CN111110917A - 一种制备脱细胞生物组织材料的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物组织材料的技术领域，具体涉及一种制备脱细胞生物组织材料的方法。所述方法包括如下步骤：包括冻融处理、超高压处理和去核酸三道工序，其中超高压处理采用的压力为400‑600MPa。与现有技术相比，本发明提供的技术方案采用反复冻融与超高压结合的方法，可明显缩短工艺耗时，提高脱细胞效率，另外实验参数更温和，减少了对生物支架结构的破坏；本发明实施例中超高压处理采用的压力不会导致介质水出现临界冰现象，可以更好的保留组织结构的完整性和机械性能。

Description

一种制备脱细胞生物组织材料的方法
技术领域
本发明属于生物组织材料的技术领域，具体涉及一种制备脱细胞生物组织材料的方法。
背景技术
由于脱细胞生物组织材料具有低免疫源性、完整的纤维结构和良好的机械强度，因而在医疗器械领域得到了越来越多的关注和应用。
目前，常用的脱细胞方法主要有物理法、酶消化法、酸碱法及化学去垢剂法等。然而，大量研究表明，以上几种方法存在很多问题：(1)物理法脱细胞效果较差，易导致细胞和DNA残留，引起机体免疫反应；(2)酶消化法对酶的浓度要求较高，高浓度的酶易导致胶原纤维组织受损，低浓度的酶则难以去除深层细胞，脱细胞效果差；(3)酸碱法中强酸强碱的环境对组织结构破坏较大；(4)化学去垢剂法不仅易破坏生物组织的胶原蛋白结构，残留的化学去垢剂还容易导致细胞毒性，且漂洗耗时长。因此，开发一种更简便、高效、安全的脱细胞方法将具有广泛的应用前景和重要的实用价值。
2006年，上海交通大学医学院上海儿童医学中心的殷猛等首次报道了在生物材料制备领域采用超高压技术进行脱细胞操作。首先将组织置入浸满MillliQ水的塑料袋中，在超高压设备中逐步加压至约980MPa，持续10分钟，再相继用酶消化法冲洗，酒精浸泡，PBS冲洗，共耗时11天。这种超高压脱细胞方法虽然可以完全去除细胞成分，简便快速，但是该方法中使用的压力较大，对设备要求高，且制备周期较长。另外，有研究表明高压会导致蛋白质变性，因此接近1000MPa的超高压对基质结构的作用还需进一步研究。同时，当压力高于600MPa时，作为传压介质的水会出现临界冰现象，进而会对胶原纤维造成损伤。
专利CN101185770描述了一种多次逐步增压的超高压脱细胞方法。将生物组织连通真空包装袋放入传压介质中，分别经过600MPa，800MPa和1000MPa各5分钟的超高压处理后，即可将细胞完全去除，且不破坏蛋白结构。但该过程中多次的逐步增压工艺较为复杂，对技术要求高；且后续压力较大，对设备要求高。同时，该过程中操作压力也均在600MPa及以上，也会出现水的临界冰现象。另外，超高压力也会导致组织结构致密性高，孔隙率小，很可能导致脱细胞效果降低。
总之，现有的生物组织脱细胞方法(如物理法、化学去垢剂法等)存在脱细胞不完全、胶原组织受损或残余物毒性较大等缺点，在工艺上还有待改善和提高。新的超高压脱细胞的处理工艺虽然有一定的优势，但是在压力设备需求、生物组织形态变化及机械性能强化等方面仍需进一步改进。
发明内容
本发明提供了一种制备脱细胞生物组织材料的方法，用以解决目前方法制备脱细胞生物组织材料脱除细胞不完全、组织受损严重或残留毒性物质的问题。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案是：所述制备脱细胞生物组织材料的方法，包括冻融处理、超高压处理和去核酸三道工序，其中超高压处理采用的压力为400-600MPa。
可选地，所述方法具体包括如下步骤：
步骤一，将生物组织上的脂肪剥离并对所述生物组织进行修剪和清洗；
步骤二，冻融处理：将步骤一处理后的生物组织反复冻融多次；
步骤三，超高压处理：将步骤二处理后的生物组织清洗密封，置于超高压仪器内进行超高压处理；
步骤四，去核酸：将步骤三处理后的生物组织，用核酸酶去除细胞残余核酸组分；
步骤五，保存：将步骤四处理后的生物组织清洗后密封保存。
需要指出的是，同批次处理的所述生物组织可以为同种同体、同种异体或异种生物组织材料。
可选地，所述步骤一具体包括如下步骤：无菌磷酸盐缓冲液浸没无纺布，将生物组织在浸润的无纺布上铺开，剥去脂肪组织层，然后将生物组织的纤维层朝上，用无尘布去除生物组织表面脂肪并剪去游离纤维，然后将生物组织裁切成规则小片进行后续处理，最后用生理盐水在室温下清洗多次，每次清洗3～5分钟。
所述室温是指室内温度，一般为20-25℃。
一般剪切成正方形小片，当然也可以是其他平行四边形、圆形、三角形等便于剪切、存放或使用的形状，面积一般控制在1～3cm2。
可选地，所述冻融单次过程如下：将生物组织置于4℃预冷10～20min、-80℃±10℃冷冻1.5～2h，37℃水浴复温15～20min。
可选地，所述步骤三具体包括如下步骤：在无菌D-Hanks溶液中清洗后置入浸满D-Hanks溶液的塑料袋中密封，再将密封于塑料袋的生物组织置入超高压机器内，在400～500Mpa以及4℃条件下处理20～30min。
可选地，所述步骤四具体包括如下步骤：将生物组织置于核酸酶溶液中，在37℃恒温摇床中以100r/min的振荡速度冲洗24～72h。
可选地，所述核酸酶溶液中含有核糖核酸酶A(RNase A)和脱氧核糖核酸酶I(DNase I)，所述RNase A的浓度为10～20μg/mL，所述DNase I的浓度为100～200μg/mL。
可选地，所述步骤五具体包括如下步骤：用磷酸盐缓冲液漂洗所述生物组织1天后，置入4℃、含有抗生素的磷酸盐缓冲液中密封保存。
可选地，提取的新鲜生物组织经预处理后运送至实验室，当日进行所述步骤一。
可选地，所述预处理包括如下步骤：将获取的新鲜生物组织置于3-5℃的无菌生理盐水中，采用pH值为6.8～8.6的磷酸盐缓冲液或pH值为6.8～8.6的D-Hanks溶液在室温下清洗多次，每次3-5分钟，直至生物组织无血迹或血水，最后将清洗达标的生物组织保存在含有抗生素的生理盐水中。
可选地，所述新鲜生物组织选自牛心包、猪心包、牛心脏瓣膜、猪心脏瓣膜、猪小肠、牛血管、猪血管、牛皮或猪皮。需要指出的是，其他动物体内相应部位的组织也可作为原材料。
本发明提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点：
1)本发明中脱细胞采用的超高压的压力值较现有技术采用的压力值(600Mpa以上)低，对设备要求低；并且由于所用压力低于600MPa，作为传压介质的水不易出现临界冰现象，有效降低对组织支架结构的破坏；
2)反复冻融与超高压结合使用，缩短了制备周期，提高了工艺处理效率；
3)该方法不使用化学去垢剂类的化学试剂，避免了细胞毒性，降低了组织钙化的风险；
4)避免使用蛋白酶，且核酸酶浓度低，可在去除组织中导致免疫原性的细胞组分的同时，降低对胶原纤维的损伤，维持结构支架的完整性；
5)由于不会对生物组织本身造成损伤，因此机械性能不会发生显著变化；
6)适用面较广，不同种类的生物组织材料均可获得理想的脱细胞效果。
附图说明
图1是实施例1中冻融加超高压处理后的牛心包生物组织HE染色图；
图2是对比例1’中单一冻融处理后的牛心包生物组织HE染色图；
图3是对比例1”中单一超高压处理后的牛心包生物组织HE染色图；
图4是实施例2中冻融加超高压处理后的猪心包生物组织HE染色图；
图5是对比例2’中单一冻融处理后的猪心包生物组织HE染色图；
图6是对比例2”中单一超高压处理后的猪心包生物组织HE染色图。
具体实施方式
为了便于理解，下面结合实施例阐述所述制备脱细胞生物组织材料的方法，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例中采用的试剂或原料无特殊说明均为市售普通商品，采用的技术手段如无特殊说明则本领域常用方式均可。
本发明提供的技术方案从屠宰厂获取生物组织直至获得脱细胞生物组织材料大致通过如下步骤：
预处理：在当地屠宰厂获取新鲜生物组织，如牛心包、猪心包、牛心脏瓣膜、猪心脏瓣膜、猪小肠、牛血管、猪血管、牛皮或猪皮等，本实施例中选区牛心包和猪心包生物组织，将其快速置于4℃左右的无菌生理盐水中，采用pH值为6.8～8.6的磷酸盐缓冲液或pH值为6.8～8.6的D-Hanks溶液，本实施例中采用pH值约为7.2～7.4的磷酸盐缓冲液在室温下清洗了3次，每次3-5分钟，直至生物组织无血迹或血水即可，如未清洗干净可继续清洗多次，最后将其保存在含有1％抗生素的生理盐水中，就可以运至实施室进行脱细胞处理了；
步骤一，将生物组织上的脂肪剥离并对所述生物组织进行修剪和清洗；
步骤二，冻融处理：将步骤一处理后的生物组织反复冻融多次；
步骤三，超高压处理：将步骤二处理后的生物组织清洗密封，置于超高压仪器内进行超高压处理；
步骤四，去核酸：将步骤三处理后的生物组织，用核酸酶去除细胞残余核酸组分；
步骤五，保存：将步骤四处理后的生物组织清洗后密封保存。
为了更好的的说明本发明提供技术方案所能解决的技术方案和优势，采用相同的生物组织，分别采用单一多次冻融或单一超高压方式处理，按照本领域的有效脱细胞指标，以材料中DNA含量降到0.1μg/ml以内为标准，调整制备过程中的具体参数。
实施例1
步骤一，在干净的灭菌方盘内均匀铺一层无菌无纺布，加入无菌磷酸盐缓冲液浸没无纺布后，将将预处理的牛心包组织在浸润的无纺布上铺开，轻轻地将明显的脂肪组织层剥去，并避免损伤纤维层。然后将生物组织的粗糙面(纤维层)朝上，用无尘布轻轻的擦拭去除组织表面脂肪。将生物组织不规则的部分及游离纤维剪去，裁剪成小片(15mmx15mm)，用生理盐水在室温下清洗3次，每次清洗3～5分钟；
步骤二，冻融处理：将步骤一处理的生物组织置于4℃预冷10min、-80℃冷冻2h，37℃水浴复温15min，该过程重复进行3次；
步骤三，超高压处理：将步骤二处理的生物组织在无菌D-Hanks溶液中彻底漂洗干净后置入浸满D-Hanks溶液的塑料袋中密封，再将密封于塑料袋的生物组织置入超高压机器内，在500Mpa以及4℃条件下处理20min；
步骤四，去核酸：将步骤三处理的生物组织置于15μg/mL RNase A、150μg/mLDNase I的核酸酶溶液中，在37℃恒温摇床中以100r/min的振荡速度冲洗48h，其中核酸酶溶液24h更换1次；
步骤五，保存：将步骤四处理的组织用磷酸盐缓冲液漂洗1天后，置入4℃、含有抗生素的磷酸盐缓冲液中密封保存，备用，表1中给出了处理前与处理后，生物组织在厚度、断裂强度和DNA含量。
表1-牛心包处理前和处理后对比
厚度mm 断裂强度MPa DNA含量μg/mL
处理前 0.290±0.005 17.61±3.32 0.623±0.031
处理后 0.273±0.004 16.27±4.85 0.059±0.012
如图1和表1所示，实验结果表明：所制备的脱细胞牛心包组织的厚度为0.273±0.004mm，断裂强度为16.27±4.85MPa，DNA含量为0.051±0.012g/mL。将经过脱细胞处理后的牛心包使用组织学(HE)染色实验(见图1)，结果显示牛心包组织中的纤维走向相对一致，连续性好，呈波浪状，心包中的胶原纤维结构没有被破坏。由此可见，本发明使用的脱细胞处理方法处理后的猪心包能够保持组织原先结构和状态。
对比例1’(单一反复冻融)：
与实施例1的区别在于没有超高压处理过程，为了将DNA含量降至0.1μg/ml以下，调整了如下实验参数：
冻融处理时间需要从2h延长至4h，水浴复温也由15min延长至了30min
核酸酶溶液中RNase A的含量需从15μg/mL提高到100μg/mL。
实验证明，在缺少超高压的步骤下，想要实现脱细胞的目的，需要改变实验参数，才能使DNA含量降到0.1μg/ml以内。此外，将经过此操作的牛心包组织进行组织学(HE)染色实验，如图1和2比较可以发现，与实施例1相比，实施例1’处理的牛心包组织中存在纤维断裂，且仍有少量深染细胞核等。
对比例1”(单一超高压)：
与实施例1的区别在于没有多次冻融处理过程，为了将DNA含量降至0.1μg/ml以下，调整了如下实验参数：
超高压处理：压力由500Mpa提高到981MPa，处理时间由20min缩短至10min；
实验证明，在缺少反复冻融的步骤下，想要实现脱细胞的目的，需要改变实验参数，处理压力明显增加。此外，将经过单一超高压处理的牛心包组织使用组织学(HE)染色实验，如图1和3比较可以发现，与实施例1处理的生物组织相比，实施例1”处理的牛心包组织中存在轻微纤维断裂，且仍有少量深染细胞核存在。
实施例2
步骤一，在干净的灭菌方盘内均匀铺一层无菌无纺布，加入无菌磷酸盐缓冲液浸没无纺布后，将将预处理的猪心包组织在浸润的无纺布上铺开，轻轻地将明显的脂肪组织层剥去，并避免损伤纤维层。然后将生物组织的粗糙面(纤维层)朝上，用无尘布轻轻的擦拭去除组织表面脂肪。将生物组织不规则的部分及游离纤维剪去，裁剪成小片(15mmx15mm)，用生理盐水在室温下清洗3次，每次清洗3～5分钟；
步骤二，冻融处理：将步骤一处理的生物组织置于4℃预冷15min、-80℃冷冻1.5h，37℃水浴复温15min，该过程重复进行3次；
步骤三，超高压处理：将步骤二处理的生物组织在无菌D-Hanks溶液中彻底漂洗干净后置入浸满D-Hanks溶液的塑料袋中密封，再将密封于塑料袋的生物组织置入超高压机器内，在500Mpa以及4℃条件下处理20min；
步骤四，去核酸：将步骤三处理的生物组织置于20μg/mL RNase A、200μg/mLDNaseI的核酸酶溶液中，在37℃恒温摇床中以100r/min的振荡速度冲洗24h，其中核酸酶溶液24h更换1次；
步骤五，保存：将步骤四处理的组织用磷酸盐缓冲液漂洗1天后，置入4℃、含有抗生素的磷酸盐缓冲液中密封保存，备用，表2中给出了处理前与处理后，生物组织在厚度、断裂强度和DNA含量。
表2-猪心包处理前和和超高压脱细胞后对比
厚度mm 断裂强度MPa DNA含量μg/mL
处理前 0.216±0.005 19.63±2.61 0.698±0.022
处理后 0.177±0.005 17.59±3.48 0.047±0.010
如图4和表2所示，实验结果表明：所制备的脱细胞猪心包组织的厚度为0.177±0.005mm，断裂强度为17.59±3.48MPa，DNA含量为0.047±0.010g/mL。将经过脱细胞处理后的猪心包使用组织学(HE)染色实验(见图4)，结果显示猪心包组织中的纤维走向相对一致，连续性好，呈波浪状，心包中的胶原纤维结构没有被破坏。由此可见，本发明使用的脱细胞处理方法处理后的牛心包能够保持组织原先结构和状态。
对比例2’(单一反复冻融)：
与实施例2的区别在于没有超高压处理过程，为了将DNA含量降至0.1μg/ml以下，调整了如下实验参数：
冻融处理时间需要从1.5h延长至6h，水浴复温也由15min延长至了30min
核酸酶溶液中RNase A的含量需从20μg/mL提高到150μg/mL，振荡冲洗时间从24h增加到48h。
实验证明，在缺少超高压的步骤下，想要实现脱细胞的目的，需要改变实验参数，才能使DNA含量降到0.1μg/ml以内。此外，将经过此操作的猪心包组织进行组织学(HE)染色实验，如图4和5比较可以发现，与实施例2’处理的生物组织相比，实施例2”处理的猪心包组织中存在少量的纤维断裂，且仍有少量深染细胞核等。
对比例2”(单一超高压)：
与实施例2的区别在于没有多次冻融处理过程，为了将DNA含量降至0.1μg/ml以下，调整了如下实验参数：
超高压处理：压力由500Mpa提高到1000MPa，处理时间由20min缩短至10min；
去核酸步骤振荡冲洗时间从24h增加到48h。
实验证明，在缺少反复冻融的步骤下，想要实现脱细胞的目的，需要改变实验参数，处理压力明显增加，才能使DNA含量降到0.1μg/ml以内。此外，将经过单一超高压处理的猪心包组织使用组织学(HE)染色实验，如图4和6比较可以发现，与实施例2处理的生物组织相比，实施例2”处理的猪心包组织中存在轻微纤维断裂，且仍有少量深染细胞核存在。
实施例3
步骤一，在干净的灭菌方盘内均匀铺一层无菌无纺布，加入无菌磷酸盐缓冲液浸没无纺布后，将将预处理的猪心包组织在浸润的无纺布上铺开，轻轻地将明显的脂肪组织层剥去，并避免损伤纤维层。然后将生物组织的粗糙面(纤维层)朝上，用无尘布轻轻的擦拭去除组织表面脂肪。将生物组织不规则的部分及游离纤维剪去，裁剪成小片(15mmx15mm)，用生理盐水在室温下清洗3次，每次清洗3～5分钟；
步骤二，冻融处理：将步骤一处理的生物组织置于4℃预冷20min、-80℃冷冻2h，37℃水浴复温15min，该过程重复进行3次；
步骤三，超高压处理：将步骤二处理的生物组织在无菌D-Hanks溶液中彻底漂洗干净后置入浸满D-Hanks溶液的塑料袋中密封，再将密封于塑料袋的生物组织置入超高压机器内，在400Mpa以及4℃条件下处理30min；
步骤四，去核酸：将步骤三处理的生物组织置于10μg/mL RNase A、100μg/mLDNase I的核酸酶溶液中，在37℃恒温摇床中以100r/min的振荡速度冲洗72h，其中核酸酶溶液24h更换1次；
步骤五，保存：将步骤四处理的组织用磷酸盐缓冲液漂洗1天后，置入4℃、含有抗生素的磷酸盐缓冲液中密封保存，备用，表3中给出了处理前与处理后，生物组织在厚度、断裂强度和DNA含量。
表3-牛心包组织处理前和超高压脱细胞后对比
厚度mm 断裂强度MPa DNA含量μg/mL
处理前 0.282±0.005 18.96±4.23 0.701±0.029
处理后 0.257±0.005 14.77±5.41 0.104±0.018
如表3所示，实验结果表明：所制备的脱细胞牛心包组织的厚度为
0.257±0.005mm，断裂强度为14.77±5.41MPa，DNA含量为0.104±0.018g/mL。
对比例3’
与实施例3的区别在于没有超高压处理过程，对比实验证明，在缺少超高压的步骤下，想要达到脱细胞的目的，需要改变实验参数，即反复冻融的时间明显增加(2h增加为3h)，且核酸酶的浓度明显增加(10μg/mL RNase A增加为100μg/mL RNase A)，才能使DNA含量降到0.1μg/ml以内。
对比例3”
与实施例3的区别在于没有多次冻融处理过程，对比实验证明，在缺少反复冻融的步骤下，想要达到脱细胞的目的，需要改变实验参数，即需要800MPa的超高压力处理牛心包组织15min，再用20μg/mL RNase A、150μg/mL DNase I继续处理牛心包，才能使DNA含量降到0.1μg/ml以内。
综合上述实施例与对比例的效果比较，本发明提供的技术在众多方面都明显优于现有技术，再次总结说明如下：
采用本发明实施例中的反复冻融与超高压结合的方法进行脱细胞操作，相对于单一反复冻融处理或单一超高压处理，将两种处理工艺结合可明显缩短工艺耗时，提高脱细胞效率。另外，反复冻融处理和超高压处理的结合使用比两种处理工艺单独使用时实验参数更温和，即，不仅使用的核酸酶浓度更低，减少了反复冻融的时间，还降低了超高压处理中的操作压力从而减少了对生物支架结构的破坏，也明显降低了对超高压设备的压力和安全需求。
采用本发明实施例中的方法进行脱细胞操作可以避免化学去垢剂法及生物酶方法对胶原纤维的破坏及有毒物质残留。并且，采用的超高压力介于400MPa和600MPa之间，能有效避免传压介质水出现临界冰现象，实现在完全脱细胞的基础上，更好的保留组织结构的完整性和机械性能。并且操作简单易行，设备要求低，成本可控。
采用本发明实施例中的低浓度的核酸酶消化。相对于蛋白酶，核酸酶不会对蛋白质作用，因而不会对胶原纤维造成破坏，最大限度的保留了组织结构的原始状态。同时，低浓度的核酸酶消化，缓冲液冲洗，即可在较短时间内完全去除残余细胞成分，缩短了生物组织的制备时间。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制。尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换，而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种制备脱细胞生物组织材料的方法，其特征在于，包括冻融处理、超高压处理和去核酸三道工序，其中超高压处理采用的压力为400-600MPa。
2.根据权利要求1所述制备脱细胞生物组织材料的方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤：
步骤一，将生物组织上的脂肪剥离并对所述生物组织进行修剪和清洗；
步骤二，冻融处理：将步骤一处理后的生物组织反复冻融多次；
步骤三，超高压处理：将步骤二处理后的生物组织清洗密封，置于超高压仪器内进行超高压处理；
步骤四，去核酸：将步骤三处理后的生物组织，用核酸酶去除细胞残余核酸组分；
步骤五，保存：将步骤四处理后的生物组织清洗后密封保存。
3.根据权利要求2所述制备脱细胞生物组织材料的方法，其特征在于，所述步骤一具体包括如下步骤：无菌磷酸盐缓冲液浸没无纺布，将生物组织在浸润的无纺布上铺开，剥去脂肪组织层，然后将生物组织的纤维层朝上，用无尘布去除生物组织表面脂肪并剪去游离纤维，然后将生物组织裁切成规则小片进行后续处理，最后用生理盐水在室温下清洗多次，每次清洗3～5分钟。
4.根据权利要求2所述制备脱细胞生物组织材料的方法，其特征在于，所述冻融单次过程如下：将生物组织置于4℃预冷10～20min、然后在-80℃±10℃冷冻1.5～2h，最后在37℃水浴复温15～20min。
5.根据权利要求2所述制备脱细胞生物组织材料的方法，其特征在于，所述步骤三具体包括如下步骤：在无菌D-Hanks溶液中清洗后置入浸满D-Hanks溶液的塑料袋中密封，再将密封于塑料袋的生物组织置入超高压机器内，在400～500MPa以及4℃条件下处理20～30min。
6.根据权利要求2所述制备脱细胞生物组织材料的方法，其特征在于，所述步骤四具体包括如下步骤：将生物组织置于核酸酶溶液中，在37℃恒温摇床中以100r/min的振荡速度冲洗24～72h。
7.根据权利要求6所述制备脱细胞生物组织材料的方法，其特征在于，所述核酸酶溶液中含有核糖核酸酶A(RNase A)和脱氧核糖核酸酶I(DNase I)，所述RNase A的浓度为10～20μg/mL，所述DNase I的浓度为100～200μg/mL。
8.根据权利要求2所述制备脱细胞生物组织材料的方法，其特征在于，所述步骤五具体包括如下步骤：用磷酸盐缓冲液漂洗所述生物组织1天后，置入4℃、含有抗生素的磷酸盐缓冲液中密封保存。
9.根据权利要求2所述制备脱细胞生物组织材料的方法，其特征在于，提取的新鲜生物组织经预处理后运送至实验室，当日进行所述步骤一；所述新鲜生物组织选自牛心包、猪心包、牛心脏瓣膜、猪心脏瓣膜、猪小肠、牛血管、猪血管、牛皮或猪皮。
10.根据权利要求9所述制备脱细胞生物组织材料的方法，其特征在于，所述预处理包括如下步骤：将获取的新鲜生物组织置于3-5℃的无菌生理盐水中，采用pH值为6.8～8.6的磷酸盐缓冲液或pH值为6.8～8.6的D-Hanks溶液在室温下清洗多次，每次3-5分钟，直至生物组织无血迹或血水，最后将清洗达标的生物组织保存在含有抗生素的生理盐水中。
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