CN110904030A - 一种软组织细胞外基质提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种软组织细胞外基质提取方法，包括将动物软组织浸入处理液中溶胀、超声处理；将材料转移至水或缓冲液中，冷却，超声处理；将处理完成的材料用水或缓冲液振荡清洗，得细胞外基质材料。本发明方法能将细胞外基质提取工艺中时间减短至3‑4h，脱细胞工艺时间能缩短至30min，同时能保证免疫物质能够充分脱除效果，不仅提高工艺效率，也不影响免疫脱除质量，更是降低了长时间的表面活性剂对胶原网络的毒化作用，相对保留了外基质更多的生物活性。

Description

一种软组织细胞外基质提取方法

技术领域

本发明涉及生物材料领域，具体涉及一种软组织细胞外基质提取方法，可用于生物材料生产制备及医疗器械加工制造。

背景技术

细胞外基质是一种结构蛋白和功能蛋白组成的复杂混合物，主要由胶原、糖蛋白、氨基聚糖与蛋白聚糖以及弹性蛋白等组成，构成了细胞生命活动的微环境，维持细胞自身的功能及细胞间的交流，由于其中不含有诱发免疫识别的物质，在移植至异体受体时，不会被免疫识别为异物，而且可以支持宿主细胞的生长，甚至能诱导细胞的定向分化。

细胞外基质来源于动物组织，其中免疫物质主要集中在组织中的细胞核内，提取细胞外基质的原理也就是将细胞免疫核物质脱除。目前最广泛使用的方法是化学与物理法相结合，物理法破坏细胞结构，化学法漂洗出细胞碎片，但是即使在对工艺优化后，免疫脱除工艺周期仍然可能长达24h，对细胞结构的破坏仍旧难以降低。

在生物学中，常利用超声的空泡效应、热效应及机械效应来作进行细胞破碎。在超声的声压震荡作用下，会在透过的液体介质中形成空泡，在超声波纵横波交替正负压强下受到压缩和拉伸，出现猛烈聚爆，产生几十兆帕至上百兆帕巨大的瞬时压力，同时会出现上千度的瞬时高温，从而能快速使细胞结构破裂。在外基质提取中，细胞结构破碎后，大量的非水溶性的免疫碎片还是可能残留于外基质骨架内，因此还需要结合一定的化学方法，如表面活性剂处理，将其中的细胞碎片增溶去除。但是，高能量密度超声的空泡效应、热效应及机械效应可能对外基质骨架造成不可逆的损伤。胶原在42℃左右就会发生热收缩，导致外基质胶原纤维网变形，蛋白质空间结构也发生改变，严重降低活性，不再适合细胞的爬行生长。因此，最初仅使用超声破碎组织和细胞结构以提取其中的核物质或蛋白，外基质网会在提取中几乎被完全破坏。后期经过研究和改进，对超声频率和功率进行细化调整后，已经能在骨、血管、真皮、筋膜等较硬组织的脱细胞处理中使用，其胶原网空间结构较难被破坏，而且后续应用部位对其空间结构要求并不是非常高，只要能保证基本的骨架和取向即可，已能缩短处理时间，提高处理效率。

但是，在超声应用于角膜、羊膜、脊髓等软组织的脱细胞处理时，由于其纤维网力学强度非常低，超声可能会对其造成较严重的影响。尤其是角膜，由于其纤维束层层相叠组成的结构非常精密，轻微的结构破坏就会导致整体性能的缺陷，降低光学透过性，以至于材料根本无法进行后续使用。已有脱细胞工艺如CN201811591406将羊膜超声处理，然后物理刮除所述羊膜上的细胞； CN201810862285用了碱法与超声辅助破碎鱼皮细胞及辅助交联，用于口腔修复，而CN201810429745用超声和酶法结合处理小肠粘膜下层作为硬膜补片，此两种工艺材料都是选择的力学强度较高的硬质膜，因此超声对材料破坏小，也不要求光学性能。这些处理工艺时间用于角膜的脱细胞处理时，由于时间仍然较长、试剂性破坏性大等原因，工艺并不适用。通过设计适当的工艺更大幅度缩短脱细胞时间并减小结构破坏，才能保证利用超声对角膜等软组织细胞外基质进行快速提取而不造成结构损伤。

发明内容

为了解决上述存在的问题，本发明的目的在于提供一种软组织细胞外基质提取方法。能大幅度缩短脱细胞时间并减小结构破坏，保证利用超声对角膜等软组织细胞外基质进行快速提取而不造成结构损伤。

本发明所采取的技术方案是：

一种软组织细胞外基质提取方法，包括以下步骤：

1）将经过前处理后的动物软组织浸入处理液中溶胀1-60min，用频率为15-40kHz，功率为30-300W的超声处理0.5-30min；

2）将材料转移至水或缓冲液中，冷却至-18 - 4℃，用频率为15-40kHz，功率为3-50W的超声处理0.5-1min；

3）将处理完成的材料用水或缓冲液洗净，得细胞外基质材料。

优选的，所述步骤3）水为纯化水，所述缓冲液为PBS溶液。

优选的，所述动物软组织为缝合力≤10N的动物组织。

优选的，所述动物软组织为角膜、结膜、羊膜、脊髓、神经中的至少一种。

优选的，所述处理液为含0.05-2%wt表面活性剂的水溶液。

优选的，所述表面活性剂包括十二烷基硫酸钠、硫代甜菜碱10、曲拉通X-100、脱氧胆酸钠中的至少一种。

优选的，所述处理液还含有0.01%-50%wt助剂。

优选的，所述助剂为丙三醇、丙二醇、山梨醇、丁二醇、氯化镁、氯化钙中的至少一种。

优选的，所述动物软组织在浸入处理液前是经除去多余组织、洗净、消毒处理的动物软组织。

优选的，所述步骤1）和2）中的超声处理独立选自连续或脉冲超声。优选的，所述脉冲处理工艺为1-5 s开，关时长每次比开时长多1 s。

优选的，所述步骤3）洗净为振荡清洗。优选的，振荡清洗次数1-3次，每次10min。

上述软组织细胞外基质提取方法应用于生物材料及医疗器械加工制造中，主要能用于快速提取角膜、结膜、羊膜、脊髓、神经等细胞外基质，可在后续作为生物材料或用作再生型医疗器械。

本发明中，缝合力测量时，是利用万用拉力机将单股穿透组织较薄侧的5-0缝线两侧同时向材料反方向拉伸，在线对材料剪切拉出过程中的最大力，能模拟真实材料缝合后材料受力情况。一般来说，角膜缝合力约为2N、结膜缝合力约为1N、羊膜约为0.1N、脊髓约为0.05N、神经为4-10N；细胞外基质骨、肌肉等较硬、厚的组织等缝合力都在10N以上。

本发明中，将动物软组织浸入处理液中溶胀，是为了使处理液中成分在原材料中分散，材料与处理液中能达到一定的溶胀平衡。

本发明中，将温度降低至 -18 - 4 ℃下进行超声处理，目的是通过降低温度，以减轻后续超声处理中的热效应，减少局部过热引起的变形及活性降低。

本发明中，步骤1）超声频率选择15-40kHz范围，功率为30-300W时处理能保证各样品在处理液中的处理效果，使得细胞成分在协同作用下能够被破碎和洗出，在连续或脉冲超声处理下，仅需处理0.5min-30min就可保证处理完全。

本发明中，振荡清洗优选振荡清洗1-3次，每次10min，即可基本洗出其中的细胞物质及残余处理液，提取出较纯净的细胞外基质材料。

本发明中，处理液中添加的表面活性剂主要用途为将材料内细胞物质洗脱及洗出。十二烷基硫酸钠（SDS）、硫代甜菜碱10、曲拉通X-100、脱氧胆酸钠为化学脱细胞工艺常用表面活性剂，但由于其同时对外基质生物活性具有毒化作用，因此选用浓度为0.05%-2%wt等较低浓度以降低变性破坏作用，增强洗脱效果。

本发明中，处理液中添加助剂，主要也是利于降低超声带来的空泡效应、热效应及机械效应。降低温度能够降低热效应，但是在稀溶液降低到0℃以下时，即使整体不凝固，材料局部也会发生冰晶化反应出现微相分离，而在超声作用下能量主要集中在此类相界面上，反而增加了机械效应和热效应，严重损伤胶原网格结构。因此，在加入本发明优选浓度的丙三醇、丙二醇、山梨醇、丁二醇、氯化镁、氯化钙等后，能够降低整体的凝固点，防止出现因为结晶出现导致的局部相分离，或能够被外基质吸附起到增韧作用，也相当于增加了各相间的相容性。在整体的相连续性提高后，就能降低超声机械效益及热效应。同时，丙三醇、丙二醇不仅能连同表面活性剂有效降低液体表面张力，也能增加液体粘度，从而减少空泡效应带来的能量冲击。

本发明中，经过测试，发现连续或脉冲处理都能够有效地进行外基质提取并保留结构，但在组织较薄或超声处理时间在5min以上时，优选脉冲工艺，能降低热效应。

本发明中，优选的脉冲工艺中1-5 s开，关时长每次比开时长多1 s对于角膜、结膜等组织提取有较好的效果，能够有效保留其光学等物理外观性能。

本发明所述的经过前处理后的动物软组织为经除去多余组织、洗净、消毒的动物软组织。

对于脂肪含量高的神经组织，还需提前脱脂。所述脱脂可选用弱碱处理、脂肪酶处理、超临界提取。如原料选用脂肪含量高的神经组织时，则需要进行脱脂处理，否则影响下一步工艺；如选用角膜、结膜组织时，则仅需洗净即可。

本发明的工艺进一步改进后也可适用于软骨、血管、骨等较硬、厚材料的细胞外基质提取，需要视材料的厚度和硬度而进一步延长超声处理时间及升高处理温度，以获得较好的免疫物质脱除效果，同时通过保护性助剂的加入，能更好维持材料的三维及表面结构。

本发明的有益效果是：

本发明能够快速对软组织细胞外基质进行提取，通过利用超声促进表面活性剂导入胶原骨架内，促进细胞物质快速裂解破碎，并经过低强度超声处理快速洗出，能将细胞外基质提取工艺总时间减短至3-4h，其中的关键脱细胞工艺时间能缩短至0.5-30min，同时能保证免疫物质能够充分脱除效果，不仅提高工艺效率，也不影响免疫脱除质量，更是降低了长时间的表面活性剂对胶原网络的毒化作用，相对保留了外基质更多的生物活性。

本发明的工艺有利于外基质胶原网的的空间结构保持，通过保护性助剂的加入和低温工艺，能减少表面活性剂使用量，也有利于胶原网格整体均相化，减少超声的热效应、空泡效益和机械效应对外基质网络的损伤，而不会影响超声对细胞破碎及与外基质间的分离效果。

本发明工艺涉及的材料和耗材简单易得，对超声设备的要求并不严格，普通的超声细胞破碎仪即可满足使用要求，实施简单，价格成本低，能有效提升工艺效率，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1 是各实施例产品HE染色后效果图；

图2 是各对照实施例产品HE染色后效果图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1

将羊角膜组织周围多余组织除去，并经初步清洗和消毒处理后，浸入含有2%wt曲拉通X-100及50%wt丙三醇的处理液中溶胀60min后，冷却至-18℃后，利用频率为40kHz，功率为300W的超声连续处理30s，再将其转移至PBS溶液中，用频率为40kHz，功率为50W的超声连续处理30s，再将处理完成的材料用PBS溶液振荡清洗3次，每次10min，即得到羊角膜细胞外基质材料。

实施例2

将牛结膜组织周围多余组织除去，并经初步清洗和消毒处理后，浸入含有1%wt 硫代甜菜碱10及33%wt丙二醇的处理液中溶胀40min，冷却至-10℃后，利用频率为30kHz，功率为180W的超声脉冲处理10min，脉冲设置为5s开，6s关，再将其转移至纯化水中，用频率为30kHz，功率为25W的超声连续处理1min，再用纯化水清洗2次，每次10min，即得到牛结膜细胞外基质材料。

实施例3

将羊膜初步清洗和消毒处理后，浸入含有0.5% wt 十二烷基硫酸钠及18%wt丁二醇的处理液中溶胀15min，冷却至-5℃后，利用频率为22kHz，功率为100W的超声脉冲处理20min，脉冲设置为3s开，4s关，再将材料转移至PBS溶液中，用频率为22kHz，功率为10 W的超声连续处理40s，将处理完成的材料用纯化水清洗10min，即得到羊膜细胞外基质材料。

实施例4

将鼠脊髓初步清洗和消毒处理后，浸入含有0.05% wt脱氧胆酸钠及0.01%wt山梨醇溶液的处理液中溶胀1min，冷却至4℃后，利用频率为15kHz，功率为30W的超声连续处理30min，将材料转移至PBS溶液中，用频率为15kHz，功率为3W的脉冲处理1min，脉冲设置为1s开，2s关，将处理完成的材料用纯化水清洗10min，即得到鼠脊髓细胞外基质材料。

实施例5

将猪角膜组织周围多余组织除去，并经初步清洗和消毒处理后，浸入含有1%wt曲拉通X-100、0.02%wt脱氧胆酸钠、12%wt丙三醇、2%山梨醇的处理液中溶胀45min后，冷却至-5℃后，利用频率为22kHz，功率为150W的超声脉冲处理5min，设置为1s开，2s关，再将角膜材料转移至PBS溶液中，用频率为15kHz，功率为40W的超声连续处理50s，再将处理完成的材料用纯化水振荡清洗3次，每次10min，即得到猪角膜细胞外基质材料。

实施例6

将兔结膜组织周围多余组织除去，并经初步清洗和消毒处理后，浸入含有0.8%wt 十二烷基硫酸钠 及14 %wt氯化钙的处理液中溶胀5min，冷却至-5℃后，利用频率为30kHz，功率为250W的超声脉冲处理15 min，脉冲设置为2s开，3s关，再将其转移至纯化水中，用频率为22kHz，功率为35W的超声连续处理40s，再用纯化水清洗2次，每次10min，即得到兔结膜细胞外基质材料。

实施例7

将羊膜组织初步清洗和消毒处理后，浸入含有0.13 %wt 硫代甜菜碱10、0.03%wt曲拉通X-100、5%wt氯化镁及1%wt山梨醇的处理液中溶胀8min，冷却至0℃后，利用频率为22kHz，功率为50W的超声连续处理18min，再将其转移至PBS中，用频率为35kHz，功率为25W的超声连续处理30s，再用纯化水清洗10min，即得到羊膜细胞外基质材料。

实施例8

将猪角膜组织周围多余组织除去，并经初步清洗和消毒处理后，浸入含有0.5 %wt拉通X-100、0.1%硫代甜菜碱10、0.1%脱氧胆酸钠及28%wt丙三醇、14%丁二醇、1%山梨醇的处理液中溶胀35min，冷却至-8℃后，利用频率为40kHz，功率为180W的超声连续处理3min，再将其转移至纯化水中，用频率为30kHz，功率为15W的超声连续处理1min，再用纯化水清洗3次，每次10min，即得到猪角膜细胞外基质材料。

实施例9

将猪神经组织周围多余组织除去，用0.2g/L脂肪酶水溶液在37 ℃下振荡4h脱脂，并经初步清洗和消毒处理后，浸入含有1.5 %wt 十二烷基硫酸钠、0.1%脱氧胆酸钠、0.6%氯化镁、0.2%氯化钙的处理液中溶胀25min，冷却至0℃后，利用频率为22kHz，功率为280W的超声连续脉冲处理8min，脉冲设定为1s开，2s关，再将其转移至纯化水或PBS溶液中，用频率为22kHz，功率为25W的超声连续处理1min，用PBS溶液清洗3次，每次10min，即得到猪神经外基质材料。

对照实施例1

将牛结膜组织周围多余组织除去，并经初步清洗和消毒处理后，浸入含有1%wt 硫代甜菜碱10及33%wt丙二醇的处理液中溶胀40min，常温下利用频率为30kHz，功率为180W的超声脉冲处理10min，脉冲设置为5s开，6s关，再将其转移至纯化水中，用频率为30kHz，功率为25W的超声连续处理1min，再用纯化水清洗2次，每次10min，即得到牛结膜细胞外基质材料。

对照实施例2

将猪角膜组织周围多余组织除去，并经初步清洗和消毒处理后，浸入含有1%wt曲拉通X-100、0.02%wt脱氧胆酸钠、12%wt丙三醇、2%山梨醇的处理液中溶胀45min后，冷却至-5℃后，在普通的振荡反应器上用100rpm频率下恒温振荡5min，再将角膜材料转移至PBS溶液中，继续振荡50s，再将处理完成的材料用纯化水振荡清洗3次，每次10min，即得到猪角膜细胞外基质材料。

对照实施例3

将猪角膜组织周围多余组织除去，并经初步清洗和消毒处理后，浸入含有1%wt曲拉通X-100、0.02%wt脱氧胆酸钠中溶胀45min后，冷却至-5℃后，利用频率为22kHz，功率为150W的超声脉冲处理5min，设置为1s开，2s关，再将角膜材料转移至PBS溶液中，用频率为15kHz，功率为40W的超声连续处理50s，再将处理完成的材料用纯化水振荡清洗3次，每次10min，即得到猪角膜细胞外基质材料。

对照实施例4

将猪角膜组织周围多余组织除去，并经初步清洗和消毒处理后，浸入含有1%wt曲拉通X-100、0.02%wt脱氧胆酸钠、12%wt丙三醇、2%山梨醇的处理液中溶胀45min后，室温下利用频率为22kHz，功率为150W的超声脉冲处理5min，设置为1s开，2s关，再将角膜材料转移至PBS溶液中，用频率为15kHz，功率为40W的超声连续处理50s，再将处理完成的材料用纯化水振荡清洗3次，每次10min，即得到猪角膜细胞外基质材料。

对照实施例5

将猪角膜组织周围多余组织除去，并经初步清洗和消毒处理后，浸入含有12%wt丙三醇、2%山梨醇的处理液中溶胀45min后，冷却至-5℃后，利用频率为22kHz，功率为150W的超声脉冲处理5min，设置为1s开，2s关，再将角膜材料转移至PBS溶液中，用频率为15kHz，功率为40W的超声连续处理50s，再将处理完成的材料用纯化水振荡清洗3次，每次10min，即得到猪角膜细胞外基质材料。

对照实施例6

将猪神经组织周围多余组织除去，用0.2g/L脂肪酶水溶液在37 ℃下振荡4h脱脂，并经初步清洗和消毒处理后，浸入含有0.6%氯化镁、0.2%氯化钙的处理液中溶胀25min，冷却至0℃后，利用频率为22kHz，功率为280W的超声连续脉冲处理8min，脉冲设定为1s开，2s关，再将其转移至纯化水或PBS溶液中，用频率为22kHz，功率为25W的超声连续处理1min，用PBS溶液清洗3次，每次10min，即得到猪神经外基质材料。

由于结膜、羊膜、脊膜都为结构类似的薄膜，因此选择代表性的结膜、角膜及神经，对照例1、6分别与实施例2、9相对照，对照例2、3、4、5分别为实施例5改变各项工艺条件后与实施例5进行对照，最终观察实施例1～9及对照例1～6制得的材料的形貌，并其进行切片HE染色后观察组织形貌及结构，实施例1～9结果如图1所示，对照例1～6结果如图2所示。

由图1可知，实施例1-9所获得的产品上均无可见的蓝色染色物质，说明细胞核类免疫物质均基本脱除。而且各实施例在脱除细胞后，胶原纤维的长度、走向和排布并无被明显破坏，而实施例4由于材料厚度低、力学性能较差，HE染色效果并不明显，但是胶原纤维网的破坏并不强烈。

由图2可见，实施例与各对比例间均有较大的差异。对照例1为实施例2不经过降温制得；对照例2、3、4、5分别为为实施例5改用常规振荡工艺（不经过超声处理）、不加入处理助剂、不降低温度及不加入表面活性剂制得；对照例6为实施例9不加入表面活性剂制得。其中，对照例1由于未降低温度，结膜的弱胶原网络主要由于超声热效应发生微区收缩成为孔洞状；对照例2由于不经过超声处理，振荡时间短，细胞核物质无法完全脱除；对照例3不加入处理助剂降低空泡效益、机械效应，胶原纤维被机械性撕裂，排布明显不规整；对照例4同样未降低温度，软组织的胶原网络微区也会收缩出现孔洞；对照例5和6由于不加入表面活性剂，而无法快速洗出细胞成分，难以提取纯净外基质。

综上所述，本发明的工艺能够通过超声导入表面活性剂的方式对细胞外基质快速提取，而通过加入处理助剂的方式对产品结构进行了保护，实施简单，价格成本低，能有效提升工艺效率，具有广阔的应用前景。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的实质和原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均为等效置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种软组织细胞外基质提取方法，包括以下步骤：

1）将经过前处理后的动物软组织浸入处理液中溶胀1-60min，用频率为15-40kHz，功率为30-300W的超声处理0.5-30min；

2）将材料转移至水或缓冲液中，冷却至-18 - 4℃，用频率为15-40kHz，功率为3-50W的超声处理0.5-1min；

3）将处理完成的材料用水或缓冲液洗净，得细胞外基质材料。

2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：所述动物软组织为缝合力≤10N的动物组织。

3.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于：所述动物软组织为角膜、结膜、羊膜、脊髓、神经。

4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：所述处理液为含0.05-2%wt表面活性剂的水溶液。

5.根据权利要求4所述的提取方法，其特征在于：所述表面活性剂包括十二烷基硫酸钠、硫代甜菜碱10、曲拉通X-100、脱氧胆酸钠中的至少一种。

6.根据权利要求4所述的提取方法，其特征在于：所述处理液还含有0.01%-50%wt助剂。

7.根据权利要求6所述的提取方法，其特征在于：所述助剂为丙三醇、丙二醇、山梨醇、丁二醇、氯化镁、氯化钙中的至少一种。

8.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：所述动物软组织在浸入处理液前是经除去多余组织、洗净、消毒处理的动物软组织。

9.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：所述步骤1）和2）中的超声处理独立选自连续或脉冲超声。

10.根据权利要求9所述的提取方法，其特征在于：所述脉冲处理工艺为1-5 s开，关时长每次比开时长至少多1 s。

Images