JP2015515277A - バイオ人工濾過器官 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、35 U.S.C.§119(e)の下でその全内容が参照により本明細書に組み入れられる、2012年4月18日に提出された米国特許仮出願第61/635,043号の恩典を主張する。
本発明は、米国国立衛生研究所によって付与された契約書番号DP2 OD008749-01号の下で米国政府の支援を受けて行われた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
発明の技術分野
本発明は、バイオ人工濾過器官、ならびにそのような器官を作製する方法およびシステムに向けられる。より具体的に、本発明は、腎臓および肝臓タイプの器官などのバイオ人工濾過器官、ならびにそれらを作製する方法に向けられる。
米国ではほぼ100万人の患者が末期腎疾患(ESRD)を有し、毎年、100,000例を超える新規症例が診断されている((CDC)、C.f.D.C.a.P. National chronic kidney disease fact sheet:U.S. Department of Health and Human Services (HHS), CDC, Atlanta, GA, 2010(非特許文献1))。血液透析は、末期腎疾患(ESRD)患者の生存率を増加させるが、移植は、依然として利用可能な唯一の治癒的処置である。米国では毎年約18,000例の腎移植が行われているが、なおも現在、ほぼ100,000人のアメリカ人がドナー腎臓を待っている(OPTN: 臓器調達移植ネットワークウェブサイトVol 2012(非特許文献2))。患者の需要は増加するものの、ドナー臓器数は停滞しており、移植を待つ平均期間は3年を超えて、待機者の死亡率は、診断により5〜10%である。腎移植免疫学の進歩にもかかわらず(Kawai, T., et al. HLA-mismatched renal transplantation without maintenance immunosuppression. N Engl J Med 358, 353-361 (2008)(非特許文献3))、レシピエントの20%が、移植後5年以内に急性の拒絶事例を経験し、移植された(死亡したドナーの移植片)人のおよそ40%が移植後10年以内に死亡するか、または移植片の機能を失う。生物工学によって自己腎臓を作製すれば、ESRDにおける長期間の血液透析の必要がなくなるよう要求に応じて移植片を提供することによって、理論的にこれらの問題が回避されうる。
本発明は、バイオ人工濾過器官、たとえば腎臓または肝臓を作製するための方法およびシステムを目的とする。本発明に従って、死体の器官全体を脱細胞化して、細胞外マトリックス(ECM)骨格を作製した。ECM骨格に、内皮細胞および上皮細胞を播種することによって細胞を再配置することができる。本発明に従って、播種は、内皮細胞、たとえばヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)の腎動脈を介した灌流、および浮遊新生児腎細胞(NKC)の尿管を介した注入によって行うことができる。いくつかの態様に従って、播種の際にECM骨格の圧力および温度が制御される播種チャンバーにおいて、細胞の送達を行うことができる。本発明のいくつかの態様に従って、骨格全体に腎臓を横切る圧勾配を形成するために、ECM骨格を、0 cm H2Oと80 cm H2Oの間の範囲の真空雰囲気に供した。播種段階は、腎臓構築物が安定化されるまで行うことができ、その後、全器官培養条件を提供する灌流バイオリアクターに器官を移して、器官を次の成熟レベルまで培養することができる。
本発明は、バイオ人工濾過器官、たとえば腎臓または肝臓を作製するための方法およびシステムに向けられる。本発明に従って、死体腎および肺を脱細胞化して、器官全体の細胞外マトリックス(ECM)骨格を作製した。骨格に内皮細胞および上皮細胞を播種することによって、ECM骨格に細胞を再配置することができる。本発明に従って、播種は、温度および/または圧制御環境下で行われうる。
適切なドナー細胞による再播種または再細胞化にとって適切な細胞外マトリックスを作製するための腎および肺組織の脱細胞化は、本明細書において実施例において、ならびにたとえばMishra et al., 2012, Ann. Thorac. Surg. 93: 1075-1081(肺の脱細胞化)、およびSong et al, 2011, Ann. Thorac. Surg. 92: 998-1005(肺の脱細胞化)において記述される。同様に、その全体が参照により本明細書に組み入れられ、心臓、肝臓、肺、および腎臓を含む異なる多数の固形器官の脱細胞化を説明するUS 2009/0202977も参照されたい。
当技術分野において公知のまたは本明細書において記述される、たとえばドナー腎またはドナー肺に由来する脱細胞化骨格に、血管内皮細胞または血管内皮細胞前駆細胞を再播種すると、脱細胞化器官の血管系を再確立することができ、上皮細胞を再播種すると、機能的上皮を再度確立することができる。腎上皮細胞を注入すると、得られるバイオ人工器官は、尿の産生を伴う腎臓の濾過機能を行うことができる。たとえば肝上皮細胞を注入すると、バイオ人工器官は、胆汁の産生を伴う肝臓の濾過機能を行うことができる。いずれの場合においても、脱細胞化骨格を再細胞化するための細胞は、たとえばドナー器官もしくは複数の器官に由来しうるか、または代わりにたとえば胚幹細胞、人工多能性幹細胞、または異種ドナー起源もしくはレシピエントに対して自己のいずれかからの成人幹細胞でありうる幹細胞から分化しうる。
腎臓の灌流脱細胞化
全体で64例の腎臓を灌流脱細胞化のために単離した。動物実験は全て、動物福祉法に従って行い、マサチューセッツ総合病院の施設内動物飼育使用委員会の承認を受けた。本発明者らは、雄性の12週齢Sprague-Dawley系ラット(Charles River Labs, Wilmington, MA)を、5%イソフルラン(Baxter, Deerfield, IL)吸入を用いて麻酔した。肝臓下大静脈を通して全身ヘパリン処理(American Pharmaceutical Partners, Schaumburg, IL)を行った後、内側腹部切開によって、腹膜後腔を露出した。ジェロータ筋膜、腎周囲脂肪、および腎被膜を除去した後、腎動脈、静脈、および尿管を切断して、腎臓を腹部から摘出した。25ゲージカニューレ(Harvard Apparatus, Holliston, MA)を尿管に挿入した。次に、腎動脈に挿入した充填済25-ゲージカニューレ(Harvard Apparatus, Holliston, MA)によって、ヘパリン加PBS(Invitrogen, Grand Island, NY)の順行性の動脈灌流を30 mmHgの動脈圧で15分間行い、残留血液を腎臓から除去した。次に、脱細胞化溶液を30 mmHgの定圧で次の順序で投与した:1%SDS(Fisher, Waltham, MA)の脱イオン水溶液を12時間、脱イオン水15分、および1%Triton-X-100(Sigma, St. Louis, MO)の脱イオン水溶液を30分間。脱細胞化後、10,000U/mLペニシリンG、10 mg/mLストレプトマイシン、および25μg/mLアンフォテリシン-B(Sigma, St. Louis, MO)を含むPBSの1.5 mL/分の一定動脈灌流によって腎臓を96時間洗浄した。
2.5から3.0日齢のSprague-Dawley系新生仔を最初にCO2チャンバーにおいて安楽死させた後、70%エタノール(Fisher, Waltham, MA)によって汚染を除去した。内側腹部切開によって、腎臓へのアクセスを得て、腎臓を摘出して、腎上皮増殖培地(REGM: Lonza, Atlanta, GA)中で氷中(4℃)で保存した。次に、残留結合組織を除去するために腎臓を100 mm培養皿(Corning, Corning, NY)に移した後、<l mm3片に細切した。腎組織スラリーを、DMEM (Invitrogen, Grand Island, NY)中で1 mg/mLコラゲナーゼI(Invitrogen, Grand Island, NY)および1 mg/mLディスパーゼ(StemCell Technologies, Vancouver, BC, Canada)に浮遊させて、37℃のシェーカーで30分間インキュベートした。得られた消化物スラリーを濾過して(100μm; Fisher, Waltham, MA)、4℃REGMによって洗浄した。次に、本発明者らは、上記のコラゲナーゼ/ディスパーゼ中で消化した非染色組織を浮遊させて、インキュベーション、染色、およびブロッキングを繰り返した。得られた細胞溶液を遠心沈降させて(200 g、5分)、細胞沈降物をREGM 2.5 mLに浮遊させて、計数し、以下に記述される無細胞腎骨格に播種した。
継代回数8〜10回のM-cherry標識ヒト臍帯静脈内皮細胞(贈与、Joseph P. Vacanti)をゼラチン-a(BD Biosciences, Bedford, MA)コーティング細胞培養プラスチックにおいて増殖させて、内皮増殖培地-2(EGM2: Lonza, Atlanta, GA)によって生育させた。播種時に、細胞をトリプシン処理して、遠心沈降させ、EGM2 2.0 mLに浮遊させて計数した後、以下に記述される脱細胞化腎に播種した。
トリプシン処理を行ってEGM-2 2.0 mL中で希釈したヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)50.67±12.84×106個を、動脈カニューレを介して1.0 mL/分の一定流で無細胞腎骨格に播種した(n=26)。細胞を終夜接着させた後、灌流培養を再開した。ラット新生仔腎細胞60.71±11.67×106個を上記の技法後に単離して、計数し、REGM 2.5 mLに浮遊させた。器官チャンバーを-40 cm H2O圧に供した後、尿管カニューレを通して細胞浮遊物を播種した(n=26)。細胞を終夜接着させた後、灌流培養を再開した。
腎バイオリアクターは、器官留置時に一度開く必要があるだけで、洗浄および組み立て後にガス滅菌することができるクローズドシステムとして設計された。灌流培地および細胞浮遊物は、汚染のリスクを最小限にするために滅菌アクセスポート(Cole-Parmer, Vernon Hills, IL)を通して注入することができる。脱細胞化腎マトリックスを、腎動脈、静脈、および尿管を通して灌流システムに接続して、水ジャケットを有する滅菌器官チャンバー(Harvard Apparatus, Holliston, MA)に入れた。5%CO2 95%室内空気によって平衡にしたシリコンチューブ酸素付加装置(Cole-Parmer, Vernon Hills, IL)の中に流した後、酸素付加培地によって1.5 mL/分で腎動脈を灌流した。尿管および静脈を、生体模倣培養のあいだ、異なる区画を通してリザーバーへと受動的に排液させた。
インビトロ腎機能を評価するために、1つのネイティブ腎、再生腎、および脱細胞化腎を、NaHCO3(25.0 mM)、NaCl(118mM)、KCl(4.7 mM)、MgSO4(1.2 mM)、NaH2PO4(1.2 mM)、CaCl2(1.2 mM)、BSA(5.0 g/dL)、D-グルコース(100 mg/dL)、尿素(12 mg/dL)、クレアチニン(20 mg/dL)(Sigma Aldrich, St. Louis, MO)を含む0.22μm濾過(Fisher, Waltham, MA)Krebs-Henseleit(KH)溶液によって灌流した。アミノ酸のグリシン(750 mg/L)、L-アラニン(890 mg/L)、L-アスパラギン(1,320 mg/L)、L-アスパラギン酸(1330 mg/L)、L-グルタミン酸(1470 mg/L)、L-プロリン(1150 mg/L)、およびL-セリン(1050 mg/L)(Invitrogen, Grand Island, NY)を試験前に添加した。KH溶液を酸素付加して(5%CO2、95%O2)、加温し(37℃)、および動脈カニューレの中を80〜120 mmHgの定圧で再循環させずに灌流した。尿および静脈排出液を、個別の採取チューブに受動的に排液した。試料を灌流の開始後10、20、30、40、および50分目に採取して、分析するまで-80℃で直ちに凍結した。尿、静脈排出液、および灌流KH溶液をCatalyst Dx Chemistry Analyzer(Idexx, Westbrook, ME)を用いて定量した。腎血管抵抗(RVR)は、動脈圧(mmHg)/腎血流(ml/g/分)として計算した。インビトロ実験の終了後、腎臓の中に滅菌PBSを流して、カニューレを外し、さらに処理するまで冷(4℃)PBSを含む滅菌容器に移した。
ネイティブ腎、脱細胞化腎、および再生腎をパラフィン包埋(5%ホルマリン緩衝PBS、Fisher, Waltham, MA)するために、同一の固定プロトコールに従って室温で24時間処理し、凍結切片のための切片を、4%パラホルムアルデヒド(Fisher, Waltham, MA)中で4℃で終夜固定した。切片を、標準プロトコールに従って、切片作製のために、パラフィンまたはTissue Tek OCTコンパウンド(VWR, Bridgeport, NJ)に包埋した。組織切片を5μmの切片に切断して、標準プロトコールを用いて、H & E染色(Sigma Aldrich, St. Louis, MO)を行った。切片はまた、製造元のプロトコールに従ってMovatペンタクロム(American Mastertech, Lodi, CA)によっても染色した。
組織を、0.1 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液、pH 7.4中で2.0%グルタルアルデヒドによって4℃で終夜固定して、すすぎ、カコジル酸緩衝液中で1.0%四酸化オスミウムによって室温で1時間後固定し、すすいだ(Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA)。次に、切片を、一連の段階的エタノールを通して脱水して、Epon樹脂(Ted Pella, Redding, CA)をEpon:エタノールの1:1溶液において終夜浸透させた。次に、切片を新しいEponの中に数時間入れた後Epon中で60℃で終夜包埋した。薄切片をUC6ウルトラミクロトーム(Leica, Buffalo Grove, IL)において切断して、formvarコーティンググリッドに収集して、酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛によって染色し、JEM 1011透過型電子顕微鏡(Jeol, Peabody, MA)で80 kVで調べた。AMTデジタルイメージングシステム(Advanced Microscopy Techniques, Danvers, MA)を用いて画像を収集した。
SDSを、Stains-All Dye(Sigma, St. Louis, MO)を用いて既に記述されたように30定量した。簡単に説明すると、凍結乾燥組織をコラゲナーゼ緩衝液(Sigma, St. Louis, MO)中で軽く回転させながら37℃で48時間消化した。任意の残留SDSを含む消化物上清(1μl)を、Stains-All Dye標準溶液4 mlに添加した後、488 nmでの吸光度を測定した。Quanti-iT PicoGreen dsDNAキット(Invitrogen, Grand Island, NY)を用いてDNAを定量した。簡単に説明すると、プロテイナーゼ-K(200μg/ml)(Sigma, St. Louis, MO)を有するTris-HCl緩衝液中で凍結乾燥組織試料から37℃で軽く回転させながら3時間、DNAを抽出した。消化物上清(10μl)をTE緩衝液において希釈した後、調製したPicoGreen試薬と混合した。試料を480 nmで励起して、520 nmでの蛍光を測定した。可溶性のコラーゲンを、製造元の説明書に従ってSircolアッセイ(Biocolor)を用いて定量した。凍結乾燥組織試料を最初に、4℃で終夜の酸-ペプシンコラーゲン抽出に供した後、終夜単離および濃縮した。次にアッセイを説明通りに行った。Blyscanアッセイ(Biocolor)を用いて硫酸化グリコサミノグリカンを定量した。測定前に、sGAGをパパイン抽出試薬(Sigma, St. Louis, MO)を用いて抽出して、65℃で3時間加熱した。アッセイを、説明書通りに行った。濃度は全て、同時に作製した標準曲線に基づいて決定し、値を当初の組織乾燥重量に対して標準化した。
血液および尿化学を、試料およびデータの包括的管理のためのIDEXX VetLab(登録商標)ステーションと統合したCatalyst Dx(登録商標)Chemistry Analyzer(IDEXX Laboratories, Westbrook, ME, USA)を用いて分析した。製造元のプロトコールに従って、各血液試料に関して700μlを分析して、各尿試料に関して300μlを分析した。必要であれば、収集した尿の体積に基づいて尿試料を希釈して、試料体積が300μlとなるように希釈剤を添加して、結果は希釈の計算を考慮に入れた。血液試料を最初に、ヘパリンリチウム全血分離装置に通した後に分析したが、これらの試料には希釈は必要ではなかった。試料を全て、独自のIDEXX診断CLIPs Chem 10(ALB、ALB/GLOB、ALKP、ALT、BUN、BUN/CREA、CREA、GLOB、GLU、TP)およびLyte 4(Cl、K、Na、Na/K)に通し、マグネシウム、カルシウム、およびリンに関して1つの診断スライドガラスを調べた。
ネイティブ腎、脱細胞化腎、および再生腎のH&E染色切片(5μm)の被膜下および髄傍領域から、10カ所の低倍率視野(4×)を無作為に選択した(各群に関してn=3)。10カ所の視野の各々において糸球体を計数して、切片あたりの平均糸球体数を決定して、同じ群からの実験における糸球体数/切片を用いて、腎臓の各タイプにおける平均糸球体数を決定して、同じ群の実験における糸球体数/切片を用いて、各タイプの腎臓における平均糸球体を決定した(平均値±SEM)。再生腎における再播種された糸球体を、10カ所の低倍率視野のそれぞれにおけるサブセットとして計数した後、実験あたりに平均した。各実験に関して再播種された糸球体の百分率を、再播種された平均糸球体数対平均糸球体数/切片を用いて計算して、これを用いて再生腎における再播種糸球体の平均百分率を計算した(平均%±SEM)。形態測定分析では、ネイティブ腎、脱細胞化腎、および再生腎の同じH&E切片からの個々の糸球体の高倍率視野(20倍)10カ所を用いた(各群においてn=3)。全ての形態測定をImage J(NIH)を用いて決定した。個々の糸球体の各々に関して、腎小体の長軸および短軸径の両方を測定した。糸球体毛細血管床の外表面周囲で測定された面積から、ボウマン嚢の内表面周囲で測定された面積を差し引くことによって、ボウマン腔を決定した。測定値は全て、実験毎に平均して、同じ群の実験を用いて平均値±SEMを決定した。
ネイティブ腎を、全身ヘパリン処理した麻酔(5%イソフルラン吸入)下の12週齢の雄性Sprague-Dawley系ラットから採取したことを除き、ネイティブ腎、脱細胞化腎、または再生腎を同一に処置した。腎臓の外科的操作の前に左腎動脈に4℃のBelzer UW低温保存液(Bridge to Life, Columbia, SC)を1 mL/分で5分間流したことを除いて、灌流脱細胞化に関して先に記述した方法と同一の方法で、ネイティブ腎を露出して採取して、4℃の滅菌PBS 20 mLによってすすいだ後に植え込んだ。
ラット死体腎臓を、40 mmHgの定圧で1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)の腎動脈灌流を介して脱細胞化した(図4a、時間経過)。無細胞腎の組織学により、組織構築が保存され、ならびに核および細胞成分が完全に除去されたことが示された(図4b、時間経過)。灌流脱細胞化は、濾過(糸球体基底膜)、分泌、および再吸収(尿細管基底膜)において必要な腎ECMの構造および組成を保存した。他の組織について認められるように、動脈弾性線維の網状構造は、無細胞皮質および髄質実質において保存されたままであった。
無細胞腎骨格の微小構築を評価するために、本発明者らは、平均糸球体数、糸球体直径、糸球体毛細血管内腔、および部分的ボウマン腔を定量するために、確立された組織学に基づく形態測定プロトコールを適用した(Olivetti, G., Anversa, P., Rigamonti, W., Vitali-Mazza, L. & Loud, A.V. Morphometry of the renal corpuscle during normal postnatal growth and compensatory hypertrophy. A light microscope study. J Cell Biol 75, 573-585 (1977))。灌流脱細胞化腎は、死体腎と比較して固定、脱水、および包埋時にほとんどが縮小した(図5j)。それゆえ、腎皮質1 mm2あたりの見かけの糸球体数は脱細胞化によって増加したが、総断面積に対して標準化すると一定のままであった。これに対応して、門の中の冠状断面あたりの総糸球体数は、脱細胞化によって一定のままであった。糸球体直径、ボウマン腔、および糸球体毛細血管表面積は、死体腎と脱細胞化腎のあいだで差がなかった。
灌流可能な機能的腎組織を再生するために、本発明者らはラット無細胞腎に内皮細胞および上皮細胞を再配置しようと試みた。細胞の播種は、腎動脈を介してヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)浮遊物を灌流して、尿管を介してラット新生仔腎細胞(NKC)浮遊物を注入することによって行われた。細胞の送達および保持は、骨格全体に圧勾配を生成するために真空を適用することができる播種チャンバーに腎骨格を入れると劇的に改善した(図5a)。採取システムに陽圧を適用してNKCを播種しようとする試みは、糸球体に達しなかったが、経腎勾配を用いた細胞播種により、腎実質全体への細胞の分散が可能となった。細胞播種の際の真空雰囲気を、70 cm H2Oより上まで増加させると、腎杯および実質における組織損傷、ならびに極端な例において組織破壊が観察された。40 cm H2Oの真空によって、肉眼または顕微鏡的な組織損傷または細胞の漏出は起こらず、このことは、単離された尿細管基底膜の力学的特性に関するデータと一貫する(Welling, L.W. & Grantham, J.J. Physical properties of isolated perfused renal tubules and tubular basement membranes. J Clin Invest 51, 1063-1075 (1972))。播種後、腎構築物を、全器官培養条件を提供するように設計された灌流バイオリアクターに移した(図5b、c)。ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)は、肺および心臓骨格によるこれまでの実験と類似の無細胞腎マトリックスにおいて生着することが見いだされた。灌流器官培養の3から5日後、本発明者らは、腎区、葉間、および弓状動脈から糸球体および尿細管周囲毛細血管まで骨格の断面全体に伸びる内皮細胞が内側に並んだ脈管チャネルを観察した(図5d)。ネフロンに沿った異なるニッシェにおける多様な上皮細胞表現型は、尿の産生に寄与することから、本発明者らは、腎動脈を介したHUVECに加えて尿管を介したラットNKC(生後2〜3日)の組み合わせを再播種することを選択した。2〜3日齢のラット新生仔腎臓の新たに単離された酵素消化物は、上皮、内皮、および間質系列を含む全ての腎細胞タイプの不均一な混合物からなるNKCの単細胞浮遊物を生じた。細胞培養プラスチック上で単離後12時間培養すると、接着細胞の8%が糸球体上皮表現型を示すポドシンに関して染色陽性であり、69%が近位尿細管表現型を示すNa/K-ATPアーゼに関して染色陽性であり、および25%が遠位尿細管表現型を示すE-カドヘリンに関して染色陽性であった(データは示していない)。細胞の播種後、腎構築物を、灌流バイオリアクターに入れて、全器官生体模倣培養で培養した(n=31)。初回の静的培養期間によって細胞を接着させることができ、その後、酸素付加、栄養供給、および濾過刺激を提供するために灌流を開始した。新生仔ラットは、尿細管装置が未成熟であるために濃縮尿を排泄することができない(Falk, G. Maturation of renal function in infant rats. Am J Physiol 181, 157-170 (1955))。無細胞腎マトリックスにおけるインビトロ腎形成およびNKCの成熟を促進するために、本発明者らは、尿濃縮特性の発達を加速するために、グルココルチコイドおよびカテコラミンなどの公知のインビボ成熟シグナルを培養培地に補足した。本発明者らは、生理的条件下で12日まで再播種腎を培養した。培養4日目もの早期の組織学的評価で、本発明者らは、糸球体、尿細管、および血管構築が保存された、上皮および内皮細胞による腎骨格の再配置を観察した。NKCおよびHUVECは、その適切な上皮および血管区画に生着した(図5e)。再生された上皮および内皮の空間的関係は、水および溶質の濾過、分泌、および再吸収の解剖学的基礎を提供するネイティブネフロンの微小構造および極性と類似した。免疫染色により、内皮細胞および有足突起を有する密に播種された糸球体が明らかとなった。腎臓全体にわたって、有足突起は、糸球体領域に選択的に生着するように思われたが、時に非部位特異的生着が観察された(図5f-h)。上皮細胞は、β-1インテグリンに関して染色陽性である糸球体基底膜に生着し、ECMドメインに対する部位特異的細胞接着の可能性を示唆し、および観察された部位特異的細胞生着に関する作用機序の説明を提供する(図5i)。生着した上皮細胞は、極性を再度確立して、ネイティブ近位尿細管上皮と類似のNa/K ATPアーゼおよびエクオリンを発現する尿細管構造を構築することが見いだされた。同様に、e-カドヘリンを発現する上皮細胞は、ネイティブ遠位尿細管上皮および集合管と類似の構造を形成した(図5e、j-l)。E-カドヘリン陽性上皮細胞は、ネイティブの移行上皮と類似の腎盂の内側に並んだ。再生腎の透過型および走査型電子顕微鏡により、生着した有足突起を有する灌流糸球体毛細血管および有足突起の形成が示された(図5m、n)。再生腎の形態測定分析により、糸球体マトリックスの半分より多くが再細胞化されたことが示され、再生腎あたりの平均細胞糸球体数は、死体腎の糸球体数のおよそ70%であった。平均糸球体直径、ボウマン腔および糸球体毛細血管内腔は、死体腎と比較して再生腎ではより小さいように思われた(図5o)。
細胞播種および全器官培養後、本発明者らは、再生腎が、インビトロで標準化された灌流液を濾過する、代謝物をきれいにする、電解質およびグルコースを再吸収する、および濃縮尿を生成することができるか否かを調べた(図6a)。死体腎、脱細胞化腎、および再生腎を、アルブミン、尿素、および電解質を含むKrebs-Henseleit(KH)重炭酸緩衝液によって腎動脈を介して生理的圧力で灌流した。尿試料を分析して、3つの群のあいだで比較した。脱細胞化腎は、死体対照のほぼ2倍多くの濾液を産生した:再生腎は、尿の産生量が最も少なかった。3つの群は全て、試験期間のあいだに着実な尿産物を維持した(図6b、c)。尿分析の結果に基づいて、本発明者らは、糸球体濾過速度の推定値としてクレアチニンクリアランス、ならびに尿細管の吸収および分泌機能の測定として溶質排泄分画を計算した(図6d)。希釈尿産生の増加により、計算されたクレアチニンクリアランスは、死体腎と比較すると脱細胞化腎において増加し、無細胞基底膜全体での糸球体(およびおそらく追加の尿細管および管)濾過が増加したことを示した。内皮および上皮細胞による再配置後、再生構築物のクレアチニンクリアランスは、死体腎のおよそ10%に達し、これは、部分的に再構成されたおよびおそらく未成熟な糸球体膜全体での糸球体濾過の減少を示している(図6c)。血管抵抗は、脱細胞化と共に増加して、再内皮化後に減少するが、死体腎と比較すると再生構築物では高いままであることが見いだされた(図6e)。この知見は、心臓および肺の再内皮化における本発明者らのこれまでの観察と一致して、血管床の相対的未成熟さおよび細胞培養培地からの微小塞栓に関連しうる。インビトロ腎動脈灌流圧を、120 mmHgに増加したところ、再生腎における尿産生およびクレアチニンクリアランスは、死体腎の23%までに達した(図6b、c)。アルブミン保持は、脱細胞化腎において、露出した糸球体基底膜の高分子ふるいに対する推定される関与と一貫するレベルまで減少した。再細胞化により、アルブミン保持は、部分的に回復したが、再生腎では改善したものの永続的なアルブミン尿症が起こった。グルコース再吸収は、脱細胞化によって失われ、束縛のない濾過および尿細管上皮の喪失と一貫した。再生腎は、部分的に回復したグルコース再吸収を示し、このことは、機能的膜輸送体を有する近位尿細管上皮細胞の生着によって、糖尿の減少が起こることを示唆した。灌流圧をより高くしても、再生腎におけるアルブミンまたはグルコース喪失の増加は起こらなかった。選択的電解質再吸収は、脱細胞化腎において失われた。クレアチニンは電解質よりわずかにより多く濾過され、有効電解質保持分画の範囲は5〜10%であった。この差は、保持されるイオンの電荷および基底膜が原因である可能性がある(Bray, J. & Robinson, G.B. Influence of charge on filtration across renal basement membrane films in vitro. Kidney Int 25, 527-533 (1984))が、イオンの範囲は、無細胞血管、糸球体、および尿細管基底膜全体の拡散動態のわずかな差に関連しうる。再生腎において、電解質の再吸収は、生理的レベルのおよそ50%に回復したが、これはさらに、近位および遠位尿細管上皮細胞の生着および機能を示している。尿素排泄分画は、脱細胞化腎において増加したが、再生腎ではより生理学的範囲まで回復し、このことは、尿素輸送体を有する機能的集合管上皮が部分的に再構成されたことを示唆している。
再生腎は、インビトロで尿を産生したことから、本発明者らは、バイオ人工腎臓が、同所移植後にインビボで機能しうるという仮説を立てた。本発明者らは、実験的左腎摘出を行って、再生左腎を同所移植した。本発明者らは、再生左腎をレシピエントの腎動脈および静脈に吻合した(図7a)。試験期間全体を通して、再生腎移植片は、血管、腎集合管、または実質からの出血のいかなる徴候もなく、良好に灌流されるように思われた(図7b)。尿管にカニューレを挿入したままにして、肉眼的血尿の証拠がなく、澄んだ尿がインビボで産生されることを報告し、および尿試料を採取した。再生腎は、レシピエントの血管系の鉗子を外した後まもなくから実験の計画終了時まで尿を産生した。外植された再生腎の組織学的評価から、実質の出血または微小血管血栓形成の証拠なく血液が灌流される血管系であることが示された(図7c、d)。
無細胞腎骨格の微小構築を評価するために、本発明者らは、平均糸球体数、糸球体直径、糸球体毛細血管内腔、および部分的ボウマン腔を定量するために、確立された組織学に基づく形態測定プロトコールを適用した(Olivetti, G., Anversa, P., Rigamonti, W., Vitali-Mazza, L. & Loud, A.V. Morphometry of the renal corpuscle during normal postnatal growth and compensatory hypertrophy. A light microscope study. J Cell Biol 75, 573-585 (1977))。灌流脱細胞化腎は、死体腎と比較して固定、脱水、および包埋時にほとんどが縮小した。それゆえ、腎皮質1 mm2あたりの見かけの糸球体数は脱細胞化によって増加したが、総断面積に対して標準化すると一定のままであった。これに対応して、門の中の冠状断面あたりの総糸球体数は、脱細胞化によって一定のままであった。糸球体直径、ボウマン腔、および糸球体毛細血管表面積は、死体腎と脱細胞化腎のあいだで差がなかった。
灌流可能な機能的腎組織を再生するために、本発明者らはラット無細胞腎に内皮細胞および上皮細胞を再配置しようと試みた。細胞の播種は、腎動脈を介してヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)浮遊物を灌流して、尿管を介してラット新生仔腎細胞(NKC)浮遊物を注入することによって行われた。細胞の送達および保持は、骨格全体に圧勾配を生成するために真空を適用することができる播種チャンバーに腎骨格を入れると劇的に改善した(図6a)。採取システムに陽圧を適用してNKCを播種しようとする試みは、糸球体に達しなかったが、経腎勾配を用いた細胞播種により、腎実質全体への細胞の分散が可能となった。細胞播種の際の真空雰囲気を、70 cm H2Oより上まで増加させると、腎杯および実質における組織損傷、ならびに極端な例において組織破壊が観察された。40 cm H2Oの真空によって、肉眼または顕微鏡的な組織損傷または細胞の漏出は起こらず、このことは、単離された尿細管基底膜の力学的特性に関するデータと一貫する(Welling, L.W. & Grantham, J.J. Physical properties of isolated perfused renal tubules and tubular basement membranes. J Clin Invest 51, 1063-1075 (1972))。播種後、腎構築物を、全器官培養条件を提供するように設計された灌流バイオリアクターに移した(図6b、c)。ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)は、肺および心臓骨格によるこれまでの実験と類似の無細胞腎マトリックスにおいて生着することが見いだされた。灌流器官培養の3から5日後、本発明者らは、腎区、葉間、および弓状動脈から糸球体および尿細管周囲毛細血管まで骨格の断面全体に伸びる内皮細胞が内側に並んだ脈管チャネルを観察した(図6d)。ネフロンに沿った異なるニッシェにおける多様な上皮細胞表現型は、尿の産生に寄与することから、本発明者らは、腎動脈を介したHUVECに加えて尿管を介したラットNKC(生後2〜3日)の組み合わせを再播種することを選択した。2〜3日齢のラット新生仔腎臓の新たに単離された酵素消化物は、上皮、内皮、および間質系列を含む全ての腎細胞タイプの不均一な混合物からなるNKCの単細胞浮遊物を生じた。細胞培養プラスチック上で単離後12時間培養すると、接着細胞の8%が糸球体上皮表現型を示すポドシンに関して染色陽性であり、69%が近位尿細管表現型を示すNa/K-ATPアーゼに関して染色陽性であり、および25%が遠位尿細管表現型を示すE-カドヘリンに関して染色陽性であった(データは示していない)。細胞の播種後、腎構築物を、灌流バイオリアクターに入れて、全器官生体模倣培養で培養した(n=31)。初回の静的培養期間によって細胞を接着させることができ、その後、酸素付加、栄養供給、および濾過刺激を提供するために灌流を開始した。新生仔ラットは、尿細管装置が未成熟であるために濃縮尿を排泄することができない(Falk, G. Maturation of renal function in infant rats. Am J Physiol 181, 157-170 (1955))。無細胞腎マトリックスにおけるインビトロ腎形成およびNKCの成熟を促進するために、本発明者らは、尿濃縮特性の発達を加速するために、グルココルチコイドおよびカテコラミンなどの公知のインビボ成熟シグナルを培養培地に補足した。本発明者らは、生理的条件下で12日まで再播種腎を培養した。培養4日目もの早期の組織学的評価で、本発明者らは、糸球体、尿細管、および血管構築が保存された、上皮および内皮細胞による腎骨格の再配置を観察した。NKCおよびHUVECは、その適切な上皮および血管区画に生着した(図6e)。再生された上皮および内皮の空間的関係は、水および溶質の濾過、分泌、および再吸収の解剖学的基礎を提供するネイティブネフロンの微小構造および極性と類似した。免疫染色により、内皮細胞および有足突起を有する密に播種された糸球体が明らかとなった。腎臓全体にわたって、有足突起は、糸球体領域に選択的に生着するように思われたが、時に非部位特異的生着が観察された(図6f、g)。上皮細胞は、β-1インテグリンに関して染色陽性である糸球体基底膜に生着し、ECMドメインに対する部位特異的細胞接着の可能性を示唆し、および観察された部位特異的細胞生着に関する作用機序の説明を提供する(図6e、h)。生着した上皮細胞は、極性を再度確立して、ネイティブ近位尿細管上皮と類似のNa/K ATPアーゼおよびアクアポリンを発現する尿細管構造を構築することが見いだされた。同様に、e-カドヘリンを発現する上皮細胞は、ネイティブ遠位尿細管上皮および集合管と類似の構造を形成した(図6e、h)。E-カドヘリン陽性上皮細胞は、ネイティブの移行上皮と類似の腎盂の内側に並んだ。再生腎の透過型および走査型電子顕微鏡により、生着した有足突起を有する灌流糸球体毛細血管および有足突起の形成が示された(図6i、j)。再生腎の形態測定分析により、糸球体マトリックスの半分より多くが再細胞化されたことが示され、再生腎あたりの平均細胞糸球体数は、死体腎の糸球体数のおよそ70%であった。平均糸球体直径、ボウマン腔および糸球体毛細血管内腔は、死体腎と比較して再生腎ではより小さいように思われた。
細胞播種および全器官培養後、本発明者らは、再生腎が、インビトロで標準化された灌流液を濾過する、代謝物をきれいにする、電解質およびグルコースを再吸収する、および濃縮尿を生成することができるか否かを調べた(図7a)。死体腎、脱細胞化腎、および再生腎を、アルブミン、尿素、および電解質を含むKrebs-Henseleit(KH)重炭酸緩衝液によって腎動脈を介して生理的圧力で灌流した。尿試料を分析して、3つの群のあいだで比較した。脱細胞化腎は、死体対照のほぼ2倍多くの濾液を産生した:再生腎は、尿の産生量が最も少なかった。3つの群は全て、試験期間のあいだに着実な尿産物を維持した(図7b)。尿分析の結果に基づいて、本発明者らは、糸球体濾過速度の推定値としてクレアチニンクリアランス、ならびに尿細管の吸収および分泌機能の測定として溶質排泄分画を計算した(図7d)。希釈尿産生の増加により、計算されたクレアチニンクリアランスは、死体腎と比較すると脱細胞化腎において増加し、無細胞基底膜全体での糸球体(およびおそらく追加の尿細管および管)濾過が増加したことを示した。内皮および上皮細胞による再配置後、再生構築物のクレアチニンクリアランスは、死体腎のおよそ10%に達し、これは、部分的に再構成されたおよびおそらく未成熟な糸球体膜全体での糸球体濾過の減少を示している(図7c)。血管抵抗は、脱細胞化と共に増加して、再内皮化後に減少するが、死体腎と比較すると再生構築物では高いままであることが見いだされた(図7d)。この知見は、心臓および肺の再内皮化における本発明者らのこれまでの観察と一致して、血管床の相対的未成熟さおよび細胞培養培地からの微小塞栓に関連しうる。インビトロ腎動脈灌流圧を、120 mmHgに増加したところ、再生腎における尿産生およびクレアチニンクリアランスは、死体腎の23%までに達した(図7b、c)。アルブミン保持は、脱細胞化腎において、露出した糸球体基底膜の高分子ふるいに対する推定される関与と一貫するレベルまで減少した。再細胞化により、アルブミン保持は、部分的に回復したが、再生腎では改善したものの永続的なアルブミン尿症が起こった。グルコース再吸収は、脱細胞化によって失われ、束縛のない濾過および尿細管上皮の喪失と一貫した。再生腎は、部分的に回復したグルコース再吸収を示し、このことは、機能的膜輸送体を有する近位尿細管上皮細胞の生着によって、糖尿の減少が起こることを示唆した。灌流圧をより高くしても、再生腎におけるアルブミンまたはグルコース喪失の増加は起こらなかった。選択的電解質再吸収は、脱細胞化腎において失われた。クレアチニンは電解質よりわずかにより多く濾過され、有効電解質保持分画の範囲は5〜10%であった。この差は、保持されるイオンの電荷および基底膜が原因である可能性がある(Bray, J. & Robinson, G.B. Influence of charge on filtration across renal basement membrane films in vitro. Kidney Int 25, 527-533 (1984))が、イオンの範囲は、無細胞血管、糸球体、および尿細管基底膜全体の拡散動態のわずかな差に関連しうる。再生腎において、電解質の再吸収は、生理的レベルのおよそ50%に回復したが、これはさらに、近位および遠位尿細管上皮細胞の生着および機能を示している。尿素排泄分画は、脱細胞化腎において増加したが、再生腎ではより生理学的範囲まで回復し、このことは、尿素輸送体を有する機能的集合管上皮が部分的に再構成されたことを示唆している。
再生腎は、インビトロで尿を産生したことから、本発明者らは、バイオ人工腎臓が、同所移植後にインビボで機能しうるという仮説を立てた。本発明者らは、実験的左腎摘出を行って、再生左腎を同所移植した。本発明者らは、再生左腎をレシピエントの腎動脈および静脈に吻合した(図7e)。試験期間全体を通して、再生腎移植片は、血管、腎集合管、または実質からの出血のいかなる徴候もなく、良好に灌流されるように思われた(図7e)。尿管にカニューレを挿入したままにして、肉眼的血尿の証拠がなく、澄んだ尿がインビボで産生されることを報告し、および尿試料を採取した。再生腎は、レシピエントの血管系の鉗子を外した後まもなくから実験の計画終了時まで尿を産生した。外植された再生腎の組織学的評価から、実質の出血または微小血管血栓形成の証拠なく血液が灌流される血管系であることが示された(図7f)。
細胞播種のためのバイオ人工濾過器官骨格を封入するように、および播種チャンバーの内部に圧制御環境を提供するように適合され、第一の流体チャネルが細胞浮遊液を播種チャンバ―内へと通すことを可能にするように、および少なくとも1つの気圧チャネルが播種チャンバーの内部を気圧ポンプに接続することを可能にするように適合された複数のポートを含む、密閉播種チャンバー;
播種チャンバー内部の環境圧を感知するように適合された圧センサー
を備え、かつ
気圧ポンプが播種チャンバー内部を陰圧に維持することができる、
少なくとも1本の動脈管および少なくとも1本の輸出管を含む濾過器官の骨格に細胞を播種するための細胞播種システム。
[本発明1002]
第一の細胞浮遊物を細胞播種チャンバーに送達するために少なくとも1つの流体チャネルに接続された第一の細胞浮遊物リザーバーをさらに備える、本発明1001の細胞播種システム。
[本発明1003]
第一の細胞浮遊物を細胞播種チャンバーにポンプ注入するために第一の細胞浮遊物リザーバーに接続された第一の浮遊物用ポンプをさらに備える、本発明1002の細胞播種システム。
[本発明1004]
細胞浮遊物が内皮細胞を含む、本発明1002の細胞播種システム。
[本発明1005]
細胞浮遊物が上皮細胞を含む、本発明1002の細胞播種システム。
[本発明1006]
播種チャンバーのポートを通過する第二の流体チャネル、および、第二の細胞浮遊物を細胞播種チャンバーに送達するために第二の流体チャネルに接続された第二の細胞浮遊物リザーバーをさらに備える、本発明1001の細胞播種システム。
[本発明1007]
第一の細胞浮遊物を細胞播種チャンバーにポンプ注入するために第一の細胞浮遊物リザーバーに接続された第一の浮遊物用ポンプをさらに備える、本発明1002の細胞播種システム。
[本発明1008]
細胞播種チャンバーが、加熱チャンバーの中に少なくとも部分的に封入され、播種チャンバーを実質的に一定の温度に維持するように適合された加熱エレメントを含む、本発明1001の細胞播種システム。
[本発明1009]
細胞播種チャンバーを、10 cm H 2 Oと70 cm H 2 Oの間の陰圧に維持する、本発明1001の細胞播種システム。
[本発明1010]
細胞播種チャンバーを、30 cm H 2 Oと50 cm H 2 Oの間の陰圧に維持する、本発明1001の細胞播種システム。
[本発明1011]
細胞播種のための濾過器官骨格を封入するように、および播種チャンバーの内部に圧制御環境を提供するように適合され、第一の流体チャネルが細胞浮遊液を播種チャンバー内へと通し、第二の流体チャネルが細胞浮遊液を播種チャンバー内へと通し、第三の流体チャネルが細胞浮遊液を播種チャンバー内へと通すことを可能にするように、および少なくとも1つの気圧チャネルが播種チャンバーの内部を気圧ポンプに接続することを可能にするように適合された複数のポートを含む、密閉播種チャンバー;
気圧ポンプが、播種チャンバー内部で約40 cm H 2 Oの陰圧を維持することができる、播種チャンバー内部の環境圧を感知するように適合された圧センサー;
第一のチャネルに接続されて、第一の浮遊細胞群を細胞播種チャンバーに送達する、第一の浮遊細胞群を維持するように適合された第一の細胞浮遊物リザーバー;
第二のチャネルに接続されて、第二の浮遊細胞群を細胞播種チャンバーに送達する、第二の浮遊細胞群を維持するように適合された第二の細胞浮遊物リザーバー;および
第三のチャネルに接続されて、第三の浮遊細胞群を細胞播種チャンバーに送達する、第三の浮遊細胞群を維持するように適合された第三の細胞浮遊物リザーバー
を備える、少なくとも1本の動脈管、少なくとも1本の静脈管、および少なくとも1本の輸出管を含む濾過器官骨格に細胞を播種するための細胞播種システム。
[本発明1012]
血管内皮細胞または血管内皮細胞前駆細胞を血管区画に再播種しかつ上皮細胞または上皮細胞前駆細胞を再播種し輸出管を1本しか有さない盲端の上皮細胞区画に再播種した脱細胞化組織骨格を含む、人工バイオ濾過組織組成物であって、
該上皮細胞または上皮細胞前駆細胞が、陰圧勾配を脱細胞化骨格の外部に適用しながら細胞浮遊物を輸出管を介して注入することによって該盲端区画に導入される、人工バイオ濾過組織組成物。
[本発明1013]
骨格が脱細胞化腎臓骨格である、本発明1012の組成物。
[本発明1014]
上皮細胞が腎上皮細胞または腎上皮細胞前駆細胞である、本発明1013の組成物。
[本発明1015]
上皮細胞が肝上皮細胞または肝上皮細胞前駆細胞である、本発明1013の組成物。
[本発明1016]
骨格が、脱細胞化肺組織骨格である、本発明1012の組成物。
[本発明1017]
上皮細胞が腎上皮細胞または腎上皮細胞前駆細胞である、本発明1016の組成物。
[本発明1018]
上皮細胞が肝上皮細胞または肝上皮細胞前駆細胞である、本発明1016の組成物。
[本発明1019]
血管区画が、互いに流体連通している1本の輸入管および1本の輸出管を有し、内皮細胞またはその前駆細胞が、該細胞の浮遊物を輸入管の中に注入することによって導入される、本発明1012の組成物。
[本発明1020]
脱細胞化骨格の外部に適用される陰圧勾配が10 cm H 2 Oから70 cm H 2 Oの範囲にある、本発明1012の組成物。
[本発明1021]
脱細胞化骨格の外部に適用される陰圧勾配が20 cm H 2 Oから60 cm H 2 Oの範囲にある、本発明1012の組成物。
[本発明1022]
脱細胞化骨格の外部に適用される陰圧勾配が30 cm H 2 Oから50 cm H 2 Oの範囲にある、本発明1012の組成物。
[本発明1023]
人工バイオ濾過組織組成物が、血液から代謝老廃物の20%超を除去する、本発明1012の組成物。
[本発明1024]
人工バイオ濾過組織組成物が、血液から代謝老廃物の40%超を除去する、本発明1012の組成物。
[本発明1025]
人工バイオ濾過組織組成物が、血液から代謝老廃物の60%超を除去する、本発明1012の組成物。
[本発明1026]
人工バイオ濾過組織組成物が、血液中のクレアチニンの20%超を除去する、本発明1012の組成物。
[本発明1027]
人工バイオ濾過組織組成物が、血液中の血糖の20%超を保持する、本発明1012の組成物。
[本発明1028]
人工バイオ濾過組織組成物が、血液中の血清アルブミンの20%超を保持する、本発明1012の組成物。
[本発明1029]
人工バイオ濾過組織組成物が、血液中の血糖の40%超を保持する、本発明1012の組成物。
本発明のこれらおよび他の可能性は、本発明そのものと共に、添付の図面、以下の詳細な説明、および添付の特許請求の範囲を検討した後、より完全に理解されるであろう。
Claims (29)
- 細胞播種のためのバイオ人工濾過器官骨格を封入するように、および播種チャンバーの内部に圧制御環境を提供するように適合され、第一の流体チャネルが細胞浮遊液を播種チャンバ―内へと通すことを可能にするように、および少なくとも1つの気圧チャネルが播種チャンバーの内部を気圧ポンプに接続することを可能にするように適合された複数のポートを含む、密閉播種チャンバー;
播種チャンバー内部の環境圧を感知するように適合された圧センサー
を備え、かつ
気圧ポンプが播種チャンバー内部を陰圧に維持することができる、
少なくとも1本の動脈管および少なくとも1本の輸出管を含む濾過器官の骨格に細胞を播種するための細胞播種システム。 - 第一の細胞浮遊物を細胞播種チャンバーに送達するために少なくとも1つの流体チャネルに接続された第一の細胞浮遊物リザーバーをさらに備える、請求項1記載の細胞播種システム。
- 第一の細胞浮遊物を細胞播種チャンバーにポンプ注入するために第一の細胞浮遊物リザーバーに接続された第一の浮遊物用ポンプをさらに備える、請求項2記載の細胞播種システム。
- 細胞浮遊物が内皮細胞を含む、請求項2記載の細胞播種システム。
- 細胞浮遊物が上皮細胞を含む、請求項2記載の細胞播種システム。
- 播種チャンバーのポートを通過する第二の流体チャネル、および、第二の細胞浮遊物を細胞播種チャンバーに送達するために第二の流体チャネルに接続された第二の細胞浮遊物リザーバーをさらに備える、請求項1記載の細胞播種システム。
- 第一の細胞浮遊物を細胞播種チャンバーにポンプ注入するために第一の細胞浮遊物リザーバーに接続された第一の浮遊物用ポンプをさらに備える、請求項2記載の細胞播種システム。
- 細胞播種チャンバーが、加熱チャンバーの中に少なくとも部分的に封入され、播種チャンバーを実質的に一定の温度に維持するように適合された加熱エレメントを含む、請求項1記載の細胞播種システム。
- 細胞播種チャンバーを、10 cm H2Oと70 cm H2Oの間の陰圧に維持する、請求項1記載の細胞播種システム。
- 細胞播種チャンバーを、30 cm H2Oと50 cm H2Oの間の陰圧に維持する、請求項1記載の細胞播種システム。
- 細胞播種のための濾過器官骨格を封入するように、および播種チャンバーの内部に圧制御環境を提供するように適合され、第一の流体チャネルが細胞浮遊液を播種チャンバー内へと通し、第二の流体チャネルが細胞浮遊液を播種チャンバー内へと通し、第三の流体チャネルが細胞浮遊液を播種チャンバー内へと通すことを可能にするように、および少なくとも1つの気圧チャネルが播種チャンバーの内部を気圧ポンプに接続することを可能にするように適合された複数のポートを含む、密閉播種チャンバー;
気圧ポンプが、播種チャンバー内部で約40 cm H2Oの陰圧を維持することができる、播種チャンバー内部の環境圧を感知するように適合された圧センサー;
第一のチャネルに接続されて、第一の浮遊細胞群を細胞播種チャンバーに送達する、第一の浮遊細胞群を維持するように適合された第一の細胞浮遊物リザーバー;
第二のチャネルに接続されて、第二の浮遊細胞群を細胞播種チャンバーに送達する、第二の浮遊細胞群を維持するように適合された第二の細胞浮遊物リザーバー;および
第三のチャネルに接続されて、第三の浮遊細胞群を細胞播種チャンバーに送達する、第三の浮遊細胞群を維持するように適合された第三の細胞浮遊物リザーバー
を備える、少なくとも1本の動脈管、少なくとも1本の静脈管、および少なくとも1本の輸出管を含む濾過器官骨格に細胞を播種するための細胞播種システム。 - 血管内皮細胞または血管内皮細胞前駆細胞を血管区画に再播種しかつ上皮細胞または上皮細胞前駆細胞を再播種し輸出管を1本しか有さない盲端の上皮細胞区画に再播種した脱細胞化組織骨格を含む、人工バイオ濾過組織組成物であって、
該上皮細胞または上皮細胞前駆細胞が、陰圧勾配を脱細胞化骨格の外部に適用しながら細胞浮遊物を輸出管を介して注入することによって該盲端区画に導入される、人工バイオ濾過組織組成物。 - 骨格が脱細胞化腎臓骨格である、請求項12記載の組成物。
- 上皮細胞が腎上皮細胞または腎上皮細胞前駆細胞である、請求項13記載の組成物。
- 上皮細胞が肝上皮細胞または肝上皮細胞前駆細胞である、請求項13記載の組成物。
- 骨格が、脱細胞化肺組織骨格である、請求項12記載の組成物。
- 上皮細胞が腎上皮細胞または腎上皮細胞前駆細胞である、請求項16記載の組成物。
- 上皮細胞が肝上皮細胞または肝上皮細胞前駆細胞である、請求項16記載の組成物。
- 血管区画が、互いに流体連通している1本の輸入管および1本の輸出管を有し、内皮細胞またはその前駆細胞が、該細胞の浮遊物を輸入管の中に注入することによって導入される、請求項12記載の組成物。
- 脱細胞化骨格の外部に適用される陰圧勾配が10 cm H2Oから70 cm H2Oの範囲にある、請求項12記載の組成物。
- 脱細胞化骨格の外部に適用される陰圧勾配が20 cm H2Oから60 cm H2Oの範囲にある、請求項12記載の組成物。
- 脱細胞化骨格の外部に適用される陰圧勾配が30 cm H2Oから50 cm H2Oの範囲にある、請求項12記載の組成物。
- 人工バイオ濾過組織組成物が、血液から代謝老廃物の20%超を除去する、請求項12記載の組成物。
- 人工バイオ濾過組織組成物が、血液から代謝老廃物の40%超を除去する、請求項12記載の組成物。
- 人工バイオ濾過組織組成物が、血液から代謝老廃物の60%超を除去する、請求項12記載の組成物。
- 人工バイオ濾過組織組成物が、血液中のクレアチニンの20%超を除去する、請求項12記載の組成物。
- 人工バイオ濾過組織組成物が、血液中の血糖の20%超を保持する、請求項12記載の組成物。
- 人工バイオ濾過組織組成物が、血液中の血清アルブミンの20%超を保持する、請求項12記載の組成物。
- 人工バイオ濾過組織組成物が、血液中の血糖の40%超を保持する、請求項12記載の組成物。
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