞化心臓を、エバンスブルーを用いたランゲンドルフ灌流を介して染色し、血管基底膜を染色して、大血管および微小血管密度を定量する。さらに、心臓にポリスチレン粒子を灌流させて、冠容量、すなわち血管漏出のレベルを定量し、冠排液および組織切片を分析することにより灌流の分布を評価することができる。3つの基準の組み合わせを評価して、単離された非脱細胞化心臓と比較する:すなわち、1)ポリスチレン粒子の均等な分布、2)あるレベルの漏出における有意な変化、3)微小血管密度。
実施例1-ラット心臓の脱細胞化
12週齢のF344 Fischer雄ラット(Harlan Labs、PO Box 29176 Indianapolis、IN 46229)に、100mg/kgケタミン(Phoenix Pharmaceutical、Inc.、St. Joseph、MO)および10mg/kgキシラジン(Phoenix Pharmaceutical、Inc.、St. Joseph、MO)の腹腔内注射を使用して麻酔をかけた。左大腿静脈を介した全身ヘパリン化(American Pharmaceutical Partners、Inc.、Schaumberg、IL)の後、胸骨正中切開を行って、心膜を開いた。胸骨後脂肪体を除去し、上行胸部大動脈を切開し、その枝部を結紮した。大静脈および肺静脈、肺動脈および胸部大動脈を離断した後、心臓を胸部から取り出した。プレフィルド1.8 mm大動脈カニューレ(Radnoti Glass、Monrovia、CA)を、上行大動脈に挿入して、逆行冠灌流(ランゲンドルフ)を行った。心臓に、10μMアデノシンを含有するヘパリン化PBS(Hyclone、Logan、UT)を、75cm H2Oの冠灌流圧で15分間灌流させた後、1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)または1%ポリエチレングリコール1000(PEG 1000)(EMD Biosciences、La Jolla、Germany)または1%Triton-X 100(Sigma、St. Louis、MO)含有脱イオン水を2〜15時間灌流させた。この後、15分間の脱イオン水灌流、および1%Triton-X(Sigma、St. Louis、MO)含有脱イオン水での30分間の灌流を行った。次いで、心臓に、抗生物質含有PBS(100U/mlペニシリン-G(Gibco、Carlsbad、CA)、100U/mlストレプトマイシン(Gibco、Carlsbad、CA)、および0.25μg/mlアンホテリシンB(Sigma、St. Louis、MO))を124時間連続的に灌流させた。
腎臓を単離するために、腹膜内容物全体をウェットガーゼに包み、注意深く横に動かして後腹膜腔を露出した。腸間膜血管を結紮し、離断した。腹部大動脈を結紮し、腎動脈が始まる下で離断した。胸部大動脈を横隔膜のちょうど上で離断し、1.8 mm大動脈カニューレ(Radnoti Glass、Monrovia、CA)を使用してカニューレ挿入した。腎臓を後腹腔から注意深く除去し、滅菌PBS(Hyclone、Logan、UT)に沈めて、腎動脈に対する牽引力を最小限にした。15分間のヘパリン化PBSでの灌流の後、1%SDS(Invitrogen、Carlsbad、CA)含有脱イオン水での2〜16時間の灌流、および1%Triton-X(Sigma、St. Louis、MO)含有脱イオン水での30分間の灌流を行った。次いで、肝臓を、抗生物質含有PBS(100U/mlペニシリン-G(Gibco、Carlsbad、CA)、100U/mlストレプトマイシン(Gibco、Carlsbad、CA)、0.25μg/mlアンホテリシンB(Sigma、St. Louis、MO))で、124時間、連続的に灌流した。
(気管を有する)肺を、胸部から注意深く除去し、滅菌PBS(Hyclone、Logan、UT)に沈めて、肺動脈に対する牽引力を最小限にした。15分間のヘパリン化PBS灌流の後、1%SDS(Invitrogen、Carlsbad、CA)含有脱イオン水での2〜12時間の灌流、および1%Triton-X(Sigma、St. Louis、MO)含有脱イオン水での15分間の灌流を行った。次いで、肺を、抗生物質含有PBS(100U/mlペニシリン-G(Gibco、Carlsbad、CA)、100U/mlストレプトマイシン(Gibco、Carlsbad、CA)、0.25μg/mlアンホテリシンB(Sigma、St. Louis、MO))で、124時間、連続的に灌流した。
肝臓を単離するために、正中開腹により大静脈を露出し、切開し、マウス大動脈カニューレ(Radnoti Glass、Monrovia、CA)を使用してカニューレを挿入した。肝動脈および静脈、ならびに胆管を離断し、肝臓を腹部から注意深く除去し、滅菌PBS(Hyclone、Logan、UT)に沈めて、門脈に対する牽引力を最小限にした。15分間のヘパリン化PBSでの灌流の後、1%SDS(Invitrogen、Carlsbad、CA)含有脱イオン水で2〜12時間、および1%Triton-X(Sigma、St. Louis、MO)含有脱イオン水で15分間の灌流を行った。次いで、肝臓を、抗生物質含有PBS(100U/mlペニシリン-G(Gibco、Carlsbad、CA)、100U/mlストレプトマイシン(Gibco、Carlsbad、CA)、0.25μg/mlアンホテリシンB(Sigma、St. Louis、MO))で、124時間、連続的に灌流した。
組織構造および免疫蛍光.パラフィン包理した脱細胞化組織に対してモバット・ペンタクローム染色を、製造元(American Mastertech Scientific、Lodi、CA) の指示書に従って行った。簡単に言うと、脱パラフィンスライドを、ヴァーヘフ弾性染色法を使用して染色し、濯ぎ、2%塩化第二鉄中で識別し、濯ぎ、5%チオ硫酸ナトリウムに入れ、濯ぎ、3%氷酢酸中でブロッキングし、1%アルシアンブルー溶液中で染色し、濯ぎ、クロセインスカーレット-酸フクシン中で染色し、濯ぎ、1%氷酢酸に浸し、5%リンタングステン酸中で脱染し、1%氷酢酸に浸し、脱水し、アルコールサフラン溶液に入れ、脱水し、載置し、カバーで覆った。
[T(ε= 40%歪み) - T(ε= 36%歪み)]/4%歪み
式中、Tは工学的応力、およびεは工学的歪みである。接線係数の値を平均化し、二本の軸(周縁および長手)、ならびにグループ間で比較した。
生体適合性を評価するために、1ccの標準的な拡張培地(イスコフ改変ダルベッコ培地(Gibco、Carlsbad、CA)、10%ウシ胎仔血清(HyClone、Logan、UT)、100U/mlペニシリン-G(Gibco、Carlsbad、CA)、100U/mlストレプトマイシン(Gibco、Carlsbad、CA)、2 mmol/L L-グルタミン(Invitrogen、Carlsbad、CA)、0.1mmol/L 2-メルカプトエタノール(Gibco、Carlsbad、CA)に懸濁した100,000のマウス胚幹細胞(mESC)を、ECM切片およびコントロールプレートに、特別な成長因子刺激またはフィーダー細胞支持体無しに播種した。4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を、10μg/mlの濃度で細胞培養培地に添加して、細胞核を標識化して、細胞付着および拡張の定量を可能にした。UV光の下での画像、ならびに基準点、24、48 および72時間後の位相差を、Nikon Eclipse TE200倒立顕微鏡(FryerCo. Inc.、Huntley、IL)上にImagePro Plus 4.5.1(Mediacybernetics、Silver Spring、MD)を使用して、記録した。
SDS脱細胞化したラット心臓の大動脈弁能力および冠血管床の完全状態を、2%エバンスブルー染料でのランゲンドルフ灌流により評価した。染料での左心室充満は観察されなかったため、大動脈弁が無傷であることが示された。肉眼的に、染料の漏出の兆候無しに、冠動脈の4つ目の分岐点までの充満を確認した。その後、組織切片において、大きい(150μm)および小さい(20μm)動脈および静脈の灌流を、エバンスブルー染色された血管基底膜の赤色蛍光によって確認した。
ラット心臓、肺、腎臓および肝臓に加えて、本明細書に記載の灌流型脱細胞化プロトコルを骨格筋、膵臓、小腸、大腸、食道、胃、脾臓、脳、脊髄および骨に適用した場合にも同様の結果が生じた。
ヘパリン化雄動物からブタ腎臓を単離した。単離した臓器を灌流するために、腎動脈にカニューレ挿入し、PBS灌流で15分間にわたり血液を洗い出した。27Lの1%SDS含有脱イオン水での灌流を、35.5時間、50〜100mmHgの圧力下で行った。1%Triton-X-100含有脱イオン水での灌流を開始して、ECM足場からSDSを除去した。その後、脱細胞化腎臓の洗浄および緩衝を、抗生物質含有PBSでの120時間の灌流により行って、界面活性剤を除去し、生体適合性pHを得た。
大動脈弁に対して遠位の大動脈にカニューレ挿入し、肺動脈幹の左枝(分岐の遠位側)、および下大静脈(IVC)以外の全ての他の大管および肺管を結紮することにより、F344ラット由来の心臓を準備した。ランゲンドルフ逆行冠灌流、および2リットルの1%SDSを12〜16時間にわたって使用することにより脱細胞化を成し遂げた。次いで、35mLの1%Triton-X-100で30〜40分間かけて心臓を再生した後、抗生物質および抗真菌剤含有PBSで72時間洗浄した。移植前にIVCを結紮した。
実施例1-心臓ECM薄片の再細胞化
脱細胞化ECMの生体適合性を評価するために、1つの脱細胞化心臓の1mmの厚みの薄片を、筋原および内皮細胞系と共に培養した。2×105ラット骨格筋芽細胞、C2C12マウス筋芽細胞、ヒト臍帯内皮細胞(HUVEC)、およびウシ肺内皮細胞(BPEC)を、組織切片上に播種し、標準的な条件下で7日間共培養した。筋原細胞は、ECM内を移動および拡大し、元の線維配向と整列した。これらの筋原細胞は、増殖の増加を示し、ECM薄片の大部分に完全に再集合した。内皮細胞系は、湿潤性成長がより少ないパターンを示し、移植片表面上に単層を形成した。これらの条件下では、検出可能な抗増殖性効果は見とめられなかった。
冠灌流によって脱細胞化心臓ECM上および中に再生細胞を播種する効率を決定するために、脱細胞化心臓を臓器チャンバに移し、細胞培養条件(5%CO2、60%湿度、37℃)下で酸素処理した細胞培養培地で連続的に灌流した。120×106PKH-標識化HUVEC(50mlの内皮細胞成長培地に懸濁)を、40cm H2O冠灌流圧で注入した。冠排液を保存し、細胞を数えた。その後、排液を再循環させ、再度灌流させて、最大数の細胞を送達した。再循環を2回繰り返した。三度目の継代の後、およそ9O×106細胞が心臓内で保持されていた。心臓を、500mlの再循環している酸素処理された内皮細胞培養培地で、120時間、連続的に灌流した。その後、心臓を取り出し、低温切開のために包埋した。HUVECは、心臓全体の動脈および静脈残渣(residues)に制約したが、血管外ECMにいまだ完全に分散していなかった。
ラット新生仔心臓細胞の単離および調製. 1日目に、8〜10匹の1〜3日齢のSPF Fisher-344新生仔ラット(Harlan Labs、Indianapolis、IN)を5%吸入イソフルレン(Abbott Laboratories、NorthChicago、IL)で沈静状態にし、70%EtOHを噴霧し、すばやく胸骨正中切開を滅菌状態で行った。心臓を切除し、すぐに、HBSS(新生仔心筋細胞単離系由来の試薬#1(Worthington Biochemical Corporation、Lakewood、NJ))を含む氷上の50ml円錐管に入れた。上清を除去し、激しく旋回することにより冷たいHBSSで全心臓を1回洗浄した。心臓を5mlの冷たいHBSSを含む100 mm培養皿に移し、結合組織を除去し、残った組織を細かく刻んだ(<1mm2)。追加のHBSSを添加して、合計プレート容量を9mlにし、これに1mlトリプシン(試薬#2、Worthington kit)を添加して、50μg/mlの最終濃度を得た。プレートを、5℃クーラー内で一晩インキュベートした。
実施例1-ラット肝臓単離手順
体重1kg当たり75mgのケタミン、および体重1kg当たり10mgのキシラジンで、各ラットを麻酔した。ラットの腹部を剃り、ベタジンで滅菌した。ラットに大用量のナトリウムヘパリン(体重100g当たり100μL ヘパリン(1,000UI/mLストック))を、胃内静脈に静脈内投与した。
準備したカテーテルを門脈に挿入し、プロリン(proline)縫合糸で結紮した。ラインの完全性を検証し、注射器に入ったPBS(Mg+2およびCa+2は含まない)を使用した灌流によって、肝臓から潜血を除去した。肝臓ゴムストッパーをバイオリアクターにはめた。フラスコを回収リザーバーの上に配置し、十分な長さのラインを介して1%SDS(1.6L)のコンテナを取り付けて、およそ20mm Hgの最大圧力を生成するカラムを作製した。2〜4時間の灌流の後、1%SDSのコンテナを空にし、追加の1.6Lの1%SDSで再度満たした。合計4つの1.6Lの1%SDSバッチを典型的に使用して、肝臓を灌流した。脱細胞化の後、肝臓の外見はきれいな白色であり、脈管が見えた。
温めた培地(37℃)に細胞(4000万個の初代肝臓由来細胞またはHepG2ヒト細胞)を、1ミリリットル当たり約800万細胞(典型的に5mL)で懸濁し、注射針に投入することによって再細胞化を行った。門脈を介して細胞を注入し、その間、肝臓はバイオリアクター内またはペトリ皿内に入れた。追加的または代替的に、細胞は、任意の他の血管アクセスを介して注入されるか、または実質に直接注射され得ることに留意されたい。
脱細胞化および再細胞化肝臓の機能を以下のように評価した。初代ラット肝細胞で再細胞化した肝臓における、尿素生成(図14)、アルブミン生成(図15)、およびシトクロムP-450IAI(エトキシレゾルフィン-O-デエチラーゼ(EROD))活性(図16)を評価した。尿素生成はベルトロー(Berthelot)/比色分析アッセイキット(Pointe Scientific Inc.)を用いて決定し、アルブミン生成およびEROD活性については、Culture of Cells for Tissue Engineering (Vunjak-Novakovic & Freshney、eds.、2006、Wiley-Liss)から適応させた方法を用いてアッセイした。これらの実験は、培養期間の間、肝臓由来細胞が、肝臓に特異的な機能性を保持することを実証した。
図17は、脱細胞化心臓、肺、肝臓、および腎臓上で少なくとも3週間、胎仔および成体由来の幹細胞/始原細胞が増殖したことを示すグラフである。細胞の増殖は、高倍率視野ごとの核DAPI染色の数を数えることにより決定した。図18は、マウス胚幹細胞(mESC)および増殖している成体筋肉始原細胞(骨格筋芽細胞;SKMB)が、脱細胞化心臓、肺、肝臓、および腎臓上で生存可能であったことを示すグラフである。細胞の生存性は、tunnelアッセイを用いて、3週間後のアポトーシスの程度、対、DAPI染色細胞核の合計数を検出することにより決定した。
細胞の単離
ワージントンプロトコルを使用し、心臓のほぼ真ん中で切ることにより、仔ラット由来のLVおよびRVを単離した。基部から第2のLAD枝部までの領域を捨て、残りを約10mLのHBSSに入れた。任意に、心臓のLVおよびRV部分を、トリプシン中で、最長18〜22時間、5℃にて一晩インキュベートしてもよい。脱細胞化したマトリックスに注射するために細胞を注射器に引き上げた後、残った細胞をコントロールとして使用した(例えば、10mL培地を添加して、細胞をプレート化した)。
よく洗浄した脱細胞化細胞外マトリックス(ECM)を得た。例えば、心臓細胞外マトリックスを、最低2000mLのPBS溶液を用いて3〜4日間洗浄した。18 ga.カニューレ(IN:LVを通る僧帽弁;OUT:大動脈)を使用して心臓にカニューレ挿入し、4-0縫合糸を用いて固定した。LVカニューレは、LV内腔内にある先端付近まで進めた(例えば、LVカニューレの先端は僧帽弁から約0.7cmのところにあった)。漏出がないか、構造をチェックした。任意に、25〜28mL/分の[心臓前(pre-heart)]流れプローブ範囲で少なくとも5〜10秒間、ポンプを開始することにより「高速」テストを行って、細胞を導入する前にしっかりとしたECM接続を確実にすることができる。
100〜120mLの培地バイオリアクターに入れ、60mm培養プレートを心臓の先端の下に配置して、余剰細胞を受け、冠閉塞を回避し、かつ変異細胞からのアポトーシスシグナル伝達を回避した。27gaの針、および1ccのTB注射器を使用して細胞を注射した。およそ一回の注射当たりに70μLの細胞を心室壁に注射し、針の進入角度は垂線(normal)に対して15度であった。前方LV壁に10〜12回、心臓の先端に3〜4回、細胞を注射した。注射した細胞の合計容量は、約1.3〜1.5mLであるはずである。いくらかの逆流および細胞の欠失は予想される。心臓をバイオリアクター内に下ろし、ポンプおよびタンク(95%O2および5%CO2)を作動させ、漏出、流れの問題、およびその他のあらゆる技術的な問題について心臓をモニタリングした。翌日、リアクターを開け、ペース線を取り付けた。周波数:1 Hz;遅延:170 MS;持続時間:6 MS;電圧範囲:45〜60V;流速(IN):18〜22mL/分;流速(OUT):14〜18mL/分;差、約6〜7 mL/分で、ペース(連続的)を開始した。
以下のレシピは1リットルのものである。IMDMに、100mL FBS10%;5 mL Pen Strep;10 mL L-Glut;168μL Amp-B;1mLB-Mercap;20mLウマ血清;180mgCa2+;96mg Mg2+;および50mgビタミンCを添加する。
新生仔心筋細胞(NNCMまたはNEO細胞)をワージントンキットプレップから得た。NEO細胞は温度感受性であった。約35℃まで落ちると、同じように鼓動しなくなった。NEO細胞は、コンフルエントではないものの、24時間以内に2Dプレート上で鼓動を開始した。NEO細胞が増殖し一緒に鼓動し始めると、互いの上で増殖し、同期して鼓動し始める。最終的に、細胞は自らを機械的に制限し、通常10〜16日目で鼓動を止める。
図19は、脱細胞化心臓(右パネル)および死体心臓(左パネル)のSEM写真である。SEM写真は、左心室(LV)および右心室(RV)の両方について得た。写真から分かるように、灌流型脱細胞化心臓は、細胞成分を欠くが、脈管を含めて、無傷の心筋の空間的および構造的特徴を保持する。さらに、灌流型脱細胞化したマトリックスにおいて、細胞が完全に失われたにも関わらず、織り(w)、巻き(c)および筋交い(s)を含む構造的特徴が保持されているのを見ることができる。
実施例1-浸漬を用いた脱細胞化
本明細書に記載の灌流方法を用いて臓器(ラット肝臓、腎臓、心臓、肺、筋肉、皮膚、骨、脳、および血管系;ブタ肝臓、胆嚢、腎臓、および心臓)を脱細胞化した。
図21Aは、灌流型脱細胞化したブタ肝臓写真を示し、図21Bおよび21Cはそれぞれ、灌流型脱細胞化したブタ肝臓の管および実質性マトリックスのSEMを示す。これらの写真は、灌流型脱細胞化臓器の脈管およびマトリックスの完全性を示す。他方で、図22は、浸漬型脱細胞化したラット肝臓の全体図を示し、この場合には、低倍率(左)および高倍率(右)の両方においてマトリックスのほころびが見られる。
本発明は、詳細な説明と併せて説明してきたが、上記説明は、例示することを意図したものであり、添付の請求の範囲により定義される本発明の範囲を限定するものではないことが理解されよう。その他の局面、利点、および改変は、以下の請求の範囲内にある。
[1]
脱細胞化肝臓を提供する工程であって、該脱細胞化肝臓が肝臓の脱細胞化細胞外マトリックスを含み、該細胞外マトリックスが外面を含み、該細胞外マトリックスが血管樹を含めて脱細胞化前の細胞外マトリックスの形態を実質的に保持し、該外面が実質的に無傷である、前記工程と、
該脱細胞化肝臓と、約40,000以上の再生細胞とを、該細胞が該脱細胞化肝臓の内および上で生着、増殖および/または分化する条件下で接触させる工程と
を含む、肝臓の作製方法。
[2]
前記脱細胞化肝臓を、約2300万以上の再生細胞と接触させる、[1]記載の方法。
[3]
前記脱細胞化肝臓を、約3000万以上の再生細胞と接触させる、[1]記載の方法。
[4]
前記脱細胞化肝臓を、約3500万以上の再生細胞と接触させる、[1]記載の方法。
[5]
前記再生細胞が肝細胞である、[1]記載の方法。
[6]
前記再生細胞を、門脈を介して前記脱細胞化肝臓に注入する、[1]記載の方法。
[7]
前記再生細胞を、前記脱細胞化肝臓に注射する、[1]記載の方法。
[8]
脱細胞化肝臓またはその葉(lobe)含有部分を提供する工程であって、該脱細胞化肝臓またはその葉含有部分が、該肝臓またはその葉含有部分の脱細胞化細胞外マトリックスを含み、該細胞外マトリックスが外面を含み、血管樹などの該細胞外マトリックスが脱細胞化前の細胞外マトリックスの形態を実質的に保持し、該外面が実質的に無傷である、前記工程と、
脱細胞化肝臓またはその葉含有部分の葉と、再生細胞の集合とを、該再生細胞が該脱細胞化肝葉の内および上で生着、増殖および/または分化する条件下で接触させる工程と
を含む、肝葉の作製方法。
[9]
前記再生細胞が初代肝細胞である、[8]記載の方法。
[10]
前記再生細胞を、門脈を介して前記葉に注入する、[8]記載の方法。
[11]
臓器を提供する工程と、
該臓器の1つ以上の空洞、管、および/または導管においてカニューレを挿入して、カニューレ挿入した臓器を作製する工程と、
該1つ以上のカニューレ挿入を介して、該カニューレ挿入した臓器に第1の細胞破壊培地を灌流させる工程と、
対応する死体臓器と比較して、脱細胞化臓器に残っている核酸の量を決定する工程と
を含む、臓器を脱細胞化する方法。
[12]
前記灌流が、臓器組織1グラム当たり約2〜12時間である、[11]記載の方法。
[13]
前記灌流工程を、脱細胞化臓器における核酸が5%以下となるまで続ける、[11]記載の方法。
[14]
前記細胞破壊培地が1%SDSを含む、[11]記載の方法。
[15]
前記灌流が、カニューレ挿入した空洞、管および/または導管のそれぞれから多方向で行われる、[11]記載の方法。
[16]
副腎の脱細胞化細胞外マトリックスを含む脱細胞化哺乳動物副腎であって、
該細胞外マトリックスが外面を含み、血管樹などの該細胞外マトリックスが脱細胞化前の細胞外マトリックスの形態を実質的に保持し、該外面が実質的に無傷である、
前記脱細胞化哺乳動物副腎。
本発明の一以上の態様の詳細が、添付の図面および以下の記載に示されている。本発明のその他の特徴、目的、および利点は、図面および詳細な説明、ならびに請求の範囲から明らかになろう。
Claims (16)
- 脱細胞化肝臓を提供する工程であって、該脱細胞化肝臓が肝臓の脱細胞化細胞外マトリックスを含み、該細胞外マトリックスが外面を含み、該細胞外マトリックスが血管樹を含めて脱細胞化前の細胞外マトリックスの形態を実質的に保持し、該外面が実質的に無傷である、前記工程と、
該脱細胞化肝臓と、約40,000以上の再生細胞とを、該細胞が該脱細胞化肝臓の内および上で生着、増殖および/または分化する条件下で接触させる工程と
を含む、肝臓の作製方法。 - 前記脱細胞化肝臓を、約2300万以上の再生細胞と接触させる、請求項1記載の方法。
- 前記脱細胞化肝臓を、約3000万以上の再生細胞と接触させる、請求項1記載の方法。
- 前記脱細胞化肝臓を、約3500万以上の再生細胞と接触させる、請求項1記載の方法。
- 前記再生細胞が肝細胞である、請求項1記載の方法。
- 前記再生細胞を、門脈を介して前記脱細胞化肝臓に注入する、請求項1記載の方法。
- 前記再生細胞を、前記脱細胞化肝臓に注射する、請求項1記載の方法。
- 脱細胞化肝臓またはその葉(lobe)含有部分を提供する工程であって、該脱細胞化肝臓またはその葉含有部分が、該肝臓またはその葉含有部分の脱細胞化細胞外マトリックスを含み、該細胞外マトリックスが外面を含み、血管樹などの該細胞外マトリックスが脱細胞化前の細胞外マトリックスの形態を実質的に保持し、該外面が実質的に無傷である、前記工程と、
脱細胞化肝臓またはその葉含有部分の葉と、再生細胞の集合とを、該再生細胞が該脱細胞化肝葉の内および上で生着、増殖および/または分化する条件下で接触させる工程と
を含む、肝葉の作製方法。 - 前記再生細胞が初代肝細胞である、請求項8記載の方法。
- 前記再生細胞を、門脈を介して前記葉に注入する、請求項8記載の方法。
- 臓器を提供する工程と、
該臓器の1つ以上の空洞、管、および/または導管においてカニューレを挿入して、カニューレ挿入した臓器を作製する工程と、
該1つ以上のカニューレ挿入を介して、該カニューレ挿入した臓器に第1の細胞破壊培地を灌流させる工程と、
対応する死体臓器と比較して、脱細胞化臓器に残っている核酸の量を決定する工程と
を含む、臓器を脱細胞化する方法。 - 前記灌流が、臓器組織1グラム当たり約2〜12時間である、請求項11記載の方法。
- 前記灌流工程を、脱細胞化臓器における核酸が5%以下となるまで続ける、請求項11記載の方法。
- 前記細胞破壊培地が1%SDSを含む、請求項11記載の方法。
- 前記灌流が、カニューレ挿入した空洞、管および/または導管のそれぞれから多方向で行われる、請求項11記載の方法。
- 副腎の脱細胞化細胞外マトリックスを含む脱細胞化哺乳動物副腎であって、
該細胞外マトリックスが外面を含み、血管樹などの該細胞外マトリックスが脱細胞化前の細胞外マトリックスの形態を実質的に保持し、該外面が実質的に無傷である、
前記脱細胞化哺乳動物副腎。
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WO2014151739A1 (en) * | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Miromatrix Medical Inc. | Use of perfusion decellularized liver for islet cell recellularization |
US9888680B2 (en) | 2013-04-04 | 2018-02-13 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Functional recovery of human lungs for transplantation |
RU2539918C1 (ru) * | 2013-11-29 | 2015-01-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ получения тканеспецифического матрикса для тканевой инженерии паренхиматозного органа |
CN103751843B (zh) * | 2013-12-05 | 2015-09-16 | 南方医科大学珠江医院 | 制备全肝脏生物支架的试剂盒及全肝脏生物支架制备方法 |
KR101637548B1 (ko) | 2013-12-24 | 2016-07-20 | 연세대학교 산학협력단 | 세포 배양 및 세포 분화를 위한 탈세포화 기관 매트릭스 동결건조 분쇄물 및 이의 제조 방법 |
WO2015138999A1 (en) * | 2014-03-14 | 2015-09-17 | The General Hospital Corporation | Lung bioreactor |
CN103966092A (zh) * | 2014-04-10 | 2014-08-06 | 欧东波 | 器官脱细胞循环灌流再生培养瓶 |
WO2015181245A1 (en) * | 2014-05-27 | 2015-12-03 | Novahep Ab | Bioengineered allogeneic valve |
CA2959526C (en) * | 2014-09-02 | 2023-12-12 | United Therapeutics Corporation | Automated bioreactor system, system for automatically implementing protocol for decellularizing organ, and waste decontamination system |
WO2016048243A1 (en) * | 2014-09-23 | 2016-03-31 | Nanyang Technological University | A bioreactor module, a bioreactor system and methods for thick tissue seeding and cultivation in an hirearchical organization and physiological mimiking conditions |
JP2016185115A (ja) * | 2015-03-27 | 2016-10-27 | シスメックス株式会社 | 臓器灌流方法および臓器灌流装置 |
CN106148270B (zh) * | 2015-04-13 | 2019-09-06 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种用于生物人工肝支持系统的三维微肝组织单元的构建方法 |
CN104771788B (zh) * | 2015-05-05 | 2017-08-25 | 北京帝康医药投资管理有限公司 | 一种基于大网膜脱细胞基质的组织工程皮肤及其构建方法 |
CN106693055A (zh) * | 2015-07-26 | 2017-05-24 | 复旦大学附属华山医院 | 一种小脑脱细胞再生生物支架及其制备方法和用途 |
WO2017044810A1 (en) | 2015-09-11 | 2017-03-16 | The General Hospital Corporation | Regeneration of a functional pulmonary vascular bed |
WO2017136786A1 (en) * | 2016-02-05 | 2017-08-10 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Rigionally specific tissua-derived extracellular metrix |
KR20180133253A (ko) | 2016-04-05 | 2018-12-13 | 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 미네소타 | 조직에 매립되어 있는 구조적 구성요소를 갖는 공학처리된 조직, 및 제조 및 사용하는 방법 |
ITUA20164238A1 (it) * | 2016-06-09 | 2017-12-09 | G F S P A | Metodo e apparato per la decellularizzazione di organi |
CN107621462B (zh) * | 2016-07-13 | 2020-03-31 | 王志伟 | 一种组织透明化液sut及其制备和应用 |
CN106267345B (zh) * | 2016-08-04 | 2019-03-26 | 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 | 一种具有生物活性的再生期器官去细胞生物支架的制备方法及其产品和应用 |
EP3509651B1 (en) * | 2016-09-06 | 2022-12-28 | Miromatrix Medical Inc. | Use of resected liver serum for whole liver engineering |
CN107412865A (zh) * | 2016-10-27 | 2017-12-01 | 浙江保尔曼生物科技有限公司 | 高强度的具有抗凝血功能的去细胞化肾脏生物支架及制备方法 |
CN107096070B (zh) * | 2017-03-09 | 2020-08-21 | 中国医学科学院阜外医院 | 一种脱细胞肺支架及其制备方法 |
US20210162125A1 (en) * | 2018-02-28 | 2021-06-03 | Pop Test Oncology Llc | Medical Devices and Uses Thereof |
CN108465126A (zh) * | 2018-05-25 | 2018-08-31 | 中国人民解放军总医院 | 模拟生理过程的膀胱脱细胞基质的制备装置 |
US20220106570A1 (en) * | 2019-01-30 | 2022-04-07 | Nagasaki University | Disease model |
WO2020191374A1 (en) * | 2019-03-21 | 2020-09-24 | Miromatrix Medical Inc. | Improved decellularization of isolated organs |
CA3191775A1 (en) * | 2020-09-04 | 2022-03-10 | Narendra R. Vyavahare | Systems and methods for processing tissue |
US11998662B1 (en) | 2021-06-09 | 2024-06-04 | Reprise Biomedical, Inc. | Biologic matrix for a wound site and related methods |
CN114949357B (zh) * | 2022-05-20 | 2023-08-01 | 上海市第十人民医院 | 一种阴茎脱细胞支架及其制备方法和应用 |
WO2024104780A1 (en) | 2022-11-18 | 2024-05-23 | Baxter Healthcare Sa | Extracorporeal blood treatment for organ support |
CN117100912A (zh) * | 2023-06-08 | 2023-11-24 | 北京科昕恒业生物科技有限公司 | 一种肺脏脱细胞基质及其制备方法 |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH1176400A (ja) * | 1997-09-09 | 1999-03-23 | Masahito Nagaki | 人工臓器 |
JP2000004870A (ja) * | 1998-06-23 | 2000-01-11 | Terumo Corp | 細胞支持基材、培養装置および液体処理装置 |
US20050249816A1 (en) * | 1999-12-29 | 2005-11-10 | Wake Forest University Health Services | Tissue engineered liver constructs |
JP2007222391A (ja) * | 2006-02-23 | 2007-09-06 | Kuraray Medical Inc | バイオ人工臓器 |
JP2008541717A (ja) * | 2005-05-26 | 2008-11-27 | フレゼニウス メディカル ケア ドイッチェランド ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 肝臓前駆細胞 |
JP2009505752A (ja) * | 2005-08-26 | 2009-02-12 | リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミネソタ | 臓器および組織の脱細胞化および再細胞化 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6479064B1 (en) * | 1999-12-29 | 2002-11-12 | Children's Medical Center Corporation | Culturing different cell populations on a decellularized natural biostructure for organ reconstruction |
CA2445110A1 (en) * | 2001-05-01 | 2002-11-07 | Universite Du Quebec A Montreal | Tridimensional biocompatible support structure for bioartificial organs and uses thereof |
WO2003085100A1 (fr) * | 2002-04-04 | 2003-10-16 | Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. | Procede de culture de cellules de foie sur une duree prolongee |
WO2007002228A1 (en) * | 2005-06-23 | 2007-01-04 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods for ex vivo propagation of adult hepatic stem cells |
-
2010
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-
2011
- 2011-10-02 IL IL215463A patent/IL215463A0/en unknown
-
2015
- 2015-08-24 JP JP2015164446A patent/JP2016039903A/ja active Pending
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2017
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2019
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2021
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2022
- 2022-05-17 JP JP2022080860A patent/JP2022107023A/ja active Pending
-
2023
- 2023-12-04 JP JP2023204715A patent/JP2024015176A/ja active Pending
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH1176400A (ja) * | 1997-09-09 | 1999-03-23 | Masahito Nagaki | 人工臓器 |
JP2000004870A (ja) * | 1998-06-23 | 2000-01-11 | Terumo Corp | 細胞支持基材、培養装置および液体処理装置 |
US20050249816A1 (en) * | 1999-12-29 | 2005-11-10 | Wake Forest University Health Services | Tissue engineered liver constructs |
JP2008541717A (ja) * | 2005-05-26 | 2008-11-27 | フレゼニウス メディカル ケア ドイッチェランド ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 肝臓前駆細胞 |
JP2009505752A (ja) * | 2005-08-26 | 2009-02-12 | リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミネソタ | 臓器および組織の脱細胞化および再細胞化 |
JP2007222391A (ja) * | 2006-02-23 | 2007-09-06 | Kuraray Medical Inc | バイオ人工臓器 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2010120539A3 (en) | 2011-02-03 |
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IL215463A0 (en) | 2011-12-29 |
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