CN104379726A - 生物人工过滤器官 - Google Patents

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Abstract

通过在负压环境中用内皮细胞或内皮细胞祖细胞、以及用上皮细胞或上皮细胞祖细胞对支架进行再接种，可由器官支架制造生物人工过滤器官。所述负压促进了对所述支架进行更大程度的再接种。

Description

生物人工过滤器官
相关申请的交叉引用
根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求美国临时申请号61/635,043(2012年4月18日提交)的优先权，以引用的方式将其整体内容并入本文。
政府支持
本发明是在由美国国立卫生研究院授予的合同DP2OD008749-01的美国政府支持下作出的。美国政府对本发明拥有一定的权利。
技术领域
本发明针对生物人工过滤器官(bioartificial filtration organ)和用于制造该器官的方法和系统。更具体而言，本发明针对生物人工过滤器官及其制造方法，所述生物人工过滤器官例如为肾和肝型器官。
背景技术
在美国，有近一百万终末期肾病(ESRD)患者，且每年新发病例超过100,000例((CDC)，C.f.D.C.a.P.National chronic kidney disease factsheet:general information and national estimates on chronic kidney diseasein the United States，2010.(U.S.Department of Health and Human Services(HHS)，CDC，Atlanta，GA，2010))。尽管血液透析提高了终末期肾病(ESRD)患者的存活率，然而移植仍然是唯一可行的有效治疗。在美国，每年进行约18,000例肾移植，然而目前仍有近10万美国人在等待供体肾(OPTN：Organ Procurement and Transplantation Network Website，Vol.2012)。不断上升的患者需求与停滞的供体器官数量导致了取决于诊断，平均等候时间超过三年、等待名单死亡率达到5-10％。尽管肾移植免疫学有所进展(Kawai，T.等，HLA-mismatched renal transplantation withoutmaintenance immunosuppression.N Engl J Med 358，353-361(2008))，仍有20％的接受者在移植5年内会出现急性排异反应，并且约40％的接受移植(尸体供体移植体(deceased-donor grafts))个体在接受移植后的十年内死亡或丧失移植体功能。通过在需要时提供移植体以避免在ESRD中对长期血液透析的需要，建立自体(autologous)生物工程化肾理论上可以绕开这些问题。
肾执行过滤、分泌、吸收和合成功能，从而维持体液内稳态和电解质平衡，并清除代谢物和毒素。血液过滤和血液透析使用无细胞半透膜来替代部分(但并非全部)上述功能。已对生物工程化的活(viable)管状结构进行了若干尝试，以为血液过滤补充细胞依赖性功能(Humes，H.D.，Krauss，J.C.，Cieslinski，D.A.&Funke，A.J.，Tubulogenesis fromisolated single cells of adult mammalian kidney:clonal analysis with arecombinant retrovirus.The American journal of physiology 271，F42-49(1996)；Humes，H.D.，MacKay，S.M.，Funke，A.J.&Buffington，D.A.，Tissue engineering of a bioartificial renal tubule assist device:in vitrotransport and metabolic characteristics.Kidney international 55，2502-2514(1999))。当将血液过滤装置与生物工程化肾小管结合时，所得到的生物人工肾(BAK)替代了患尿毒症的犬中的肾功能(Humes，H.D.，Buffington，D.A.，MacKay，S.M.，Funke，A.J.&Weitzel，W.F.，Replacementof renal function in uremic animals with a tissue-engineered kidney.NatBiotechnol 17，451-455(1999))，并暂时改善了急性肾衰竭患者的肾功能(Humes，H.D.等，Initial clinical results of the bioartificial kidneycontaining human cells in ICU patients with acute renal failure.Kidneyinternational 66，1578-1588(2004)；Humes，H.D.，Weitzel，W.F.&Fissell，W.H.，Renal cell therapy in the treatment of patients with acute and chronicrenal failure.Blood Purif 22，60-72(2004))。在另一方法中，当移植到无肾大鼠中时，肾原基(kidney primordia)已显示出在体内发育为功能性器官并延长了寿命(Rogers，S.A.&Hammerman，M.R.，Prolongationof life in anephric rats following de novo renal organogenesis.Organogenesis 1，22-25(2004))。使得肾辅助设备更便携(Gura，V.，Macy，A.S.，Beizai，M.，Ezon，C.&Golper，T.A.，Technical breakthroughsin the wearable artificial kidney(WAK)，Clin J Am Soc Nephrol 4，1441-1448(2009))、或甚至是可植入(Fissell，W.H.&Roy，S.，Theimplantable artificial kidney，Semin Dial 22，665-670(2009))的设备已经达到了临床前评估阶段，并为改善末期肾衰竭患者的生活质量保留了极大希望。开发完全可植入的永久移植体的一个关键步骤在于开发支架材料，所述支架材料促进过滤和重吸收、支持从接种(seeded)细胞再生为功能性组织、并且允许经由血液灌注的完全接受者整合。
发明内容
本发明针对用于制造生物人工过滤器官(例如肾或肝)的方法和系统。根据本发明，对尸体的(cadaveric)全器官进行脱细胞(decellularized)，从而制造细胞外基质(ECM)支架。可通过用内皮细胞和上皮细胞进行接种来对ECM支架进行再殖(repopulate)。根据本发明，接种可以通过经肾动脉灌注内皮细胞(例如人脐静脉内皮细胞(HUVEC))和经输尿管滴注悬浮的新生儿肾细胞(NKC)来实现。根据一些实施方式，可在接种室中进行细胞递送，所述接种室在接种期间为ECM支架提供受控的压力和温度。根据本发明的一些实施方式，对ECM支架施加0～80cm H2O范围内的环境真空作用，从而在支架上产生跨肾(transrenal)压力梯度。接种步骤可进行至肾构建体变得稳定，然后可将器官转移到灌注生物反应器，以提供全器官培养条件，以将器官培养至进一步成熟的水平。
根据本发明的一些实施方式，可在接种系统中对脱细胞的全器官进行接种。接种系统可包含第一室，所述第一室可适于将ECM支架支持或悬挂在第一室的底部表面上方，并为ECM支架的细胞接种提供受控的压力和/或温度。可提供真空泵和压力传感器，使得能够例如使用专用控制器或编程计算机对第一室内的环境压力进行控制。
可将ECM支架的肾动脉连接至配置为含有动脉内皮细胞悬液的细胞储液池(reservoir)，所述动脉内皮细胞悬液可在受控的压力下被泵入肾动脉中。可将压力传感器连结至将动脉内皮细胞供给至肾动脉中的管线(tube)，并可将传感器输出连接至控制器或编程计算机，所述控制器或编程计算机控制泵的运行，从而控制进入肾动脉的压力。可将ECM支架的输尿管连接至配置为含有上皮细胞悬液的细胞储液池，所述上皮细胞悬液可在受控的压力下被泵入输尿管中。可将压力传感器连结至将上皮细胞供给至输尿管中的管线，并可将传感器输出连接至控制器或编程计算机，所述控制器或编程计算机控制泵的运行，从而控制进入输尿管的压力。可将ECM支架的肾静脉连接至配置为含有静脉内皮细胞悬液的细胞储液池，所述静脉内皮细胞悬液可在受控的压力下被泵入肾静脉中。可将压力传感器连结至将静脉内皮细胞供给至肾静脉中的管线，并可将传感器输出连接至控制器或编程计算机，所述控制器或编程计算机控制泵的运行，从而控制进入肾静脉的压力。
还可将第一室、动脉内皮细胞悬液、上皮细胞悬液和静脉内皮细胞悬液保持在温度受控的环境中。根据一些实施方式，可将第一室、动脉内皮细胞悬液、上皮细胞悬液和静脉内皮细胞悬液包含于第二室中，所述第二室包含连接至控制器或编程计算机的加热元件和温度传感器。温度传感器允许控制器或编程计算机监控细胞接种环境的温度，并对加热元件进行控制，从而控制细胞接种环境温度。
根据本发明的其它实施方式，可使用脱细胞肺支架形成生物人工肾。根据本发明的其它实施方式，可使用脱细胞肺支架形成生物人工肝。
根据本发明的其它实施方式，形成的人工ECM支架在接种后可制造生物工程化肾，所述生物工程化肾提供了在血管腔(vascular space)和泌尿管腔(urinary space)之间的逆流过滤(counter-current filtration)。在该实施方式中，血管结构以预定构造形成，其提供第一方向的流动；泌尿管提供相反方向的逆流流动，从而引起溶质和水从血管转移至泌尿管。
根据本发明的实施方式，可提供如下一种或多种功能。在一些实施方式中，提供了基于将两种以上细胞类型引入脱细胞基质来制造生物人工过滤全器官的方法。该方法可以包括在脱细胞器官支架上施加真空压力梯度，以促进上皮细胞有效进入具有盲端的(blind-ended)生物过滤区室(compartment)。类似地，提供了通过将两种以上细胞类型引入脱细胞基质而制造的生物人工过滤全器官。细胞类型包括再接种(re-seeds)和重构(re-constitutes)器官的功能性血管腔的至少一种内皮细胞类型或祖细胞；以及再接种和重构功能性上皮生物过滤区室的至少一种上皮细胞类型或其祖细胞，血液流过(transits)血管腔时，所述生物过滤区室与血液供给交界。在一些实施方式中，本发明使得能够在生物人工构建体中进行过滤和重吸收。在一些实施方式中，获得了生物人工肾。在一些实施方式中，获得了生物人工肝。在一些实施方式中，提供了用于制备执行一种或多种生物过滤功能的生物人工器官的系统。
阅读了以下附图、具体实施方式和所附权利要求书之后，将更完全地理解本发明的这些和其它功能以及本发明本身。
附图说明
图1示出了根据本发明一些实施方式的细胞接种系统的示意图。
图2A和图2B示出了根据本发明一些实施方式的来自脱细胞肺支架的生物工程化肾的示意图。
图3A和图3B示出了根据本发明一些实施方式的来自脱细胞肺支架的生物工程化肝的示意图。
图4说明了对完整大鼠肾的灌注脱细胞。(a)进行顺行(antegrad)肾动脉灌注脱细胞的尸体大鼠肾的缩时(time lapse)照片。Ra，肾动脉；Rv，肾静脉；U，输尿管。新鲜分离的肾(左)；SDS灌注6小时后(中)；SDS灌注12小时后(右)。(b)相应的灌注脱细胞期间大鼠肾Movat’sPentachrome染色的代表性切片(黑色箭头显示肾小球囊(Bowman’scapsule)，比例尺为250μm)。(c)尸体大鼠肾切片的代表性免疫组化染色，示出弹性蛋白(黑色箭头指向皮质管中膜(tunica media of corticalvessels)的弹性纤维)、IV型胶原和层粘连蛋白(黑色箭头强调肾小球基底膜)的分布(比例尺为250μm，插入图为40×)。(d)对弹性蛋白、IV型胶原和层粘连蛋白进行免疫组化染色后的相应的脱细胞大鼠肾组织切片，确认在无细胞状态下保留了细胞外基质蛋白(比例尺为250μm，插入图为40×)。(e)尸体大鼠肾小球的透射电镜照片(TEM)，示出由肾小球囊(BC)包围的毛细血管(C)、系膜基质(M)和足细胞(P)(比例尺为10μm)。(f)脱细胞大鼠肾小球的TEM，显示出脱细胞肾中无细胞(acellularity)而保留由肾小球囊(BC)包封的毛细血管(C)、系膜基质(M)和肾小球囊腔(Bowman’s space)(比例尺为10μm)。(g-i)对尸体大鼠肾组织和脱细胞大鼠肾组织中的DNA、总胶原和硫酸糖胺聚糖的生化定量(平均值±SD，p值由学生t检验确定)，显示灌注脱细胞后DNA含量下降，而保留胶原和糖胺聚糖(ns：不显著)。(j)尸体大鼠肾和脱细胞大鼠肾的组织学横切片(histologic cross sections)的形态测定分析。脱细胞肾进行脱水并包埋，使得每mm2肾小球的数量明显增加，肾小球直径和肾小球囊腔减小。每一横切片中肾小球的总计数在脱细胞后保持不变。
图5说明了脱细胞大鼠肾的细胞接种和全器官培养。(a)细胞接种装置的示意图，所述装置使得能够经由附接至肾动脉(ra)的端口A进行内皮细胞接种、并经由附接至输尿管(u)的端口B进行上皮细胞接种，同时器官室中的负压施加至端口C，从而产生跨肾压力梯度。(b)生物反应器中全器官培养的示意图，所述生物反应器使得能够经由附接至肾动脉(ra)的端口A进行组织灌注、并经由端口B排出(drainage)至储液池(u：输尿管，k：肾)。(c)全器官培养中接种有细胞的脱细胞大鼠肾。(d)重新内皮化的肾构建体的荧光显微照片。CD31(红)和DAPI阳性的HUVEC在整个移植体横切片的血管树上排列(图像重构，左侧，比例尺为500μm)并形成直至肾小球毛细血管的单层(右侧图，白色箭头指向内皮细胞，比例尺为50μm)。(e)重新内皮化和重新上皮化的肾构建体的荧光显微照片，示出肾小球中表达podocin(绿色)的细胞和内皮细胞(CD31阳性，红色)的植入(engraftment)(左侧图，比例尺为25μm，白色箭头标记肾小球囊，白色星号标记血管极)；肾小管(tubuli)内基底侧分布(basolateral distribution)中的表达Na/K ATPase的细胞(绿色)的植入，类似于具有适当核极性的近端肾小管结构(左中侧图，比例尺为10μm，T为肾小管，Ptc为肾小管周围毛细血管)；肾小管内表达E-钙粘蛋白(E-cadherin)的细胞的植入，类似于远端肾小管结构(右中侧图，比例尺为10μm，T为肾小管，Ptc为肾小管周围毛细血管)；重新内皮化管道(vessel)的3D重构导致形成肾小球(白色箭头标记肾小球囊，白色星号标记血管极)。(f)整个移植体横切片的图像重构，证实了表达podocin的上皮细胞的植入(比例尺为500μm)。插入图示出了位点特异性(右上方插入图)和非特异性(下方插入图)的细胞植入。大鼠尸体肾切片的代表性免疫组化染色示出肾小球中的podocin表达(中间图，比例尺为50μm)。(g)大鼠尸体肾小球的podocin的免疫组化染色(比例尺为50μm)。(h)再生肾小球中的nephrin表达(左侧图)和尸体对照中的nephrin表达(右侧图，比例尺为50μm)。(i)再生近端肾小管结构中的水通道蛋白-1(aquaporin-1)表达(左侧图)和尸体对照中的水通道蛋白-1表达(右侧图，比例尺为50μm)。(j)再生近端肾小管上皮细胞中的Na/K ATPase表达(左侧图)和尸体对照中的Na/K ATPase表达(右侧图，比例尺为50μm)。(k)再生远端肾小管上皮细胞中的E-钙粘蛋白表达(左侧图)和尸体对照中的E-钙粘蛋白表达(右侧图，比例尺为50μm)。(l)生物工程化肾构建体切片的代表性免疫组化染色，示出肾小球中的β-1整合素表达(左侧图)。(m)再生肾小球的代表性透射电镜照片，示出带有红血细胞(RBC)的毛细血管以及沿肾小球基底膜的足突(黑色箭头)(左侧图，比例尺为2μm)；粘附于肾小球基底膜的足细胞(P)的透射电镜照片(黑色箭头)(右侧图，比例尺为2μm，BC为肾小球囊)。(n)再生肾移植体横切片中肾小球(白色箭头)的扫描电镜照片(血管蒂(vascular pedicle)*，比例尺为10μm)。(o)尸体大鼠肾和再生大鼠肾组织学横切片的形态测定分析。在再生肾中，每横切片的肾小球、平均肾小球直径和肾小球囊腔保持不变。与尸体肾相比，再生肾中的肾小球毛细血管腔(lumen)似乎较小，这是由于相比于尸体肾小球毛细血管内皮细胞的数量，再生构建体中HUVEC的数量增加。
图6示出了生物工程化肾构建体的体外(in vitro)功能。(a)经历体外测试的生物工程化大鼠肾构建体的照片。经由插管的(canulated)肾动脉(Ra)和肾静脉(Rv)对肾进行灌注，经由输尿管(U)将尿液排出。白色箭头标出了排出管线(tubing)中的尿液/空气界面。(b)对在80mmHg灌注的脱细胞肾、尸体肾和再生肾以及在120mmHg灌注的再生肾(再生*)的平均尿液流速(mL/min)进行总结的柱状图。脱细胞肾表现出多尿(polyuric)状态，而与尸体肾相比，再生构建体相对少尿。(c)示出在80mmHg灌注的尸体肾、脱细胞肾和再生肾以及在120mmHg灌注的再生肾(再生*)的平均肌酐(creatinine)清除的柱状图。随着灌注压力上升，再生肾中的肌酐清除有所改善。(d)分离的尸体肾(黄色)、脱细胞肾(蓝色)以及再生肾(橙色)构建体的尿分析。组间显著差异以单因素方差分析和Bonferroni事后修正后获得的*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001列出。溶质的驻留(retention)分数(R)、重吸收分数(r)和排泄(excretion)分数(e)以所计算的过滤量的百分数表示。(e)示出尸体肾、脱细胞肾和再生肾的血管阻力(resistance)的柱状图，显示随着脱细胞血管阻力有所增加，而在再生肾中部分恢复。(f)基于组织学和体外功能测试结果的尸体肾、脱细胞肾和再生肾功能的示意模型。
图7示出了原位(orthotopic)移植和体内(in vivo)功能。(a)剖腹术、左肾切除术和再生左肾构建体原位移植后的大鼠腹膜照片。将接受者的左肾动脉(Ra)和左肾静脉(Rv)连接至再生肾的肾动脉和静脉。再生肾的输尿管(U)保持插管状态，以收集植入后产生的尿液。(b)松开(unclamping)左肾动脉(Ra)和肾静脉(Rv)后的移植再生肾构建体的照片，示出移植体的均匀灌注，无出血迹象。(c)移植再生肾的复合组织学图像，确认了整个肾横切片中的灌注(比例尺为500μm)。(d)更高放大倍数的再生肾切片，示出血管中的红细胞进入肾小球，而不存在间质(interstitial)出血。
图8示出了灌注脱细胞大鼠肾的台盼蓝灌注。在经由肾动脉灌注台盼蓝的脱细胞肾的照片中，强调了段动脉、叶间动脉、弓形动脉和小叶间动脉，表明灌注脱细胞后保留的血管导管(vascular conduits)。
具体实施方式
本发明针对用于制造生物人工过滤器官(例如肾或肝)的方法和系统。根据本发明，对尸体肾和肺进行脱细胞，以产生全器官的细胞外基质(ECM)支架。可通过用内皮细胞和上皮细胞对支架进行接种，对ECM支架进行再殖。根据本发明，可在温度和/或压力受控的环境中进行接种。
图1示出了根据本发明一些实施方式的细胞接种系统100的示意图。细胞接种系统100可以包含接种室112，接种室112可具有足够大小，以包封(enclose)待接种的全过滤器官支架200，并提供受控的压力环境。接种室112可包含多个端口，所述端口使得可将流体(例如气体和液体)泵入和泵出接种室112。支架200可包含多根管道(vessels)，包括肾动脉a、肾静脉v和输尿管u，这些管道可用于将细胞灌注至支架200中。
接种室112可包含压力控制系统，其包含可连结至控制器160的真空泵122及压力传感器124。控制器160可响应来自于压力传感器124的信号(所述信号表示接种室112内部的压力)而控制真空泵122，从而控制接种室112内部的压力。真空泵122可与穿过接种室112中的一个端口的管线相连。控制器160可以是专用压力控制器，其适于并被配置为控制真空泵122，从而将接种室112中的压力保持在设定水平。或者，控制器160可以是编程计算机，其将压力控制在设定水平、或根据可随时间改变压力的程序来控制压力。根据本发明的一些实施方式，压力控制系统可以将接种室112中的压力保持在0cm～80cm H2O的范围内。根据本发明的一些实施方式，压力控制系统可以将接种室112中的压力保持在10cm～70cm H2O的范围内。根据本发明的一些实施方式，压力控制系统可以将接种室112中的压力保持在20cm～60cm H2O的范围内。根据本发明的一些实施方式，压力控制系统可以将接种室112中的压力保持为高于80cm H2O。可根据支架孔隙度和待接种细胞的性质来确定接种室中保持的压力。根据一些实施方式，可基于待接种在支架中的细胞数量，凭经验来确定压力。
可将支架与一个或多个提供用于接种的细胞的储液池连接。如图1所示，可为能够提供进入支架200的流路的各管道a、v和u提供单独的储液池。当支架200是肾时，可通过管线将输尿管u流路连接至含有上皮细胞悬液134的储液池132。可使用连接至控制器160的泵136以预定压力将上皮细胞悬液134泵入输尿管u。可将连接至控制器160的压力传感器138连接至该管线，来监测泵入支架200的上皮细胞悬液134的压力。可通过管线将支架200的动脉管道a连接至含有动脉内皮细胞悬液144的储液池142。可使用连接至控制器160的泵146以预定压力将动脉内皮细胞悬液144泵入动脉a。可将连接至控制器160的压力传感器148连接至该管线，来监测泵入支架200的动脉内皮细胞悬液144的压力。可通过管线将支架200的静脉管道v连接至含有静脉内皮细胞悬液154的储液池152。可使用连接至控制器160的泵156以预定压力将静脉内皮细胞悬液154泵入静脉v。可将连接至控制器160的压力传感器158连接至该管线，来监测泵入支架200的静脉内皮细胞悬液154的压力。各储液池132、142和152可包含混合组件(如磁混合器m1、m2、m3和搅拌棒s1、s2、s3)，以维持所述悬液。
根据本发明的一些实施方式，待接种的细胞的量将取决于器官的大小和性质。根据本发明的一些实施方式，对于支架200而言，每1.0～1.5克支架200的组织可接种约1000万～1亿个上皮细胞，每1.0～1.5克支架200的组织可接种约1000万～1亿个动脉内皮细胞，并且每1.0～1.5克支架200的组织可接种约1000万～1亿个静脉内皮细胞。根据本发明的一些实施方式，各储液池可填充有约50万～500万个细胞/cc的溶液。
在接种过程中，可将接种室112保持在预定温度。根据一些实施方式，可将接种室112包封在加热室110中，加热室110可包含连接至控制机制的加热元件116和温度传感器118，所述控制机制对加热元件进行操作，以将温度保持在设定的水平或范围。根据本发明的一些实施方式，可将温度传感器118和加热元件116连接至控制器120，控制器120可以响应来自温度传感器的信号而对加热元件116进行控制，从而对接种室112的温度进行控制。根据本发明的其它实施方式，加热室还可包含储液池132、142和152，从而将细胞悬液保持在相同温度。根据一些实施方式，在接种过程中，可将接种室112维持在20℃～40℃的范围内。
根据本发明的一些实施方式，支架200可来自提供动脉连接、静脉连接以及第三连接的肾、肺或另一过滤器官，所述第三连接连接至单独通路，为制得的过滤器官提供过滤输出。在肾中，第三连接对应于输尿管；在肺中，第三连接对应于气管和气腔(air space)。在所建立的器官中，动脉连接提供血液流入，静脉连接提供血液流出，器官内的膜或其它结构将至少一种溶质和水从血液转移至第三连接。因此，例如，可以由肾支架或肺支架制造生物人工肾。在另一实例中，可以由肾支架或肺支架制造生物人工肝。
图2A和图2B示出来自脱细胞肺支架200'的生物工程化肾的示意图。如图2A所示，肺支架200'包含动脉连接202、静脉连接204和气管连接206。通过用动脉内皮细胞接种动脉连接202，动脉连接202将成为肾动脉。通过用静脉内皮细胞接种静脉连接204，静脉连接204将成为肾静脉；通过用上皮细胞接种气管连接206，气管连接206将成为输尿管。图2B示出了血液流入肾动脉202并流出肾静脉204、而尿液则从先前为肺气道的气管206排出的示意图。
图3A和图3B示出来自脱细胞肺支架的生物工程化肝的示意图。如图3A所示，该支架包含动脉连接、静脉连接和气管(或支气管)连接。通过用动脉内皮细胞接种动脉连接，动脉连接将成为肝动脉。通过用静脉内皮细胞接种静脉连接，静脉连接将成为肝静脉；通过用上皮细胞或肝细胞接种气管连接，气管连接将成为肝管。图3B示出了血液流入肝动脉并流出肝静脉、而胆汁则从先前的肺气道排出的示意图。
根据本发明的一些实施方式，支架可以是三维的全器官支架，该支架包含用于将再接种的器官连接至血液供给的至少一根动脉管道和至少一根静脉管道。在植入后，再接种的器官可经由动脉管道接收血液并经由静脉管道送回血液。根据本发明的一些实施方式，过滤器官至少可部分地发挥从经由连接(connections)流至再接种器官的动脉管道和静脉管道的血液供给中除去滤液的功能。此外，过滤器官还可以包含接收滤液(例如尿液或胆汁)的区室或腔，并且包含输出管道，使得器官能够通过与例如动物的尿道或消化道的连接而排出滤液。过滤器官的实例包括肾和肝，肾的输出管道是输尿管，肝的输出管道是肝管。当使用肺支架并接种肾细胞或肝细胞时，气管或支气管通道将成为所述输出管道。
根据本发明的一些方法，可通过对人和非人的尸体器官(包括例如肾、肺和类似器官)进行脱细胞，来制造具有完整和可灌注的血管和管状组件的过滤器官细胞外基质(ECM)支架。可检查ECM支架以确认ECM组合物(composition)是完整并保留了微结构(microarchitecture)的。可通过利用功能性内皮细胞和上皮细胞再殖ECM支架，来制造根据本发明的一些生物人工器官。根据本发明的一些实施方式，例如图1所示及本文中所描述的，所述再殖可通过在接种室中对ECM支架进行再接种来进行。再接种后，可通过动脉灌注在体外仿生培养中对接种的ECM支架进行培养，以促进功能性肾组织和相关肾功能(包括过滤、重吸收和产生尿液)的形成。或者，可通过移植入宿主体内(替换现有器官或在其基础上增加)来对接种的ECM支架进行体内培养。
支架脱细胞
对肾和肺组织进行脱细胞，以生成适于借助合适的供体细胞进行再接种或再细胞化的细胞外基质支架，这在本文的实施例中以及例如以下文献中有所描述：Mishra等，2012，Ann.Thorac.Surg.93：1075-1081(肺脱细胞)；以及Song等，2011，Ann.Thorac.Surg.92：998-1005(肺脱细胞)。也请参见US2009/0202977，以引用的方式将其整体内容并入本文，该专利文献展示了对许多不同的实体器官(包括心脏、肝、肺和肾)进行的脱细胞。
用于支架再细胞化的细胞：
对于如本领域中已知的、或是如本文所述的例如来自供体肾或供体肺的脱细胞支架，可用血管内皮细胞或血管内皮细胞祖细胞对其进行再接种，从而重建(re-establish)脱细胞器官的血管系统；并可用上皮细胞对其进行再接种，从而重建功能性上皮。如果滴注肾上皮细胞，由此产生的生物人工器官可以执行带有尿液输出的肾过滤功能。如果例如滴注的是肝上皮细胞，则该生物人工器官可以执行带有胆汁输出的肝过滤功能。在任一情况下，用于对脱细胞支架进行再细胞化的细胞可以来自于例如供体器官或器官，或者替代地，由干细胞分化而来，所述干细胞可以是例如来自对接受者而言是异源供体源或自体的胚胎干细胞、诱导多能干细胞或成体干细胞。
在一些实施方式中，可用如本文所述的内皮细胞群和上皮细胞群对组织支架(例如脱细胞肾或肺支架)进行接种，所述细胞群随后可原位增殖，使得器官完全再殖或再生。也就是说，预期在一些实施方式中在支架上会有显著的细胞增殖，从而建立功能性器官组织。该增殖通常在将接种的组织支架在如本文所述的生物反应器系统中孵育时发生，在所述生物反应器系统中，例如在大体上(substantially)连续的流动下，用培养基对血管系统进行灌注。若有必要，可通过向培养基中添加合适的生长因子来对细胞增殖进行刺激。例如，可通过添加VEGF和/或其它生长因子以及本领域已知的激素来对内皮细胞增殖进行刺激。可应用类似方法、使用适合于所涉及的细胞类型的因子对上皮细胞扩增进行刺激。对用于再细胞化的各种细胞的制备如下所述。
血管内皮细胞：在一些实施方式中，可使用从人产后脐带分离的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)作为内皮细胞祖细胞来源，所述内皮细胞祖细胞可被扩增并用于对如下文所述的实施例中的脱细胞支架的血管系统(vasculature)进行接种。这些未成熟的内皮细胞在本文所述的支架中的适当植入和功能表明，甚至可使用相对未成熟的内皮细胞，并且支架细胞外基质可为细胞的排列、附着和进一步成熟提供辅助(cues)，从而发挥动脉血管内皮和静脉血管内皮的功能。
或者，人内皮细胞可来自成年供体组织。用于对来自成体组织的人内皮细胞进行分离和大规模扩增的方法在例如以下文献中有所描述：Hofmann等，2009，J.Vis.Exp.32:e1524，题为“Isolation and Large ScaleExpansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells”。简要来说，所述方法包括使用肝素化、但除此之外未经其它处理的人外周血作为人内皮细胞集落形成祖细胞(ECFC)的来源。Hofmann等的方法非常适合于提供大量尚未在动物血清存在下培养的人内皮细胞祖细胞，以及大量在例如皮下引入小鼠模型中时形成功能性血管结构的人内皮细胞祖细胞。
作为另一替代，可使用诱导分化为血管内皮细胞或血管内皮细胞祖细胞表型的胚胎干(ES)细胞来再殖脱细胞支架的血管腔。鼠科动物ES细胞分化为血管内皮细胞表型在例如以下文献中有所描述：Darland等，2001，Curr.Top.Dev.Biol.52：107-149；以及Hirashime等，1999，Blood93：1253-1263，以引用的方式将二者整体并入本文。人ES细胞系分化为功能性血管内皮细胞表型在例如以下文献中有所描述：Levenberg等，2002，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99：4391-4396。简要来说，作者描述了通过将ES细胞从其成纤维细胞滋养层中移出、并以不含LIF和bFGF的培养基对细胞进行悬浮培养，从而由培养的ES细胞制备拟胚体(EB)。在拟胚体内自发分化后，使用标记的抗PECAM1抗体，通过FACS对解离的EB细胞进行分选。对PECAM1阳性细胞部分进行分析，发现其对额外的内皮细胞标志物(包括vWF)呈阳性、以及N-钙粘蛋白和VE-钙粘蛋白细胞连接(cell junctions)的存在，并且该细胞摄取乙酰化LDL。证明了当移植到SCID小鼠中时，由此分离的内皮细胞产生功能性血管结构。以这一方式或本领域已知的任何其它方式由ES细胞或ES细胞系制得的人内皮细胞提供了用于接种至肾支架或肺支架的内皮细胞来源。
用于对支架血管系统进行再细胞化的内皮细胞的另一替代来源是由诱导多能干(iPS)细胞分化而来的细胞。iPS细胞是来自于分化细胞(包括成体分化细胞)的多能干细胞，借助一组重编程蛋白因子的表达将细胞“重编程”。iPS细胞的一个优势在于，可从待利用本文所述的生物人工器官进行处理的个体产生多能干细胞，从而无需为了避免排异反应而提供与供体组织相匹配的组织类型。也就是说，iPS细胞和由其分化而来的细胞对于获得这些细胞的个体的细胞而言是免疫等同的。iPS细胞易于培养扩增，并具有分化为基本上任何细胞或组织类型的潜能，从而提供了大量期望类型细胞的来源。多能性的诱导最初由Yamanaka及其同事使用逆转录病毒载体来使以下四种转录因子表达而实现：KLF4、c-MYC、OCT4和SOX2(KMOS)(Takahashi，K.及S.Yamanaka，Cell，2006.126(4)：663-76页；Takahashi，K.等，Cell，2007.131(5)：861-72页)。自从该首次发现起，用于产生iPS细胞的方法已改进并扩展至包括所述因子的非逆转录病毒表达；以及包括适用于不同细胞类型的重编程因子的不同组合(Chang，C.-W.等，Stem Cells，2009.27(5)：1042-1049页；Kaji，K.等，Nature，2009.458(7239)：771-5页；Okita，K.等，Science，2008.322(5903)：949-53页；Stadtfeld，M.等，Science，2008.322(5903)：945-9页；Woltjen，K.等，Nature，2009；Yu，J.等，Science，2009：1172482页；Fusaki，N.等，Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci，2009.85(8)：348-62页)。
当考虑植入或移植iPS细胞或其分化后代时，由于细胞基因组不因病毒插入而改变，并且细胞不表达任何病毒基因，非逆转录病毒介导或者非病毒介导的重编程方法的进展提供了安全性优点。已使用无核酸方法产生了人多能干细胞，所述方法包括使用带有细胞穿透肽部分的重组蛋白进行连续蛋白转导(Kim，D.等，Cell Stem Cell，2009.4(6)：472-476页；Zhou，H.等，Cell Stem Cell，2009.4(5)：381-4页)。最近，由Rossi及其同事描述了一种基于核酸的方法，该方法导入经修饰的编码重编程因子的RNA(参见例如US 2012/0046346)。由于所引入的RNA并不修改细胞基因组并自然降解，该方法既适于产生将被用于制备用于移植的分化细胞的iPS细胞，又适于在随后引入促进iPS细胞向期望方向分化的蛋白因子，例如，分化为血管内皮或肾上皮或肝上皮表型。
可借助本领域已知的方法使iPS细胞分化为血管内皮细胞表型。例如，Taura等，Arteriosclerosis，Thrombosis and Vascular Biology 2009.29：1100-1103，题为“Induction and Isolation of Vascular Cells from HumanInduced Pluripotent Stem Cells-Brief Report”的文献描述了使iPS细胞分化为血管内皮细胞的方法。作者证明了同样方法也适用于人ES细胞系，并产生具有相似特性和制造效率的内皮细胞。类似地，Choi等，Stem Cells2009.27：559-567，题为Hematopoietic and Endothelial Differentiation ofHuman Induced Pluripotent Stem Cells的文献描述了人iPS细胞和ES细胞系分化为CD31+、CD43-内皮细胞。可将这些方法中的任意一者或两者用于提供本发明所述的方法和组合物所需的用于在以血管内皮细胞对组织支架进行的再接种中使用的人内皮细胞或内皮细胞祖细胞。
肾上皮细胞：肾上皮细胞可以分离自供体肾组织，或由ES细胞或iPS细胞在合适条件下分化产生。
从成体或例如新生儿组织分离肾上皮细胞的方法在Bussolati等，Am.J.Pathol.2005.166：545-555，题为Isolation of Renal Progenitor Cells fromAdult Human Kidney的文献中有描述。由所述方法分离的细胞为CD133+并表达PAX-2(一种胚胎肾细胞标志物)，但不表达造血标志物。使用MACS系统(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)，通过磁性细胞分选从成体肾组织的肾小管(tubular)部分分离CD133+细胞。在扩增培养基存在下将CD133+细胞铺板于纤连蛋白上，所述扩增培养基由60％DMEM LG(Invitrogen，Paisley，UK)、40％MCDB-201组成，具有1×胰岛素-转铁蛋白-硒、1×亚油酸2-磷酸酯、10-9mol/L地塞米松、10-4抗坏血酸2-磷酸酯、100U青霉素、1000U链霉素、10ng/ml表皮生长因子和10ng/ml血小板衍生生长因子-BB(全部来自Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)以及2％胎牛血清(EuroClone，Wetherby，UK)。为了进行细胞克隆，在扩增培养基存在下将单细胞置于96孔板中。在成纤维细胞生长因子-4(10ng/ml)和肝细胞生长因子(20ng/ml，Sigma)存在下获得上皮分化。细胞可在培养中扩增，并可体外分化为肾上皮细胞和内皮细胞表型。当皮下植入SCID小鼠中时，未分化细胞形成表达肾上皮细胞标志物的肾小管结构。作者展示了将扩增的CD133+细胞IV注射至患有甘油诱导的肾小管坏死(tubulonecrosis)的SCID小鼠中时，使得细胞归位(homing)至受损肾并整合至肾小管中。从而，以所述方式分离的人供体肾上皮细胞祖细胞为本文所述的方法和组合物提供了供体肾上皮细胞的来源。
用于使人胚胎干细胞分化为肾上皮细胞的方法是本领域已知的，并且在例如Narayanan等，Kidney International.2013年2月6日，电子出版，题为“Human Embryonic Stem Cells Differentiate into Functional RenalProximal Tubular-Like Cells”的文献中有描述。作者描述了使人胚胎干细胞分化为肾上皮细胞以提供人肾细胞的可靠来源的方案。根据他们的方法分化的细胞表达肾近端肾小管细胞及其前体的特征标志物，但其它肾细胞类型的标志物未表达或低水平表达。标志物表达类似于原代培养的人肾近端肾小管细胞上的标志物；分离的细胞在体内和体外均形成了肾小管结构。这些分化干细胞和体外培养的原代人肾近端肾小管细胞的标志物表达模式是类似的。分化干细胞显示出肾近端肾小管细胞的形态和功能特征，并在体外和体内产生肾小管结构。以这种方式产生的细胞可用于对肾支架进行再接种，或者，可用于对例如本文其它地方所述的肺支架的上皮细胞区室进行接种。
用于使人iPS细胞分化为肾上皮细胞的方法在例如Song等，2012，PLOS One 7：e46453中有描述。简要来说，将人iPS细胞集落解离并用补充有活化素A、BMP-7和视黄酸的DMEM-F12和2.5％胎牛血清进行悬浮培养。在3天后，将细胞转移至0.1％明胶包被的不存在滋养层的培养皿中，以单层培养另外的10天，在此期间，细胞具有培养的肾小球足细胞的形态。随后在不含活化素A、BMP-7和视黄酸补充物的培养基中维持该足细胞，使得允许在培养中长期增殖。分化细胞表达podocin和synaptopodin，其定位与正常培养的人足细胞中的定位类似。当与部分解离的鼠科动物胚胎肾外植体进行再聚集时，整合入肾小球的细胞发生聚集。可使用以这一方式或本领域已知的另一方式从iPS细胞分化而来的肾上皮细胞对本文所述的肾支架进行再殖。
应当注意的是，例如，当使用肾上皮细胞对肾支架进行再接种时，完全无需使细胞彻底分化。在该情况下，支架ECM为祖细胞或部分分化的细胞提供辅助，使其完成分化，成为所期望的上皮细胞类型。这同样适用于其它脱细胞组织支架。因此，本文所述方法中的一个优点可在于，将未成熟的或部分分化的细胞应用至所述支架，并使所述支架驱动适当的分化。因此，例如，特别考虑可通过接种干细胞、定向祖细胞(committedprogenitor cell)或完全分化的细胞来对组织支架进行再殖。例如，考虑通过接种中胚层祖细胞、肾祖细胞、或完全分化或部分分化的肾上皮细胞来对肾支架进行再殖。
肝细胞：肝细胞也可为由供体组织制备、由人ES细胞或ES细胞系分化、或由iPS细胞(包括来自预计接受者的iPS细胞)分化。从供体组织(包括来自活体供体的组织)分离肝细胞和肝上皮细胞的方法是本领域公知的。从人iPS细胞高效产生肝细胞样细胞在例如Si-Tayeb等，2010，Hepatology 51：297-305中有描述。这些细胞表现出关键的肝功能，并可体内整合至肝实质(hepatic parenchyma)中。
根据本发明的一些实施方式，可将ECM支架(例如，肾支架或肺支架)悬浮在接种室中，并与储液池相连，使得能够灌注内皮细胞和上皮细胞。根据一些实施方式，可将肾动脉连接至用于灌注内皮细胞(例如，悬浮的人脐静脉内皮细胞(HUVEC))的悬液储液池。根据一些实施方式，可将肾静脉连接至用于灌注内皮细胞(例如，悬浮的人脐静脉内皮细胞(HUVEC))的悬液储液池。根据一些实施方式，可将输尿管连接至用于灌注上皮细胞(例如，悬浮的新生儿肾细胞(NKC))的悬液储液池。可通过施加真空以建立跨支架的压力梯度，促进细胞移入较小空间并直至到达整个支架，从而改善细胞递送和驻留。
根据一些实施方式，为建立所需的跨肾压力梯度，可向ECM支架施加0～80cm H2O范围内的环境真空。根据其它实施方式，并根据待接种器官的性质和大小，可使用其它真空压力范围，例如10～70cm H2O、20～60cm H2O、30～50cm H2O和高于80cm H2O。根据一些实施方式，真空压力可随时间改变，例如，以高值(例如80cm H2O)起始，从而将细胞引入支架最远和最深的区域，然后，随着达到期望的细胞量，降低至例如20cm H2O。根据一些实施方式，真空压力可随时间改变，例如，以低值(例如20cm H2O)起始，从而将细胞引入支架，然后，随着达到期望的细胞量，提高至例如80cm H2O。
根据本发明的一些实施方式，对于支架200，每1.0～1.5克支架200的组织可接种约1000万～1亿个上皮细胞，每1.0～1.5克支架200的组织可接种约1000万～1亿个动脉内皮细胞，并且每1.0～1.5克支架200的组织可接种约1000万～1亿个静脉内皮细胞。根据本发明的一些实施方式，各储液池可填充有约50万～500万个细胞/cc的溶液。接种过程持续至已将期望数量的细胞灌注至所述支架中。
根据一些实施方式，接种过程可在温度受控的环境中进行。根据本发明的一些实施方式，在整个过程中温度可保持大体上恒定。根据本发明的一些实施方式，在接种过程期间温度可发生改变。在一些实施方式中，可将接种室维持在20℃～40℃的范围内。
根据本发明的一些实施方式，可将接种的支架转移至适于提供全器官培养条件的灌注生物反应器。根据一些实施方式，并不将接种的支架转移，而可改变接种室内部的环境条件，使其与为生物反应器所确定的条件一致，并且可经由动脉连接输入灌注介质，同时可对来自输尿管的器官产出进行监测。
根据其它实施方式，可将接种的支架植入人类宿主或非人动物宿主中进行体内培养。在一些实施方式中，可通过手术将肾植入肾盂(pelvis)中，并连接至接受者的腹股沟动脉、静脉和膀胱。在其它实施方式中，可通过手术将肾植入皮下位置，并连接至上腹部(epigastric)动脉和静脉，而可将输尿管保留为排出至腹膜中，直至完全成熟。
对再生器官功能的评估：可通过对滤液的组成进行监测来对本文所述的再生的或合成的生物过滤器官或构建体的功能进行评估和监测。
举例来说，对再生肾而言，所述滤液为尿液，其将经由输尿管离开肾(或者，在使用肾上皮细胞对肺支架进行再殖的情况下，尿液将积累并经由气管或支气管从先前的气腔离开)。肾的正常功能之一为防止血糖(即葡萄糖)流失至尿液中。因此，来自正常健康个体的尿液的葡萄糖含量应当非常低。当使用内皮细胞和上皮细胞对肾支架进行再殖时，通常需要一定的时间来建立过滤功能，并且来自输尿管的流出液(effluent)最初将包含来自灌注介质的葡萄糖。随着再殖的肾开始执行其过滤功能，所产生的滤液中的葡萄糖浓度将逐渐降低，并且灌注介质葡萄糖和尿液/流出液葡萄糖之间的差值将增大。在一个实施方式中，当尿液中的葡萄糖浓度与灌注介质中的葡萄糖浓度相比小于50％时，优选与灌注介质中的葡萄糖浓度相比小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％或更低时，再生肾已足够成熟。
健康肾通常保留的另一因素或代谢物是肌酐清除。随着再殖的肾重新建立生物过滤功能，由于更多肌酐被从灌注液中清除，滤液/尿液中的肌酐将增加。通常，清除至少10％的灌注液肌酐表明了正常功能，优选为至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或更多，直至正常人肾的肌酐清除速率。正常个体中的肌酐清除速率随年龄增加而下降。然而，注意到具有如下范围。在年龄小于40岁的男性中，正常速率通常为约107～139(mL/min)或1.8～2.3毫升/秒(mL/sec)；在年龄小于40岁的女性中，正常速率通常为约87～107mL/min或1.5～1.8mL/sec。超过20岁后，随着个体变老，肌酐清除值通常每10年下降约6.5mL/min。
肾成熟度的另一量度为白蛋白的驻留。正常尿液中蛋白含量低。再殖后的初期，来自介质的白蛋白将以相对高的浓度存在于流出液中。随着肾重新建立其正常的半透屏障功能，血管系统应当变得对介质中的蛋白(包括白蛋白)的渗透性降低，尿液中的白蛋白浓度将降低。在一个实施方式中，再生肾保留了灌注液中至少30％的白蛋白，优选至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或更多。在一个实施方式中，再生肾保留了灌注液中至少80％的白蛋白。在一个实施方式中，再生肾保留了灌注液中至少85％的白蛋白。在一个实施方式中，再生肾保留了灌注液中至少90％的白蛋白。在一个实施方式中，再生肾保留了灌注液中95％的白蛋白。在一个实施方式中，再生肾保留了灌注液中至少98％的白蛋白。在一个实施方式中，再生肾保留了灌注液中至少99％的白蛋白。在一个实施方式中，再生肾保留了灌注液中100％的白蛋白。
在一些实施方式中，肾构建体的体外测试允许对尿液样品和肾功能进行化学分析。例如，尿分析数据可包括下列数据：比重1.003～1.040、pH 4.6～8.0、Na 10～40mEq/L、K低于8mEq/L、Cl低于8mEq/L、蛋白1～15mg/dL、摩尔渗透压浓度(osmolality)80～1300mOsm/L、尿胆红素阴性、尿血阴性、尿酮阴性、尿白细胞阴性、尿亚硝酸盐阴性、RBC’s0～2/HPF、WBC’s 0～2/HPF、RBC管型0/HPF、尿胆素原0.2～1.0Ehr U/dl；24小时尿值：淀粉酶250～1100IU/24hr、钙100～250mg/24hr、氯化物110～250mEq/24hr、肌酐1～2g/24hr、肌酐清除(男)100～140mL/min、肌酐清除(男)16～26mg/kg/24hr、肌酐清除(女)80～130mL/min、肌酐清除(女)10～20mg/kg/24hr、镁6～9mEq/24hr、摩尔渗透压浓度450～900mOsm/kg、磷0.9～1.3g/24hr、钾35～85mEq/24hr、蛋白0～150mg/24hr、钠30～280mEq/24hr、尿素氮10～22gm/24hr、尿酸240～755mg/24hr。
可替代地或额外地，可通过在灌注介质中加入示踪染料(如荧光标记的微球和荧光标记的白蛋白)来对再生肾的成熟度进行监测或评价。认为染料在灌注介质中的驻留表明再殖器官成熟并建立了生物过滤功能，进入滤液/尿液的比例降低。
作为在对支架进行接种后在生物反应器(例如本文所述的生物反应器)中进行培养的替代，在某些实施方式中可以考虑的是，给予足够的时间供细胞附着后，可将再接种的器官直接移植给接受者，而不在反应器中进行灌注培养。在这些情况下，所述接受者通过其循环系统提供营养物和天然生长因子，该营养物和天然生长因子足以维持移植体，并允许或促进接种细胞的扩增和进一步分化。因此，尽管优选再殖器官、再生器官或人工再生器官尽可能地成熟，然而可以考虑的是，新器官无需变得完美即可提供治疗益处。任何疗法(例如延长必要的肾透析治疗之间的时间)都可对其接受者产生很大影响。正如所注意到的，植入相对未成熟的器官不但可允许立即获得有效的生物过滤，还可允许器官随时间进一步成熟并且在功能上得以改善。
移植：可将如本文所述的再殖生物过滤器官移植至有需要的接受者。如本文中所指出的，所述接受者与再殖细胞来源的个体可以是同一人，或者，例如，所述细胞可来自组织匹配的供体。移植的器官通常只需要与循环系统相连，使得血液流入动脉并流出静脉。滤液可由移植器官排放至离开机体的导管，例如，排出至收集袋；或者，可替代地，可将来自器官(例如，对于再殖肾而言为输尿管，或者对于再殖肺而言为先前的气腔或细支气管)的流出液排出至选定的系统。因此，在一个实施方式中，可引导尿液排入膀胱，或胆汁可排入胆囊。
可将移植的器官置于其正常的解剖位置中，例如，在该器官位置处替代受损或患病器官。或者，可将移植的器官原位移植到提供必要的动脉/静脉供给和排出系统、以及提供足以使器官存在的空间的任何位置。
实施例
方法和材料
肾的灌注脱细胞
分离总计64个肾，用于灌注脱细胞。全部动物实验均在符合动物福利法(the Animal Welfare Act)的情况下进行，并经位于MassachusettsGeneral Hospital的实验动物管理与使用委员会批准。使用吸入的5％异氟烷(isoflurane)(Baxter，Deerfield，IL)，将12周龄的雄性Sprague-Dawley大鼠(Charles River Labs，Wilmington，MA)麻醉。通过肝内下腔静脉(intrahepatic inferior vena cava)进行全身肝素化(American PharmaceuticalPartners，Schaumburg，IL)后，使用中位(median)剖腹术暴露腹膜后腔。去除Gerota's筋膜(fascia)、肾周脂肪和肾包膜(capsule)后，对肾动脉、静脉和输尿管进行横切并从腹部取下肾。将25G(gauge)插管(Harvard Apparatus，Holliston，MA)插入输尿管。然后，将预填充的25G插管(Harvard Apparatus，Holliston，MA)插入肾动脉，使得在30mmHg动脉压下将肝素化的PBS(Invitrogen，Grand Island，NY)顺行动脉灌注15分钟，以从肾中去除残余血液。随后，在30mmHg恒压下按下列顺序给予脱细胞溶液：去离子水中的1％SDS(Fisher，Waltham，MA)，12小时；去离子水，15分钟；以及去离子水中的1％Triton-X-100(Sigma，St.Louis，MO)，30分钟。脱细胞后，使用具有10,000U/mL青霉素G、10mg/mL链霉素和25μg/mL两性霉素B(Sigma，St.Louis，MO)的PBS对肾进行洗涤(在1.5mL/min的恒定动脉灌注下进行96小时)。
大鼠新生儿肾细胞的分离和制备
对于2.5-3.0日龄的Sprague-Dawley新生鼠，首先在CO2室中安乐死，然后用70％乙醇(Fisher，Waltham，MA)去污。中位剖腹术使得可触及肾，将其切除并储存于冰上(4℃)的肾上皮生长培养基(REGM；Lonza，Atlanta，GA)中。随后将肾转移到100mm培养皿(Corning，Corning，NY)，去除残留的结缔组织并随后切碎为<1mm3的碎片。将肾组织浆液重悬于DMEM(Invitrogen，Grand Island，NY)中的1mg/mL胶原酶I(Invitrogen，Grand Island，NY)和1mg/mL分散酶(StemCell Technologies，Vancouver，BC，Canada)中，并在37℃摇床中孵育30分钟。将所得的消化浆液过滤(strained)(100μm；Fisher，Waltham，MA)，并以4℃的REGM洗涤。然后将如上所述在胶原酶/分散酶中消化的未过滤(non-strained)组织重悬，并重复培养、过滤和封闭(blocking)。对得到的细胞溶液进行离心(200g，5分钟)，将细胞沉淀重悬在2.5mL REGM中，计数，并接种到如下所述的无细胞肾支架中。
人脐静脉内皮细胞的传代培养和制备
在明胶-a(BD Biosciences，Bedford，MA)包被的细胞培养塑料板上对第8-10代的M-cherry标记的人脐静脉内皮细胞(Joseph P.Vacanti赠予)进行扩增，并利用内皮细胞生长培养基-2(EGM2：Lonza，Atlanta，GA)使其生长。在接种时，对细胞进行胰蛋白酶处理、离心、重悬在2.0mL EGM2中、计数、并随后接种到如下所述的脱细胞肾中。
细胞接种
经由动脉插管，以1.0mL/min的恒定流速将经胰蛋白酶处理的、在2.0mL EGM-2中稀释的50.67±12.84×106个人脐静脉内皮细胞(HUVEC)接种到无细胞肾支架中(n＝26)。使细胞附着过夜，随后恢复灌注培养。在上述步骤后，分离60.71±11.67×106个新生大鼠肾细胞、计数、并重悬在2.5mL REGM中。在对器官室施加-40cm H2O的压力后，经由输尿管插管接种细胞悬液(n＝26)。使细胞附着过夜，随后恢复灌注培养。
生物反应器的设计和全器官培养
将肾生物反应器设计为封闭系统，该封闭系统在净化和组装后可经气体消毒，只需要在放置器官时开启一次。灌注介质和细胞悬液可经由无菌通路端口(Cole-Parmer，Venon Hills，IL)注入，以使污染风险最小。将脱细胞的肾基质经由肾动脉、静脉和输尿管连接至灌注系统，并将其置于无菌且带有水套(water-jacketed)的器官室(Harvard Apparatus，Holliston，MA)中。在流经以5％CO2、95％室内空气平衡的硅胶管(silicone)氧合器(oxygenator)(Cole-Parmer，Venon Hills，IL)后，氧合介质以1.5mL/min的流速灌注肾动脉。在仿生培养过程中，输尿管和静脉可被动地经由单独区室排入储液池中。
分离的肾的实验
为了对体外肾功能进行评价，以0.22μm-过滤(Fisher，Waltham，MA)的Krebs-Henseleit(KH)溶液对单个天然肾、再生肾和脱细胞肾进行灌注，所述溶液含有：NaHCO3(25.0mM)、NaCl(118mM)、KCl(4.7mM)、MgSO4(1.2mM)、NaH2PO4(1.2mM)、CaCl2(1.2mM)、BSA(5.0g/dL)、D-葡萄糖(100mg/dL)、尿素(12mg/dL)、肌酐(20mg/dL)，(Sigma Aldrich，St.Louis，MO)。在测试前添加下列氨基酸(Invitrogen，Grand Island，NY)：甘氨酸(750mg/L)、L-丙氨酸(890mg/L)、L-天冬酰胺(1,320mg/L)、L-天冬氨酸(1330mg/L)、L-谷氨酸(1470mg/L)、L-脯氨酸(1150mg/L)和L-丝氨酸(1050mg/L)。将KH溶液进行氧合(5％CO2，95％O2)、加热(37℃)，并以80-120mmHg恒压经由动脉插管进行灌注，不进行再循环。尿液和静脉流出液被动排入单独的收集管中。在灌注开始后10分钟、20分钟、30分钟、40分钟和50分钟时取样，并立即在-80℃冷冻直至进行分析。使用Catalyst Dx Chemistry Analyzer(Idexx，Westbrook，ME)对尿液、静脉流出液和灌注用KH溶液进行定量。肾血管阻力计算为动脉压力(mmHg)/肾血流量(ml/g/min)。在体外实验完成后，以无菌PBS对肾进行冲洗，拔除插管，将其转移至无菌容器中的冷却(4℃)PBS中，直至进一步处理。
组织学、免疫荧光和免疫组化
利用相同的石蜡包埋固定方案(5％福尔马林缓冲的PBS，Fisher，Waltham，MA)将天然肾、脱细胞肾和再生肾在室温处理24小时，并将用于冷冻切片的切片于4℃在4％多聚甲醛(Fisher，Waltham，MA)中固定过夜。将切片包埋在石蜡或Tissue Tek OCT复合物(VWR，Bridgeport，NJ)中，用于根据标准方案进行切片。将组织切片切为5μm的切片并使用标准方案进行H&E染色(Sigma Aldrich，St.Louis，MO)。还按照制造商的方案，使用Movat’s Pentachrome(American Mastertech，Lodi，CA)对切片进行了染色。
通过2次换为二甲苯(5分钟)、2次换为100％乙醇(3分钟)、2次换为95％乙醇(3分钟)对石蜡包埋的切片进行脱石蜡，将其放置于去离子水中(溶液全部来自Fisher，Waltham，MA)。为了进行免疫染色，首先将脱蜡玻片(slides)在热的(95℃)柠檬酸钠缓冲液(pH＝6.0)(Dako，Carpinteria，CA)中进行抗原修复20分钟，然后冷却至室温20分钟。为了对IV型胶原、弹性蛋白和层粘连蛋白表位进行免疫染色，在PBS中将玻片封闭5分钟，然后将其与含有20μg/mL蛋白酶-K(Sigma，St.Louis，MO)的TE缓冲液(pH＝8.0)在37℃孵育10分钟。在PBS中封闭5分钟后，使用双内源酶封闭剂(Dako，Carpinteria，CA)对玻片处理5分钟，然后使用封闭缓冲液(含有1％BSA、0.1％Triton-X的PBS；Sigma，St.Louis，MO)处理30分钟。在4℃使一抗附着过夜。使用封闭缓冲液制造一抗稀释液，所述一抗稀释液如下：1:50抗弹性蛋白，1:50抗层粘连蛋白(Santa Cruz Biotech，Santa Cruz，CA)；1:50抗IV型胶原(Lifespan Bioscience，Seattle，WA)；1:200抗podocin，1:200抗Na/K-ATPase(Abcam，Cambrige，MA)；以及1:200抗E-钙粘蛋白(R&D Systems，Minneapolis，MN)。在一抗孵育后，在PBS中洗涤玻片5分钟，并以1:100添加缀合有HRP的二抗，处理30分钟(Dako，Carpinteria，CA)。用PBS对所得玻片进行洗涤，用3,3'-二氨基联苯胺(Dako，Carpinteria，CA)进行显色，直至观测到良好的染色强度。使用苏木精(Sigma，St.Louis，MO)对细胞核进行复染。在使用连续酒精梯度和二甲苯(Fisher，Walthem，MA)脱水后，使用封片剂(permount)(Fisher，Walthem，MA)安装盖玻片。
为了进行免疫荧光，如上所述对石蜡包埋的切片进行脱石蜡、抗原修复、并接受在封闭缓冲液中制备的一抗稀释液。在添加一抗后，如上所述对玻片进行封闭。使全部以1:250在封闭缓冲液中稀释的荧光二抗(缀合至Alexa-荧光团的抗体种类；Invitrogen，Grand Island，NY)附着45分钟。使用DAPI(Invitrogen，Grand Island，NY)对细胞核进行复染，并使用Fluoromount-G(Southern-Biotech，Birmingham，AL)安装盖玻片(Fisher，Walthem，MA)。将省略一抗的样品以及免疫球蛋白G1抗体(Vector Labs，Burlingame，CA)的样品作为免疫组化和免疫荧光的阴性对照。使用Nikon Eclipse TE200显微镜(Nikon，Tokyo，Japan)记录免疫组化、H&E和pentachrome染色图像，同时使用Nikon A1R-A1共聚焦显微镜(Nikon，Tokyo，Japan)记录免疫荧光图像。
透射电镜
将组织在含2.0％戊二醛的0.1M甲胂酸钠(sodium cacodylate)缓冲液(pH 7.4)中4℃固定过夜，漂洗，在含1.0％四氧化锇的甲胂酸盐缓冲液中室温后固定(post-fix)1小时，并漂洗(Electron Microscopy Sciences，Hatfield，PA)。随后，对切片进行梯度乙醇脱水，并使用Epon树脂(TedPella，Redding，CA)在1:1的Epon:乙醇溶液中浸透(infiltrated)过夜。随后将切片置于新鲜Epon中数小时，并随后包埋于Epon中60℃过夜。在UC6超薄切片机(Leica，Buffalo Grove，IL)上切出薄切片，收集在包被有聚乙酸甲基乙烯酯(formvar)的栅格(grids)上，使用醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色，并在JEM 1011透射电镜上以80kV(Jeol，Peabody，MA)进行检测。使用AMT数字成像系统(Advanced MicroscopyTechniques，Danvers，MA)采集图像。
SDS、DNA、胶原和sGAG定量
如先前所描述的30，使用Stains-All染料(Sigma，St.Louis，MO)对SDS进行定量。简要来说，在胶原酶缓冲液(Sigma，St.Louis，MO)中于37℃对冻干组织进行消化48小时，伴有轻轻转动。随后将含有任何残留SDS的消化上清液(1μL)加至4ml工作Stains-All染料溶液中，随后在488nm处测定吸光度。使用Quanti-iT PicoGreen dsDNA试剂盒(Invitrogen，Grand Island，NY)对DNA进行定量。简要来说，使用含有蛋白酶K(200μg/毫升)(Sigma，St.Louis，MO)的Tris-HCl缓冲液于37℃从冻干组织样品中提取DNA 3小时，伴有轻轻转动。在TE缓冲液中对消化上清液(10μL)进行稀释，然后与制备的PicoGreen试剂混合。在480nm处激发样品，并在520nm处测量荧光。按照制造商说明，使用Sircol测定(Biocolor)对可溶性胶原进行定量。首先在4℃对冻干组织样品进行酸-胃蛋白酶胶原过夜提取，随后过夜分离并浓缩。然后依据说明进行测定。使用Blyscan测定(Biocolor)对硫酸糖胺聚糖进行定量。在测量之前，使用木瓜蛋白酶提取试剂(Sigma，St.Louis，MO)对sGAG进行提取，并在65℃加热3hr。然后依据说明进行测定。全部浓度均基于平行生成的标准曲线而确定，并且使用原始组织干重对值进行了归一化。
血液和尿液样品的化学分析
使用整合有用于综合性样品和数据管理的IDEXX工作站的Catalyst化学分析仪(IDEXX Laboratories，Westbrook，ME，USA)对血液和尿液化学进行分析。根据制造商方案，对每一血液样品分析700μL，对每一尿液样品分析300μL。如有必要，基于所收集的尿液体积对尿液样品进行稀释，加入稀释液使得样品体积为300μL，结果中考虑了稀释计算。在分析前，首先使血液样品通过肝素锂全血分离器，这些样品无需进行稀释。全部样品均通过拥有专利权的(proprietary)IDEXX诊断CLIPs Chem 10(ALB、ALB/GLOB、ALKP、ALT、BUN、BUN/CREA、CREA、GLOB、GLU、TP)和Lyte 4(Cl、K、Na、Na/K)，以及用于镁、钙和磷酸盐的单个诊断片(diagnostic slides)。
肾小球的形态测定定量
从天然肾、脱细胞肾和再生肾(每一组中n＝3)的H&E染色切片(5μm)的包膜下(subcapsular)和近髓质(juxtamedullary)区域中随机选择十个低倍视野(4×)。在10个视野的每一个中对肾小球进行计数，以确定每切片的平均肾小球数量；并且，使用来自同组实验的肾小球/切片数量来确定各类型肾中的平均肾小球(平均值±SEM)。作为子集，在10个低倍视野中的每一个中对再生肾的再接种肾小球进行计数，并随后计算每一实验的平均值。使用再接种肾小球的平均数量与肾小球/切片的平均数量之比对各实验中再接种肾小球的百分数进行计算，并将该百分数用于对再生肾中再接种肾小球的平均百分数进行计算(平均值％±SEM)。使用来自天然肾、脱细胞肾和再生肾的相同H&E切片的个别(individual)肾小球的10个高倍视野(20×)进行形态测定分析(每组中n＝3)。所有形态测定测量均使用Image J(NIH)来确定。对于个别肾小球中的每一个，对肾小体(renal corpuscle)的长轴和短轴直径均进行了测量。由肾小球毛细血管床的外表面周围测得的面积减去由肾小球囊内表面周围测得的面积，对肾小球囊腔进行确定。得出全部测量的每实验平均值，并用来自同一组的实验来确定平均值±SEM。
器官制备和原位移植
对天然肾、脱细胞肾或再生肾进行相同处理，不同的是天然肾取自全身肝素化后的、麻醉(5％异氟烷吸入)的12周龄雄性Sprague-Dawley大鼠。与如上所述相同地暴露并取下天然肾以用于灌注脱细胞，不同的是，在对肾进行手术处理之前，以1mL/min的流速用4℃的Belzer UW冷却储液(Bridge to Life，Columbia，SC)将左肾动脉冲洗5分钟，并在植入之前使用20mL的无菌4℃PBS漂洗。
通过在冰上对肾门(hilar)结构(动脉、静脉和输尿管)进行环切(dissecting…circumferentially)，准备用于原位移植的肾移植体。使用先前描述的改进的套管(cuff)技术17，分别使用24G和20G的FEP聚合物定制套管(Smith-Medical，Dubliln，OH)对移植体肾动脉和静脉进行套管。对于体内实验，使10周龄(220-225克)的NIHRNU-M接受者大鼠(Taconic Farms，Germantown，NY)接受5％吸入异氟烷诱发，并通过16G气管内管(endotracheal tube)(BD Biosciences，Bedford，MA)保持通入1-3％的异氟烷吸入。将动物仰放于加热垫(Sunbeam，Salem，MA)上。在施以中位剖腹术并通过右肾静脉进行全身肝素化后，对接受者左肾动脉、静脉和输尿管进行识别和环切，在左肾门附近切入，留下(sparing)左肾上腺动脉。随后使用微弹簧夹钳(Fine Science Tools，FosterCity，CA)夹住左肾动脉和静脉。随后小心地将左肾与Gerota's筋膜分开并移除。将再生肾移植体的动脉和静脉套管插入接受者的血管中，使用6-0丝结扎(Fine Science Tools，Foster City，CA)固定。随后不再夹住接受者的动脉和静脉，并确认明显接合(patent anastomose)。通过25G留置针(angiocath)(Harvard Apparatus，Holliston，MA)使尿液被动地从输尿管排出。使用尸体原位肾移植和脱细胞肾移植作为对照。
实施例1.尸体肾灌注脱细胞
在40mmHg恒压下，使用1％十二烷基硫酸钠(SDS)，通过肾动脉灌注对尸体大鼠肾进行脱细胞(图4a，缩时)。无细胞肾的组织学示出了组织架构的保留、以及细胞核和细胞组分的完全去除(图4b，缩时)。灌注脱细胞保留了对于过滤(肾小球基底膜)、分泌和重吸收(肾小管基底膜)来说完整的肾ECM的结构和组成。如在其它组织中所看到的，动脉弹性纤维网仍保留在无细胞的皮质和髓质实质(acellular cortical andmedullary parenchyma)中。
免疫组化染色证实了关键ECM组分(如层粘连蛋白和IV型胶原)在生理分布(如无细胞肾小球基底膜)中的存在(图4c、图4d)。从小叶中心茎(centrilobular stalk)延伸的带有毛细血管和系膜基质的分叶肾小球(lobulated glomerular)基底膜的微结构仍保持完整。无细胞肾小球进一步被多层连续的具有褶皱的肾小球囊基底膜覆盖(图4e、图4f)。肾小管基底膜仍保留有延伸到近端肾小管腔中的齿状外突(dentateevaginations)。在高倍率扫描电镜下，近端肾小管腔表面的平行嵴与远端肾小管腔表面的不太平行的网状组织并置，这与先前报道的对无细胞肾组织的电镜评估一致(Atala，A.，Bauer，S.B.，Soker，S.，Yoo，J.J.&Retik，A.B.Tissue-engineered autologous bladders for patients needingcystoplasty.Lancet 367，1241-1246(2006)(未示出))。SDS、去离子水和Triton-X 100将每肾的总DNA含量降至低于10％(图4g)。PBS洗涤后，在无细胞肾支架中不能检出SDS。ECM总胶原和糖胺聚糖的浓度保持在与尸体肾组织并无显著区别的水平(图4h、图4i)。为了确认灌注脱细胞方案对大型动物肾和人肾的可扩展性(scalability)，使用类似灌注方案成功地对猪肾和人肾进行了脱细胞(图5对大型动物肾和人肾的灌注脱细胞进行了说明。尸体(左侧)和脱细胞(中间图)的人大小的肾的照片表明，对大鼠肾进行的灌注脱细胞可放大为产生用于直接临床转化的无细胞肾ECM。Ra，肾动脉；Ur，输尿管。脱细胞猪肾与人肾的相应Pentachrome染色(右图)。比例尺为250μm)。通过灌注染料，确认了沿着分层(hierarchical)血管床的可灌注通道的保留，这与灌注脱细胞心和肺的在先经验是类似的(图8)。通过在生理灌注压力下使用改进的Krebs-Henseleit溶液对血管系统进行灌注而进行的无细胞肾支架功能测试导致产生的滤液具有与灌注液几乎等量的蛋白、葡萄糖和电解质，表明进行了跨肾小球和肾小管基底膜的流体静力学(hydrostatic)过滤，而缺失了大分子筛分(sieving)和主动重吸收(下文进一步详细描述)。
实施例2.无细胞肾基质的形态测定
为了对无细胞肾支架的微结构进行评估，采用已建立的基于组织学的形态测定方案来对肾小球平均数、肾小球直径、肾小球毛细血管腔以及部分肾小球囊腔进行定量(Olivetti，G.，Anversa，P.，Rigamonti，W.，Vitali-Mazza，L.&Loud，A.V.Morphometry of the renal corpuscle duringnormal postnatal growth and compensatory hypertrophy.A light microscopestudy.J Cell Biol 75，573-585(1977))。随着进行固定、脱水和包埋，与尸体肾相比，灌注脱细胞肾的萎缩最为明显(图5j)。因此，随着脱细胞的进行，每mm2肾皮质的肾小球表观数量增加，但当相对于横切片总面积进行归一化后，其数量保持不变。与此相对应，随着脱细胞的进行，经由肾门的每冠状(coronal cross section)横切片的肾小球总计数保持不变。肾小球直径、肾小球囊腔和肾小球毛细血管的表面积在尸体肾与脱细胞肾之间并无差异。
实施例3.无细胞肾基质的再细胞化
为了使可灌注的功能性肾组织再生，尝试利用内皮细胞和上皮细胞对无细胞大鼠肾进行再殖。通过经由肾动脉灌注悬浮的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、并经由输尿管滴注悬浮的新生大鼠肾细胞(NKC)，完成细胞接种。当将肾支架安置在允许施加真空以产生跨支架的压力梯度的接种室中时，细胞递送和驻留得到了极大改善(图5a)。向收集系统施加正压力来接种NKC的尝试并未到达肾小球，而使用跨肾梯度的细胞接种使得细胞分散在整个肾实质内。当在细胞接种期间将环境真空增加至高于70cm H2O时，在肾盏(calyxes)和实质中观测到组织损伤，并在极端情况下观测到组织破坏。40cm H2O的真空度不产生宏观或微观组织损伤或细胞泄漏，这与在分离的肾小管基底膜机械性能中获得的数据一致(Welling，L.W.&Grantham，J.J.Physical properties of isolated perfusedrenal tubules and tubular basement membranes.J Clin Invest 51，1063-1075(1972))。接种后，将肾构建体转移到设计用于提供全器官培养条件的灌注生物反应器中(图5b、图5c)。与使用肺和心脏支架的在先实验类似，发现人脐静脉内皮细胞(HUVEC)植入无细胞肾基质中。进行灌注器官培养三至五天后，观察到血管通道排列有内皮细胞，其在整个支架横切面上延伸，由段动脉、叶间动脉和弓状动脉直至肾小球和肾小管周围毛细血管(图5d)。由于沿肾单位的不同区位(niches)中的多种上皮细胞表型对尿液产生均有贡献，我们选择了除了经由肾动脉再接种HUVEC以外、再经由输尿管再接种大鼠NKC(2-3日龄)的组合。由新鲜分离的2-3日龄新生大鼠肾的酶消化产物制备NKC单细胞悬液，所述悬液由全部肾细胞类型(包括上皮细胞、内皮细胞和间质细胞谱系)的异质混合物组成。当分离后在细胞培养塑料板上培养12小时时，8％的附着细胞对podocin染色呈阳性，表示其为肾小球上皮表型；69％的附着细胞对Na/K-ATPase染色呈阳性，表示其为近端肾小管表型；且25％的附着细胞对E-钙粘蛋白染色呈阳性，表示其为远端肾小管表型(数据未示出)。细胞接种后，将肾构建体安置于灌注生物反应器中，并在全器官仿生培养中培养(n＝31)。最初的静止培养阶段使细胞得以附着，随后开始灌注，以提供氧合作用、营养物供给及过滤刺激。由于管状器官(tubularapparatus)不成熟，新生大鼠无法排泄浓缩尿液(Falk，G.Maturation ofrenal function in infant rats.Am J Physiol 181，157-170(1955))。为了促进无细胞肾基质中的体外肾生成和NKC成熟，我们向培养基中补充了已知体内成熟信号(如糖皮质激素和儿茶酚胺)来加速尿液浓缩功能的发育。我们在生理条件下将再接种肾培养了多达12天。对于早在培养第四天时的组织学评估，我们观察到上皮细胞和内皮细胞对肾支架的再殖以及肾小球、肾小管和血管结构的保留。NKC和HUVEC植入至其合适的上皮区室和血管区室(图5e)。再生上皮和内皮间的空间关系类似于为水和溶质过滤、分泌和重吸收提供解剖学基础的天然肾单位的微观解剖学性质和极性。免疫染色显示了被内皮细胞和足细胞密集接种的肾小球。在整个肾中，尽管偶尔也能观察到非位点特异性植入，足细胞似乎更倾向于植入肾小球区域(图5f-图5h)。植入至肾小球基底膜上的上皮细胞对β-1整合素染色呈阳性，表明细胞位点特异性粘附至ECM区域的潜在可能，并对观测到的位点特异性细胞植入提供了机理(mechanistic)解释(图5i)。发现植入的上皮细胞重建了极性，并在表达Na/K-ATPase和水通道蛋白的肾小管结构中组织化(organize)，这与天然近端肾小管上皮相似。类似地，表达E-钙粘蛋白的上皮细胞形成类似于天然远端肾小管上皮和集尿管(collecting duct)的结构(图5e、图5j-图5l)。排列于肾盂的E-钙粘蛋白阳性的上皮细胞类似于天然变移上皮(transitionalepithelium)。再生肾的透射电镜和扫描电镜示出灌注的肾小球毛细血管与植入的足细胞，并示出足突形成(图5m、图5n)。再生肾的形态测定分析显示，超过一半的肾小球基质的再细胞化导致每再生肾中的细胞化肾小球平均数量约为尸体肾的70％。与尸体肾相比，再生肾中的肾小球平均直径、肾小球囊腔和肾小球毛细血管腔似乎较小(图5o)。
实施例4.无细胞肾和再生肾的体外功能
在细胞接种和全器官培养之后，我们对再生肾过滤标准灌注液、清除代谢物、重吸收电解质和葡萄糖、以及生成浓缩尿液的体外能力进行了测试(图6a)。用含有白蛋白、尿素和电解质的Krebs-Henseleit(KH)碳酸氢盐缓冲溶液在生理压力下经由肾动脉对尸体肾、脱细胞肾和再生肾进行灌注。对尿液样品进行分析并在三组之中进行比较。与尸体肾对照相比，脱细胞肾产生了近两倍的滤液；再生肾产生了最少量的尿液。所有三组在测试期间均维持平稳的尿液输出(图6b、图6c)。基于尿分析的结果，作为对肾小球过滤率的评估，我们计算了肌酐清除；作为对肾小管吸收和分泌功能的分析，我们计算了溶质排泄分数(图6d)。由于稀释尿液的产出增加，与尸体肾相比，脱细胞肾中计算所得的肌酐清除增加，表明跨无细胞基底膜的肾小球(可能还包括肾小管和导管(ductal))过滤有所增加。在利用内皮细胞和上皮细胞再殖之后，再生构建体的肌酐清除达到尸体肾的约10％，表明跨部分重构的、且可能未成熟的肾小球膜的肾小球过滤有所下降(图6c)。发现血管阻力随着脱细胞而有所增加，并且在重新内皮化之后下降，但与尸体肾相比，再生构建体中仍保持更高水平(图6e)。这一发现与我们先前在心脏和肺的重新内皮化中观测的结果相一致，并可能与血管床的相对未成熟以及来自细胞培养基的微栓(micro-emboli)有关。当体外肾动脉灌注压升至120mmHg时，再生肾中的尿液产生和肌酐清除速率达到尸体肾的至多23％(图6b、图6c)。在脱细胞肾中，白蛋白驻留降低至与剥离的(denuded)肾小球基底膜对大分子筛分的预期贡献相一致的水平。随着再细胞化的进行，白蛋白驻留得以部分恢复，导致再生肾中改善的、但仍是持续性的白蛋白尿。随着脱细胞化，葡萄糖重吸收丧失，这与自由过滤和肾小管上皮细胞的丧失相一致。再生肾表现出部分恢复的葡萄糖重吸收，表明具有功能性膜转运蛋白的近端肾小管上皮细胞的植入，使得葡萄糖尿减少。更高的灌注压力并未导致再生肾中白蛋白增加或葡萄糖损失。脱细胞肾中丧失了电解质的选择性重吸收。过滤的肌酐比电解质稍多，使得有效的电解质驻留分数为5～10％。这一差异可能是由所保持的离子和基底膜的电荷引起的(Bray，J.&Robinson，G.B.Influence of charge on filtration across renalbasement membrane films in vitro.Kidney Int 25，527-533(1984))，同时离子范围可能与跨无细胞血管、肾小球和肾小管基底膜中扩散动力学的细微差别有关。在再生肾中，电解质重吸收恢复至约50％的生理水平，进一步表明了近端肾小管和远端肾小管上皮细胞的植入和功能。尿素排泄分数在脱细胞肾中有所增加，并在再生肾中回到更接近生理范围的水平，这表明具有尿素转运蛋白的功能性集尿管上皮细胞得以部分重建。
实施例5.再生肾的原位移植和体内功能
由于再生肾在体外产生尿液，我们推测生物人工肾可以在原位移植后在体内发挥作用。我们进行了实验性的左肾切除并原位移植了再生左肾。我们使再生左肾与接受者的肾动脉和静脉相接合(图7a)。在整个测试期间，再生肾移植体表现出良好灌注，而无任何血管系统、收集系统或实质(parenchyma)出血的迹象(图7b)。输尿管保持插管状态，以记录体内产生清澈尿液而无肉眼可见的血尿迹象，并收集尿液样品。在将接受者血管系统松开后不久直至实验计划的终点，再生肾产生尿液。外植再生肾的组织学评价显示，灌流血液的血管系统没有实质出血或微血管血栓形成的迹象(图7c、图7d)。
对应于体外研究，脱细胞肾产生高血糖(249±62.9mg/dL，天然对照则为29±8.5mg/dL)、高白蛋白(26.85±4.03g/dL，天然对照则为0.6±0.4g/dL)、低尿素(18±42.2mg/dL，天然对照则为617.3±34.8mg/dL)和低肌酐(0.5±0.3mg/dL，天然对照则为24.6±5.8mg/dL)的滤液。
与天然肾相比，再生肾产出较少尿液(1.2±0.1μl/min，天然肾对照中为3.2±0.9μl/min，脱细胞肾中为4.9±1.4μl/min)；与天然肾对照相比，该尿液具有较低的肌酐(1.3±0.2mg/dL)和尿素(28.3±8.5mg/dL)，但与脱细胞肾相比表现出改善的葡萄糖尿(160±20mg/dL)和白蛋白尿(4.67±2.51g/L)。与体外实验结果类似，再生肾中的肌酐清除低于天然肾(0.01±0.002ml/min，天然肾对照中为0.36±0.09ml/min)，尿素排泄也较低(0.003±0.001mg/min，天然肾对照中为0.19±0.01mg/min)。在经由接受者血管系统进行体内血液灌注时，再生肾的原位移植显示出直接的移植体功能，而无形成血栓或出血的迹象。尿分析结果与体外观测的相对不成熟的构建体相对应。
其它实施方式也涵盖于本发明的范围和精神内。例如，由于软件的性质，上述功能可以使用软件、硬件、固件、硬接线，或以上要素的任意组合来实施。实施功能的特征也可在物理上位于不同位置，包括被分散而使得在不同的物理位置处实施部分功能。
此外，尽管以上说明针对本发明，但该说明也可包括一个以上发明。

Claims (29)

1.一种用于对过滤器官支架进行接种的细胞接种系统，所述过滤器官包含至少一根动脉管道和至少一根输出管道，所述系统包含：
密封的接种室，所述接种室适于包封用于细胞接种的生物人工过滤器官支架，并适于在所述接种室的内部提供压力受控的环境，所述接种室包含多个端口，所述端口适于允许第一流体通道将细胞悬液流体输送入所述接种室，并适于允许至少一个空气压力通道将所述接种室的内部与空气压力泵相连；
压力传感器，所述压力传感器适于对所述接种室内部的环境压力进行检测；并且
其中，所述空气压力泵能够在所述接种室内部保持负压。
2.如权利要求1所述的细胞接种系统，其进一步包含第一细胞悬液储液池，所述第一细胞悬液储液池连接至至少一个流体通道，用于将第一细胞悬液递送至所述细胞接种室。
3.如权利要求2所述的细胞接种系统，其进一步包含第一悬液泵，所述第一悬液泵连接至所述第一细胞悬液储液池，用于将所述第一细胞悬液泵送至所述细胞接种室。
4.如权利要求2所述的细胞接种系统，其中，所述细胞悬液包含内皮细胞。
5.如权利要求2所述的细胞接种系统，其中，所述细胞悬液包含上皮细胞。
6.如权利要求1所述的细胞接种系统，其进一步包含第二流体通道，所述第二流体通道穿过所述接种室的端口；以及第二细胞悬液储液池，所述第二细胞悬液储液池连接至所述第二流体通道，用于将第二细胞悬液递送至所述细胞接种室。
7.如权利要求2所述的细胞接种系统，其进一步包含第一悬液泵，所述第一悬液泵连接至所述第一细胞悬液储液池，用于将所述第一细胞悬液泵送至所述细胞接种室。
8.如权利要求1所述的细胞接种系统，其中，所述细胞接种室至少部分地包封在加热室中，并且所述细胞接种室包含加热元件，所述加热元件适于将所述接种室保持在大体上恒定的温度。
9.如权利要求1所述的细胞接种系统，其中，将所述细胞接种室保持在10cm～70cm H2O的负压范围内。
10.如权利要求1所述的细胞接种系统，其中，将所述细胞接种室保持在30cm～50cm H2O的负压范围内。
11.一种用于对过滤器官支架进行接种的细胞接种系统，所述过滤器官支架包含至少一根动脉管道、至少一根静脉管道和至少一根输出管道，所述系统包含：
密封的接种室，所述接种室适于包封用于细胞接种的过滤器官支架，并适于在所述接种室的内部提供压力受控的环境，所述接种室包含多个端口，所述端口适于允许第一流体通道将细胞悬液流体输送入所述接种室，适于允许第二流体通道将细胞悬液流体输送入所述接种室，适于允许第三流体通道将细胞悬液流体输送入所述接种室，并适于允许至少一个空气压力通道将所述接种室的内部与空气压力泵相连；
压力传感器，所述压力传感器适于对所述接种室内部的环境压力进行检测，其中，所述空气压力泵能够在所述接种室内部保持约40cm H2O的负压；
第一细胞悬液储液池，所述第一细胞悬液储液池适于将第一细胞群保持于悬液状态，所述第一细胞悬液储液池连接至所述第一通道，并将处于悬液状态的所述第一细胞群递送至所述细胞接种室；
第二细胞悬液储液池，所述第二细胞悬液储液池适于将第二细胞群保持于悬液状态，所述第二细胞悬液储液池连接至所述第二通道，并将处于悬液状态的所述第二细胞群递送至所述细胞接种室；以及
第三细胞悬液储液池，所述第三细胞悬液储液池适于将第三细胞群保持于悬液状态，所述第三细胞悬液储液池连接至所述第三通道，并将处于悬液状态的所述第三细胞群递送至所述细胞接种室。
12.一种工程化生物过滤组织组合物，所述组合物包含脱细胞组织支架，所述脱细胞组织支架在血管区室中用血管内皮细胞或血管内皮细胞祖细胞进行再接种，并在仅具有一根输出管道的具有盲端的上皮细胞区室中用上皮细胞或上皮细胞祖细胞进行接种，其中，在对脱细胞支架外部施加负压梯度的情况下，通过经由所述输出管道滴注细胞悬液，将所述上皮细胞或所述上皮细胞前体导入所述具有盲端的区室。
13.如权利要求12所述的组合物，其中，所述支架为脱细胞肾支架。
14.如权利要求13所述的组合物，其中，所述上皮细胞是肾上皮细胞或肾上皮细胞前体。
15.如权利要求13所述的组合物，其中，所述上皮细胞是肝上皮细胞或肝上皮细胞前体。
16.如权利要求12所述的组合物，其中，所述支架为脱细胞肺组织支架。
17.如权利要求16所述的组合物，其中，所述上皮细胞是肾上皮细胞或肾上皮细胞前体。
18.如权利要求16所述的组合物，其中，所述上皮细胞是肝上皮细胞或肝上皮细胞前体。
19.如权利要求12所述的组合物，其中，所述血管区室具有单根输入管道和单根输出管道，所述输入管道与所述输出管道彼此流体连通；并且其中，通过将所述细胞悬液滴注至所述输入管道中，将内皮细胞或内皮细胞前体引入。
20.如权利要求12所述的组合物，其中，施加在所述脱细胞支架外部的所述负压梯度在10cm～70cm H2O的范围内。
21.如权利要求12所述的组合物，其中，施加在所述脱细胞支架外部的所述负压梯度在20cm～60cm H2O的范围内。
22.如权利要求12所述的组合物，其中，施加在所述脱细胞支架外部的所述负压梯度在30cm～50cm H2O的范围内。
23.如权利要求12所述的组合物，其中，所述工程化生物过滤组织组合物从血液中除去多于20％的代谢废弃产物。
24.如权利要求12所述的组合物，其中，所述工程化生物过滤组织组合物从血液中除去多于40％的代谢废弃产物。
25.如权利要求12所述的组合物，其中，所述工程化生物过滤组织组合物从血液中除去多于60％的代谢废弃产物。
26.如权利要求12所述的组合物，其中，所述工程化生物过滤组织组合物除去血液中多于20％的肌酐。
27.如权利要求12所述的组合物，其中，所述工程化生物过滤组织组合物保留血液中多于20％的血糖。
28.如权利要求12所述的组合物，其中，所述工程化生物过滤组织组合物保留血液中多于20％的血清白蛋白。
29.如权利要求12所述的组合物，其中，所述工程化生物过滤组织组合物保留血液中多于40％的血糖。
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