CN111304150A - 可促进移植物微循环血供恢复的ADSCs与EPCs干细胞体系 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种可促进移植物微循环血供恢复的ADSCs与EPCs干细胞体系，由来源于脂肪组织的脂肪源性干细胞(ADSCs)与来源于外周血的血管内皮祖细胞(EPCs)构成。采用酶解法提取培养ADSCs；采取外周血，用肝素抗凝及甲基纤维素沉降红细胞后，采用淋巴细胞分离液进行梯度离心+贴壁法收集纯化EPCs。将分别培养的ADSCs与EPCs按ADSC：EPC＝1：1的细胞比例，细胞总量为20000个/cm2进行联合培养，本发明改善移植物营养供给，促进移植脂肪组织成活、脂肪细胞分化，提高了移植效率，缩短了治疗周期。另一方面，所有细胞从自体提取，创伤小，痛苦轻，容易被患者所接受。

Description

可促进移植物微循环血供恢复的ADSCs与EPCs干细胞体系
技术领域
本发明涉及临床治疗技术，具体涉及一种可促进移植物微循环血供恢复的ADSCs与EPCs干细胞体系。
背景技术
组织移植是整形外科常见的临床治疗方式，目前，皮瓣移植可以用于烧伤整形和疤痕切除术，自体脂肪移植可以用于全面部填充、隆胸等治疗领域。而移植物血管化和微循环血供恢复直接影响到组织移植后的存活率。早期组织移植存活最主要的步骤是尽早让移植组织血管化，改善血供以防止移植物坏死、液化、吸收。而移植后在促进血管化的同时，减少移植的排异反应和感染风险，是有效促进移植组织存活的关键之一。研究显示，脂肪组织是一个高度血管化的组织，会分泌一些生长因子，如血管内皮细胞生长因子(VEGF)、血管生成素(angiopoietin1，ANGPT)等促进血管的生成。
促进移植物微循环血供恢复是早期组织移植存活的重要措施之一，良好的微循环血供是指在移植组织内，大量的新生血管形成，血供良好，有大量含红细胞的小血管，其管腔连续，管壁层次完整。
良好的微循环血供是提高组织移植存活率的关键，微循环血供恢复是新生血管的形成和血运的建立，可改善移植物的营养供给以促进移植组织成活、移植相关干细胞分化。
组织移植中最常见的是脂肪移植，而临床工作中主要方法是单纯脂肪移植，但这种方法的微循环血供恢复时间较长，脂肪组织移植血管化困难，容易导致脂肪组织坏死液化、吸收、成活困难、需要反复治疗等问题。我们在工作中发现，大多数患者对于多次反复治疗有抵触情绪，增加了患者的心理负担和身体疼痛，加之脂肪移植的存活率较低会影响医生对于脂肪填充和利用效率的判断，很难达到理想效果。
随着脂肪来源干细胞(ADSCs)和血管内皮祖细胞(EPCs)的研究深入，在临床上取得了满意效果。组织移植向我们提出了更专业的要求，我们需要构建一个成活率高、副反应小、微血管循环建立的组织细胞联合培养体系。
发明内容
(一)要解决的技术问题
为了克服现有技术不足，现提出一种可促进移植物微循环血供恢复的ADSCs与EPCs干细胞体系，改善移植物营养供给，促进移植组织成活，缩短患者术后恢复时间。
(二)技术方案
本发明的通过如下技术方案实现：本发明提出了一种可促进移植物微循环血供恢复的ADSCs与EPCs干细胞体系，包括脂肪源性干细胞(ADSCs)与血管内皮祖细胞(EPCs)，所述脂肪源性干细胞(ADSCs)采用酶解法提取培养，所述血管内皮祖细胞(EPCs)用肝素抗凝及甲基纤维素沉降红细胞后，采用淋巴细胞分离液进行梯度离心，再贴壁法收集纯化，所述脂肪源性干细胞(ADSCs)与血管内皮祖细胞(EPCs)联合培养，构建可促进移植物微循环血供恢复的ADSCs与EPCs干细胞体系。
进一步而言，所述脂肪源性干细胞(ADSCs)来源于脂肪组织，所述血管内皮祖细胞(EPCs)来源于外周血。
进一步而言，所述脂肪源性干细胞(ADSCs)与血管内皮祖细胞(EPCs)的细胞比例为1：1。
进一步而言，所述脂肪源性干细胞(ADSCs)与血管内皮祖细胞(EPCs)的细胞总密度为20000个/cm2。
(三)有益效果
本发明相对于现有技术，具有以下有益效果：
采用ADSCs与EPCs干细胞体系与移植组织构建联合培养体系，在建立移植组织的微循环，改善血供，提高移植物成活等方面，具有单纯组织移植无法比拟的优点：采用外周血来源EPCs纯度高，排外因细胞来源不同而易向来源组织自行分化的可能性；外周血EPCs活性高，可稳定扩增至30代，其新生血管及建立微循环的能力明显优于成熟血管内皮细胞；外周血EPCs与脂肪组织均可以从自体提取，创伤小，痛苦轻，容易被患者所接受，避免排异反应的发生，良好的血管化及微循环的形成，良好的血液供应确保移植脂肪的成活，避免不良反应及反复治疗。同时二者均来自患者自体，避免异体干细胞及组织移植携带基因变异、病毒及其他疾病传播的风险
本发明提到的一种可促进移植物微循环血供恢复的ADSCs与EPCs干细胞体系，改善移植物营养供给，促进移植脂肪组织成活、脂肪细胞分化，提高了移植效率，缩短了治疗周期。另一方面，所有细胞从自体提取，创伤小，痛苦轻，容易被患者所接受。
附图说明
图1是不同培养基及细胞上清液中形成血管管腔的管长对比。
图2是不同培养基及细胞上清液中形成血管管腔的节点分支对比。
图3是EPC-ADSC联合培养体系、EPC+assay medium、EPC+EGM2MV体系中ANGPT1表达。
图4是EPC-ADSC联合培养体系、EPC+assay medium、EPC+EGM2MV体系中ANGPT2表达。
图5是EPC-ADSC联合培养体系、EPC+assay medium、EPC+EGM2MV体系中CDH5表达。
图6是EPC-ADSC联合培养体系、EPC+assay medium、EPC+EGM2MV体系中Fit1表达。
图7是EPC-ADSC联合培养体系、EPC+assay medium、EPC+EGM2MV体系中Tie2表达。
图8是EPC-ADSC联合培养体系、EPC+assay medium、EPC+EGM2MV体系中VEGF表达。
图9是单纯脂肪组织植入裸鼠皮下14天。
图10是脂肪组织+ADSC-EPC干细胞体系联合培养植入裸鼠皮下14天。
图11是单纯脂肪组织植入裸鼠皮下14天血管化情况(LM×40)。
图12是脂肪组织+ADSC-EPC干细胞体系联合培养植入裸鼠皮下14天,脂肪组织与皮下组织融合好，二者间有新生血管建立的血供(LM×40)。
图13是单纯脂肪组织植入裸鼠皮下14天血管化情况(LM×1000)。
图14是脂肪组织+ADSC-EPC干细胞体系联合培养植入裸鼠皮下14天,脂肪组织与皮下组织融合好，二者间有新生血管建立的血供(LM×1000)。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例：
本发明所示的一种可促进移植物微循环血供恢复的ADSCs与EPCs干细胞体系，由来源于脂肪组织的脂肪源性干细胞(ADSCs)与来源于外周血的血管内皮祖细胞(EPCs)构成。采用酶解法提取培养ADSCs；采取外周血，用肝素抗凝及甲基纤维素沉降红细胞后，采用淋巴细胞分离液进行梯度离心+贴壁法收集纯化EPCs。将分别培养的ADSCs与EPCs按ADSC：EPC＝1：1的细胞比例，细胞总量为20000个/cm2进行联合培养。
以ADSC-EPC干细胞体系辅助自体脂肪移植为例，1mg脂肪与1ml ADSC-EPC干细胞体系(2×106细胞/ml，ADSC：EPC＝1：1)联合组织细胞培养后移植。通过检测脂肪移植物的血管化情况以及微循环血供建立情况，对该干细胞体系的促移植物微循环血供建立能力进行验证。
首先，检测EPC与ADSC联合培养体系中ADSC促进EPC血管管腔形成：在Matrigel凝胶血管生成模型中，通过不同培养基及细胞上清液中形成血管管腔的管长和节点分支对比，如图1、2所示，EPC在ADSC细胞培养基中EPC成管效率最高，形成最多的管腔节点分支数，说明ADSC分泌的成分可有效促进血管管腔的形成。
接着，检测EPC与ADSC联合培养体系中ADSC促进EPC血管化标志物的表达：在插入式培养皿中比较ADSCs与EPCs干细胞体系、EPC+assay medium、EPC+EGM2MV中的EPC各项血管化标志物的表达情况。如图3、4、5、6、7、8示，包括血管生成素1(angiopoietin1，ANGPT1)、血管生成素2(angiopoietin1，ANGPT2)、CDH5、Fit1、Tie2以及血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)在ADSC-EPC干细胞体系中高表达，表达量明显高于assay medium中、EGM2MV中进行培养的EPC，说明EPC+ADSC干细胞体系，ADSC可高效能的促进新生血管的形成与功能化。
再者，以ADSC-EPC干细胞体系辅助自体脂肪移植，检测活体内脂肪组织与ADSC-EPC干细胞体系成脂：将A组：单纯脂肪组织移植，B组：脂肪组织+ADSC-EPC干细胞体系，分别植入裸鼠皮下，于术后14天时切取移植物进行评估，如图9、10、11、12、13、14所示，单纯脂肪组织见脂肪团块体积较移植时较小，脂肪组织与皮下组织融合不良，有液化吸收情况，脂肪团内未见明显新生血管形成；而脂肪组织+ADSC-EPC体系组，移植组织团块体积与移植时体积大小一致，脂肪呈团块状，脂肪组织与皮下组织融合良好，未见分界，同时见二者间形成微血管连接，形成的微血管内见红细胞，血管可见完整管壁。说明脂肪组织+ADSC-EPC体系能有效形成新生微血管，改善其与周围组织的相容性，减少移植脂肪萎缩、吸收，提高成活率。
上面所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的构思和范围进行限定。在不脱离本发明设计构思的前提下，本领域普通人员对本发明的技术方案做出的各种变型和改进，均应落入到本发明的保护范围，本发明请求保护的技术内容，已经全部记载在权利要求书中。

Claims (4)

1.一种可促进移植物微循环血供恢复的ADSCs与EPCs干细胞体系，其特征在于：包括脂肪源性干细胞(ADSCs)与血管内皮祖细胞(EPCs)，所述脂肪源性干细胞(ADSCs)采用酶解法提取培养，所述血管内皮祖细胞(EPCs)用肝素抗凝及甲基纤维素沉降红细胞后，采用淋巴细胞分离液进行梯度离心，再贴壁法收集纯化，所述脂肪源性干细胞(ADSCs)与血管内皮祖细胞(EPCs)联合培养，构建可促进移植物微循环血供恢复的ADSCs与EPCs干细胞体系。
2.根据权利要求1所述的可促进移植物微循环血供恢复的ADSCs与EPCs干细胞体系，其特征在于：所述脂肪源性干细胞(ADSCs)来源于脂肪组织，所述血管内皮祖细胞(EPCs)来源于外周血。
3.根据权利要求2所述的可促进移植物微循环血供恢复的ADSCs与EPCs干细胞体系，其特征在于：所述脂肪源性干细胞(ADSCs)与血管内皮祖细胞(EPCs)的细胞比例为1：1。
4.根据权利要求3所述的可促进移植物微循环血供恢复的ADSCs与EPCs干细胞体系，其特征在于：所述脂肪源性干细胞(ADSCs)与血管内皮祖细胞(EPCs)的细胞总密度为20000个/cm2。
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