CN102872478A - 一种全生物化组织工程血管的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种全生物化组织工程血管的构建方法，其特征在于，以羊颈动脉为材料，制备脱细胞血管基质；以内皮祖细胞、平滑肌祖细胞和脂肪干细胞分别作为构建血管内膜、中膜和外膜的种子细胞；以生物反应器实现血管构建中的壁切应力、环状张力和轴向拉伸力的动态过程。该方法采用优化的血管基质和种子细胞来源，经过构建过程中的标准化3-D受力和动态调控，构建出血管结构、力学特性和生物学活动都接近天然血管的组织工程血管。使其具备工业化生产和临床应用潜力，将为组织工程血管进入市场奠定基础。

Description

一种全生物化组织工程血管的构建方法

技术领域

本发明属于生物组织工程技术领域，提供一种全部以生物和自体细胞为原料的组织工程血管构建方案，该组织工程血管具有与天然血管接近的血管结构、力学特性和生物学活性，用于冠状动脉搭桥、桡动-静脉短路、深静脉置换等需要血管移植手术，作为天然血管的替代物。

背景技术

每年全世界开展的冠脉搭桥和血管旁路手术超过500万例，需要大量的血管移植材料。目前主要采用自体血管移植，但有些患者本身可供移植的血管已经使用或发生病理改变，就只能使用人工材料替代血管，而人工血管又有弹性差、通畅率低等弊端，解决移植物来源矛盾最终要依靠组织工程血管。从全球第一条组织工程血管诞生到现在的20多年里，血管构建技术都取得了很大进步，但直到现在仍然没有开发出一个能达到临床应用要求的组织工程血管。现将当前组织工程血管相关技术介绍如下：

（1）支架材料

天然支架材料来源于生物体，一般是由生物体内提取的胶原经过化学和热处理，再经过交联制备而成，具有良好的种子细胞相容性，能为细胞粘附、增殖和成熟提供近似于体内正常血管组织细胞间的基质条件，但它的力学强度无法天然血管相比，并且胶原的微观结构与血管组织有很大区别。人工合成材料可以大规模批量生产，来源丰富，具有很好的可塑性，无免疫圆形，还可以精准地控制其形态、尺寸、孔径大小和力学强度等特性，但其细胞相容性难以达到天然血管水平，很大程度上限制了后续的细胞化过程。

（2）种子细胞

目前组织工程血管的种子细胞仍以单一来源的成熟细胞或干细胞为主，还没有理想的种子细胞出现。以成熟的血管壁平滑肌细胞作为种子细胞，其具有收缩性、调节细胞外基质分泌和提供生物力学稳定的作用，但成熟血管壁细胞的获取会造成新的损伤，而且扩增能力有限，多次传代后性状会发生改变，不能实现组织工程血管的量产。因此近年来又出现了以干细胞作为种子细胞的尝试，最多被研究的有从骨髓中分离的成体干细胞，它具有很强的增殖能力和定向分化能力，可以从自身的骨髓获得进行培养扩增，多次传代后表型不会发生改变。胚胎干细胞可以分化成血管平滑肌细胞和内皮细胞，是理想的种子细胞，但诱导其定向分化的技术还不成熟，获取和培养的过程负责，而且还会牵扯伦理道德方面的问题。

（3）构建环境

组织工程血管的培养必须在生物反应器中动态进行，目的是为组织工程血管提供稳定的、与生物体内相似的生长环境，这是构建人工血管成败的关键因素。培养环境中，化学因素条件就是组织工程血管生长必须的营养、pH值、氧气、代谢产物等条件，这些在目前技术条件下都可以解决。物理因素就是组织工程血管构建过程中的力学环境，当前技术只考虑了两种力学刺激：一种是沿血管周径分布的由血流压力形成的环状张力，另一种是平行于血管长轴的血流对血管内表面造成的剪切力。而另一种血管应力——由心脏搏动产生的对动脉血管的轴向拉伸力却被忽视，这是可能是导致目前组织工程血管难以临床应用的重要原因。而且，血管构建过程中的力学环境是一个动态过程，目前还没有对这个动态过程进行标准化的研究。

综上所述，在现有的血管构建技术下，没有一条具有量产和临床应用潜力的组织工程血管出现，究其原因，一是在体外反应过程中难以模拟复杂的血管受力环境，因此所构建的工程血管在结构和强度上都无法比肩天然血管；二是采集构建血管的种子细胞受到技术上和伦理学的诸多限制。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的缺点，提供一种全生物化组织工程血管的构建方法，该方法采用优化的血管基质和种子细胞来源，经过构建过程中的标准化3-D受力和动态调控，构建出血管结构、力学特性和生物学活动都接近天然血管的组织工程血管。使其具备工业化生产和临床应用潜力，将为组织工程血管进入市场奠定基础。

本发明的目的是通过以下技术方案来解决的：

这种全生物化组织工程血管的构建方法是以羊颈动脉为材料，制备脱细胞血管基质；以内皮祖细胞、平滑肌祖细胞和脂肪干细胞分别作为构建血管内膜、中膜和外膜的种子细胞；以生物反应器实现血管构建中的壁切应力、环状张力和轴向拉伸力的动态过程。

进一步，上述构件方法具体按照以下步骤进行：

（1）血管支架的制备

将新鲜成年山羊颈动脉，置于4℃含青霉素和链霉素各180mg/L的无菌PBS液中；去除血液杂质和附属结缔组织、脂肪成分以及血管外膜；截取长度为20~30mm的动脉作为制备血管支架的材料，并进行脱细胞处理；

（2）种子细胞的分离培养

①内皮祖细胞：取患者全骨髓2ml，以100U/ml的肝素溶液冲洗，密度为1.020g/ml的Percoll单核细胞分离液上层，2500rpm离心25min，吸除最上层段液体，吸取单核细胞层；用无血清培养基洗涤2次，以DMEM/F12为基础培养基，添加终浓度为10ng/ml的表皮生长因子和血管内皮生长因子，调节细胞终浓度为5×10⁵/ml，接种到预铺有纤连蛋白的培养皿，37℃、5%CO₂培养箱中进行培养；待可见瓶底细胞呈铺路石状生长，经传代3次后可得到单纯的内皮祖细胞；

②平滑肌祖细胞：构建以血管平滑肌细胞特异性序列SM22α启动的EGFP报告基因系统，转染培养的患者骨髓基质细胞，72h后消化为单细胞悬液，上机通过流式活细胞分选的方法分离出GFP阳性细胞，即为SPCs；以含20%小牛血清的DMEM培养液37℃，5%CO₂条件下培养，7~9d待细胞融合至80%以上时传代；

③脂肪干细胞：吸取患者皮下脂肪组织；清洗取出血液、血管；37℃下，使用0.25%胰蛋白酶消化30min；加入同体积含10%FBS的DMEM培养液，中和消化液；1200rpm离心10min，红细胞裂解液消化红细胞；100目滤器过滤，离心去除残渣；接种于预铺小牛血清的培养瓶中，以含10%FBS的DMEM/F12培养液培养，1周左右细胞能够融合；

（3）血管构建过程中的反应

将脱细胞血管基质安装入反应腔；种子细胞与相应的培养液混合，调整细胞密度为1×10⁷/ml，分别加入到对应的培养罐；接通混合气体，进气压力为0.01MPa；开启蠕动泵，双路液体按顺时针方向在系统内循环；首先，在内外腔均加载构建中膜的种子细胞SPCs，培养液为含25ng/ml PDGF-BB、5%FBS的DMEM培养基，反应28d；然后，外腔种子细胞替换为ADSCs，培养液为10%FBS的DMEM/F12，并添加bFGF25ng/ml，内腔细胞仍为SPCs，反应7天；最后，更换内腔种子细胞为EPCs，培养液为10%FBS的DMEM/F12，含有终浓度各为10ng/ml的bFGF和VEGF，反应7天；每隔5天或指示剂显示pH值在7.2~7.4范围外时，暂停系统，离心收集细胞后更换培养液。

进一步的，上述步骤（1）中进行脱细胞处理的具体步骤为：

①反复冻融：将材料分别置于4℃预冷、-80℃冷冻2h、37℃水浴复温15min，上述冻融过程反复进行3次；

②超高压处理：将材料以无菌D-Hank’s液反复冲洗干净后，密封入塑料袋，袋中浸满D-Hank’S液，置入超高压舱中，500MPa、4℃条件下处理20min，处理结束后无菌条件下将内层特制塑料袋中的血管取出；

③化学方法脱细胞处理：将上述步骤处理过的血管在SDS中以37℃振摇，100rpm，12h；然后使用PBS液振摇漂洗48h，彻底去除残留SDS；

④脱细胞血管基质的冻干及消毒：在-80℃低温冰箱中速冻24h，再置入-70℃、6.67×10^-4KPa的冷冻干燥机内6h冷冻干燥，用包装袋密闭分装后，⁶⁰Co辐照消毒。

本发明具有以下有益效果：

（1）组织工程血管的结构观察

按照发明内容中描述的方法进行脱细胞血管基质支架制备，并在上述反应条件下，以种子细胞，经过血管平滑肌层构建、内皮细胞覆盖和脂肪干细胞的外膜包裹过程，全生物化的组织工程血管构建完成。大体上观察，脱细胞血管基质基本保持管状结构；HE染色显示胶原纤维和弹性纤维保持天然形态；Masson染色显示血管基质管壁胶原纤维成分连续性保存良好。构建的组织工程血管内表面光滑，管腔直径较支架略小，血管弹性良好；HE染色可见大量核蓝染的细胞存在，红色胶原纤维平行排列；Masson染色显示胶原纤维呈蓝色，肌纤维呈红色，细胞核呈蓝褐色。上述大体和组织学观察表明，本发明构建的组织工程血管在外观和结构上与天然血管基本相似。

（3）组织工程血管的力学强度检测

对构建完成组织工程血管立即进行力学强度检测，在生物力学测试机上进行应变率的测定，并将其与天然血管和高分子材料血管进行应力（Strain）-应变（Stress）曲线的比较，结果表明组织工程血管的应变远接近天然血管，而高分子材料血管应变率最低，说明构建的组织工程血管顺应性正。爆破压测定表明，构建的血管最大爆破压达到天然血管的88.7%，因此力学强度可以达到要求；尼龙血管爆破压远高于天然血管，说明高分子材料在力学强度上优势较大。

（4）组织工程血管的生物学活性检测

构建的组织工程血管放在血环环实验平台，加入终浓度为10μmol/L的乙酰胆碱（Ach），组织工程血管立即表现出持续舒张反应，舒张率为46.4%，天然血管为54.2%；在加入终浓度为10μmol/L的苯肾上腺素（PE）后，组织工程血管呈现出持续收缩反应，舒张率为66.4%，天然血管为74.1%。检测说明，构建的组织工程血管具有血管内皮层和平滑肌层，呈现出一定的生物学活性，已经非常接近天然血管。

（5）组织工程血管的移植和效果观察

将构建的组织工程血管移植替换新西兰家兔的腹主动脉，进行移植效果观察。动物按无菌原则及非接触技术横断肾下腹主动脉，剪下一段腹主动脉长约2.0cm，再将构建好的组织工程血管以8/0聚丙烯线间断外翻吻合到腹主动脉上。血管移植后每个月进行彩色多普勒检查，血管替换出血流通畅，未出现狭窄情况。移植术后3个月行数字减影血管造影，证实血管通畅情况。随后麻醉取出移植段标本，进行大体观察，未发现明显炎症反应，说明构建的组织工程血管具有良好的生物相容性，未出席免疫排斥。

综上所述，本发明这种全生物化的组织工程血管构建方法，具备工业化生产和临床应用潜力，将为组织工程血管进入市场奠定基础，具有重要的社会和经济价值。

附图说明

图1为本发明的组织工程血管反应装置的结构图；

图2为本发明构建的组织工程血管横截面和血管壁剖面结构图。

具体实施方式

本发明的全生物化组织工程血管的构建方法是：以羊颈动脉为材料，制备脱细胞血管基质；以内皮祖细胞（EPCs）、平滑肌祖细胞（SPCs）和脂肪干细胞（ADSCs）分别作为构建血管内膜、中膜和外膜的种子细胞；以生物反应器实现血管构建中的壁切应力、环状张力和轴向拉伸力的的动态过程。

下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

图1是用于实现本发明构建方法的装置，图中所有反应装置均为市售设备，按照图1的连接方法进行组合。旋转反应器是血管反应的场所，内腔、外腔分别按照反应方案的要求通过含有种子细胞的培养液。步进电机提供脉动源，产生血管的环状张力；蠕动泵分别驱动内腔和外腔的培养液流动，产生血管的壁剪切力；旋转反应器内置的线性致动器沿血管长轴伸缩，产生轴向拉伸力。以Powerlab系统进行全过程的监控。基于该装置，本发明的全生物化组织工程血管的构建方法的详细工艺步骤如下：

（1）血管支架的制备

新鲜成年山羊颈动脉，置于4℃含青霉素和链霉素各180mg/L的无菌PBS液中。去除血液杂质和附属结缔组织、脂肪成分以及大部分血管外膜。截取长度为20~30mm、无明显分支、内径约5mm的动脉作为制备血管支架的材料，按以下步骤进行脱细胞处理：

①反复冻融：将材料分别置于4℃预冷、-80℃冷冻2h、37℃水浴复温15min，上述冻融过程反复进行3次；

②超高压处理：将材料以无菌D-Hank’s液反复冲洗干净后，密封入特制塑料袋，袋中浸满D-Hank’S液，置入超高压舱中，500MPa、4℃条件下处理20min，处理结束后无菌条件下将内层特制塑料袋中的血管取出；

③化学方法脱细胞处理：将经上述步骤处理的血管在0.125％SDS中37℃振摇，100rpm，12h，使用PBS液振摇漂洗48h，彻底去除残留SDS；

④脱细胞血管基质的冻干及消毒：在-80℃低温冰箱中速冻24h，再置入-70℃、6.67×10^-4KPa的冷冻干燥机内6h冷冻干燥，用包装袋密闭分装后，⁶⁰Co辐照消毒。

（2）种子细胞的分离培养

①内皮祖细胞：取患者全骨髓2ml，以10ml肝素溶液（100U/ml）冲洗，Percoll单核细胞分离液（密度1.020g/ml）上层，2500rpm离心25min，吸除最上层段液体（含有血小板和血浆），吸取单核细胞层；用无血清培养基洗涤2次，以DMEM/F12为基础培养基，添加终浓度为10ng/ml的表皮生长因子（bFGF）和血管内皮生长因子（VEGF），调节细胞终浓度为5×10⁵/ml，接种到预铺有纤连蛋白的培养皿，37℃、5%CO₂培养箱中进行培养；约9d可见瓶底细胞呈铺路石状生长，经传代3次后可得到较为单纯的内皮祖细胞。

②平滑肌祖细胞：构建以血管平滑肌细胞特异性序列SM22α启动的EGFP报告基因系统，转染培养的患者骨髓基质细胞（贴壁的骨髓单核细胞），72h后消化为单细胞悬液，上机通过流式活细胞分选的方法分离出GFP阳性细胞，即为SPCs。以含20%小牛血清的DMEM培养液37℃，5%CO₂条件下培养，7~9d待细胞融合至80%以上时传代。

③脂肪干细胞：吸取患者皮下脂肪组织；清洗取出血液、血管；37℃下，使用0.25%胰蛋白酶消化30min；加入同体积含10%FBS的DMEM培养液，中和消化液；1200rpm离心10min，红细胞裂解液消化红细胞；100目滤器过滤，离心去除残渣；接种于预铺小牛血清的培养瓶中，以含10%FBS的DMEM/F12培养液培养，1周左右细胞可融合。

（3）血管构建过程中的反应方案

组织工程血管反应器为市售设备的组合，其基本组成如图1。将脱细胞血管基质安装入反应腔；种子细胞与相应的培养液混合，调整细胞密度为1×10⁷/ml，分别加入到对应的培养罐；接通混合气体，进气压力为0.01MPa。开启蠕动泵，双路液体按顺时针方向在系统内循环。首先，在内外腔均加载构建中膜的种子细胞SPCs，培养液为含25ng/mlPDGF-BB、5%FBS的DMEM培养基，反应28d；然后，外腔种子细胞替换为ADSCs，培养液为10%FBS的DMEM/F12，并添加bFGF25ng/ml，内腔细胞仍为SPCs，反应7d；最后，更换内腔种子细胞为EPCs，培养液为10%FBS的DMEM/F12，含有终浓度各为10ng/ml的bFGF和VEGF，反应7d。每隔5d或指示剂显示pH值在7.2~7.4范围外时，暂停系统，离心收集细胞后更换培养液。具体的反应流程见表1：

表1.组织工程血管构建过程中采取的反应方案

总计反应时间为42d，构建过程中的程序和参数如此表。其中，SPCs为血管平滑肌祖细胞；EPCs为内皮祖细胞；ADSCs为脂肪干细胞；表示血管反应器转速（rpm）；F表示外腔液体流（L/min）；τmean表示平均血管壁切应力（dyne/cm2）；Pmean表示血管环状张力（mmHg）；λz表示轴向拉伸长度。

本发明构建的组织工程血管横截面和血管壁剖面结构图如图2所示：构建的组织工程血管具有与天然血管相似的三层结构。血管支架材料为羊颈动脉脱细胞血管基质，内膜1的种子细胞为内皮祖细胞，中膜2的种子细胞为血管平滑肌祖细胞，外膜3的种子细胞为脂肪干细胞。

Claims (3)

1.一种全生物化组织工程血管的构建方法，其特征在于，以羊颈动脉为材料，制备脱细胞血管基质；以内皮祖细胞、平滑肌祖细胞和脂肪干细胞分别作为构建血管内膜、中膜和外膜的种子细胞；以生物反应器实现血管构建中的壁切应力、环状张力和轴向拉伸力的动态过程。

2.根据权利要求1所述的全生物化组织工程血管的构建方法，其特征在于，该构件方法具体按照以下步骤进行：

（1）血管支架的制备

将新鲜成年山羊颈动脉，置于4℃含青霉素和链霉素各180mg/L的无菌PBS液中；去除血液杂质和附属结缔组织、脂肪成分以及血管外膜；截取长度为20~30mm的动脉作为制备血管支架的材料，并进行脱细胞处理；

（2）种子细胞的分离培养

①内皮祖细胞：取患者全骨髓2ml，以100U/ml的肝素溶液冲洗，密度为1.020g/ml的Percoll单核细胞分离液上层，2500rpm离心25min，吸除最上层段液体，吸取单核细胞层；用无血清培养基洗涤2次，以DMEM/F12为基础培养基，添加终浓度为10ng/ml的表皮生长因子和血管内皮生长因子，调节细胞终浓度为5×10⁵/ml，接种到预铺有纤连蛋白的培养皿，37℃、5%CO₂培养箱中进行培养；待可见瓶底细胞呈铺路石状生长，经传代3次后可得到单纯的内皮祖细胞；

②平滑肌祖细胞：构建以血管平滑肌细胞特异性序列SM22α启动的EGFP报告基因系统，转染培养的患者骨髓基质细胞，72h后消化为单细胞悬液，上机通过流式活细胞分选的方法分离出GFP阳性细胞，即为SPCs；以含20%小牛血清的DMEM培养液37℃，5%CO₂条件下培养，7~9d待细胞融合至80%以上时传代；

③脂肪干细胞：吸取患者皮下脂肪组织；清洗取出血液、血管；37℃下，使用体积浓度为0.25%胰蛋白酶消化30min；加入同体积含体积浓度10%FBS的DMEM培养液，中和消化液；1200rpm离心10min，红细胞裂解液消化红细胞；100目滤器过滤，离心去除残渣；接种于预铺小牛血清的培养瓶中，以含体积浓度10%FBS的DMEM/F12培养液培养，1周左右细胞能够融合；

（3）血管构建过程中的反应

将脱细胞血管基质安装入反应腔；种子细胞与相应的培养液混合，调整细胞密度为1×10⁷/ml，分别加入到对应的培养罐；接通混合气体，进气压力为0.01MPa；开启蠕动泵，双路液体按顺时针方向在系统内循环；首先，在内外腔均加载构建中膜的种子细胞SPCs，培养液为含25ng/mlPDGF-BB、体积浓度5%FBS的DMEM培养基，反应28d；然后，外腔种子细胞替换为ADSCs，培养液为体积浓度10%FBS的DMEM/F12，并添加bFGF25ng/ml，内腔细胞仍为SPCs，反应7天；最后，更换内腔种子细胞为EPCs，培养液为体积浓度10%FBS的DMEM/F12，含有终浓度各为10ng/ml的bFGF和VEGF，反应7天；每隔5天或指示剂显示pH值在7.2~7.4范围外时，暂停系统，离心收集细胞后更换培养液。

3.根据权利要求2所述的全生物化组织工程血管的构建方法，其特征在于，步骤（1）中进行脱细胞处理的具体步骤为：

①反复冻融：将材料分别置于4℃预冷、-80℃冷冻2h、37℃水浴复温15min，上述冻融过程反复进行3次；

②超高压处理：将材料以无菌D-Hank’s液反复冲洗干净后，密封入塑料袋，袋中浸满D-Hank’S液，置入超高压舱中，500MPa、4℃条件下处理20min，处理结束后无菌条件下将内层特制塑料袋中的血管取出；

③化学方法脱细胞处理：将上述步骤处理过的血管在SDS中以37℃振摇，100rpm，12h；然后使用PBS液振摇漂洗48h，彻底去除残留SDS；

④脱细胞血管基质的冻干及消毒：在-80℃低温冰箱中速冻24h，再置入-70℃、6.67×10^-4KPa的冷冻干燥机内6h冷冻干燥，用包装袋密闭分装后，⁶⁰Co辐照消毒。

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