CN106693056A - 交联引导组织再生膜及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种交联引导组织再生膜及其制备方法，制备方法包括如下步骤：对哺乳动物的皮肤进行预处理后得到真皮层皮片；对真皮层皮片依次进行脱细胞处理、病毒灭活处理和致密收缩处理，得到交联引导组织再生膜前体；将交联引导组织再生膜前体置于pH为2～7、质量百分浓度为0.1％～5％的交联剂溶液中，在4℃～37℃下交联1小时～1周，交联反应结束后洗净，预冷后冷冻干燥、灭菌，得到交联引导组织再生膜。这种交联引导组织再生膜的制备方法通过对真皮层皮片进行脱细胞处理、病毒灭活处理和致密收缩处理后再与交联剂进行交联，得到的交联引导组织再生膜的降解周期相对较长，从而为骨缺损组织修复与再生提供更加有效的、更长时间的空间支持。

Description

交联引导组织再生膜及其制备方法
技术领域
本发明涉及医疗材料领域，特别是涉及一种交联引导组织再生膜及其制备方法。
背景技术
引导组织再生技术(Guided Tissue Regeneration，GTR)是目前能够有效治疗牙周病的一种最为先进的治疗方法，其技术关键是利用生物屏障膜即组织再生引导膜的空间隔离作用，防止牙龈上皮和结蹄组织细胞向根面迁移，同时选择性地使牙周细胞和牙槽骨细胞粘附于根面并分化形成牙周新附着，因此引导膜的作用至关重要。随着GTR技术在临床越来越广泛的应用，引导膜的类型及性能已成为制备其发展的关键因素。
传统的临床所用的引导膜主要分为可吸收和不可吸收两类。由于不可吸收引导膜如膨化聚四氟乙烯植入后需要二次手术取出，给病人带来不必要的痛苦和经济心理负担，因此可吸收引导膜逐渐成为今后GTR发展的主要趋势。目前用于临床的可降解材料以胶原为主，这主要是因为胶原本身是动物组织的组成成分，因而具有良好的生物相容性和生物活性。但是胶原也存在明显的缺点，力学性能差，降解速度过快，不能为受伤组织提供足够的空间支持。
对于交联引导组织再生膜，主要的功能是提供缺损骨组织生长修复所需的足够时间的空间支持，这只要是因为牙槽骨的生长很缓慢，通常需要4个月以上，因而这就要求引导膜在满足生物安全性的同时还必须尽可能的延长材料的降解性能，为牙槽骨的修复提供足够长时间的空间支持。目前临床上主流产品胶原膜的降解周期为1～2个月，但这与实际的临床要求仍有较大差距。
发明内容
基于此，有必要提供一种降解周期相对较长的交联引导组织再生膜及其制备方法。
一种交联引导组织再生膜的制备方法，包括如下步骤：
对哺乳动物的皮肤进行预处理后得到真皮层皮片；
对所述真皮层皮片依次进行脱细胞处理、病毒灭活处理和致密收缩处理，得到交联引导组织再生膜前体，其中，所述脱细胞处理的操作为：对所述真皮层皮片依次进行低渗-高渗盐处理、酶处理以及去污剂处理；以及
将所述交联引导组织再生膜前体置于pH为2～6、质量百分浓度为0.1％～5％的交联剂溶液中，在4℃～37℃下交联1小时～3天，交联反应结束后洗净，预冷后冷冻干燥、灭菌，得到交联引导组织再生膜。
在一个实施例中，所述对哺乳动物的皮肤进行预处理后得到真皮层皮片的操作为：用机械法对所述哺乳动物的皮肤进行初步脱脂及除毛，接着用取皮机将所述哺乳动物的皮肤去掉0.1mm～0.4mm的表皮与皮下脂肪组织后制成厚度为0.2mm～1mm的真皮层皮片。
在一个实施例中，所述哺乳动物的皮肤为猪、牛、羊或马的皮肤。
在一个实施例中，还包括在对所述真皮层皮片依次进行脱细胞处理、病毒灭活处理和致密收缩处理的操作之前，将所述真皮层皮片浸泡在0℃～8℃的抗生素溶液中过夜的操作；
所述抗生素溶液的溶质为青霉素-链霉素、庆大霉素、妥布霉素、万古霉素或替考拉宁；
所述抗生素溶液的质量百分浓度为0.001％～0.1％。
在一个实施例中，对所述真皮层皮片依次进行脱细胞处理、病毒灭活处理和致密收缩处理的操作中，所述脱细胞处理的操作具体为：将所述真皮层皮片分别在质量百分浓度为0.1％～0.9％氯化钠和质量百分浓度为1.0％～10％氯化钠溶液中循环浸泡1次～3次，每次浸泡的时间为4h～12h，再将所述真皮层皮片浸泡在质量浓度为0.1％～1.0％的胰蛋白酶溶液或中性酶溶液中，置于5℃～37℃摇床中摇12h～48h，接着将所述真皮层皮片在质量浓度为0.1％～1％的去污剂溶液中5℃～37℃洗涤2次～8次，每次洗涤的时间为2h～10h，最后用PBS或者生理盐水清洗所述真皮层皮片4次～10次，每次清洗的时间为2h～10h；其中，所述去污剂为十二烷基磺酸钠、曲拉通或3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸。
在一个实施例中，对所述真皮层皮片依次进行脱细胞处理、病毒灭活处理和致密收缩处理的操作中，所述病毒灭活处理的操作具体为：将所述真皮层皮片浸入质量百分浓度为0.5％～5％的过氧化氢的乙醇溶液或过氧乙酸的乙醇溶液中，室温下浸泡30min～480min，随后用纯水清洗，并将所述真皮层皮片按照上表皮层朝上、下表皮真皮层朝下的方式固定后-80℃～-20℃预冷2h～12h，最后冷冻干燥24h～48h，其中，所述过氧化物为过氧化氢或过氧乙酸。
在一个实施例中，所述病毒灭活处理的操作具体为：将所述真皮层皮片按照上表皮层朝上、下表皮真皮层朝下的方式固定后-80℃～-20℃预冷2h～12h，接着冷冻干燥24h～48h，最后对冷冻干燥后的所述真皮层皮片进行干热灭活，所述干热灭活的温度为50℃～120℃，所述干热灭活的时间为3h～48h。
在一个实施例中，对所述真皮层皮片依次进行脱细胞处理、病毒灭活处理和致密收缩处理的操作中，所述致密收缩处理的操作具体为：将所述真皮层皮片按照上表皮层朝上、下表皮真皮层朝下的方式放置后以压力为5MPa～50MPa保压12h～48h，随后将所述真皮层皮浸没在丙酮中15min～600min，然后干燥。
在一个实施例中，所述交联剂为戊二醛、1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物(EDC)、京尼平、D-核糖、D-来苏糖、D-木糖、L-鼠李糖、树胶醛糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖、D-古洛糖和D-果糖中的一种。
一种交联引导组织再生膜，采用上述的交联引导组织再生膜的制备方法制备得到。
这种交联引导组织再生膜的制备方法通过对真皮层皮片进行脱细胞处理、病毒灭活处理和致密收缩处理，得到了交联引导组织再生膜前体再与交联剂进行交联，得到的交联引导组织再生膜。相对于传统的胶原成分的交联引导组织再生膜，这种交联引导组织再生膜的降解周期相对较长，从而为骨缺损组织修复与再生提供更加有效的、更长时间的空间支持。
附图说明
图1为一实施方式的交联引导组织再生膜的制备方法的流程图；
图2是实施例1制得的交联引导组织再生膜的光滑面的扫描电子显微镜照片；
图3是实施例1制得的交联引导组织再生膜的粗糙面的扫描电子显微镜照片；
图4为实施例1、2、3制得的交联引导组织再生膜与Bio-Gide胶原膜在胶原酶溶液中的降解性能比较的实验结果图。
具体实施方式
下面主要结合附图及具体实施例对交联引导组织再生膜及其制备方法作进一步详细的说明。
如图1所示的交联引导组织再生膜的制备方法，包括如下步骤：
S10、对哺乳动物的皮肤进行预处理后得到真皮层皮片。
对哺乳动物的皮肤进行预处理后得到真皮层皮片的操作为：用机械法对哺乳动物的皮肤进行初步脱脂及除毛，接着用取皮机将哺乳动物的皮肤去掉0.1mm～0.4mm的表皮与皮下脂肪组织后制成厚度为0.2mm～1mm的真皮层皮片。
一般的，可以将真皮层皮片剪成3cm×6cm～5cm～10cm大小的皮片。
哺乳动物的皮肤包括依次层叠的皮毛、表皮层、真皮层和皮下组织。
具体的，哺乳动物的皮肤为猪、牛、羊或马的皮肤。优选的，哺乳动物的皮肤为猪、牛、羊或马的腹部皮肤。
得到的真皮层皮片可以低温储存备用。具体的，得到的真皮层皮片可以储存在-20℃下备用。
S10还包括将预处理后的得到真皮层皮片浸泡在0℃～8℃的抗生素溶液中过夜的操作。
抗生素溶液的溶质为青霉素-链霉素、庆大霉素、妥布霉素、万古霉素或替考拉宁。其中，青霉素-链霉素为青霉素和链霉素按照质量比为3：5形成的混合物。
抗生素溶液的质量百分浓度为0.001％～0.1％。
S20、对S10得到的真皮层皮片依次进行脱细胞处理、病毒灭活处理和致密收缩处理，得到交联引导组织再生膜前体。
得到的交联引导组织再生膜前体具有光滑面与粗糙面的两面结构。
脱细胞处理的操作为：对真皮层皮片依次进行低渗-高渗盐处理、酶处理以及去污剂处理。
具体的，脱细胞处理的操作为：将真皮层皮片分别在质量百分浓度为0.1％～0.9％氯化钠和质量百分浓度为1.0％～10％氯化钠溶液中循环浸泡1次～3次，每次浸泡的时间为4h～12h，再将真皮层皮片浸泡在质量浓度为0.1％～1.0％的胰蛋白酶溶液或中性酶溶液中，置于5℃～37℃摇床中消化12h～48h，接着将真皮层皮片在质量浓度为0.1％～1％的去污剂溶液中5℃～37℃洗涤2次～4次，每次洗涤的时间为2h～4h，最后用PBS或者生理盐水清洗真皮层皮片4次～10次，每次清洗的时间为2h～6h。其中，去污剂为十二烷基磺酸钠、曲拉通或3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸。
脱细胞处理的操作为：对真皮层皮片进行灭活处理后，将经过灭活处理的真皮层皮片按照上表皮层朝上、下表皮真皮层朝下的方式置于低温冰箱中预冷后冷冻干燥。
具体的，病毒灭活处理的操作为：将真皮层皮片浸入质量百分浓度为0.5％～5％的过氧化氢的乙醇溶液或过氧乙酸的乙醇溶液中，室温下浸泡30min～480min，随后用纯水清洗，并将真皮层皮片按照上表皮层朝上、下表皮真皮层朝下的方式固定后-80℃～-20℃预冷2h～12h，最后冷冻干燥24h～48h。其中，过氧化物为过氧化氢或过氧乙酸。
或者，病毒灭活处理的操作具体为：将真皮层皮片按照上表皮层朝上、下表皮真皮层朝下的方式固定后-80℃～-20℃预冷2h～12h，接着冷冻干燥24h～48h，最后对冷冻干燥后的真皮层皮片进行干热灭活。其中，干热灭活的温度为50℃～120℃，干热灭活的时间为3h～48h。
具体的，致密收缩处理的操作为：将真皮层皮片按照上表皮层朝上、下表皮真皮层朝下的方式放置后以压力为5MPa～50MPa保压12h～36h，随后将真皮层皮浸没在丙酮中15min～600min，最后干燥。
S30、将S20得到的交联引导组织再生膜前体置于pH为2～6、质量百分浓度为0.1％～5.0％的交联剂溶液中，在4℃～37℃下交联1小时～3天，交联反应结束后洗净，预冷后冷冻干燥、灭菌，得到交联引导组织再生膜。
交联剂可以为戊二醛、1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物(EDC)、京尼平、D-核糖、D-来苏糖、D-木糖、L-鼠李糖、树胶醛糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖、D-古洛糖和D-果糖中至少一种。
S30中，预冷后冷冻干燥、灭菌的操作中，预冷的温度为-80℃～-20℃，预冷的时间为2h～12h，冷冻干燥的时间为24h～48h，灭菌可以为钴60灭菌或电子辐照灭菌。
这种交联引导组织再生膜的制备方法通过对真皮层皮片进行脱细胞处理、病毒灭活处理和致密收缩处理，得到了交联引导组织再生膜前体再与交联剂进行交联，得到的交联引导组织再生膜。相对于传统的胶原成分的交联引导组织再生膜，这种交联引导组织再生膜的降解周期相对较长，从而为骨缺损组织修复与再生提供更加有效的、更长时间的空间支持。
这种交联引导组织再生膜的制备方法采用低渗-高渗联合酶处理工艺，具有脱细胞彻底、且对组织细胞外基质天然结构的损害轻，保持了胶原纤维支架的完整性，有利于后期细胞的粘附与生长。
这种交联引导组织再生膜的制备方法采用致密收缩处理工艺，制备得到的引导膜具有光滑面与粗糙面的两面结构，具有天然的三维空间结构与良好的机械性能，能够为新生牙周组织提供充足的空间。
一实施方式的交联引导组织再生膜，采用上述的交联引导组织再生膜的制备方法制备得到。
这种交联引导组织再生膜通过上述的方法制备而成，通过采用酶与表面活性剂交替处理，处理过程中对真皮的支架结构破坏较小，能很好的保证纤维支架的完整性，有利于后期细胞的粘附与生长。
这种交联引导组织再生膜通过上述的方法制备而成，通过对真皮层皮片进行脱细胞处理、病毒灭活处理和致密收缩处理，得到了交联引导组织再生膜前体再与交联剂进行交联，得到的交联引导组织再生膜。相对于传统的胶原成分的交联引导组织再生膜，这种交联引导组织再生膜的降解周期相对较长，从而为骨缺损组织修复与再生提供更加有效的、更长时间的空间支持。
下面为具体实施例。
实施例1
(1)真皮层皮片的制备
将健康猪的整张腹部皮用机械法进行初步脱脂，用镊子把毛剔除干净，用电动取皮机先将猪皮的皮下组织去掉，再去掉表皮0.4mm，制成厚度为0.3mm的真皮层皮片，再浸泡在质量浓度为0.01％的青霉素-链霉素的水溶液中，置入4℃冰箱过夜后转入-25℃低温冰箱冷冻保存备用。
(2)交联引导组织再生膜前体的制备
脱细胞处理：将解冻后的真皮层皮片依次用质量浓度为0.1％氯化钠(低渗盐)和质量浓度为1.0％氯化钠(高渗盐)溶液循环浸泡2次，6h/次，通过低渗溶液处理促使组织吸水膨胀，从而使组织中的细胞破裂，同时组织中的胶原纤维结构松开，从而使胶原束变得疏松，再通过高渗盐溶液处理破碎细胞的DNA从组织蛋白中分离出来；再将真皮层皮片浸泡在质量浓度为0.25％的胰蛋白酶溶液中，置于30℃摇床中24h，清洗掉组织中去除组织残留的细胞碎片和细胞核；随后将真皮层皮片在0.1％的十二烷基磺酸钠溶液，35℃洗涤3次，2h/次，以去除组织中残留的细胞和细胞核，彻底祛除组织的免疫原性，同时可以达到一定的去除组织中脂肪的效果；最后用PBS洗涤6次，2h/次。
病毒灭活处理：将脱细胞处理后的真皮层皮片浸入质量浓度为2％过氧乙酸的乙醇溶液中，室温下浸泡30min，随后用纯水清洗至PH7.4，最后将真皮层皮片平铺于聚四氟乙烯模具中，其中上表皮层朝上，下表皮真皮层朝下，置于-80℃低温冰箱预冷4h后立即转入冷冻干燥机中进行干燥24h。
致密收缩处理：将冻干后的真皮层皮片按上表皮层朝上，下表皮真皮层朝下平铺于不锈钢平板上，置于压片机中以压力20MPa保压24h，随后将模压后的引导膜先浸没在丙酮中30min，然后干燥除去残留的有机溶剂。
(3)交联引导组织再生膜的制备。
将(2)得到的交联引导组织再生膜前体置于pH为3、质量百分浓度为3％的交联剂溶液中，在28℃下交联3天，交联反应结束后洗净，-80℃预冷2h后冷冻干燥48h、电子辐照灭菌，得到交联引导组织再生膜。其中，交联剂为D-核糖。
将实施例1制得的交联引导组织再生膜在扫描电子显微镜(SEM)下观察，得到图2和图3。
由图2和图3可以看出，实施例1制得的交联引导组织再生膜具有良好的胶原纤维支架结构，光滑面致密，粗糙面为多孔纤维结构，有利于后期成骨细胞在粗糙面的粘附与生长。
实施例2
(1)真皮层皮片的制备
将健康猪的整张腹部皮用机械法进行初步脱脂，用镊子把毛剔除干净，用电动取皮机先将猪皮的皮下组织去掉，再去掉表皮0.1mm，制成厚度为0.9mm的真皮层皮片，，再浸泡在质量浓度为0.1％的庆大霉素的水溶液中，置入4℃冰箱过夜后转入-25℃低温冰箱冷冻保存备用。
(2)交联引导组织再生膜前体的制备
脱细胞处理：将解冻后的真皮层皮片依次用质量浓度为0.9％氯化钠(低渗盐)和质量浓度为9.0％氯化钠(高渗盐)溶液循环浸泡3次，4h/次，通过低渗溶液处理促使组织吸水膨胀，从而使组织中的细胞破裂，同时组织中的胶原纤维结构松开，从而使胶原束变得疏松，再通过高渗盐溶液处理破碎细胞的DNA从组织蛋白中分离出来；再将真皮层皮片浸泡在质量浓度为0.1％的中性酶溶液中，置于35℃摇床中24h，清洗掉组织中去除组织残留的细胞碎片和细胞核；随后将真皮层皮片在0.1％的曲拉通溶液，35℃洗涤4次，4h/次，以去除组织中残留的细胞和细胞核，彻底祛除组织的免疫原性，同时可以达到一定的去除组织中脂肪的效果；最后用生理盐水洗涤4次，6h/次。
病毒灭活处理：将脱细胞处理后的真皮层皮片浸入质量浓度为0.5％过氧乙酸的乙醇溶液中，室温下浸泡240min，随后用纯水清洗后将真皮层皮片平铺于聚四氟乙烯模具中，其中上表皮层朝上，下表皮真皮层朝下，置于-80℃低温冰箱预冷4h后立即转入冷冻干燥机中进行干燥24h。
致密收缩处理：将冻干后的真皮层皮片按上表皮层朝上，下表皮真皮层朝下平铺于不锈钢平板上，置于压片机中以压力5MPa保压48h，随后将模压后的引导膜先浸没在丙酮中300min，最后干燥除去残留的有机溶剂。
(3)交联引导组织再生膜的制备
将(2)得到的交联引导组织再生膜前体置于pH为6、质量百分浓度为0.5％的交联剂溶液中，在4℃下交联1天，交联反应结束后洗净，-20℃预冷12h后冷冻干燥24h、电子辐照灭菌，得到交联引导组织再生膜。其中，交联剂为1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物(EDC)。
实施例3
(1)真皮层皮片的制备
将健康猪的整张腹部皮用机械法进行初步脱脂，用镊子把毛剔除干净，用电动取皮机先将猪皮的皮下组织去掉，再去掉表皮0.2mm，制成厚度为0.5mm的真皮层皮片，再浸泡在质量浓度为0.1％的妥布霉素的水溶液中，置入4℃冰箱过夜后转入-25℃低温冰箱冷冻保存备用。
(2)交联引导组织再生膜前体的制备
脱细胞处理：将解冻后的真皮层皮片依次用质量浓度为0.5％氯化钠(低渗盐)和质量浓度为5.0％氯化钠(高渗盐)溶液循环浸泡3次，12h/次，通过低渗溶液处理促使组织吸水膨胀，从而使组织中的细胞破裂，同时组织中的胶原纤维结构松开，从而使胶原束变得疏松，再通过高渗盐溶液处理破碎细胞的DNA从组织蛋白中分离出来；再将真皮层皮片浸泡在质量浓度为1％的胰蛋白酶溶液中，置于25℃摇床中36h，清洗掉组织中去除组织残留的细胞碎片和细胞核；随后将真皮层皮片在1％的3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸溶液，35℃洗涤3次，2h/次，以去除组织中残留的细胞和细胞核，彻底祛除组织的免疫原性，同时可以达到一定的去除组织中脂肪的效果；最后用PBS洗涤6次，2h/次。
病毒灭活处理：将脱细胞处理后的真皮层皮片平铺于聚四氟乙烯模具中，其中上表皮层朝上，下表皮真皮层朝下，置于-20℃低温冰箱预冷12h后立即转入冷冻干燥机中进行干燥36h，然后在100℃干热灭菌12h。
致密收缩处理：将冻干后的真皮层皮片按上表皮层朝上，下表皮真皮层朝下平铺于不锈钢平板上，置于压片机中以压力50MPa保压12h，随后将模压后的引导膜先浸没在丙酮中480min，最后真空干燥除去残留的有机溶剂。
(3)交联引导组织再生膜的制备
将(2)得到的交联引导组织再生膜前体置于pH为5、质量百分浓度为0.25％的交联剂溶液中，在37℃下交联2h，交联反应结束后洗净，-50℃预冷6h后冷冻干燥36h、钴60灭菌灭菌，得到交联引导组织再生膜。其中，交联剂为戊二醛。
将实施例1～3制得的交联引导组织再生膜与商用Bio-Gide胶原膜(GeistlichPharma AG，Switzerland，REF 30802.6)在浓度为80单位/mL的胶原酶(sigma，货号C0130，来源于溶组织梭菌)中，37℃下降解24小时，比较各自的酶降解性能，得到图4。
由图4可以看出，实施例1～3制得的交联引导组织再生膜的具有更优的耐胶原酶降解性能，因而具有更长的降解时间。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种交联引导组织再生膜的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
对哺乳动物的皮肤进行预处理后得到真皮层皮片；
对所述真皮层皮片依次进行脱细胞处理、病毒灭活处理和致密收缩处理，得到交联引导组织再生膜前体，其中，所述脱细胞处理的操作为：对所述真皮层皮片依次进行低渗-高渗盐处理、酶处理以及去污剂处理；以及
将所述交联引导组织再生膜前体置于pH为2～6、质量百分浓度为0.1％～5％的交联剂溶液中，在4℃～37℃下交联1小时～3天，交联反应结束后洗净，预冷后冷冻干燥、灭菌，得到交联引导组织再生膜。
2.根据权利要求1所述的交联引导组织再生膜的制备方法，其特征在于，所述对哺乳动物的皮肤进行预处理后得到真皮层皮片的操作为：用机械法对所述哺乳动物的皮肤进行初步脱脂及除毛，接着用取皮机将所述哺乳动物的皮肤去掉0.1mm～0.4mm的表皮与皮下脂肪组织后制成厚度为0.2mm～1mm的真皮层皮片。
3.根据权利要求2所述的交联引导组织再生膜的制备方法，其特征在于，所述哺乳动物的皮肤为猪、牛、羊或马的皮肤。
4.根据权利要求1所述的交联引导组织再生膜的制备方法，其特征在于，还包括在对所述真皮层皮片依次进行脱细胞处理、病毒灭活处理和致密收缩处理的操作之前，将所述真皮层皮片浸泡在0℃～8℃的抗生素溶液中过夜的操作；
所述抗生素溶液的溶质为青霉素-链霉素、庆大霉素、妥布霉素、万古霉素或替考拉宁；
所述抗生素溶液的质量百分浓度为0.001％～0.1％。
5.根据权利要求1所述的交联引导组织再生膜的制备方法，其特征在于，对所述真皮层皮片依次进行脱细胞处理、病毒灭活处理和致密收缩处理的操作中，所述脱细胞处理的操作具体为：将所述真皮层皮片分别在质量百分浓度为0.1％～0.9％氯化钠和质量百分浓度为1.0％～10％氯化钠溶液中循环浸泡1次～3次，每次浸泡的时间为4h～12h，再将所述真皮层皮片浸泡在质量浓度为0.1％～1.0％的胰蛋白酶溶液或中性酶溶液中，置于5℃～37℃摇床中摇12h～48h，接着将所述真皮层皮片在质量浓度为0.1％～1％的去污剂溶液中5℃～37℃洗涤2次～8次，每次洗涤的时间为2h～10h，最后用PBS或者生理盐水清洗所述真皮层皮片4次～10次，每次清洗的时间为2h～10h；其中，所述去污剂为十二烷基磺酸钠、曲拉通或3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸。
6.根据权利要求1所述的交联引导组织再生膜的制备方法，其特征在于，对所述真皮层皮片依次进行脱细胞处理、病毒灭活处理和致密收缩处理的操作中，所述病毒灭活处理的操作具体为：将所述真皮层皮片浸入质量百分浓度为0.5％～5％的过氧化氢的乙醇溶液或过氧乙酸的乙醇溶液中，室温下浸泡30min～480min，随后用纯水清洗，并将所述真皮层皮片按照上表皮层朝上、下表皮真皮层朝下的方式固定后-80℃～-20℃预冷2h～12h，最后冷冻干燥24h～48h，其中，所述过氧化物为过氧化氢或过氧乙酸。
7.根据权利要求1所述的交联引导组织再生膜的制备方法，其特征在于，所述病毒灭活处理的操作具体为：将所述真皮层皮片按照上表皮层朝上、下表皮真皮层朝下的方式固定后-80℃～-20℃预冷2h～12h，接着冷冻干燥24h～48h，最后对冷冻干燥后的所述真皮层皮片进行干热灭活，所述干热灭活的温度为50℃～120℃，所述干热灭活的时间为3h～48h。
8.根据权利要求1所述的交联引导组织再生膜的制备方法，其特征在于，对所述真皮层皮片依次进行脱细胞处理、病毒灭活处理和致密收缩处理的操作中，所述致密收缩处理的操作具体为：将所述真皮层皮片按照上表皮层朝上、下表皮真皮层朝下的方式放置后以压力为5MPa～50MPa保压12h～48h，随后将所述真皮层皮浸没在丙酮中15min～600min，然后干燥。
9.根据权利要求1所述的交联引导组织再生膜的制备方法，其特征在于，所述交联剂为戊二醛、1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸盐、京尼平、D-核糖、D-来苏糖、D-木糖、L-鼠李糖、树胶醛糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖、D-古洛糖和D-果糖中的一种。
10.一种交联引导组织再生膜，其特征在于，所述交联引导组织再生膜采用如权利要求1～9中任一项所述的交联引导组织再生膜的制备方法制备得到。
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