CN111467574B - 基于edc/nhs活化和重组人源胶原蛋白修饰的生物瓣膜材料及其制备方法 - Google Patents

基于edc/nhs活化和重组人源胶原蛋白修饰的生物瓣膜材料及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于EDC/NHS活化和重组人源胶原蛋白修饰的生物瓣膜材料及其制备方法，制备方法包括以下步骤：(1)将经戊二醛交联的生物瓣膜材料置于EDC/NHS溶液中浸泡，然后清洗；(2)将步骤(1)所得清洗后的生物瓣膜材料置于重组人源胶原蛋白溶液中浸泡，然后清洗，制得。本发明可有效解决现有的生物瓣膜材料抗凝血性能、抗钙化性能和生物相容性较差的问题。

Description

基于EDC/NHS活化和重组人源胶原蛋白修饰的生物瓣膜材料 及其制备方法
技术领域
本发明属于医用材料技术领域，具体涉及一种基于EDC/NHS活化和重组人源胶原蛋白修饰的生物瓣膜材料及其制备方法。
背景技术
心脏瓣膜疾病是一种常见的瓣膜衰退疾病，在解剖学上表现为血液通路变窄或瓣膜关闭不全。心脏瓣膜疾病的治疗包括开胸瓣膜置换手术以及经皮心脏瓣膜置换手术。开胸手术对病人创伤大、风险高、恢复慢、需体外循环支持，很多患者无法接受。经皮心脏瓣膜置换手术因为对病人创伤小、风险低，成为未来瓣膜手术的主要趋势。
生物心脏瓣膜是指一类用于替换人体病变心脏瓣膜的生物医学材料。生物心脏瓣膜一般由猪心包膜、牛心包膜等通过戊二醛交联制备而成。戊二醛交联处理具有操作简单，成本低以及胶原蛋白交联程度高的特点，是目前生物心脏瓣膜化学交联的行业首选。然而，对于戊二醛交联的生物心脏瓣膜由于瓣膜上残留醛基的存在，具有一定毒性以及钙化的问题，尤其是作为血流经过肺动脉瓣和静脉瓣时，由于血液流动较慢容易发生凝血，从而导致生物心脏瓣膜只有10年左右的有效使用年限。通过戊二醛交联方法可以稳定材料中的胶原蛋白，但是由于其作为异体植入物，植入后会发生不同程度排异反应进而引发各种临床症状，生物相容性需提高，其次残留醛基的存在导致一定的生物毒性及钙化，同时其抗凝血性能亟待提高，导致戊二醛交联的生物材料具有一定技术缺陷。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种基于EDC/NHS活化和重组人源胶原蛋白修饰的生物瓣膜材料及其制备方法，可有效解决现有的生物瓣膜材料抗凝血性能、抗钙化性能和生物相容性较差的问题。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种基于EDC/NHS活化和重组人源胶原蛋白修饰的生物瓣膜材料，其制备方法包括以下步骤：
(1)将经戊二醛交联的生物瓣膜材料置于EDC/NHS溶液中浸泡，然后清洗；
(2)将步骤(1)所得清洗后的生物瓣膜材料置于重组人源胶原蛋白溶液中浸泡，然后清洗，制得。
进一步地，步骤(1)中经戊二醛交联的生物瓣膜材料通过以下方法获制得：将动物源心包生物材料浸入体积浓度为0.1-10％的戊二醛溶液中反应4-38h，制得；其中，戊二醛溶液可以为戊二醛水溶液，也可以为戊二醛的PBS缓冲溶液。
进一步地，步骤(1)中将动物源心包生物材料浸入戊二醛溶液之前还包括对动物源心包生物材料的预处理，去除黏附的非心包和非胶原组织。预处理过程可以采用如下方式：在振荡条件下用蒸馏水清洗动物源心包生物材料直至不再含有黏附的非心包或非胶原组织，优选为将动物源心包生物材料置于蒸馏水中，于4℃，100r/min条件下振荡清洗2h。
进一步地，步骤(1)中将经戊二醛交联的生物瓣膜材料置于pH＝5.3，浓度为含10-500mmol/LEDC的MES缓冲溶液中浸泡，浸泡时间小于等于30min，然后按照EDS和NHS的摩尔比为1:1-1:2加入NHS活化1-5h。
进一步地，步骤(2)中将步骤(1)所得清洗后的生物瓣膜材料置于浓度为1-30mg/mL的重组人源胶原蛋白溶液中浸泡1-24h。
进一步地，步骤(2)中重组人源胶原蛋白一级结构为不含O(羟脯氨酸)，并且兼顾细胞黏附特性，优选为包含细胞黏附功能的GER片段，但不含与血小板表面α2β1整合素特异性结合的GFOGER片段。
进一步地，步骤(2)中重组人源胶原蛋白的氨基酸序列的核心序列为GERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAP，还可以对核心序列进行修饰，修饰位置及基团包括但不限于巯基末端、双键末端、甲基丙烯酸酯。
进一步地，制备过程还包括将步骤(2)所得清洗后的生物瓣膜材料置于还原剂溶液中浸泡，然后清洗的过程。
进一步地，还原剂浓度为20-100mg/mL，浸泡时间为0.1-24h；优选还原剂浓度为50mmol/L，浸泡时间为12h。
进一步地，还原剂为硼氢化钠、硼氢化钾或氰基硼氢化钠。
本发明提供的基于EDC/NHS活化和重组人源胶原蛋白修饰的生物瓣膜材料及其制备方法，具有以下有益效果：
动物源心包生物材料有羧基官能团，可经EDC/NHS活化体系将羧基活化为活性酯中间体后再与具有氨基的重组人源胶原蛋白反应，通过形成酰胺键连接重组人源胶原蛋白，同时戊二醛交联的动物源心包生物材料中还残留有醛基，该醛基可与重组人源胶原蛋白中的氨基进行反应，从而将重组人源胶原蛋白通过碳氮双键和单键连接在戊二醛交联的生物材料上。一方面通过对残留醛基的修饰，减少其带来的毒性以及避免与醛基相关的生物材料钙化问题的出现；另一方面，由于重组人源Ⅲ型胶原蛋白具备与人体完全相同的结构，具有低免疫原性等特征，利用重组人源胶原修饰方法将提升动物源生物心脏瓣膜的生物相容性。
本发明中的重组人源Ⅲ型胶原蛋白是经筛选后通过生物合成手段获得的具备与人Ⅲ型胶原蛋白相同结构的胶原功能区，无显著细胞毒性，人体内免疫排异低；由于其具备羧基、氨基和胍基等官能团，其结构中正负电荷集中，具有较高的水溶性及细胞黏附活性。不同于传统胶原蛋白，本发明设计了具有抗凝血性能的重组人源Ⅲ型胶原蛋白，具有高内皮细胞亲和力，其序列设计避开了血小板结合位点的胶原蛋白结构，是一种可用于心血管材料改性的定制化胶原材料，其意义体现在重组人源Ⅲ型胶原蛋白不仅免疫排异极低，抗凝血性能也非常显著。传统的胶原蛋白是多种类型胶原的混合物，难以去除结构中含O的残基，导致血小板凝结DNA片段进而导致免疫反应的动物氨基酸基团难以完全切除。本发明设计的重组人源Ⅲ型胶原蛋白一级结构中就不含O，不会出现上述问题。
本发明中设计的重组人源Ⅲ型胶原蛋白具有显著的抗凝血效果，且对比动物胶原，其既可以降低动物源组织的免疫原性，又可增强细胞黏附性及抗凝血性，利于心血管植入器械表面内皮化。
重组人源Ⅲ型胶原蛋白以共价结合的方式引入到瓣膜材料中，活性得以较好的保持，通过还原剂的后处理即还原剂通过与重组人源胶原蛋白修饰的生物材料中的碳氮双键及修饰过程中未反应的醛基反应，将其还原为更稳定的单键，从而提高重组人源胶原蛋白与生物材料键合的稳定性得到进一步的提高，有利于维持其胶原蛋白的长效性。
附图说明
图1为实施例1中实验组的血小板黏附实验SEM图；其中右图为左图的放大图。
图2为戊二醛交联生物瓣膜对照组的血小板黏附实验SEM图；其中右图为左图的放大图。
具体实施方式
实施例1
一种基于EDC/NHS活化和重组人源胶原蛋白修饰的生物瓣膜材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)采集新鲜的猪心包，置于蒸馏水中，于4℃，100r/min条件下振荡清洗2h；
(2)将步骤(1)清洗后的猪心包置于在体积浓度为0.625％的戊二醛水溶液中浸泡24h，得经戊二醛交联的动物源心包生物材料；
(3)将经戊二醛交联的动物源心包生物材料清洗后浸泡于50mmol/L含EDC的MES缓冲溶液中(pH＝5.3)中，浸泡30min，然后加入NHS，最终浓度为50mmol/L，浸泡5h后，取出洗净；
(4)将步骤(3)所得的生物材料浸泡于30mg/ml重组人源Ⅲ型胶原蛋白的PBS溶液中，浸泡24h，然后取出，用蒸馏水清洗干净；其中，重组人源Ⅲ型胶原蛋白的氨基酸序列为GERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAP；
(5)将步骤(4)所得的生物材料浸泡于50mmol/L的硼氢化钾(KBH4)PBS溶液中，浸泡12h，再用蒸馏水清洗干净。
实施例2
一种基于EDC/NHS活化和重组人源胶原蛋白修饰的生物瓣膜材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)采集新鲜的猪心包，置于蒸馏水中，于4℃，100r/min条件下振荡清洗2h；
(2)将步骤(1)清洗后的猪心包置于在体积浓度为0.625％的戊二醛水溶液中浸泡24h，得经戊二醛交联的动物源心包生物材料；
(3)将经戊二醛交联的动物源心包生物材料清洗后浸泡于500mmol/L含EDC的MES缓冲(，pH＝5.3)中，浸泡15min，然后加入NHS，最终浓度为500mmol/L，浸泡3h后，取出洗净；
(4)将步骤(3)所得的生物材料浸泡于15mg/ml重组人源Ⅲ型胶原蛋白的PBS溶液中，浸泡24h，然后取出，用蒸馏水清洗干净；其中，重组人源Ⅲ型胶原蛋白的氨基酸序列为GERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAP；
(5)将步骤(4)所得的生物材料浸泡于50mmol/L的硼氢化钠(NaBH4)PBS溶液中，浸泡12h，再用蒸馏水清洗干净。
实施例3
一种基于EDC/NHS活化和重组人源胶原蛋白修饰的生物瓣膜材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)采集新鲜的猪心包，置于蒸馏水中，于4℃，100r/min条件下振荡清洗2h；
(2)将步骤(1)清洗后的猪心包置于在体积浓度为0.625％的戊二醛水溶液中浸泡24h，得经戊二醛交联的动物源心包生物材料；
(3)将经戊二醛交联的动物源心包生物材料清洗后浸泡于500mmol/L含EDC的MES缓冲溶液中(pH＝5.3)中，浸泡10min，然后加入NHS，最终浓度为500mmol/L，浸泡2h后，取出洗净；
(4)将步骤(3)所得的生物材料浸泡于5mg/ml重组人源Ⅲ型胶原蛋白的PBS溶液中，浸泡24h，然后取出，用蒸馏水清洗干净；其中，重组人源Ⅲ型胶原蛋白的氨基酸序列为GERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAP；
(5)将步骤(4)所得的生物材料浸泡于50mmol/L的氰基硼氢化钠(NaCNBH3)PBS溶液中，浸泡12h，再用蒸馏水清洗干净。
实施例4
一种基于EDC/NHS活化和重组人源胶原蛋白修饰的生物瓣膜材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)采集新鲜的猪心包，置于蒸馏水中，于4℃，100r/min条件下振荡清洗2h；
(2)将步骤(1)清洗后的猪心包置于在体积浓度为2％的戊二醛水溶液中浸泡12h，得经戊二醛交联的动物源心包生物材料；
(3)将经戊二醛交联的动物源心包生物材料清洗后浸泡于500mmol/L含EDC的MES缓冲溶液中(pH＝5.3)中，浸泡30min，然后加入NHS，最终浓度为500mmol/L，浸泡5h后，取出洗净；
(4)将步骤(3)所得的生物材料浸泡于2mg/ml重组人源Ⅲ型胶原蛋白的PBS溶液中，浸泡12h，然后取出，用蒸馏水清洗干净；其中，重组人源Ⅲ型胶原蛋白的氨基酸序列为GERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAP；
(5)将步骤(4)所得的生物材料浸泡于20mmol/L的氰基硼氢化钠(NaCNBH3)PBS溶液中，浸泡5h，再用蒸馏水清洗干净。
实施例5
一种基于EDC/NHS活化和重组人源胶原蛋白修饰的生物瓣膜材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)采集新鲜的猪心包，置于蒸馏水中，于4℃，100r/min条件下振荡清洗2h；
(2)将步骤(1)清洗后的猪心包置于在体积浓度为2％的戊二醛水溶液中浸泡12h，得经戊二醛交联的动物源心包生物材料；
(3)将经戊二醛交联的动物源心包生物材料清洗后浸泡于500mmol/L含EDC的MES缓冲溶液中(pH＝5.3)中，浸泡30min，然后加入NHS，最终浓度为500mmol/L，浸泡5h后，取出洗净；
(4)将步骤(3)所得的生物材料浸泡于10mg/ml重组人源Ⅲ型胶原蛋白的PBS溶液中，浸泡5h，然后取出，用蒸馏水清洗干净；其中，重组人源Ⅲ型胶原蛋白的氨基酸序列为GERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAP；
(5)将步骤(4)所得的生物材料浸泡于50mmol/L的硼氢化钾(KBH4)PBS溶液中，浸泡1h，再用蒸馏水清洗干净。
实施例6
一种基于EDC/NHS活化和重组人源胶原蛋白修饰的生物瓣膜材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)采集新鲜的猪心包，置于蒸馏水中，于4℃，100r/min条件下振荡清洗2h；
(2)将步骤(1)清洗后的猪心包置于在体积浓度为0.5％的戊二醛水溶液中浸泡24h，得经戊二醛交联的动物源心包生物材料；
(3)将经戊二醛交联的动物源心包生物材料清洗后浸泡于500mmol/L含EDC的MES缓冲溶液中(pH＝5.3)中，浸泡30min，然后加入NHS，最终浓度为500mmol/L，浸泡5h后，取出洗净；
(4)将步骤(3)所得的生物材料浸泡于20mg/ml重组人源Ⅲ型胶原蛋白的PBS溶液中，浸泡10h，然后取出，用蒸馏水清洗干净；其中，重组人源Ⅲ型胶原蛋白的氨基酸序列为GERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAP；
(5)将步骤(4)所得的生物材料浸泡于20mmol/L的硼氢化钾(KBH4)PBS溶液中，浸泡24h，再用蒸馏水清洗干净。
实施例7
一种基于EDC/NHS活化和重组人源胶原蛋白修饰的生物瓣膜材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)采集新鲜的猪心包，置于蒸馏水中，于4℃，100r/min条件下振荡清洗2h；
(2)将步骤(1)清洗后的猪心包置于在体积浓度为1％的戊二醛水溶液中浸泡24h，得经戊二醛交联的动物源心包生物材料；
(3)将经戊二醛交联的动物源心包生物材料清洗后浸泡于500mmol/L含EDC的MES缓冲溶液中(pH＝5.3)中，浸泡30min，然后加入NHS，最终浓度为500mmol/L，浸泡5h后，取出洗净；
(4)将步骤(3)所得的生物材料浸泡于25mg/ml重组人源Ⅲ型胶原蛋白的PBS溶液中，浸泡15h，然后取出，用蒸馏水清洗干净；其中，重组人源Ⅲ型胶原蛋白的氨基酸序列为GERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAP；
(5)将步骤(4)所得的生物材料浸泡于60mmol/L的硼氢化钠(NaBH4)PBS溶液中，浸泡12h，再用蒸馏水清洗干净。
实施例8
一种基于EDC/NHS活化和重组人源胶原蛋白修饰的生物瓣膜材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)采集新鲜的猪心包，置于蒸馏水中，于4℃，100r/min条件下振荡清洗2h；
(2)将步骤(1)清洗后的猪心包置于在体积浓度为2％的戊二醛水溶液中浸泡24h，得经戊二醛交联的动物源心包生物材料；
(3)将经戊二醛交联的动物源心包生物材料清洗后浸泡于500mmol/L含EDC的MES缓冲溶液中(pH＝5.3)中，浸泡30min，然后加入NHS，最终浓度为500mmol/L，浸泡5h后，取出洗净；
(4)将步骤(3)所得的生物材料浸泡于10mg/ml重组人源Ⅲ型胶原蛋白的PBS溶液中，浸泡24h，然后取出，用蒸馏水清洗干净；其中，重组人源Ⅲ型胶原蛋白的氨基酸序列为GERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAP；
(5)将步骤(4)所得的生物材料浸泡于80mmol/L的硼氢化钠(NaBH4)PBS溶液中，浸泡16h，再用蒸馏水清洗干净。
实施例9
一种基于EDC/NHS活化和重组人源胶原蛋白修饰的生物瓣膜材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)采集新鲜的猪心包，置于蒸馏水中，于4℃，100r/min条件下振荡清洗2h；
(2)将步骤(1)清洗后的猪心包置于在体积浓度为0.625％的戊二醛水溶液中浸泡24h，得经戊二醛交联的动物源心包生物材料；
(3)将经戊二醛交联的动物源心包生物材料清洗后浸泡于500mmol/L含EDC的MES缓冲溶液中(pH＝5.3)中，浸泡5min，然后加入NHS，最终浓度为500mmol/L，浸泡1h后，取出洗净；
(4)将步骤(3)所得的生物材料浸泡于1mg/ml重组人源Ⅲ型胶原蛋白的PBS溶液中，浸泡24h，然后取出，用蒸馏水清洗干净；其中，重组人源Ⅲ型胶原蛋白的氨基酸序列为GERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAP。
实施例10
一种基于EDC/NHS活化和重组人源胶原蛋白修饰的生物瓣膜材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)采集新鲜的猪心包，置于蒸馏水中，于4℃，100r/min条件下振荡清洗2h；
(2)将步骤(1)清洗后的猪心包置于在体积浓度为0.625％的戊二醛水溶液中浸泡12h，得经戊二醛交联的动物源心包生物材料；
(3)将经戊二醛交联的动物源心包生物材料清洗后浸泡于500mmol/L含EDC的MES缓冲溶液中(pH＝5.3)中，浸泡5min，然后加入NHS，最终浓度为500mmol/L，浸泡1h后，取出洗净；
(4)将步骤(3)所得的生物材料浸泡于30mg/ml重组人源Ⅲ型胶原蛋白的PBS溶液中，浸泡24h，然后取出，用蒸馏水清洗干净；其中，重组人源Ⅲ型胶原蛋白的氨基酸序列为GERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAP。
对比例
戊二醛处理组(对照组)：采集新鲜的猪心包，置于蒸馏水中，于4℃，100r/min条件下振荡清洗2h，然后置于置于在体积浓度为0.625％的戊二醛水溶液中浸泡24h，再用蒸馏水清洗干净。
实验例血小板黏附实验
通过血小板黏附实验可以发现采用实施例1的方法对生物瓣膜进行处理后，生物瓣膜表面吸附的血小板相比于对照组中生物瓣膜表面吸附的血小板明显减少，表明基于EDC/NHS活化和重组人源胶原蛋白修饰的生物瓣膜材料具备较为优异的抗凝血功能。

Claims (9)

1.一种基于EDC/NHS活化和重组人源胶原蛋白修饰的生物瓣膜材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将经戊二醛交联的生物瓣膜材料置于EDC/NHS溶液中浸泡，然后清洗；
(2)将步骤(1)所得清洗后的生物瓣膜材料置于重组人源胶原蛋白溶液中浸泡，然后清洗，制得；
重组人源Ⅲ型胶原蛋白的氨基酸序列中包含GER片段，但不含GFOGER片段。
2.根据权利要求1所述的基于EDC/NHS活化和重组人源胶原蛋白修饰的生物瓣膜材料的制备方法，其特征在于，步骤(1)中经戊二醛交联的生物瓣膜材料通过以下方法获制得：将动物源心包生物材料浸入体积浓度为0.1-10％的戊二醛溶液中反应4-38h，制得。
3.根据权利要求1所述的基于EDC/NHS活化和重组人源胶原蛋白修饰的生物瓣膜材料的制备方法，其特征在于，步骤(1)中将经戊二醛交联的生物瓣膜材料置于pH＝5.3，浓度为含10-500mmol/L EDC的MES缓冲溶液中浸泡，浸泡时间小于等于30min，然后按照EDS和NHS的摩尔比为1:1-1:2加入NHS活化1-5h。
4.根据权利要求1所述的基于EDC/NHS活化和重组人源胶原蛋白修饰的生物瓣膜材料的制备方法，其特征在于，步骤(2)中将步骤(1)所得清洗后的生物瓣膜材料置于浓度为1-30mg/mL的重组人源胶原蛋白溶液中浸泡1-24h。
5.根据权利要求1所述的基于EDC/NHS活化和重组人源胶原蛋白修饰的生物瓣膜材料的制备方法，其特征在于，步骤(2)中重组人源胶原蛋白的核心序列为GERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAP。
6.根据权利要求1所述的基于EDC/NHS活化和重组人源胶原蛋白修饰的生物瓣膜材料的制备方法，其特征在于，还包括：将步骤(2)所得清洗后的生物瓣膜材料置于还原剂溶液中浸泡，然后清洗的过程。
7.根据权利要求6所述的基于EDC/NHS活化和重组人源胶原蛋白修饰的生物瓣膜材料的制备方法，其特征在于，还原剂浓度为20-100mg/mL，浸泡时间为0.1-24h。
8.根据权利要求6或7中所述的基于EDC/NHS活化和重组人源胶原蛋白修饰的生物瓣膜材料的制备方法，其特征在于，还原剂为硼氢化钠、硼氢化钾或氰基硼氢化钠。
9.采用权利要求1-8任一项所述的方法制得的基于EDC/NHS活化和重组人源胶原蛋白修饰的生物瓣膜材料。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114632195B (zh) * 2022-02-28 2023-01-06 四川大学 一种抗凝促心肌组织修复的可降解封堵器及其制备方法
CN114796623B (zh) * 2022-03-08 2023-04-07 四川大学 一种促心肌组织修复的全降解心脏封堵器涂层及其制备方法
CN117229386A (zh) * 2023-03-16 2023-12-15 山西锦波生物医药股份有限公司 一种具有164.88°三螺旋结构低分子量胶原蛋白
CN116036361B (zh) * 2023-03-29 2023-06-20 四川大学 一种注射水凝胶及其制备方法和应用
CN116983477A (zh) * 2023-08-03 2023-11-03 晨兴(南通)医疗器械有限公司 复合交联生物瓣膜材料的制备方法及复合交联生物瓣膜材料

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3562820A (en) * 1966-08-22 1971-02-16 Bernhard Braun Tubular sheet and strip form prostheses on a basis of biological tissue
EP1951331A1 (en) * 2005-11-14 2008-08-06 Seoul National University Industry Foundation Method for producing collagen/apatite composite membrane for guided bone regeneration
CN102499993A (zh) * 2011-11-01 2012-06-20 微创医疗器械(上海)有限公司 一种边缘刚性化人工生物瓣膜的制备方法
CN105194733A (zh) * 2014-06-30 2015-12-30 王静 一种化学处理人工瓣膜的方法
CN105935454A (zh) * 2015-09-18 2016-09-14 广州市美昊生物科技有限公司 一种脱细胞基质源组织工程支架及其制备方法和应用
CN108785747A (zh) * 2018-07-07 2018-11-13 四川大学 一种提高生物材料抗钙化性能的处理方法及其生物材料

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9925303B2 (en) * 2012-11-13 2018-03-27 Edwards Lifesciences Corporation Methods for cross-linking bioprosthetic tissue using bio-orthogonal binding pairs

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3562820A (en) * 1966-08-22 1971-02-16 Bernhard Braun Tubular sheet and strip form prostheses on a basis of biological tissue
EP1951331A1 (en) * 2005-11-14 2008-08-06 Seoul National University Industry Foundation Method for producing collagen/apatite composite membrane for guided bone regeneration
CN102499993A (zh) * 2011-11-01 2012-06-20 微创医疗器械(上海)有限公司 一种边缘刚性化人工生物瓣膜的制备方法
CN105194733A (zh) * 2014-06-30 2015-12-30 王静 一种化学处理人工瓣膜的方法
CN105935454A (zh) * 2015-09-18 2016-09-14 广州市美昊生物科技有限公司 一种脱细胞基质源组织工程支架及其制备方法和应用
CN108785747A (zh) * 2018-07-07 2018-11-13 四川大学 一种提高生物材料抗钙化性能的处理方法及其生物材料

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