CN104940997A - 一种组织工程化人类心肌组织 - Google Patents
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Abstract
本发明属生物医学工程领域，涉及一种组织工程化人类心肌组织及其制备方法。本发明的组织工程化人类心肌组织由去细胞化的自然心脏基质作为支架，接种有人类的诱导多能干细胞分化来源的正常心脏的各种细胞成分制成。本组织工程化心肌组织具有与正常人类心肌组织相似的细胞组分、细胞外基质及生物学功能，可以进行体外药物的测试和筛选、初步的临床前期小动物的体内移植研究和治疗疗效观察，最终为实现人类心血管疾病的个体化治疗提供帮助。
Description
技术领域
本发明属生物医学工程领域，具体涉及一种组织工程化人类心肌组织及其制备方法。
背景技术
组织工程是二十一世纪兴起的一门新型交叉学科，也有人称其为再生医学(Regenerative Medicine)。它的基本定义是：利用生物活性物质，通过体外培养或构建的方法，研究、开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物。近年来随着组织工程的发展，其内涵逐渐扩大，成为再生医学的重要手段。其核心是模拟体内组织发生的环境，在体外培养细胞，构建由细胞和生物材料组成的、具有特定功能的三维工程化组织，替代受损组织器官。目前,国内外用于组织工程的材料有天然材料(如明胶、胶原蛋白、基质胶或藻酸盐)和人工合成大分子材料(如聚己内酰胺、聚乙醇酸、聚乳酸及其共聚物)。研究显示，上述用于组织工程的材料存在有如下缺陷：天然材料只能形成单层心肌细胞层，力学性能差，难于满足组织构建的一些要求；人工合成大分子材料只能作为机械支架为细胞生长提供三维空间，其降解产物可能会引发机体的炎症反应。
本申请的发明人，拟提供一种可用于移植的组织工程人类心肌组织，以克服现有技术的缺陷，最终通过临床转化，为实现人类心血管疾病的个体化治疗提供辅助。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的现有替代品的缺陷，提供一种功能的可用于移植的组织工程化人类心肌组织。
具体地讲，本发明提供了由自然心脏基质和多种人类细胞制备的组织工程心肌组织；该组织工程心肌组织通过临床转化后，可用于1)体外检测各类药物对人类心脏组织的毒性作用；2)治疗或替代心肌梗死后的坏死心肌组织。
本发明的组织工程化人类心肌组织由去细胞化的自然心脏基质作为支架，接种有人类的诱导多能干细胞分化来源的正常心脏的各种细胞成分制成。本发明的实施例中，优选由来源于同一人类个体的诱导多能干细胞定向分化和纯化后所得的心肌细胞和同一个体脂肪组织提取的脂肪干细胞与大鼠或猪去细胞化心脏基质制成组织工程化人类心肌组织。
本发明构建的组织工程化心肌组织将去细胞化的大鼠或猪的心脏为自然心脏基质作为工程化心肌组织基质，将去细胞化的基质架构后，制得不同尺寸和外形的心脏基质片段，将人类诱导多能性干细胞定向分化为心血管系统细胞和人的脂肪组织提取的脂肪干细胞与大鼠或猪心脏基质结合培养，制成有功能的工程化人类心脏组织。
本发明的组织工程化人类心肌组织具有与正常人类心肌组织相似的细胞组分、细胞外基质及生物学功能，可以进行体外药物的测试和筛选、初步的临床前期小动物的体内移植研究和治疗疗效观察，最终为实现人类心血管疾病的个体化治疗提供有意义的辅助。
本发明是通过下述技术方案和步骤实现的：
A.取去细胞化得大鼠或猪心脏，获得自然心脏基质；
B.将去细胞化的大鼠或猪心脏基质按需制成形状、尺寸不同的基材；
C.体外重编程正常人类的体细胞为诱导多能性干细胞，定向分化为该人类的心血管系统细胞；所述的体细胞选自皮肤细胞或血液单核细胞；
D.将分化后的诱导多能干细胞来源的心肌细胞进行纯化，使其比例达到95％以上，制成种子细胞1；
E、分离相同个体的脂肪干细胞，体外培养，制成种子细胞2；
F、将种子细胞1和种子细胞2混合后接种于去细胞化的大鼠或猪心脏基质上，体外三维培养，构建组织工程化心肌组织。
本发明中，自然心脏基质可采用SDS、胰酶、Triton X-100依次循环灌流大鼠、猪心脏，制得去细胞化自然心脏基质；
本发明中，按需要将制得的自然心脏基质制成大小、形状不同的基材；
本发明中，可采用本领域已知方法进行体外重编程诱导多能性干细胞，诱导多能干细胞心肌细胞的定向分化和纯化以及脂肪干细胞的分离和培养；本发明的实施例中，采用体外培养诱导多能性干细胞、分化心肌细胞，具体包括：
诱导多能性干细胞mTeSR培养液，37℃含5％二氧化碳培养箱培养，细胞长满后，联合运用Wnt通路的促进剂和抑制剂使其向心肌细胞分化；心肌细胞纯化：分化20天后，用纯化心肌细胞的选择性培养基培养，得到纯度较高的心肌细胞，用无钙镁PBS冲洗，经胰酶消化后，加入含胎牛血清的DMEM培养液终止消化，移入离心管中，离心，弃去上清液，加入含胎牛血清的DMEM培养液，混匀，计数；
脂肪干细胞的分离和培养：将所得同一个体的脂肪组织以PBS液冲洗两遍，剪碎，Ⅱ型胶原酶37℃消化；FBS终止消化，离心，弃上清，细胞重悬于PBS中，过滤，所得滤液离心，弃上清，DMEM培养液重悬细胞，种于培养皿中37℃，5％CO2恒温箱中培养，2-3日换一次培养液，直到细胞融合至60％-75％密度时传代；
本发明中，将纯化后的心肌细胞和脂肪干细胞接种到所采用的的大小、形状不同的大鼠或猪去细胞化心脏基质上，经体外三维培养，构建不同形状和尺寸的组织工程化心肌组织。
本发明采用去细胞化的自然心脏基质作为心肌组织基质，具有良好生物相容性、力学性能和生物降解性。
所制得的组织工程化心肌组织与正常心肌组织相似，具有正常心脏的各种细胞成分、细胞外基质及生物学活性。
经测试，本发明制得的组织工程化人类心肌组织具有与正常人类心肌组织相似细胞成分和电生理功能，既保持一定的机械强度，基本力学性能，又具有合理的孔隙率，良好的细胞相容性，生物降解性，不会引起炎症反应，是一种可以用于移植的具有生物学活性的活组织。可进一步用于进行体外药物的测试和筛选，以及初步的临床前期小动物的体内移植研究和治疗疗效观察，最终对实现人类心血管疾病的个体化治疗提供有意义的辅助。
附图说明
图1，制得去细胞化大鼠心脏基质流程图，
其中A：灌流前；
B：灌去离子水后；
C：灌PBS后；
D：灌胰酶后；
E：灌SDS溶液后；
F：灌Triton X-100溶液后。
图2，未处理大鼠心脏和去细胞化后大鼠心脏HE及荧光染色。
图3，正常心脏和去细胞化心脏细胞外基质鉴定，可见去细胞化心脏细胞外基质保存完好。
图4，人诱导多能干细胞分化来源的心肌细胞鉴定，这些心肌细胞具有完整的纤维结构，表达正常心肌细胞的蛋白标志物如cTnT，a-actinin,MLC2v等。
图5，人诱导多能干细胞和脂肪干细胞接种到去细胞化大鼠心脏基质后形成的人造心肌组织的外貌(A)与HE染色观察细胞与支架结合情况及细胞排列(B)，免疫荧光染色可观察到心肌细胞(cTnT)与平滑肌细胞(SMA)存在于组织内。
图6，人造人类心肌组织有与正常心脏一致的对影响心脏收缩与节律的药物的反应，如图中所示，人造人类心肌组织对正性肌力药物去甲肾上腺素与钙离子拮抗剂硝苯地平(Nifedipine)有与心脏一致的反应。
具体实施方式
实施例1
1)自然心脏基质的制备
按图1所示，采用1％的SDS、0.02％胰酶+EDTA、1％Triton X-100、含双抗的无菌PBS和灭菌水，依次循环灌流大鼠心脏，得到无菌的去细胞化自然心脏基质(如图2所示)；
2)将得到的自然心脏基质按需制成1cm3大小的正方形基材；
3)体外培养诱导多能性干细胞、分化心肌细胞:
诱导多能性干细胞用专用培养液(购于STEMCELL Technologies公司或自配)，37℃含5％二氧化碳培养箱培养，细胞长满后，联合使用Wnt通路的促进剂和抑制剂使其向心肌细胞分化，7天后可见跳动的心肌细胞；
4)心肌细胞纯化：
分化20后，用纯化心肌细胞的选择性培养基(不含葡萄糖含乳糖的DMEM，购于Gbico)培养7天，得到纯度较高的心肌细胞，用无钙镁PBS冲洗，经0.05％的胰酶消化后，加入含10％胎牛血清的DMEM培养液终止消化，移入离心管中，600转/分钟离心，弃去上清液，加入含10％胎牛血清的DMEM培养液，混匀，计数；
进一步对所述的心肌细胞进行鉴定，结果显示，所述的心肌细胞具有完整的纤维结构，表达正常心肌细胞的蛋白标志物如cTnT，a-actinin,MLC2v等(如图4所示)；
5)脂肪干细胞的分离和培养：
将所得脂肪组织以PBS液冲洗两遍，剪碎，转入广口烧杯内，加入等体积的0.075％Ⅱ型胶原酶，置于磁力搅拌器上，125转/分钟，37℃消化30分钟；FBS终止消化，1200g离心5分钟，弃上清，细胞重悬于PBS中，100um滤器过滤，所得滤液300g离心5分钟，弃上清，含10％FBS的DMEM(购于Gbico)培养液重悬细胞，种于培养皿中37℃，5％CO2恒温箱中培养，2-3日换一次培养液，直至细胞融合至60％-75％密度时1:3传代；
本发明采用的体外重编程诱导多能性干细胞，诱导多能干细胞心肌细胞的定向分化和纯化，脂肪干细胞的分离和培养均按本领域已知方法；
6)将来源于同一个正常人的纯化后心肌细胞和脂肪干细胞按9:1的比例，接种到制得的大鼠去细胞化心脏基质上，接种密度为106/cm2，体外三维培养，构建有功能的人类心肌组织(如图3所示)；结果显示，所形成的人造心肌组织的外貌(A)与HE染色观察细胞与支架结合情况及细胞排列(B)，免疫荧光染色可观察到心肌细胞(cTnT)与平滑肌细胞(SMA)存在于组织内(如图5所示)。
本发明上述方法制得的组织工程化人类心肌组织具有与正常人类心肌组织相似细胞成分和电生理功能，既保持一定的机械强度，基本力学性能，又具有合理的孔隙率，良好的细胞相容性，生物降解性，不会引起炎症反应，是一种可以用于移植的具有生物学活性的活组织。
实施例2
按实施例1方法制得的组织工程化人类心肌组织在体外进行长期培养，利用多电极微阵列手段检测其收缩功能和电生理功能，结果显示其具有与正常人类心肌组织相似细胞成分和电生理功能，在该心肌组织培养环境中加入不同小分子化学药物或中草药制剂等，通过多电极微阵列系统检测其收缩功能和电生理功能变化，结果显示，可提前预测所测试小分子化学药物或中草药制剂在人体内可能的对心脏组织的功能影响和毒性反应；图6显示了所述的人造人类心肌组织有与正常心脏一致的对影响心脏收缩与节律的药物的反应，所述的人造人类心肌组织对正性肌力药物去甲肾上腺素与钙离子拮抗剂硝苯地平(Nifedipine)有与心脏一致的反应。
Claims (5)
1.一种组织工程化人类心肌组织，其特征在于，由去细胞化的自然心脏基质作为支架和接种有人类的诱导多能干细胞分化来源的正常心脏的各种细胞成分制成。
2.按权利要求1所述的组织工程化人类心肌组织，其特征在于，组织工程化人类心肌组织由来源于同一人类个体的诱导多能干细胞定向分化和纯化后所得的心肌细胞和同一个体脂肪组织提取的脂肪干细胞与大鼠或猪去细胞化心脏基质制成。
3.按权利要求1所述的组织工程化人类心肌组织，其特征在于，所述的支架材料是自然心脏基质，生物相容性好。
4.制备权利要求1的组织工程化心肌组织的方法，其特征在于，其包括下述步骤：
A.取去细胞化的大鼠或猪心脏，获得自然心脏基质；
B.将去细胞化的大鼠或猪心脏基质按需制成形状、尺寸不同的基材；
C.体外重编程正常人类的体细胞为诱导多能性干细胞，定向分化为该人类的心血管系统细胞；
D.将分化后的诱导多能干细胞来源的心肌细胞进行纯化，使其比例达到95％以上，制成种子细胞1；
E、分离相同个体的脂肪干细胞，体外培养，制成种子细胞2；
F、将种子细胞1和种子细胞2混合后接种于步骤A的去细胞化的大鼠或猪心脏基质上，体外三维培养，构建得组织工程化心肌组织。
5.按权利要求4的方法，其特征在于，所述步骤C的体细胞选自皮肤细胞或血液单核细胞。
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