CN107913290A - 一种复合细胞制剂、制备方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种复合细胞制剂、制备方法及其用途，其包含：自体富血小板血浆PRP、自体脂肪干细胞ADSCs和ADSCs来源的内皮祖细胞EPCs，包括以下步骤：采集脂肪并分离出脂肪细胞；脂肪细胞经ADSCs培养基培养得到P2代自体ADSCs；所述P2代的ADSCs经EPCs培养基培养得到P0代ADSCs来源的EPCs；采集受者自身抗凝外周血经过离心得到PRP，以及上述复合细胞制剂在治疗由糖尿病引起的下肢动脉闭塞症药物中的应用。本发明有益效果：采用EPCs培养基诱导ADSCs培养，获得CD133表达率为68.72±11.60%，vWF表达率为75.91±9.83%的EPCs，无需采集骨髓或动员外周血，糖尿病下肢动脉闭塞症患者患部注射后能降低肢体痛感和冷感，侧支血管新生率100%；总生存率为78.12%，保肢生存率为68.00%，能够有效延长患者截肢时间。

Description

一种复合细胞制剂、制备方法及其用途
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，具体来说，涉及复合细胞制剂、制备方法及其用途。
背景技术
下肢动脉硬化闭塞症(Lower extremity Arteriosclerosis occlusivedisease，LEASO)是动脉粥样硬化累及下肢动脉导致动脉狭窄或闭塞而引起肢体缺血症状的慢性疾病，是全身动脉硬化性疾病在下肢的表现，主要是细胞、纤维基质、脂质和组织碎片的异常沉积，在动脉内膜或中层发生增生过程中复杂的病理变化。LEASO的临床症状主要取决于肢体缺血的发展速度和程度。闭塞性病变的范围无论怎样广泛，只要动脉阻塞的病变发展速度缓慢，即可使侧支循环有效地建立，分支血流相应地增加，血液供应得以补偿，从而使组织遭受缺血和缺氧的程度可以缓和，临床上甚至没有明显的缺血症状。如果病变发展较快，侧支循环建立不完全，代偿有限，患者可出现下肢凉、麻木、无力、间歇性跛行、静息痛、肢体缺血性溃疡、坏疽等临床症状。随病情进展，LEASO的药物治疗效果不佳，多采用血管腔内治疗和动脉血管搭桥手术治疗以重建DM-LEASO患者下肢远端血供，降低截肢率和死亡率。
糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是下肢动脉粥样硬化闭塞症的高危发病因素。DM引起的下肢血管病变多累及远端动脉，口径细，且长段闭塞性病变居多，动脉血管搭桥术因缺乏远端流出道成为相对禁忌症。而血管腔内治疗虽然作为首选治疗方案，能治疗膝下长段血管闭塞，但部分DM患者无法经受血管腔内手术，以及部分患者DM累及的术后膝下血管急性闭塞率和再狭窄率很高，发展很快，肢体侧支循环无法及时代偿建立，截肢成为这两类患者的唯一选择。
近20年来，细胞治疗技术的基础和临床研究发展迅速，针对DM及其并发症的细胞治疗技术也取得了一定进展。2002年Tateishi Yuyama E等率先报道细胞移植治疗ASO的短期有效性，为治疗性血管新生理论提供了新的证据。血管新生包括两个方面，一方面是血管生成，另一方面是血管形成。前者是血管出芽形成新的血管，后者是在没有血管的情况下由内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)、成肌细胞、血管周细胞(pericytes，PCs)等相互作用形成新的血管。既往多个研究组证明骨髓干细胞(Bone marrow stemcells,BMSCs)、动员外周血干细胞(Mobilized-peripheral stem cells,M-PBSCs)具有成血管作用，与其中含有的EPCs、间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)有关。对DM-ASO患者自体EPCs的研究发现，DM导致患者EPCs增殖、迁移、粘附以及生存能力损失，血管生成能力降低，而异体EPCs移植受受体免疫排斥作用的影响，疗效甚差，EPCs移植的治疗性血管再生应用面临绝境，转而依赖于通过BMSCs或M-PMSCs移植或体外培养高增殖活性的自体EPCs再移植的补充疗法新策略。其后的研究也证明了这一点。BMSCs、M-PBSCs、脐带血干细胞(umbilical cord blood stem cells，UCBSCs)移植能重建血管网络，改善患者下肢侧支循环和血流灌注，患肢冷感、疼痛、间歇性跛行、溃疡明显好转。但BMSCs采集需有创采集骨髓，对于很多老年患者和疾病患者存在障碍，且影响患者生存质量，而UCB-MNCs和M-PBMSCs单独移植治疗DM-LEASO时，耐缺氧环境能力较差，存活期短。寻找新的种子细胞成为细胞移植治疗DM-LEASO的关键。
MSCs存在于多种组织，包括脂肪组织和骨髓组织，外周血中含量较少。有文献报道血管周细胞是一种MSCs，能调控内皮细胞增殖分化，进而调控血管生成，另外的研究也表明多种组织来源的MSCs具有成内皮分化潜能。而动物实验结果表明，自体骨髓-MSCs、脂肪-MSCs移植治疗DM-LEASO时，具有更强的缺氧环境耐受能力，存活期长，诱导血管新生潜能低于BMSCs或与之相当，但进一步的研究表明，MSCs在血管新生过程中是通过旁分泌起作用的，而没有直接参与血管新生，其作用更趋向于通过调节免疫功能诱导构建血管新生微环境。鉴于BMSCs、M-PBSCs、UCBSCs、MSCs、EPCs均具有诱导血管新生的作用，但任何单一细胞成分均有不同的缺陷。
针对相关技术中的问题，目前尚未提出有效的解决方案。
发明内容
针对相关技术中的上述技术问题，本发明提出一种复合细胞制剂的制备方法，能够显著减轻了患者的肢体疼痛和冷感，有效延长患者截肢时间。
为实现上述技术目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种复合细胞制剂，其包含：自体富血小板血浆(Platelet-rich plasma，以下简称PRP)、自体脂肪干细胞(Adipose-derived stem cells，以下简称ADSCs)和ADSCs来源的内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells，以下简称EPCs)。
进一步地，以含2％CaCl2的生理盐水分别重悬ADSCs和EPCs，调整细胞密度至2x107/mL，再按体积比1：1与PRP混匀，静置20分钟，得到所述复合细胞制剂。
本发明的另一方面，提供了复合细胞制剂的制备方法，包括如下步骤：
S1.采集脂肪并分离出脂肪细胞；
S2.脂肪细胞经ADSCs培养基培养得到P2代自体ADSCs；
S3.所述P2代自体ADSCs经EPCs培养基培养得到P0代ADSCs来源的EPCs；
S4.采集受者自身抗凝外周血经过离心得到PRP。
进一步地，所述步骤S3进一步包括如下步骤：以ADSCs培养基重悬P2代自体ADSCs，接种至培养器皿中培养，换EPCs培养基培养6天收获P0代ADSCs来源的EPCs。
进一步地，所述步骤S5进一步包括如下步骤：采集受者自身枸橼酸钠抗凝外周血，离心收取上清及部分红细胞；再次离心弃去上部上清，收取中间层和红细胞层上部白膜层。
进一步地，所述步骤S2进一步包括如下步骤，采用腹部皮下抽脂，剔除小血管和结缔组织，剪碎呈流体状，以含硫酸庆大霉素的医用生理盐水重悬，离心取脂肪层和沉淀层，以消化液消化，经水浴和充分振荡后去悬浮絮状物，经筛网过滤，收集滤液，滤液离心弃上清，以PBS重悬，静置后吸弃悬浮物，再次离心弃上清。
进一步地，所述步骤S3进一步包括如下步骤，以ADSCs培养基重悬细胞，调整细胞密度后接种至培养器皿中，于37℃，5％CO2培养箱内培养至70-80％汇合时收获；收获时加入胰蛋白酶溶液室温消化5分钟，加入抑肽酶溶液终止消化；离心弃上清，收获沉淀物；沉淀物经洗涤和细胞筛过滤，收集滤液；滤液离心弃上清，收获沉淀细胞，记为P0代自体脂肪干细胞；P0代自体脂肪干细胞传代培养至P2代收获。
进一步地，所述于37℃，5％CO2培养箱内培养至70-80％汇合时收获的具体操作方法为，24小时半量换液，36小时半量换液，48小时全换液，以后隔天换液，至70-80％汇合。
进一步地，所述ADSCs培养基为含有Ultroser G serum substitute的UltraCULTURE；所述EPCs培养基为含有以下成分的DMEM/F12：无动物源成分血清替代品、地塞米松、重组人血管内皮生长因子、重组人碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子-1。
本发明的另一个方面，还提供了上述复合细胞制剂的应用，其用于治疗糖尿病引起的下肢动脉闭塞症的药物中的用途。
本发明的有益效果：采用EPCs培养基诱导ADSCs培养，获得CD133表达率为68.72±11.60％，vWF表达率为75.91±9.83％的EPCs，无需采集骨髓或动员外周血，糖尿病下肢动脉闭塞症患者患部注射后能降低肢体痛感和冷感，侧支血管新生率100％；总生存率为78.12％，保肢生存率为68.00％，能够有效延长患者截肢时间
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是P0代的ADSCs形态图；
图2是P2代的ADSCs形态图；
图3是培养第3天的ADSCs来源的EPCs形态图；
图4是培养第6天的ADSCs的EPCs形态图；
图5是ADSCs来源的EPCs培养至第18天形成类血管结构形态图；
图6是P2代ADSCs、ADSCs来源的P0代EPCs体内发育状态图；
图7是P2代ADSCs体内成血管发育形态图；
图8是P2代ADSCs来源的EPCs体内成血管发育形态图；
图9是肢体疼痛和肢体冷感评分统计图；
图10是新生侧支血管评分统计图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中所使用的各种试剂及实验器材均可以从商业途径获得。
首先，对本发明实施例中出现的英文词汇及涉及的试剂材料作出说明：
DMEM/F12：是一种细胞培养基，生产厂商为GIBCO，货号为12400-024；
硫酸庆大霉素：生产厂商为Sigma，货号为E003632；
肝素钠抗凝剂：生产厂商为鼎国生物，货号为AC-0031；
PBS:磷酸盐缓冲液；
Collagenase NB 1：胶原酶NB 1，生产厂商为SERVA，货号为17455.03；
rh DNase-I：重组人脱氧核糖核酸酶I，生产厂商为ProSpec，货号为ENZ-319；
UltraCULTURE：无血清培养基，生产厂商为LONZA，货号为12-725F；
Ultroser G serum substitute：血清替代物，生产厂商为PALL，货号为15950-017；
胰蛋白酶溶液：生产厂商为Biological industries，货号为T6424-1VL；
抑肽酶溶液：生产厂商为Sigma，货号为A1250000；
无动物源成分血清替代品：生产厂商为Stemboscience，货号为C08003C；
地塞米松：生产厂商为Sigma，货号为D4902；
重组人血管内皮生长因子：生产厂商为PeproTech，货号为AF-100-20；
重组人碱性成纤维细胞生长因子：生产厂商为PeproTech，货号为AF100-18B；
胰岛素样生长因子-1：生产厂商为Prospec-Tany，货号为cyt-216；
鼠抗人CD133/1(AC133)-PE：生产厂商为Miltenyi，货号为130-080-801；
标记鼠抗人vWF-F8/86：生产厂商为Invitrogen，货号为MA5-14029；
Alexa488标记兔抗鼠二抗：生产厂商为Invitrogen，货号为A11059；
兔抗人CD31(EP3095)：生产厂商为abcam，货号为ab134168；
羊抗兔IgG(HRP)：生产厂商为abcam，货号为ab205718。
其次，获取临床病例；
病例选择标准
纳入标准：1、根据1999年世界卫生组织(WHO)标准诊断为DM的患者；2、根据Doppler法下肢血管病变程度分级方法，评定为下肢血管病变患者；3、下肢数字减影血管造影(Digital subtraction angiography，DSA)显示单侧肢体膝以下3支动脉完全闭塞，或膝以下2支动脉完全闭塞、另1支动脉不同程度狭窄，无膝以上动脉血管严重闭塞，符合TASCII标准D型的患者；排除标准：1、糖尿病合并急性心肌缺血、急性脑血管病变、急慢性肝肾功能不全患者；2、糖尿病合并增殖期视网膜病变患者；3、伴发恶性肿瘤患者；4、合并溃疡、干湿性坏疽及严重感染患者；5、治疗前曾接受血管腔内治疗、动脉搭桥术、经皮旁路血管重建术、截肢、截指患者。
1.2病例一般资料
抽取61例符合选择标准的患者纳入研究，其中对照组29例，男20例，女9例；年龄46～78岁，平均68.24±9.09岁；DM病程1-25年，平均9.72±7.16年；合并静息痛17例；Fontatine分期为II-III期；侧支血管评分1级5例，2级1例，3级0例；溃疡2例，无坏疽，其中，对照组患者行降糖、调脂、降压等内科常规治疗；治疗组32例，男22例，女10例；年龄48～78岁，平均65.68±8.36岁；病程3个月～30年，平均7.07±9.46年；合并静息痛21例；Fontatine分期为II-III期；侧支血管评分1级7例，2级2例，3级0例；溃疡8例，无坏疽，在内科常规治疗的基础上行细胞移植治疗。两组患者年龄(t＝1.143，P＝0.258)、性别(χ2＝0.000，P＝0.986)、Fontatine分期(t＝0.523，P＝0.603)、DM病程(t＝0.890，P＝0.377)等一般资料均无统计学差异。对照组患者自第一次入院治疗后开始随访，平均随访21.28±13.35个月(2-36个月)，治疗组患者自复合细胞移植后开始随访，平均随访24.22±10.38个月(3-36个月)。
实施例一：自体ADSCs制备
1.1脂肪采集
采集前供者体检，应无肿瘤史、无病毒感染、无支原体感染，脂肪采集在专业医疗采集机构采集；具体方法为腹部皮下抽脂50mL。采集后立即置于125mL冰浴无菌瓶(型号2019-0250，生产厂商Nalgene)中，无菌瓶中含50mL保存液。
保存液为添加了如下成分的DMEM/F12：
50ug/mL硫酸庆大霉素；
10％肝素钠抗凝剂。
1.2脂肪细胞分离
剔除小血管和结缔组织，剪碎呈流体状，少见颗粒；以2倍体积的医用生理盐水(含50ug/mL硫酸庆大霉素)重悬，500g离心，10分钟，取脂肪层和沉淀层；重复洗涤2次，收集脂肪层和沉淀层，以二倍体积的消化液消化，37度水浴，30分钟，每5分钟充分振荡；去悬浮絮状物；200目筛网过滤，收集滤液；1000rpm离心10分钟，弃上清，以PBS重悬，静置10分钟，吸弃悬浮物，300g离心，10分钟，弃上清。
消化液含有如下成分：
0.15mg/mL Collagenase NB 1；
50IU/mL rh DNase-I。
1.3ADSCs培养
以ADSCs培养基重悬细胞，调整细胞密度为5×105/mL，接种至175cm2组织培养瓶(型号EasyFlask，生产厂家NUNC)中，于37℃，5％CO2培养箱内培养，24小时半量换液，36小时半量换液，48小时全换液，以后隔天换液，至70-80％汇合时收获；收获时吸弃培养上清，生理盐水洗涤培养表面1次，加入0.25％胰蛋白酶溶液，室温消化5分钟，加入1mL抑肽酶溶液终止消化；400g离心，5min，弃上清，收获沉淀物；以生理盐水洗涤2次，以100um尼龙细胞筛过滤，收集滤液；400g离心，5min，弃上清，收获沉淀细胞，记为P0代ADSCs；P0代ADSCs传代培养至P2代收获，接种密度为6000/cm2。
所述ADSCs培养基为含有2％Ultroser G serum substitute的UltraCULTURE。
实施例二：ADSCs来源的EPCs制备
以ADSCs培养基重悬P2代ADSCs，调整细胞密度至10000/cm2，接种至175cm2组织培养瓶中，培养24小时，换EPCs培养基，继续培养6天，收获P0代EPCs。
所述EPCs培养基为含有以下成分的DMEM/F12：
5％无动物源成分血清替代品；
10-8mol/L地塞米松；
20ng/mL重组人血管内皮生长因子；
5ng/mL重组人碱性成纤维细胞生长因子；
5ng/mL胰岛素样生长因子-1。
实施例三：PRP制备
临床采集受者自身枸橼酸钠抗凝外周血100mL，取150g离心10分钟，收上清及部分红细胞；再次取240g离心5分钟，弃去上部30％上清，收取中间层和红细胞层上部白膜层，约40mLPRP备用。
实施例四：裸鼠背部移植ADSCs、EPCs的成血管潜能
以生理盐水分别悬浮P2代ADSCs和P0代EPCs，调整细胞密度至1
X106/mL，接种至6周龄Balb/c裸鼠背部脊柱两侧皮下，一侧为ADSCs组，一侧为EPCs组，每侧接种一针，每针200uL，接种后第24天时手术取移植物，行免疫组织化学染色检查成脂肪、成血管情况。
实施例五：流式细胞学检测
以生理盐水悬浮1X106P2代ADSCs和P0代EPCs细胞悬液，生理盐水洗涤2次，分别加入鼠抗人CD133/1(AC133)-PE流式抗体，或者以70％乙醇固定细胞10分钟，以0.25％TritonTMX-100透化处理20分钟，以5％BSA室温阻断30分钟，标记鼠抗人vWF-F8/86，室温孵育2小时，Alexa488标记兔抗鼠二抗，室温孵育30分钟，上机检测。
实施例六：免疫组织化学检测
样本常规包埋、切片、脱蜡入水，0.3％H202阻断内源性过氧化物酶，10％小牛血清封闭切片，滴加一抗，4℃过夜；PBS水洗后滴加二抗，DAB显色，苏木精复染胞核，脱水，透明，封片。每份样本首先在低倍镜下寻找血管高密度集中的区域作为“热点”，然后在高倍镜下选取5个视野计数微血管密度，取其平均值作为该标本的微血管计数值。任何一个与周围其它组织有明显界限、胞浆被染色的单个内皮细胞或内皮细胞簇，无论有无管腔、无论管腔内有无红细胞均定义为一个微血管，凡管腔直径大于8个红细胞或管壁有明显肌层以及纤维硬化、炎症及坏死的微血管均不计入总数。
使用的抗体包括：
兔抗人CD31(EP3095)
羊抗兔IgG(HRP)
实施例七：治疗方案
7.1内科常规治疗
两组患者均给予内科常规治疗，包括：生活方式干预控制患者每日总热量；胰岛素或联合盐酸二甲双胍、阿卡波糖控制血糖，空腹血糖降至8mmol/L左右，餐后2h降至血糖10mmol/L左右；钙离子拮抗剂、血管转换酶抑制剂降压，收缩压控制在140mm Hg(1mm Hg＝0.133kPa)、舒张压90mm Hg以下；他汀类调脂，低密度脂蛋白低于2.5mmol/L；拜阿司匹林0.1g/日抗血小板聚集；盐酸沙格雷酯10mg，每天3次，口服改善下肢供血；溃疡面给予清创、换药处理。
7.2复合细胞移植治疗
治疗组在此基础上行复合细胞移植治疗：
1、以含2％CaCl2的生理盐水分别重悬ADSCs和EPCs，调整细胞密度至2X107/mL，立即按体积比1：1与PRP混匀，静置20分钟，此为复合细胞制剂；
2、患肢局部注射复合细胞制剂：在麻醉下，沿肌纤维方向行肌肉注射，间隔3X3cm，倾斜进针1cm，退针注射，每针0.5mL；踝部、足背沿胫前动脉、腓动脉穿支、足背动脉、弓状动脉两侧行皮下注射，入针1.5cm，退针注射，间隔4cm，每针0.5mL；
3、细胞移植治疗后，给予患者平卧位，完全清醒后予常规饮食；同时心电监护，监测生命体征变化；注意观察患肢注射点有无渗血、红肿；指导患者尽早离床活动。首次复合细胞移植治疗后第14天，行第二次治疗。
实施例八：复查和随访
8.1自患者手术结束之日起，随访36个月，患者死亡或截肢、截指、接种血管内手术或旁路血管移植手术等随访终止，考察患者在随访期内的肿瘤发生情况；
8.2治疗组术后30天复查，评估肢体疼痛、冷感情况，行DSA检查侧支血管新生情况：
肢体疼痛评分：
0分：无疼痛；
1分：偶有疼痛，被问时能回忆起；
2分：疼痛经常出现但能耐受，不需或偶用一般止痛剂；
3分：经常用一般止痛剂；
4分：因疼痛影响睡眠，一般止痛剂难以缓解。
患肢冷感评分：
0分：无冷感；
1分：患者偶诉受累肢体有发凉、怕冷的感觉；
2分：受累肢体经常有发凉、怕冷的感觉；
3分：受累肢体有明显的冷、凉感觉，需采用局部保温措施，症状能得到一定程度的缓解；
4分：受累肢体有明显的冷、凉感觉，采用局部保温措施，症状亦无明显改善。
新生侧支血管分级：
0级：无新生侧支血管；
1级：新生侧支血管少许(≤3)；
2级：新生侧支血管中等(4～6)；
3级：新生侧支血管丰富(≥6)。
实施例九：结果分析
采用统计软件SPSS17.0进行分析。数据以表示，均值比较采用独立样本t-test，频数资料比较采用Chi-square test，P<0.05有统计学意义。
9.1患者纳入
本研究纳入患者61例，其中对照组29例，治疗组32例，主要临床症状为自觉肢体发凉，足部皮温降低，足背动脉波动减弱或消失；肌电图测定示双侧正中神经、尺神经、腓总神经、胫神经运动传导速度减慢，感觉传导速度减慢，波幅降低，远端潜伏期延长，F波幅正常；双下肢动脉彩色超声多普勒筛查，显示下肢动脉血管壁不均匀增厚，回声增强，壁上附着多个大小不等的强回声及低回声斑块，股浅动脉、腘动脉管腔不规则狭窄，胫前动脉，胫后动脉和/或腓总动脉管腔内充填实性低回声；股浅动脉、腘动脉彩色血流信号显示不规则细条状，足背动脉未见明显血流信号，小腿部无侧支循环建立。
9.2ADSCs培养
脂肪组织分离的细胞贴壁生长，成三角形、多角形、梭型等多种形态；d3天开始出现稀疏的集落，细胞呈现成纤维细胞样长梭形外观；d9天时70-80％汇合时收获，呈现典型的涡旋状生长状态(参见图1)；P0代ADSCs传代培养至P2代，细胞形态更加均一(参见图2)。流式检测结果表明，P2代ADSCs的CD133表达率为0.55±0.21％，vWF表达率为1.76±0.64％。
9.3ADSCs来源的EPCs制备
采用EPCs培养基诱导P2代ADSCs，部分长梭形细胞逐渐缩短(参见图3)，换液培养至d6天，局部呈现典型的卵石状单层细胞生长状态(参见图4)。流式检测结果表明，P0代EPCs的CD133表达率为68.72±11.60％，vWF表达率为75.91±9.83％，与P2代ADSCs相比均有显著性提高(P＜0.05)，继续培养时间至18天，有类血管结构形成(参见图5)。
9.4ADSCs、EPCs的体内成血管潜能
将2X105细胞移植到Balb/c裸鼠背部皮下，1周后可以观察到注射部位皮肤明显隆起，接种后24天手术取样(参见图6)，行组织化学染色检测CD31表达(参见图7和图8)，并计数微血管数量，发现ADSCs移植组微血管计数平均为3.70±1.64，与EPCs移植组(6.52±2.07)相比有显著性差异(P＜0.05)。
9.5治疗后30天复查结果
本研究共纳入61例DM-LEASO患者，均行内科常规治疗，其中32例接受2次复合细胞移植治疗，治疗后30天时，对照组肢体疼痛感评分为1.76±0.91，较治疗前(2.69±1.07)有显著降低(P＜0.05)，但明显高于治疗组(0.88±1.01)(P＜0.05)；对照组肢体冷感评分为2.72±0.75，与治疗前(3.59±0.57)相比明显降低(P＜0.05)，但明显高于治疗组(1.16±1.14)(P＜0.05)。(参加图9)
两组患者均有不同程度的侧支血管发生，对照组1级14例、2级3例、3级1例，而治疗组1级6例，2级19例，3级7例，二者相比治疗组侧支血管发生率更高(P＜0.05)。(图10)
术后30天复查时，两组患者没有新发溃疡，原有10例溃疡面，治疗组1例发展为干性坏疽，需进一步治疗，其余收口、愈合良好。
9.6随访期内考察患者OS和AFS的结果
所有患者随访2-36个月，死亡或截肢则随访终止。36个月的随访期间，对照组5例患者6-30个月死亡，OS率为82.76％，OS时间(月)为32.31±9.08；治疗组7例患者14-26月死亡，OS率为78.12％，OS时间(月)为32.47±6.96；两组患者3年OS率(χ2＝0.207，P＝0.753)和OS时间(t＝0.077，P＝0.939)均没有显著性差异。对照组15例患者2-32个月截肢，AFS率为37.50％，AFS时间(月)为21.28±13.35；治疗组8例患者9-36个月截肢，AFS率为68.00％，AFS时间(月)为28.38±9.48，两组患者3年AFS率相比有显著性差异(χ2＝4.573，P＝0.046)，而截肢时间相比也有统计学意义(t＝2.412，P＝0.019)。(表1)
表1对照组、治疗组3年随访期间OS和AFS的比较
9.7复合细胞移植的安全性
治疗组患者接受复合细胞移植后行常规护理，1例患者出现低烧反应(<39℃)，3天后自行缓解；11例肌肉钝痛，无需对症治疗2周内痛感消失，未发生局部炎症反应、过敏反应以及全身性的不良反应。
随访期间，所有患者均未发生恶性肿瘤，除对照组一例患者坏疽并发呼吸衰竭死亡外，所有死亡患者死亡原因均为心脑血管病变；死亡患者死亡前均未接受截肢手术。
实施例十结果讨论
本随访研究通过比较内科常规治疗和内科常规治疗联合复合细胞移植治疗DM-LEASO的长期疗效，结合随访检查动脉硬化风险指标，考察复合细胞移植后的不良反应和致瘤情况，评价复合细胞移植的长期疗效和安全性。
10.1复合细胞制剂的制备
PRP分离自患者自身外周血，含有丰富的细胞因子、生长因子、粘附分子，经CaCL2激活形成半固体凝胶。既往的PRP除了用于医学美容领域之外，还用于骨及软骨组织损伤修、骨性关节炎等，能促进组织修复，减少炎症反应。近来有研究表明，PRP凝胶与脂肪细胞共移植，能提高移植物的存活率，且能延长移植细胞的存活时间，促进微血管形成。既往用于DM下肢缺血症或糖尿病足细胞治疗的细胞制剂，多采用生理盐水稀释细胞，我们改进了这个配置，使用PRP作为制剂成分悬浮复合细胞，且PRP中还含有PBSCs和循环内皮细胞，对于血管新生是有利的。
既往的研究多采用BMSCs、M-PBSCs、UCBSCs、BM-MSCs、EPCs用于ASO细胞治疗的种子细胞。就样本来源和移植细胞数量而言，自体BMSCs的采集需要髂骨穿刺，甚至还需要先做骨髓动员，DM-LEASO患者每条患肢移植单个核细胞量应在1-3X109，骨髓采集需200-300mL，动员外周血需要循环采集3500mL以上，对于绝大多数老年患者、脆弱患者是很大的负担，而UCBSCs除了存在异体移植的不良反应之外，细胞数量在108数量级，单份脐带血远远不足以满足移植需要。MSCs是近年来发现对血管新生有重要作用的成体干细胞，自体BM-MSCs、异体脐带或胎盘来源的MSCs体内成血管潜能差异不大。MSCs具有低免疫原性的特征，且具有免疫调节功能，对于局部肌肉注射而言，优势很明显。但更多的研究表明，MSCs更多通过旁分泌作用诱导在体细胞的修复，新生血管更易缺失。因此，在这几种种子细胞中，EPCs具有最强的成血管潜能。但DM患者自身EPCs增殖能力、成血管能力受限，异体EPCs的免疫原性限制了它的植入和存活。我们的研究发现，自体脂肪组织来源的ADSCs具有成内皮细胞分化潜能，采用EPCs培养基培养6天，68.72±11.60％的细胞表达CD133，75.91±9.83％表达vWF，继续培养12天能自发形成类血管结构，体内移植成血管潜能也高于ADSCs。我们认为ADSCs是自体EPCs的最有前景、样本来源最丰富的前体细胞。另外有研究表明，MSCs与EPCs共培养能调节内皮细胞发育，促进血管发生。因此，我们的复合细胞制剂中同时包含了ADSCs和ADSCs来源的EPCs。
10.2复合细胞移植治疗DM-LEASO的短期疗效
32例DM-LEASO患者接受复合细胞移植治疗，30天内100％的患者患肢有侧支血管形成，对于恢复ASO患者下肢血供意义重大，因此显著减轻了患者的肢体疼痛和冷感。但是DM-LEASO患者多数合并神经炎，间歇性跛行症状和静息痛症状出现的较晚，复合细胞制剂中的ADSCs具有抑制炎症和感染的功能，对于减少溃疡、恢复神经功能也有一定的作用，治疗初期患者可能会感到疼痛加重，但治疗2周以后就能有效缓解DM-LEASO患者疼痛和跛行，从而显著改善患者的生存质量，对患者建立治疗信心很重要。
10.3随访3年期间患者OS情况分析
DM-LEASO是导致重度下肢缺血(Severe limb ischemia，CLI)的最普遍的原因之一，对于不能接受动脉旁路手术和血管腔内成形术的患者或者手术失败、效果不佳以及术后复发的患者，6个月截肢率高达40％，死亡率20％，并且糖尿病患者并发ASO增加冠状动脉疾病或心血管疾病的风险。既往有关DM-ASO患者长期疗效评价的报道少，且样本量小、随访时间短，得出的结论存在矛盾。1992年Shigematsu H等报道日本ASO-CLI患者1年OS率为81.5％，而2007年Norgren L等报道的CLI患者1年OS率不足80％。2011年R Onodera等的研究结果表明，BM-MNC移植治疗ASO，1年OS率为93％，而PB-MNC移植后的1年OS率为76％，并得出BM-MNC移植提高了患者1年OS率的结论。我们在随访研究中也关注了这一点，随访第1年，治疗组OS率为100％，而对照组OS率为89.66％，但这并不能说明患者在复合细胞移植中明显受益，因为治疗后第2年，治疗组和对照组OS率分别为96.15％和81.25％。而对OS时间的分析结果提示复合细胞移植对患者OS时间(t＝1.280，P＝0.229)上同样没有显著的作用。
DM-LEASO的病因和进展机制非常复杂，是全身性疾病，其死亡原因大多是心脑血管病变，因此其疾病控制既要考虑缓解下肢缺血性病变的症状，又要始终重视全身疾病的综合治疗及预防干预，特别是可能伴发的心脑血管疾病，内科治疗要积极控制高血糖、高血压、高血脂等动脉硬化风险因素，才能有效提高OS率和AFS率。既往有科研团队认为局部治疗对全身疾病也有显著影响，但从我们的研究结果上看局部复合细胞移植治疗对DM全身血管病变的贡献可能非常小。复合细胞局部移植，除了减轻下肢缺血症状外，对DM引起的全身病变，特别是心脑血管病变可能完全没有作用，提示在治疗并发症的同时，还要考察DM控制和并发症的进展，在行局部治疗的同时加强内科治疗和全身性细胞治疗，这个工作我们正在做。
10.4随访3年期间患者AFS情况分析
目前的研究表明，细胞移植治疗糖尿病ASO有血管发生、血管新生、动脉形成和旁分泌机制，从而改善和恢复下肢供血和供氧，达到保肢的目的。虽然对细胞移植治疗的分子细胞学机制还存在诸多争议，但许多临床研究表明细胞移植的短期(<6个月)疗效包括：能减轻静息痛、间歇性跛行等临床症状，改善TcO2、ABI等指标，以及明显缓解下肢缺血性溃疡和坏疽症状等，进而降低了截肢风险。我们的随访研究发现，对照组和治疗组至随访终点AFS率分别为37.50％％和68.00％，差异非常显著(χ2＝4.573，P＝0.032)。值得关注的是随访第1年，治疗组截肢患者AFS时间为11.00±1.73个月，明显长于对照组4.57±3.64个月(t＝-4.851，P＝0.002)。这个结果提示我们，复合细胞移植在治疗第1年明显延缓截肢时间，可以为手术、介入或更进一步的细胞治疗带来时间收益。
研究考察了复合细胞移植的短期疗效，但结合本研究OS和AFS的结果，我们认为复合细胞移植的短期临床收益不能预示长期预后良好，其表现在DM-LEASO患者经复合细胞移植后第1年AFS时间被延迟了，但随后的截肢仍旧无法完全避免，这与R Onodera等和PawanK Gupta等的推测是一致的。
10.5复合细胞治疗的安全性分析
细胞治疗最常见的不良反应是低烧、寒战、疲惫等，但也有出现发呼吸困难、血栓、血管炎、血清病、轻微急性肾小球肾病等III型超敏反应的报道，甚至可能并发出血性膀胱炎、肺静脉栓塞、肝动脉栓塞、急性肾炎、急性心肌炎、脑出血、继发肿瘤等严重不良反应。采用的是ADSCs和EPCs复合PRP半固体凝胶制剂，行肌肉注射后存活期较长，初期皮下有明显的肿块，受者感觉到轻微胀痛，11例患者感觉明显的钝痛，但1-2周时间，肿块消失后自行缓解。既往制备细胞制剂常添加人血白蛋白，大部分患者出现低烧、额头两侧潮红等症状，后来采用生理盐水悬浮细胞，这种不良反应发生的很少。PRP行肌肉或皮下注射在美容领域有广泛应用，不良反应率很低。而PRP添加ADSCs和EPCs行肌肉或皮下注射治疗后，32例患者仅1例有低烧反应，3天自行缓解。另外，3年的随访期内，没有发现因细胞移植导致的其他病症，包括纤维化、栓塞、肿瘤等。但也不能说明复合细胞治疗DM-LEASO是绝对安全的，恶性肿瘤在自体BM-MNC或PB-MNC移植后也可能发生，与患者自身携带肿瘤细胞有关，因此骨髓采集前检查患者肿瘤标志物水平，杜绝自体肿瘤细胞污染是必要的。DM-LEASO患者下肢血供不足，接受细胞治疗后皮肤有针孔创面，一定要加强护理，不然极易引发囊肿、溃疡。本研究术后护理期规定为至少1周，皮肤缺血颜色改变后才准予出院，避免额外的感染。
综上所述，复合细胞制剂经患肢肌肉、皮下注射移植治疗DM-LEASO是安全的，能有效提高AFS率，延长患者截肢时间。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种复合细胞制剂，其特征在于，其包含：自体富血小板血浆PRP、自体脂肪干细胞ADSCs和ADSCs来源的内皮祖细胞EPCs。
2.根据权利要求1所述的一种复合细胞制剂，其特征在于，以含2%CaCl2的生理盐水分别重悬ADSCs和EPCs，调整细胞密度至2x107/mL，再按体积比1：1与PRP混匀，静置20分钟，得到所述复合细胞制剂。
3.制备权利要求1所述复合细胞制剂的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.采集脂肪并分离出脂肪细胞；
S2.脂肪细胞经ADSCs培养基培养得到P2代自体ADSCs；
S3. 所述P2代自体ADSCs经EPCs培养基培养得到P0代ADSCs来源的EPCs；
S4.采集受者自身抗凝外周血经过离心得到PRP。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤S3进一步包括如下步骤：以ADSCs培养基重悬P2代自体ADSCs，接种至培养器皿中培养，换EPCs培养基培养6天收获P0代ADSCs来源的EPCs。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤S5进一步包括如下步骤：采集受者自身抗凝外周血，离心收取上清及部分红细胞；再次离心弃去上部上清，收取中间层和红细胞层上部白膜层。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤S2进一步包括如下步骤，采用腹部皮下抽脂，剔除小血管和结缔组织，剪碎呈流体状，以含硫酸庆大霉素的医用生理盐水重悬，离心取脂肪层和沉淀层，以消化液消化，经水浴和充分振荡后去悬浮絮状物，经筛网过滤，收集滤液，滤液离心弃上清，以PBS重悬，静置后吸弃悬浮物，再次离心弃上清。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤S3进一步包括如下步骤，以ADSCs培养基重悬细胞，调整细胞密度后接种至培养器皿中，于37 ℃，5%CO2培养箱内培养至70-80%汇合时收获；收获时加入胰蛋白酶溶液室温消化5分钟，加入抑肽酶溶液终止消化；离心弃上清，收获沉淀物；沉淀物经洗涤和细胞筛过滤，收集滤液；滤液离心弃上清，收获沉淀细胞，记为P0代自体ADSCs；P0代自体ADSCs传代培养至P2代收获。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述于37 ℃，5%CO2培养箱内培养至70-80%汇合时收获的具体操作方法为，24小时半量换液，36小时半量换液，48小时全换液，以后隔天换液，至70-80%汇合。
9.根据权利要求3-7任一项所述的方法，其特征在于，所述ADSCs培养基为含有Ultroser G serum substitute的UltraCULTURE；所述EPCs培养基为含有以下成分的DMEM/F12：无动物源成分血清替代品、地塞米松、重组人血管内皮生长因子、重组人碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子-1。
10.权利要求1或2所述的一种复合细胞制剂在用于治疗糖尿病引起的下肢动脉闭塞症的药物中的用途。
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