CN104622899A - Cd133+内皮前体细胞的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种CD133^＋内皮前体细胞的用途。具体地，本发明涉及CD133^＋内皮前体细胞用于制备治疗糖尿病足的药物组合物。本发明将特定的内皮前体细胞通过特定的动脉内施用方式，可以显著地改善糖尿病足病人的症状，甚至使重度糖尿病足病人都发生了某种程度逆转，从而为治疗糖尿病足提供了新的临床应用。且本发明CD133^＋内皮前体细胞取自自体并用于自体移植，无伦理缺陷且安全可行。

Description

CD133+内皮前体细胞的用途

技术领域

本发明涉及介入治疗领域，具体地涉及CD133^＋内皮前体细胞在糖尿病足中的应用。 

背景技术

糖尿病足是指因糖尿病血管病变和（或）神经病变和感染等因素，导致糖尿病患者足或下肢组织破坏的一种病变。威胁糖尿病患者的严重糖尿病并发症，给患者及其家庭、社会造成严重影响和负担。 

就目前而言，糖尿病足的治疗方式主要分为内科和外科治疗，其中，内科治疗包括控制高血糖、静脉注射改善微循环和神经功能的药物、应用有效抗菌素以及结合高压氧及中药等治疗；外科治疗创面的局部处理、腔内介入治疗、血管重建或下肢动脉旁路移植、下肢远端小动脉旁路移植等手术，而部分血管完全闭塞或严重感染且内科治疗无效者则不得不行截肢手术。此外，目前还开发了向局部肌肉组织内注射内皮细胞祖细胞或细胞因子的方法，企图促进内皮细胞的分化，但是症状的改善率仅为40%左右，因此疗效始终不理想。 

由此可见，虽然对于糖尿病足已经开发了上述的各种治疗方法，但目前尚缺乏令人满意的治疗手段，因此目前认为糖尿病足属于严重的、几乎不可逆的糖尿病并发症之一。内科治疗仅能作为辅助治疗减缓糖尿病足的恶化，而外科治疗中血管移植、血管重建手术治疗等均面临着术后伤口愈合差、血管再通不理想等后果，且大多严重糖尿病患者为老年患者，还同时并发多种心血管疾病，无法耐受时间较长且创伤较大的血管移植手术。 

因此，本领域迫切需要开发一种可以治疗甚至逆转糖尿病足进程的治疗方法。 

发明内容

本发明提供了一种自体采集的CD133+内皮细胞，其可用于自体局部动脉注射从而治疗糖尿病足。 

在本发明的第一方面，提供了一种CD133^＋内皮前体细胞的用途，用于制备治疗糖尿病足的药物组合物。 

在另一优选例中，所述的糖尿病足是按Rutherford分级为1级至4级的糖尿病足。 

在另一优选例中，所述药物组合物为液态。 

在另一优选例中，所述药物组合物中CD133^＋内皮前体细胞的含量为1×10⁴－1×10⁸个/ml，较佳地为1×10⁵－1×10⁷个/ml。 

在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂。 

在另一优选例中，所述药物组合物为动脉注射剂。 

在另一优选例中，药物组合物含有CD133^＋内皮前体细胞以及药学上可接受的载体。 

在另一优选例中，所述药物组合物由CD133^＋内皮前体细胞以及生理盐水组成。 

在另一优选例中，所述药物组合物还可以包括以下一种或多种组分：细胞因子生理盐水、人血白蛋白、抗凝剂。 

在另一优选例中，所述的人血白蛋白的浓度按未加入的原始白蛋白质量计为5%-20%。 

在另一优选例中，所述的抗凝剂浓度按所述药物组合物的总体积计为100-150IU/ml，更佳地，为125IU/ml。 

在另一优选例中，所述细胞因子包括：促红细胞生成素(EPO)、表皮生长因子(EGFR)、干细胞因子(SCF)、粒系集落刺激因子(G-CSF)、粒系巨噬系集落刺激因子(GM-CSF)。 

在另一优选例中，所述的抗凝剂为肝素。 

在另一优选例中，所述CD133^＋内皮前体细胞是自体的或异体的。 

在另一优选例中，所述的CD133^＋内皮前体细胞来自自体。 

在另一优选例中，所述的CD133^＋内皮前体细胞的来源包括静脉血、动脉血、骨髓或脐带血。 

在另一优选例中，所述的CD133^＋内皮前体细胞为原代或传代的。 

在另一优选例中，所述的药物组合物通过以下方式施用：动脉内注射、静脉注射或肌肉注射。 

在另一优选例中，所述的动脉包括下肢动脉。 

在另一优选例中，在术中取患者取健侧股动脉动脉血，并将所述动脉血进 行离心和磁珠分选后,与生理盐水制成药物组合物，并将所述药物组合物直接通过导管输注至病变的下肢血管近端。 

在另一优选例中，所述CD133^＋内皮前体细胞是未经培养的原代细胞。 

本发明第二方面，提供了一种用于治疗糖尿病足的药物组合物，所述药物组合物为液态，并且所述组合物含有1×10⁴－1×10⁸个CD133^＋内皮前体细胞/ml以及药学上可接受的载体。 

在另一优选例中，所述药物组合物通过以下方式施用：下肢动脉注射。 

本发明第三方面，提供了一种治疗糖尿病足的方法，包括步骤： 

给需要治疗的对象通过动脉内施用CD133^＋内皮前体细胞本发明第二方面所述的药物组合物。 

在另一优选例中，所述的动脉包括胫前动脉、胫后动脉、和腓动脉。 

在另一优选例中，所述的施用量为≥1×10⁷个CD133^＋内皮前体细胞。 

在另一优选例中，所述的施用次数为1次、2次或3次，更佳地，为1次。 

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。 

附图说明

图1a显示了实施例4.1中患者在进行胫前动脉成形术+CD133^＋细胞移植术之前的血管造影，显示胫前动脉近端及远端长段闭塞，未见造影充盈；图1b显示了该患者的ABI超声结果：足背动脉平均流速是0.2cm/s,血管波峰明显低平，血流灌注不足。 

图2a显示了实施例4.1中的患者在进行胫前动脉成形术+CD133^＋细胞移植术后4周的血管造影，可见患者经前动脉完全通畅，血液灌注流畅；图2b显示了该患者在术后4周的ABI超声结果：足背动脉平均流速是7.0cm/s，血管波峰明显提高，血流灌注提升。 

图3a显示了实施例4.2中患者在CD133^＋细胞移植术之前的血管造影，显示患者下肢血管未见明显狭窄；图3b显示了该患者的ABI超声结果：足背动脉平均流速是1.0cm/s，ABI:0.8。 

图4显示了实施例4.2中患者在CD133^＋细胞移植术之后的ABI超声结果： 足背动脉平均流速是8.7cm/s，ABI:1.0明显改善。 

图5显示了术后总体见患者ABI指数及血流速度较前好转。 

图6a-c显示了将术后随访与术前对比，患者红细胞、白血病、血小板计数无明显异常变化。 

图7a和图7b显示了将术后随访与术前对比，患者肝肾功能无明显异常变化。 

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现，将特定的内皮前体细胞通过特定的动脉内施用方式，应用于自体细胞移植，居然可以显著地改善糖尿病足病人的症状，甚至使重度糖尿病足病人都发生了某种程度逆转。在此基础上完成了本发明。 

CD133 

人CD133(AC133或者prominin-1)是一个由865个氨基酸组成的蛋白，其结构中包含一个细胞外区的N-端、5个跨膜结构域、两个细胞外loop环、一个59个氨基酸的细胞内C-端和8个N-糖基化。CD133预测大小为97kDa，但实际的糖基化CD133的分子量为120kDa。CD133有两个同源性抗原分别为:CD133-1和CD133-2，同属于Prominin家族，为5次跨膜糖蛋白结构。5次跨膜将整段肽链划分为两个富含半胱氨酸残基的胞内环和两个环状胞外域。每个环状胞外域中均有4个N型连接的糖基化位点，在第一个胞外域中有一亮氨酸拉链模式。前4个跨膜域中都含有半胱氨酸残基，最后一个跨膜域中含有一赖氨酸残基。另外C端尾部含有5个酪氨酸残基,提示CD133抗原可能是一生长因子受体,在与配体结合后酪氨酸残基磷酸化可引起级联反应。CD133-2比CD133-1少9个位于E1区的氨基酸,由含有856个氨基酸的肽链组成，蛋白分子量分别为112kD和120kD。然而共同具有的5次跨膜结构，以及相近似的基因顺序使它们具有了相似的生物表型。 

研究表明，CD133抗原蛋白在一些正常和非正常组织和细胞中有表达，然而CD133的生物学功能及扮演的角色还不清楚。 

有研究认为，CD133抗原蛋白在内皮祖细胞、造血干细胞、胎脑干细胞、胚胎上皮细胞、前列腺上皮干细胞、肌细胞以及其他多种脏器都有表达。另外 在多种癌细胞如乳腺癌、视网膜母细胞瘤、畸胎瘤和多种白血病病血细胞如AML、ALL、CML、MDS、CLL也可检测到CD133抗原蛋白。Yu等人发现CD133-2抗原的mRNA主要可以在胚胎肝脏、胚胎脑组织、骨骼肌、肾脏、心肌细胞以及成人胰脏、肾脏、肝脏、肺脏和胎盘等组织细胞中检测到，在造血组织中，CD133-2抗原mRNA高表达在胎肝，骨髓次之，外周血中有极其少量的CD133-2抗原mRNA表达。国内学者朱玉德等研究发现在胶质瘤细胞系和胶质瘤组织中均存在CD133+的脑肿瘤干细胞,具有自我更新和多向分化潜能。 

最初CD133抗原被发现选择性表达在人胎肝、骨髓、脐血及外周血CD34+造血细胞中，随着研究进展，人们在一些CD34+的干细胞表面也发现有CD133抗原表达。在脑肿瘤干细胞研究中CD133作为筛选肿瘤干细胞的关键性分子。国内外许多学者都应用CD133作为肿瘤干细胞的标记分子进行实体肿瘤干细胞研究。Hemmati等对小儿脑瘤中类似干细胞的肿瘤细胞进行基因分析发现，肿瘤细胞及形成的神经球表达神经干细胞(NSC)或其他干细胞特征性的基因或标志物，包括CD133、musashi21、Sox2、melk、PSP、bmi21和nestin等。Singh等发现的BTSC其表型与正常NSC相似，均表达CD133和nestin。 

此外，在CD34-造血干细胞中也发现有CD133抗原的少量表达,说明CD133抗原并不是CD34+阳性细胞特有的。 

内皮前体细胞(EPCs) 

EPCs是一群具有游走特性，能进一步增殖分化的幼稚内皮细胞，缺乏成熟内皮细胞的特征性表型，不能形成管腔样结构。其功能主要为参与了出生后缺血组织的血管发生和血管损伤后的修复。 

人EPCs主要存在于骨髓中,外周血中含量很少,外周血EPCs只占外周细胞0.01%,外周血EPCs主要由骨髓动员而来,并趋化至缺血部位。促进EPCs动员的因素有内源性因素、外源性细胞因子及药物等。 

然而，由于糖尿病患者的外周循环中EPCs的数量与功能明显下降，通过自体EPCs动员难以达到治疗的目的。 

EPC表面分子标志复杂多样，包括CD34、CD133、VEGFR2、Tie1、Tie2和VE钙粘素等。 

EPCs具造血干细胞和成熟内皮细胞的特点，可用造血干细胞和成熟内皮细胞的细胞标志物进行确认。前者的细胞标志物包括CD34、CD117和CD133;后 者有CD31、血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2)和内皮钙黏分子(VE-cadherin)。在分离EPCs时可采用CD34⁺/VEGFR-2⁺或CD133⁺/VE-cadherin⁺组合。 

在另一优选例中，由于CD34不仅局限于干细胞，也存在于成熟内皮细胞，因此在分离EPCs时优先或额外采用CD133^＋作为细胞标志物。 

药物组合物 

当在治疗上进行施用(给药)时，可将本发明CD133^＋内皮前体细胞配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。 

配制好的药物组合物可以动脉、静脉或肌内注射，优选地，为动脉注射。 

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明CD133^＋内皮前体细胞以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、羟乙基淀粉及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。 

本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水、羟乙基淀粉或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。 

本发明的药物组合物含有一定数量的CD133^＋内皮前体细胞作为活性成分。通常CD133^＋内皮前体细胞的数量约为1×10⁴－1×10⁸个/ml，较佳地为1×10⁵－1×10⁷个/ml。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每次1×10⁷个CD133^＋内皮前体细胞。 

一种优选的本发明药物组合物的组分及配方如下： 

CD133^＋内皮前体细胞，×10⁴－1×10⁸个/ml，按加入后药物组合物的体积计。 

5%人血清白蛋白，按加入前白蛋白的质量浓度计。 

肝素钠，125IU/ml，按加入后药物组合物的体积计。 

生理盐水，余量。 

治疗用途 

如本文所用，术语“近端动脉”指的是动脉的近心端，相对于远端动脉而 言，动脉血自心脏泵出后，自动脉近端流向动脉远端，并达到末梢动静脉吻合处。 

本发明CD133^＋内皮前体细胞及其药物组合物可用于治疗糖尿病足。本发明CD133^＋内皮前体细胞及其药物组合物可单独施用于糖尿病足，施用方法包括动脉注射或局部肌肉环形注射；此外，本发明CD133^＋内皮前体细胞及其药物组合物还可配合有创治疗同时施用，如进行动脉介入再通、血管再造等手术时，将本发明CD133^＋内皮前体细胞及其药物组合物直接注入靶动脉或在靶动脉的近端动脉进行动脉注射，以使CD133^＋内皮前体细胞达到靶动脉。 

在糖尿病足患者中，可将本发明CD133^＋内皮前体细胞及其药物组合物注入下肢动脉，具体动脉选择可根据血管影像学诊断结果判断，如腘动脉、胫前动脉、胫后动脉、腓动脉等。 

通常，通过血管造影判断，可对出现闭塞的动脉进行近端注射治疗；而从糖尿病足临床症状严重程度分级判断，可对Rutherford分级为1级至4级的糖尿病足进行注射治疗，更佳地，为2级至4级。Rutherford分级情况如下所示： 

表1.Rutherford分级 

（Rutherford’s categories of peripheral arterial disease） 

当然，本发明药物组合物还可配合其他血管重建或移植手术，通过动脉注射的方式促进血管生长，以利局部血供恢复，改善局部组织器官缺氧的状态。例如冠脉搭桥术、断肢(指)再植术。 

通用方法 

CD133^＋内皮前体细胞的分离、鉴定与培养 

可用于CD133^＋内皮前体细胞可通过常规手段获得,如采用MACS分选器以 及血球计数仪通过免疫磁珠分离法。一种优选的分离和培养方法如下所示： 

1.单个核细胞的分离 

a.取患者自体外周血100ml，将血袋清洁消毒后，开口，取样后血球计数仪计数。 

b.根据外周血重量，按1：4的比例加入氯化钠注射液并与外周血充分混匀为细胞悬液。 

c.取若干50ml离心管，每管加入一定量Ficoll分离液，在Ficoll分离液面上层按1：2的比例缓慢加入上述细胞悬液，切勿破坏分离界面。 

d.配平离心，离心力800g-1000g，10min。 

e.离心完毕后，小心取出，用移液管吸去上层血浆，取新的移液管吸取分界处白膜层于另外50ml离心管，按1：4的比例加入氯化钠注射液混匀。 

f.配平离心，离心力300g-500g，10min。 

g.离心完毕后，小心取出，用移液管吸去上清，加入30ml氯化钠注射液重悬，取样后血球计数仪计数。 

h.配平离心，离心力300g-500g，10分钟，离心后去上清，得到细胞沉淀(不含红细胞)。 

2.CD133免疫磁珠分选细胞 

a.根据血球计数仪得到的细胞数，按每1×10⁸细胞加入300μl氯化钠注射液重悬。 

b.按每1×10⁸细胞加入100μl FCR阻断剂。 

c.按每1×10⁸细胞加入100μl免疫磁珠，混匀。 

d.在2-8℃孵育30min。 

e.孵育完成后按每1×10⁸细胞加入1ml-2ml氯化钠注射液清洗细胞。 

f.配平离心，离心力300g，10min。 

g.离心完成后，吸去上清按每1×10⁸细胞加入500μl氯化钠注射液重悬。 

h.取MS分离柱置于清洗消毒后的MACS分选系统上，用500μl氯化钠注射液清洗三次。 

i.用移液枪将细胞悬液注入分离柱，开始分选。 

j.分选完毕后，将分离柱置于15ml分离管上，在分选柱中加入500μl氯化钠注射液，立即用活塞把标记的细胞冲洗下来，重复冲洗三次。 

k.冲洗完毕，取样计数后送样于流式。 

l.剩余细胞用50ml含人血白蛋白、肝素钠的氯化钠注射液吹打混匀，使用注射器移入血袋，封口，贴标签，4℃保存待用。 

3.流式细胞仪检测CD133阳性细胞表面抗原 

a.吸取细胞悬液2-3滴于96孔板内计数，剩余的细胞悬液置于原离心管中，配平后在900rpm×5min的条件下离心。 

b.离心后加D-Hank’s液重悬，以密度为1～3×10⁵个/ml分装于1.5ml的EP管中，并做好标记并离心。 

c.弃去EP管中上清，在每个EP管内加入不同的抗体(CD133/2(AC141)-PE、Mouse IgG2b-PE)各5ul，放在背光的地方放置30-45min并离心。 

d.离心结束后，弃去上清液，加入D-Hank’s液100-1000μl，用快速混匀器混匀并离心，重复3次。 

e.200目滤网过滤于流式管中，并做好标记。 

f.通过型号为FACSCalibur的流式细胞仪(购自B-D公司)来进行细胞表型分析。 

4.CD133^＋内皮前体细胞的培养 

本发明自体CD133+内皮前体细胞经分离后，可采用常规细胞培养方法进行培养扩增，达到一定细胞浓度后加入药学上可接受的载体，从而配制成可用于治疗糖尿病足的药物组合物。 

本发明一种优选的方式为不对分离后的自体CD133+内皮前体细胞进行培养而直接回输。 

本发明的有益效果 

本发明CD133^＋内皮前体细胞及其药物组合物能够通过动脉注射有效地刺激糖尿病足局部闭塞血管修复生长，即使重症患者也能够有效逆转下肢局部灌注差的结果，从而改善糖尿病足患者的临床症状。此外，本发明优选采用的自体CD133^＋内皮前体细胞不存在伦理问题，也解决了异体血制品的安全性问题。 

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。 

实施例1临床病例的选取及分组 

1.1取糖尿病足患者30例，入组标准： 

（1）糖尿病史＞10 

（2）年龄≤75岁 

下肢缺血2≤Rutherford分级（表1）≤4 

（3）踝肱指数(ABI)<0.7 

（4）经血管造影（DSA）明确为患肢腘动脉远端的胫前、胫后和腓动脉，其中1支或2支动脉狭窄超过50％。 

1.2出现下列情况之一即满足排除标准： 

（1）血红蛋白＜10mg/dl 

（2）肌酐清除率＜30ml/min 

（3）曾经接受过干细胞治疗 

（4）患有精神疾病 

（5）治疗随访期间，餐后2hr血糖监测连续4周超过11.1mmol/L 

（6）治疗随访期间，任何原因导致终止糖尿病基础治疗 

（7）治疗随访期间，罹患心脑血管疾病，并且导致心功能III-IV级或下肢感觉运动功能障碍 

（8）治疗随访期间，患肢外伤导致截肢 

（9）治疗随访期间，终止常规抗血小板治疗 

（10）治疗随访期间，出现凝血功能障碍 

（11）治疗随访期间，不能坚持戒烟 

（12）患有或在治疗随访期间，罹患恶性肿瘤 

1.3随机化分组 

30例病例，签署知情同意书，双盲条件下，随机数余数分组法分为以下2组： 

A组：病变血管PTA(根据狭窄程度可选)+CD133^＋EPCs治疗 

B组：病变血管PTA(根据狭窄程度可选)+安慰剂 

实施例2CD133^＋EPCs的获得及联合治疗方案 

2.1.对实施例1中所有受试者，将被通过中心静脉采集静脉血100ml，肝素抗凝。 

A组受试者的血液将交给具有GMP认证的华东干细胞库实验室按通用方法1在24小时内进行CD133^＋EPCs的磁珠分选，内毒素等常规血制品安全性测试检测合格后，无菌封装（50ml悬液，细胞量≥2×10⁷），4℃恒温储运。B组受试者的血液将用于实验室研究。 

2.2.糖尿病基础治疗 

由内分泌专科制定血糖控制方案及相关规范化常规治疗，在采血前和PTA/CD133^＋EPCs治疗后，将餐后2hr血糖控制在≤11.1mmol/L。 

2.3经皮血管腔内血管成形术(percutaneous transluminal angioplasty,PTA) 

按照介入诊疗常规，对患者进行患肢动脉数字减影血管造影，并测量定位血管异常狭窄段，对所有狭窄率＞50%的部位进行球扩PTA。 

2.4CD133^＋EPCs治疗 

A组受试者，在血管PTA植入后，导管头端置于腘动脉，经导管缓慢注入CD133^＋EPCs悬液（50ml/30min）。 

B组受试者接受安慰剂输注（0.9%氯化钠注射液50ml） 

2.5介入术后基础治疗 

按照下肢动脉硬化闭塞介入开通血管后的常规方案，给予抗凝，抗血小板治疗。同时严格要求患者戒烟。 

2.6随访 

随访期限： 

直至随访终点，或满28周 

随访终点： 

主要终点——Rutherford分级加重 

次要终点——Rutherford分级减轻后，再次加重 

随访项目： 

餐后2hr血糖，糖化血红蛋白，血液、尿液常规，肝肾功能指标，下肢远 端TcPO2，患肢血管多普勒超声及微循环超声造影，下肢动脉CTA，下肢动脉DSA，问卷调查（生活习惯，基础治疗情况调查，其他疾病监控）。 

实施例3对实施例2中患者的随访结果 

随访安排见表2 

表2 

患者的基本情况见表3：14例，II型糖尿病 

表3 

年龄

55-83岁

[0166] 

	男6例（1例2次），女7例
		随访日前	2012.12.18-2013.06.30
平均年龄	69.77±9.66岁
		下肢疼痛缓解	13/14
下肢寒冷好转	13/14
		溃疡愈合	2/3
ABI提高	12/14
		保肢	14/14

具体结果见图5-图7： 

其中，图5显示了术后总体见患者ABI指数及血流速度较前好转。图6a-c显示了将术后随访与术前对比，患者红细胞、白血病、血小板计数无明显异常变化。图7a-b显示了将术后随访与术前对比，患者肝肾功能无明显异常变化。 

由此可见，本发明自体移植CD133+内皮细胞效果良好，且安全性较高。 

实施例4实施例2中患者典型病例 

4.1病例1：女，63岁，左足间歇性跛行3月；患者3月前出现行走500米后出现左足麻木、跛行，休息后缓解，无静息痛，无夜间痛。 

4.1.1查体：左足背动脉搏动明显减弱，右足背动脉搏动正常，左足皮温减低，右足皮温正常，双足未见溃疡，双下肢神经感觉无明显异常(10g尼龙丝检查)。 

ABI（踝肱指数）:0.5。既往有糖尿病病史10年，予以胰岛素控制血糖，血糖控制在8.0mm/L，Rutherford分级：2级； 

术前检查：患者血常规、凝血功能、肝肾功能无异常。 

血管造影：胫前动脉长段闭塞(图1a)显示了患者血管造影检查胫前动脉近端及远端未见明显造影剂充盈。 

足趾微泡造影：血液灌注不畅。 

ABI超声检查(图1b)。 

4.1.2诊疗经过：行胫前动脉成形术+CD133^＋细胞移植术 

术后血管造影：图2a显示了患者胫前动脉近端及远端造影剂完全充盈，血流灌注通畅。 

术后足趾微泡造影：血流灌注通常。 

术后四周ABI超声检查(图2b)提示足背动脉血流灌注增多 

术后四周：ABI:0.7,行走500米无疼痛及麻木感，左足背动脉搏动及左足皮温明显改善。 

患者血常规、凝血功能、肝肾功能无异常。Rutherford分级：1级。 

术后八周：ABI:0.71,行走500米无疼痛及麻木感，左足背动脉可及；血常规、凝血功能、肝肾功能无异常。Rutherford分级：1级。 

4.2病例1:女，68岁，右下肢行走麻木1月；患者1月前出现行走600米后出现右足麻木，休息后缓解，无静息痛，无夜间痛。 

4.2.1查体：右足背动脉搏动稍减弱，左足背动脉搏动正常，右足皮温无明显减低，左足皮温正常，双足未见溃疡，右足神经感觉稍异常，10g尼龙丝检查，感觉稍减低，左足无明显异常。 

ABI（踝肱指数）:0.8。既往有糖尿病病史5年，予以口服拜糖平控制血糖，血糖控制在7.0mm/L 

术前检查：患者血常规、凝血功能、肝肾功能无异常。尿葡萄糖（++），尿蛋白（-） 

血管造影主干无狭窄(图3a) 

ABI超声检查显示(图3b)：患者平均血流速度明显改善，由1.0cm/s变为8.7cm/s。 

4.2.2诊疗经过：CD133^＋细胞移植术 

术后五周ABI超声检查(图4)提示足背动脉血流灌注增多 

术后五周：患者ABI:1.0，右足行走600米麻木疼痛感缓解明显，血常规、凝血功能、肝肾功能无异常。尿葡萄糖（+），尿蛋白（-）。 

术后十周：患者ABI:1.1，右足行走500米无麻木疼痛干，血常规、凝血功能、肝肾功能无异常。尿葡萄糖（+），尿蛋白（-）。 

讨论 

虽然人们尝试开发不同的治疗糖尿病足的方法，包括手术治疗、内科治疗，但用于刺激血管生长的内皮前体细胞在外周血中本身含量很低，而糖尿病人体内动员内皮前体细胞动员进入外周血的能力又进一步降低，从而导致了糖尿病 足的恶化。因此，目前尚无逆转或治疗糖尿病足的有效方法。而本发明人通过大量细胞和促血管生成细胞因子的筛选，意外地发现将CD133^＋内皮前体细胞通过特定的输注方式施用，尤其是自体CD133^＋内皮前体细胞的移植，所分离的细胞不需经过培养，仅少量的细胞富集能够使内皮前体细胞到达糖尿病足患病部位，并诱导内皮细胞分裂增殖生成大量成熟的内皮细胞。自体CD133^＋内皮前体细胞移植技术的应用，因其不存在免疫排斥;没有胚胎干细胞的伦理道德问题等优点，可使下肢血管疾病患者，尤其像年老体弱不能耐受手术搭桥的患者糖尿病下肢缺血以及糖尿病足患者下肢远段动脉经常大部分或全部闭塞的患者，多了一种可能有效的临床治疗手段。 

此外，发明人对常规的静脉施用和局部肌肉施用CD133^＋内皮前体细胞进行了动物实验，实验表明，效果，静脉施用和局部施用效果相当，但均不及动脉注射。 

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 

Claims (10)

1.一种CD133^＋内皮前体细胞的用途，其特征在于，用于制备治疗糖尿病足的药物组合物。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的糖尿病足是按Rutherford分级为1级至4级的糖尿病足。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物组合物为液态。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物为注射剂。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述CD133^＋内皮前体细胞是自体的或异体的。

6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的CD133^＋内皮前体细胞的来源包括静脉血、动脉血、骨髓或脐带血。

7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物通过以下方式施用：动脉内注射、静脉注射或肌肉注射。

8.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述CD133^＋内皮前体细胞是未经培养的原代细胞。

9.如权利要求1-8任一所述的用途，其特征在于，所述药物组合物中CD133^＋内皮前体细胞的含量为1×10⁴－1×10⁸个/ml，较佳地为1×10⁵－1×10⁷个/ml。

10.一种用于治疗糖尿病足的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为液态，并且所述组合物含有1×10⁴－1×10⁸个CD133^＋内皮前体细胞/ml以及药学上可接受的载体。