CN110801533A - 一种耳科生物材料 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种耳科生物材料，可用于修复包括耳鼓膜损伤在内的耳部创伤；该材料，由幼畜组织，如断奶仔猪的小肠粘膜下层，使用温和的植物源试剂如皂素，在低温条件下对幼畜的幼嫩组织去细胞，本发明获得的耳科生物材料，其ECM立体结构较完整，生物活性成份明显比现有产品含量多，特别是透明质酸含量高，能更好促进细胞趋化、生长和增殖，有利于耳科创面愈合；同时产品易降解吸收，并具有抗感染功效；克服了现有产品活性成份少，ECM结构破坏多，促愈合能力弱，降解慢的缺点；另外产品剂型还可以制成粉剂等不同形状，让使用更灵活，甚到更简单、方便、无痛。

Description

一种耳科生物材料

技术领域

本发明属于生物修复材料领域，具体涉及一种耳科生物材料。

背景技术

虽然人的耳膜很薄，但其解剖结构有三层(紧张部)，外层是上皮层，与外耳道皮肤相连续，本质上就属于皮肤上皮细胞，主要成分为胶原蛋白和皮肤细胞，I、V型胶原蛋白分层有序地排列，其中，直径统一与规则排列的Ⅰ型胶原蛋白,是维持鼓膜上皮细胞生长排列的重要因素。接着是中间层，由放射形和环状纤毛构成，有一定弹性和张力，也统称为纤维层(外侧为放射状，内侧为轮状)，耳膜上方有一小部分，没有中间纤维层，比较薄而松弛，称松弛部；而有纤维层的部分耳膜称为紧张部；内层是粘膜层，与鼓室粘膜相连接，由其延续而成，Ⅵ型胶原蛋白以网状结构，构成鼓膜内粘膜层的基质层，对鼓膜基质的有序排列、粘膜细胞生长起着重要作用。

另外，鼓膜按外观物理结构可分为上面的松弛部和下面的紧张部；鼓膜紧张部有3层组织。外层为上皮层，系与外耳道皮肤连续的复层鳞状上皮；中间层为固有层，即纤维组织层，又可分为两层：①浅层为放射状纤维。从锤骨柄向周围放射，②深层为环状纤维，近鼓膜边缘较丰富，中央较稀少，松弛部无此层，故较松弛；内层为粘膜层，与鼓室粘膜相延续，系单层扁平上皮细胞，其游离面有大量微绒毛；而鼓膜松弛部也有上皮层、固有层和粘膜层构成。其固有层由大量不规则排列的胶原和弹性纤维、毛细血管和有髓鞘即无髓鞘神经组成。

鼓膜穿孔或损伤是一种常见病，会导致听力下降或完全丧失，甚至会经常反复感染。通常可分为急性(较小)穿孔(其在大多数情况下自发闭合)和慢性鼓膜穿孔(较大)；膜穿孔往往由外伤或感染引起，有时中耳感染也会引起耳鼓膜自发性破裂(撕裂)，导致鼓膜穿孔；耳部可能会有感染液或血流出，也称为伴有鼓膜穿孔的中耳炎；不管什么原因导致的鼓膜穿孔，患者都希望能尽快将鼓膜修复；鼓膜穿孔的修复有手术修补法和贴补搭桥法两种；鼓膜修补术，如内衬法、夹层法、外贴法。

手术修补鼓膜疗效比较确切，但需要用颞肌筋膜或乳突骨膜等修补，创伤较大，手术费较贵；而贴补搭桥材料有多种，如鸡蛋衣、淀粉海绵、羊胎膜等，但这些传统的材料，只是作为一种普通支架来发挥作用，并无明显促进细胞生长的功能，其促进鼓膜穿孔愈合的能力较弱。较成熟的鼓膜修补材料有，可吸收的蛋白海绵、异种胶原生物膜；如辉瑞(Pfizer)生产的Gelfoam，以及美敦力(Medtronic)生产的EpiDisc，一种用于修复鼓膜的多孔透明质酸贴剂,其为生物可降解的，宣称能够同时诱导鼓膜的上皮细胞生长和血管向内生长；但这类产品，既没有细胞外基质的天然立体结构或仿天然三维结构；也没有源自ECM的多样且丰富的活性成份和细胞生长因子；这些都不是真正意义上的去细胞支架，其实际诱导细胞生长的能力通常都较弱。

目前研究较热的耳鼓膜修补材料主要是去细胞基质，可称为生物补片，也可称为去细胞组织补片，初始原料主要来源于动物小肠粘膜下层、真皮等组织；通过一系列加工处理，包括去细胞、去DNA，去α-Gal抗原等免疫原成分。这种方法获得的去细胞基质材料，一方面能保留三维立体结构，同时也含有一些重要活性成份。由去细胞基质制备而成的理想生物补片，应具有良好的生物适应性，可降解性、可吸收性；无免疫性；能够为细胞的趋化、附着、增殖、分化提供理想的空间支架和适宜的微环境，有利于损伤组织的结构修复和功能重建。

关于耳科或鼓膜修复用的去细胞补片，查到的相关专利文献如下：

一：CN 105233343A专利名称为：去细胞真皮基质鼓膜及外耳组织修复材料的制备方法；公开的步骤为：步骤1：选取动哺乳物体或人体的真皮组织；步骤2：通过对比所述真皮组织和鼓膜组织的结构，确定所述真皮组织结构中与所述鼓膜组织的结构相近且相邻3层的真皮组织α层结构；步骤3:去除所述真皮组织中除真皮组织α层结构以外的其他层，获得真皮组织α层初级原料。其发明点在于：根据真皮特点及鼓膜组织结构的特殊性，进行研制改进，制备出了与人体鼓膜结构、组织特点极为相近的鼓膜修复材料。

该专利有如下缺点：

1：工艺步骤繁杂，使用试剂众多。具体步骤是，先去细胞，然后使用特定酶和化学试剂制备固定制剂，还要再使用平衡还原液。例如，去细胞处理后的原料，于平衡还原液中混摇4～24小时，在平衡还原液中，加入相应的还原酶和中和试剂，还原I，III，VI胶原蛋白、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子-β、纤维连接蛋白等的生物活性，使其可以在植入体内后一定条件下被激活。

2：所用组织原料是真皮，生物活性成份少；虽然结构上与鼓膜组织结构相近，但在专利文献CN105920669A中，以及在刘文博发表的文章“可重塑生物补片在疝及腹壁外科的应用和展望”《海军医学杂志》2016,37(4):378-381，将真皮、心包、腹膜等原料归为惰性原料或半惰性材质，其成分主要是结构蛋白(胶原纤维和弹力纤维)，几乎没有粘连蛋白、生长因子和蛋白聚糖类等生物活性成分；即使有的话量也很少，在去细胞过程中也很容易流失。

3：另外真皮原料制备的补片，其中含有大量降解缓慢，且人体25岁后不能再生的弹性纤维蛋白，这导致修复区域远期不稳定，易失弹性。

二：CN 106983909A专利名称为：一种耳科修复材料、制备方法及应用，该发明采用的修复材料，是由经免疫原去除处理的小肠粘膜下层基质材料制成，所述修复材料包括基层和设置在所述基层上的一个或多个凸起部；该修复材料可诱导患者自身细胞长入,为细胞重建受损组织提供模板，修复为功能化的组织或器官，并且免疫原去除基质会逐步降解，与重建组织再生过程基本同步。

该专利说明书中的方法，有如下明显的三个缺点：

1：采用了胰蛋白酶去细胞，胰蛋白酶为动物源酶，是一种丝氨酸蛋白水解酶，为肽链内切酶，胰蛋白酶对各类蛋白质都具有普适性的消化和降解作用，不受蛋白质的品种类型和来源所限，对蛋白质本身也不具有针对性和选择性，胰蛋白酶对各类蛋白质上的相应酶切位点也具有普适性；因此在使用胰蛋白酶去细胞时，不可避免地会降解破坏组织中的胶原蛋白、弹性蛋白，粘蛋白以及其他蛋白类成份如纤连蛋白和层连蛋白等，正是由于胰蛋白酶对细胞外基质中的结构蛋白和功能蛋白有降解和破坏作用，包括对由胶原蛋白构建的ECM立体结构也有损伤和破坏，所以胰蛋白酶在去细胞的过程中，应该慎之双慎的使用；要严格控制胰蛋白酶的工作浓度和作用时间。而该专利中使用的胰蛋白酶工作浓度是0.1％，是胰蛋白酶用于猪小肠粘膜下层去细胞工作浓度(0.02％)的五倍；即使是采用0.02％胰蛋白酶来对薄薄(约0.1mm)猪小肠粘膜下层(SIS)的去细胞20多分钟，也会不同程度地破坏ECM立体结构和降低ECM中活性成份的保留量。

2：该专利的技术方案中，对基层(基质)材料的干燥，是先压5--10公斤的压块，使得材料平整、水分从四周溢出，使材料上下层之间紧密接触，然后放入预热至40℃烘箱中，且保持时间约16小时。这种相对较高的外部压力(5--10公斤压块)和较长时间(达14个小时)的相对高温处理(40度)，在这二个环节中的二个特定物理因素都可能会严重损坏ECM三维结构和破坏ECM中活性成份。

3：浆料的制备，向破碎后的小肠粘膜下层基质材料加入0.3％醋酸溶液；形成小肠粘膜下层基质材料浆料，小肠粘膜下层基质材料与醋酸溶液质量比为1:60；通过酸液的处理，并且要直至形成浆状，这步操作会直接导致ECM立体结构彻底破坏，同时会不同程度地导致有效活性成份的流失或功能活性完全遭受损坏。

从其实施例的检测结果可知(详见其说明书0072段)，采用该技术方案以SIS为原料，制备的耳科补片中透明质酸(HA)的含量只有296微克/克，而根据专利文献CN102256609B第0190段，SIS去细胞补片/支架中的透明质酸(HA)含量约为0.2％，即2000微克/克，是其七倍左右；这正好印证了上面所提到的三个技术缺点，这三个缺点都会不同程度地导致有效活性成份如透明质酸(HA)在内的流失。

三：CN 101879098 B专利名称为：使用丝蛋白的人工鼓膜及其制造方法；该发明提供使用丝蛋白的人工鼓膜和其制造方法；所述人工鼓膜是通过将从蚕茧或蚕丝纤维去除丝胶后获得的丝蛋白(或丝素蛋白)或丝蛋白复合物溶液脱盐并干燥而以丝素膜的形式制成。虽然这类人工鼓膜是完全可以降解，也可以复合一些生物活性成份，但其缺乏天然来源的ECM立体结构和包含在其中的有效活性成分；很难有效达到对损伤的耳科鼓膜在结构上的完全修复和和功能上彻底恢复。

理想耳科修复材料应具备下列条件：要具有良好的促耳科(包括鼓膜)组织再生功能；具有安全性，无毒性，无感染性；组织相容性好，无免疫排斥反应；相对较易降解，因为耳部相对而言，血流较少较慢，属于相对独立的组织器官；使用方便，手术简单，易于消毒灭菌；厚度合适，与鼓膜原始厚度不能相差太大，宜介于0.05--0.2mm之间，且容易在较短时间(一至三周内)完全降解吸收；取材广泛，价格低。

发明内容

本发明的目的在于，解决现有耳科生物材料的缺点和不足，如生物材料(补片)中促组织再生能力弱或促创面愈合活性成份(如透明质酸HA)少，组织诱导能力差；去细胞工艺苛刻，导致补片中活性成份流失严重，ECM结构受损，诱导细胞生长能力弱的缺点；补片降解慢，不利于组织修复；针对前述耳科生物材料存在的技术问题；发明人围绕从补片的初始原料的选择，以及对去细胞试剂的精选，工艺的优化，从这些关键技术特征出发；简单又方便地克服了现有技术方案的不足，巧妙地解决了现有技术中存在的问题。

本发明的重点和创新点在于，如何解决耳科补片诱导组织再生能力弱，生物活性因子含量低，以及可能存在的降解慢的技术难题；发明人采用了与现有技术完全不同的技术思路，直接从制备耳科生物材料的第一步，即从去细胞的组织原料这一关键因素抓起，以此为突破点来进行深入研究分析。

本发明产品的主要创新点，就在于去细胞补片的动物组织原料的选择，不是常规的来自屠宰场的商品级肉畜，而是选用幼畜，如选择断奶仔猪，约20至30日龄，体重6至8公斤；进一步地选择幼畜的结缔组织，包括小肠粘膜下层、膀胱粘膜下层、胃粘膜下层、真皮、膀胱基质、心包膜、脑膜、腹膜、阔筋膜中的一种或多种组合。

本发明产品的次要创新点，在于选择作用方式温和，对ECM结构基无破坏损伤的植物源皂素作为去细胞试剂，其对幼嫩组织，特别是幼畜小肠粘膜下层(SIS)，幼畜真皮、幼畜膀胱，能够保留较完整的ECM立体结构和ECM中较多的有效活性成分(如HA)；这类嫩组织非常敏感，对去细胞试剂的要求很高，不仅要考虑试剂类型，工作浓度，作用时的温度，处理的时间长短；总之条件要温和，方法要恰当，才能获得较完好的天然立体三维结构和保留更多的活性成份；另外，与其他组织部位相比较而言，小肠粘膜下层(SIS)的成份构成以I型纤维胶原蛋白为主，同时还含有III、IV、VI型胶原蛋白，特别是其中含有重要的IV型胶原蛋白，对新血管和基膜的形成具有明显的促进作用；同时依据美国STEPHEN F.BADYLAK的多篇文章表明SIS补片的降解产物具有较强的抗菌活性，有类似于猪防御素(porcine defensin,pBD-1)的功能；以及George S.Hussey 2018年的文章《Extracellular MatrixBioscaffolds for Building Gastrointestinal Tissue》报道SIS补片降解产物还具有诱导细胞趋化和有丝分裂的作用；因此优选组织部位是小肠粘膜下层(SIS)，其次可选组织部位是真皮、膀胱。

本发明产品的第三个创新点在于，耳科生物材料，不限于常规的片状或膜状，而是指还可以采用物理，化学，生物方法之一或其组合，加工成粉末、颗粒、胶状、膏状中的一种或产品组合，使得耳科生物材料的剂型更丰富，使用方式方法更加灵活多样；例如粉末状产品，不需要额外的手术，也没有技术难度；甚至可以不在医院，甚至没有医生指导的情况下，请家人或朋友，直接可以通过吹粉法或其他简易方法，将耳科生物材料粉送至耳内损伤或创面处，使粉末与创面接触(包括吸附/粘着)，促进鼓膜等损伤部位早日愈合。

本发明的灵感是来自，发明人对幼龄动物组织生长速度特别快，这一特点或优越性能的充分认识；在幼龄阶段，其各组织的生长速度正处于一生中的旺盛阶段；这一公认的事实，足以直接提醒我们在幼龄动物的各组织中，其细胞生长因子和生物活性成份相对含量(按干物质百分比计算)或有效活性，明显比已达到成年的或者是已初步发育好的相应动物组织高许多，多一倍或数倍，且的确已有国外相关文献报道(Breen,M.,Weinstein,H.G.,Blacik,L.J.,Borcherding,M.S.,and Sittig,R.A.Microanalysis andcharacterization of glycosaminoglycans from human tissue via zoneelectrophoresis.In Whistler,R.L.,and BeMiller,J.N.,eds.Methods inCarbohydrate Chemistry,Vol 7.New York:Academic Press,pp.101-115)。幼畜其组织再生能力强，损伤愈合时间短，创面愈合率高，这也可以充分佐证幼龄动物组织中的细胞生长因子和生物活性成份含量高或活性强。

总之，幼畜组织，特别是幼畜SIS作为耳科生物材料的原料，其优势体现还有以下几点：

一：SIS中含有丰富动静脉血管，SIS中含有少量但很重要的IV型胶原蛋白，这对耳科鼓膜损伤后的新血管和基膜的形成具有明显的促进作用；无论是什么原因造成的耳科鼓膜穿孔或破损，都能够更好地促进鼓膜受损处的修复。

二：依据美国STEPHEN F.BADYLAK博士发表的多篇文章表明SIS的降解产物具有较强的抗菌活性，有类似于猪防御素(porcine defensin,pBD-1)的功能，因为SIS源补片具有一定的防止植入部位继发感染的功能，这会更有利于伴有慢性中耳炎的鼓膜修复患者的早日康复。

三：根据George S.Hussey 2018年的文章《Extracellular Matrix Bioscaffoldsfor Building Gastrointestinal Tissue》的学术报道，SIS降解产物还具有诱导细胞趋化和有丝分裂的作用；能有效增强鼓膜里包括上皮细胞在内的各类细胞的增殖速度，有利于鼓膜的尽早修复。

四：幼畜SIS相对于，已达到出栏重的肉畜SIS而言，其含有更高含量的透明质酸HA(按干物质计算)；同时幼畜SIS补片，比已达到出栏重的肉畜SIS补片，更易降解和吸收，特别在耳部，血流量相对较少的情况下，组织修复生物材料容易降解吸收，这是一个十分明显的优点；而难降解的组织修复生物材料，不利于耳鼓膜组织的快速再生和创面的迅速愈合；相对暴露在外的耳鼓膜组织损伤，若不能及时愈合创面，则更易发生感染和炎症，进而更加难以愈合和听力的全面恢复。

发明原理

一：幼畜组织生长速度特别快，其各组织的生长速度正处于一生中的旺盛阶段；这提示幼畜组织的细胞生长因子和生物活性成份相对含量(按干物质百分比计算)，要比已达出栏重的商品肉畜或已初步发育好的肉畜高许多；幼畜其组织再生能力强，损伤愈合时间短，创面愈合率高，这也可以充分佐证幼龄动物组织中的细胞生长因子和生物活性成份含量高或活性强。

二：幼畜组织及其制备的生物材料，因其先天固有的结构特性(如交联程度低，或结构较疏松)和发育特点，相对要比已达到出栏重的肉畜组织及其生物材料，更容易被降解和吸收；特别在血流量相对较少的情况下，生物材料易降解吸收是有明显优势的。

三：在本发明中，去细胞试剂之所以选用植物源皂素，主要是因为这是一类天然的非离子型表面活性剂，其去细胞的方式针对性强，主要是通过破坏脂质细胞膜和细胞器膜，正因为作用方式针对性强，对其他成份几乎无破坏，不会影响功能蛋白的活性发挥和结构蛋白的稳定性，对ECM结构无损伤无破坏；这对鼓膜结构的良好修复非常关键；在各类鼓膜穿孔损伤后，无论是急性的，还是慢性的，其鼓膜修复再生，遇到的主要问题就是，缺乏用于上皮细胞迁移的载体，以及有利于形成鼓膜内部三层膜(上皮细胞层、致密纤维层、内皮粘膜细胞层)的细胞支架；而SIS原料在采用植物皂素去细胞后，所留下来的ECM立体结构，正好可以成为鼓膜修复所期盼的支架；同时采用温和的植物源皂素去细胞，不会引起ECM中有效成份(如透明质酸HA等)和细胞生长因子(如成纤维细胞生长因子FGF)等的流失和破坏；相比于其他化工类或半合成类去污剂而言，同样都能达到有效地去净细胞及细胞残留物的效果，但植物源皂素作用方式独特且温和，使用这类植物源皂素去细胞，能保存较完好ECM空间立体结构和保留更多ECM中的有效成份，例如透明质酸；采用本发明方法中的去细胞试剂，要明显与化工类去污剂去细胞，能保留更多的细胞生长因子和生物活性成份，含量更高，活性更强。

四：在本发明里，可选择的幼畜组织，包括小肠粘膜下层、膀胱粘膜下层、胃粘膜下层、真皮、膀胱基质、心包膜、脑膜、腹膜、阔筋膜。优选小肠粘膜下层(SIS)，膀胱基质(UBM，urinary bladder matrix)和真皮组织作为去细胞的原料；最优选小肠粘膜下层，首先，SIS去细胞补片具有更加丰富的细胞生长因子和生物活性成份，根据JASON P.HODDE1996年在《TISSUE ENGINEERING》Volume 2,Number 3和Janet E.Reing 2010年在《Biomaterials》November；31(33):8626–8633上发表的文章等技术文章材料比较可知，GAGs在SIS组织中的含量要比真皮补片中的要高；本发明制备的幼畜源SIS耳科生物材料中HA含量可达到3.57ug/mg也验证了这一点；其次，SIS含有更多样的胶原蛋白类型，包括I、III型，IV型和IV型胶原蛋白；SIS胶原蛋白含量可达到80％左右；再者，SIS补片ECM呈网状结构，能缓慢释放细胞生长因子和活性成份，具有天然长效诱导新细胞分化和促细胞生长的作用；进一步的，SIS在体内降解后的二级产物，如隐窝肽类物质，具有天然抗菌、消炎、抗氧化等功效；最后，SIS原料相对真皮而言，其相对较薄，单层仅有约0.05-0.08mm，幼猪SIS则更薄，通常真皮原料厚度(不同部位)是SIS的数倍，因此更易于各类溶液及试剂的有效处理；SIS单层补片的厚度为0.05--0.08mm，二层SIS补片的厚度约为0.1-－0.16mm；耳科鼓膜厚度约在0.1mm左右；因此使用1-3层SIS补片(厚度为0.05—0.2mm)即可制成耳科生物材料；使用SIS去细胞补片能促进靶组织细胞的趋化分化和增殖，更好地促进新胶原蛋白分泌和新细胞外基质的形成；不仅能实现新组织在结构上的完全恢复；而且能达到功能上的全面康复。

与现有技术相比，本发明具有以下显著优点和有益效果

1)本发明采用幼畜组织作为耳科生物材料原料，其含有更高含量的透明质酸HA和细胞生长因子，能明显促进创面组织和细胞的再生，能加快术后耳鼓膜组织的生长和功能恢复。

2)本发明的耳科生物材料，其原料为幼畜组织，相对较容易降解，且其降解产物多肽成分，具有一定的抗菌性能，可降低植入后炎症和感染的发生。

3)本发明的技术方案，没有使用蛋白消化酶及化工去污剂，使用温和的植物皂素去细胞，不会对ECM中胶原蛋白结构产生损伤和破坏，能够保留较完整的细胞外基质三维立体结构；具有更好的诱导细胞和血管长入功能，且在新组织长入的同时，生物材料自身相对较易降解；

4)本发明的技术方案，采用植物皂素作为去细胞试剂，不使用合成类试剂去细胞，无化学残留，安全无副作用。

5)本发明的耳科生物材料，比使用化工类去污剂，含有更多的细胞生长因子和有效活性成份，具有良好诱导组织再生功能。

6)本发明的耳科生物材料，可制成预设的不同规格大小和厚度，如由原始补片1层或多层叠加，补片可完全降解吸收，且与耳科创面组织再生，基本能达到同步；同时本发明的耳科生物材料，不限于常规的片状或膜状，而是指还可以采用理化方法，加工成粉末、颗粒、胶状、膏状中的一种或产品组合，使得耳科生物材料的剂型更丰富，使用方式方法更加灵活多样；例如粉末状产品，不需要手术和培训，基无任何技术难度；可以不在医院，甚至在没有医生指导的情况下，请家人或朋友，直接可以通过吹粉法或其他简易方法，将耳科生物材料粉送至耳内损伤或创面处，使粉末与创面接触(包括吸附/粘着)，促进鼓膜等损伤部位早日愈合。

术语/名词首选按下列文字说明来理解，另有详细说明的除非；其他术语按本领域普通技术人员水平来理解其含义。

1)组织修复材料、组织再生材料、生物补片(膜)、生物修补片、生物支架、可降解补片、可吸收补片Bio-Mesh、Bio-Patch、Patch、Bioscaffold，这些个中英文名词或术语，表面上虽有不同，但其目的和用途基本是一样的；除非有特殊的具体说明，否则上述几个名词的内涵，在实质上是等同的。

2)小肠粘膜下层SIS(Small Intestinal Submucosa)，包括空肠和回肠部分，在除去小肠粘膜层、肌层、浆膜层后所剩余的部分，以胶原蛋白为主要成份，约占80％以上，且以I型胶原蛋白为主。

3)细胞外基质ECM(Extracellular Matrix)：是存在于所有组织和器官中的非细胞成分，其不仅对细胞组织提供必需的物理支撑，为各种细胞的正常生理活动，提供适宜的场所及微环境；而且对组织的形态发生、细胞的趋化和分化，以及重要的生理生化和生物力学等方面，起到重要的杠杆调节作用，从而影响或调控组织和器官的功能。细胞50％的功能是由细胞外基质所营造的外部微环境所决定的；细胞外基质的物质组成：是以结构蛋白，如胶原蛋白(Collagen)、弹性蛋白(elastins)、纤丝蛋白等大分子成份为主要框架结构，并附着了一些功能蛋白如纤连蛋白FN(fibronectins)、层连蛋白LN(laminins)等；同时其中还携带有各类细胞生长因子(如成纤维细胞因子FGF、转化生长因子TGF、血管内皮生长因子VEGF；可能也含有极少量但很重要的表皮生长因子EGF和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)另外细胞外基质中还含有糖胺聚糖(GAGs)类、蛋白聚糖等活性成分。

4)糖胺聚糖GAGs(Glycosaminoglycan)，也称粘多糖，为杂多糖的一种，主要存在于动物结缔组织中，是参与组织正常生理活动以及组织损伤修复再生的重要原料；是ECM中的重要组成成份；按单糖残基、残基间连键的类型以及硫酸基的数目和位置，糖胺聚糖可分为5个主要类别，透明质酸(HA)、硫酸软骨素(CS)、硫酸皮肤素(DS)、硫酸角质素(KS)、硫酸乙酰肝素和肝素(HP)。

5)透明质酸(Hyaluronic acid，HA)，又称为玻尿酸或玻尿酸盐，是一种糖胺聚糖，是细胞外基质(ECM)的主要成分之一，参与组织的重建、扩增细胞间隙、炎症反应和等许多细胞生理以及组织修复过程；研究表明透明质酸具有明显的细胞效应，能明显有助于细胞趋化与迁移，以及细胞的增殖；其机理是通过细胞表面HA结合蛋白与HA结合后发生的，粘附分子CD44是HA的细胞表面受体，是一类分布极为广泛的细胞表面糖蛋白，它参与细胞一细胞之间以及细胞一基质之间的特异性粘连；Ru-MingLiu,et al.等在《Experimental CellResearch》Volume 345,Issue 2,15 July 2016,Pages 218-229上发表文章，表明，透明质酸通过激活Wnt/β-连环蛋白信号通路，可促进间充质干细胞增殖。透明质酸是具有生物学功能的天然生物聚合物，可以来自细菌以及更高级的动物，包括人类。透明质酸天然发现于身体的许多组织；透明质酸的分子量范围很大，包括大分子量的，如从约100kDa至几百万Da，同时也可以是小分子量的，如500kDa至6000kDa之间。

6)去细胞基质ACTM(Acellular Tissue Matrix)或无细胞组织基质：是指采用特定的试剂和处理方式，将动物器官或组织中的细胞、病毒、DNA等会产生免疫排斥反应的成分充分地去除或灭活，最大限度地保留原有天然立体结构的完整性，以及尽量保留原有基质中的细胞生长因子和活性功能成份；去细胞基质由于其天然立体三维(3-D)结构、含有生物活性因子、能够被受体降解、易诱导受体干细胞移(易)位分化等特点，被广泛应用于临床中，用于组织的修复和再生(先天缺损和后天创伤)；去细胞基质是新型的组织再生修复材料，具有良好的生物支架性能。

7)耳科生物材料，包括但不限于，用于鼓膜损伤(包括各种原因导致的穿孔)修复，是动物组织，经去细胞工艺等加工后所剩下的ECM立体结构，组织原料可以来源于SIS、真皮、膀胱，心包膜或其他组织等；外观形态可以是粉末、颗粒、胶状、膏状、膜片状中的一种或其组合。

除非上下文有清楚的说明，本说明书和所附权利要求中用到的单数形式“一个和“该”包括复数含义。因此，例如，“该方法”包括一或多种方法，和/或步骤，它们属于本文所述类型和/或是本领域技术人员阅读了本文后很明显能认识到的。术语“约”或“接近”是指统计学意义上的范围值，范围可以是在一个数量级之内，通常在指定数值或范围的50％以内，进一步指在20％以内，还更通常在10％以内，甚至更通常在5％以内。术语“约”或“接近”所涵盖的能允许的变化取决于研究的具体体系，是本领域技术人员可以很容易地认识到的。

下面结合具体实施例，以进一步描述本发明的原理和方案；应当理解，这些实施例只是为了举例说明和方便理解本发明的思想，但不能局限于此；实施例并非以任何方式来限制本发明范围，以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

本发明的目的在于，提供一种耳科生物材料，为实现本发明目的，具体是通过以下技术方案来实现的。一种耳科生物材料，含有去细胞的幼畜组织；即以幼畜组织为原料，通过去细胞处理等工艺加工而成。

进一步的，所述幼畜是指刚断奶、以及处于吃奶阶段的幼猪、幼牛、幼羊、幼骆驼、幼驴、幼兔、幼狗、幼猫。

进一步地，所述组织是指小肠粘膜下层、膀胱粘膜下层、胃粘膜下层、真皮基质、脑膜、腹膜、阔筋膜中的一种或多种组合。

进一步地，所述幼畜组织指刚断奶幼猪的小肠粘膜下层。

进一步地，所述加工，按操作顺序，包括前处理、去细胞处理和后续加工三个主要步骤。

进一步地，所述加工中的前处理，是指取材洗净、消毒、去脂。

进一步地，所述加工中的去细胞处理，是指以植物源表面活性剂作为去细胞试剂。

进一步地，所述后续加工，是指采用理化方法，将去细胞组织，加工成粉末、胶状、膏状、膜片。

更进一步详细地操作，所述加工，具体包括，第一个环节，即前处理，包括：取材洗净，取幼畜的结缔组织，充分冲洗干净；接着可选择酸液和或碱液进行处理消毒；然后使用有机溶剂去脂；第二个环节，即去细胞处理，使用含植物源表面活性剂的溶液，在超声条件下，浸泡幼畜组织原料，之后用PBS冲洗；第三个环节是后续加工，即将去细胞处理后的半成品，按预设的所需外观形态，采用物理方法制成相应规格；可以包括低温粉碎、干燥、包装、灭菌等步骤加工为成品。

进一步地，可以选择在去细胞处理之后，用含DNA酶的水溶液浸泡组织原料，以去除DNA，在PBS清洗后；再用含α-半乳糖苷酶的水溶液浸泡，以去α-Gal抗原。

进一步地，加工时的前处理，具体操作是：取幼畜的小肠或皮肤组织，充分洗净；机械刮除或剪切法除去小肠、皮肤组织中的非结缔组织；将分离出的小肠粘膜下层或真皮层；冲洗干净，得到的靶组织就是材料原料；接着将其置于醋酸溶液中浸泡，浸泡30—60分钟，原料与醋酸溶液的比例为1:10(W/W)；消毒：用含有过氧乙酸和醇的溶液，浸泡材料原料，进行消毒；浸泡30—60分钟；再用水超声清洗；去脂：使用醇溶液，在超声、常温条件下浸泡材料原料，材料原料与醇溶液比例为1:5--1:10，常温浸泡时间为0.5—3h；之后用水超声清洗；

进一步地，耳科生物材料，其制备方法中，所述加工中的去细胞处理，具体操作是，用含植物源表面活性剂溶液，在低温和超声下浸泡组织原料；接着用新的同浓度植物源表面活性剂溶液对组织原料进行浸泡；组织原料与溶液的比例为1:10(W/V)；可按实际情况可重复去细胞1-3次。

优化地去细胞处理操作方法是，使用含植物皂素溶液，在4-15℃和超声下浸泡补片原料10—60分钟；补片原料与溶液的比例为1:10(W/V)；之后用同浓度新鲜皂素溶液对补片原料浸泡5--60分钟；

优选以下技术参数：皂素溶液中有效皂素的含量为0.1--1％(W/W)，补片原料与植物源皂素溶液的比例为1:5---1:10，在超声条件下，于低温4—10℃条件下浸泡20--45分钟；然后用同浓度的新鲜皂素溶液再对补片原料浸泡5--30分钟；接着用PBS-EDTA进行浸泡10--30分钟。优选的植物源表面活性剂是指植物源三萜烯皂素，更优选是Quil-A来源；皂素的工作浓度为0.2—0.5％(W/W)。

下面结合具体实施例，以进一步描述本发明的原理和方案；应当理解，这些实施例只是为了举例说明和方便理解本发明的思想，但不能局限于此；实施例并非以任何方式来限制本发明范围，以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中使用的公知常识的方法；也可能包括省略了在医学生物材料领域使用的贯用手法和方法。

具体实施方式

实施例一：(断奶仔猪SIS)

选择健康的断奶仔猪，取其小肠粘膜下层，制备耳科生物补片，具体步骤如下：

1)前处理：取材清洗，选健康已达断奶日龄和体重的三元杂仔猪，取其小肠，清洗洁净后作为幼畜组织原料；经深入了解，仔猪断奶时的日龄通常在21--30天，因季节不同，断奶日龄有所不同，夏天稍短些，冬天稍长些；体重约六至八公斤，仔猪在断奶前主要吃母乳为主，其所摄入的全价饲料(有的称为教槽料或仔猪奶粉)是很少的。使用机械刮除法除去小肠空肠的粘膜层、肌层、浆膜层、淋巴结等，并切成段，得到小肠粘膜下层(SIS)原料，置于0.8％醋酸的溶液浸泡45分钟，猪小肠粘膜下层与醋酸溶液的重量比为1:8，再用纯化水冲洗3遍；接着消毒，用含有1.0％过氧乙酸和15％乙醇的混合溶液，在超声条件下，室温浸泡SIS材料90分钟，进行消毒，SIS材料与混合溶液的比例为1:10。之后使用纯化水超声清洗3遍；然后去脂，用90％乙醇，在超声条件下，常温浸泡90分钟；SIS材料与乙醇的重量比为1:10，之后用水超声清洗3遍；

2)去细胞：用含0.4％皂素溶液(商品化Quil-A，按商品所标示的浓度进行折算，以纯皂素含量来计算工作浓度)，在4℃和超声条件下浸泡补片原料30分钟；之后用同样浓度0.4％皂素溶液对补片原料进行冲洗10分钟；接着再用PBS-EDTA溶液对补片浸泡20分钟。

3)后续加工：将去细胞后的SIS片状原料，根据厚度要求，进行一层，或二层，或三层，甚至多层进行重叠，接着固定于模具上，低温冷冻干燥，再按不同预设大小与尺寸，如2cm*2cm，1cm*1cm，0.8*0.8cm进行裁切，包装，最后进行辐照灭菌，标注品名，即得成品。

实施例二：(对照组一，商品肉猪)

制备方法中具体操作与实施例一基本相同，其主要区别在于：猪的日龄和体重不同，本实施例中选择的是来自屠宰场的商品肉猪，体重近100公斤，其饲养天数达150--160天左右；其他加工方法，前处理(包括预处理，消毒，去脂)、去细胞、后续加工等步骤、方法以及使用试剂，浓度和作用时间，完全同实施例一。

实施例三：(对照组二，胰蛋白酶)

制备方法中具体操作与实施例一基本相同，其主要区别在于：选择的是第二环节，去细胞试剂的选择上；不是使用植物皂素，而是使用常规的试验，如胰蛋白酶，工作浓度为0.05％，且作用时间相同，都是30分钟；只是不会用同浓度的胰蛋白酶再次浸泡，即只用胰蛋白酶溶液作用一次(30分钟)。

实施例四：耳科生物补片中生物活性因子检测

对实施例1--3制备得到的耳科生物补片样品进行生物活性因子的检测；采用商业化试剂盒对活性成份透明质酸(HA)的含量进行检测；样品预处理方式是采用低温研磨法进行处理，检测结果如下表：

组别	组织来源及去细胞试剂	透明质酸HA(ug/mg)
			实施例1	断奶仔猪SIS+皂素	3.57
实施例2(对照组一)	商品肉猪SIS+皂素	2.25
			实施例3(对照组二)	断奶仔猪SIS+胰蛋白酶	2.11

实施例五：制成不同剂型的产品

将实施例一制成的干燥片状产品，人工机械切割，或在低温(零下5--20度)机器粉碎(转速5转每秒，时间5分钟)，加工成不同规格大小的生物小片，生物颗粒或生物粉末；直径、宽度为0.3mm,0.4mm,0.5mm,0.6mm,0,7mm,0.8mm,0.9mm,1mm1.5mm,2mm，并可以过筛分级，再进行分包装、灭菌，打标签即得。

需要强调的是，尽管权利要求中指出了以下展示和描述的本发明的某些新的特征，但并没有试图将本发明限定于特定的细节，因为相关领域的普通技术人员能够理解，可在不以任何方式偏离本发明精神的前提下，对所示出的本发明的形式和细节及其执行做出各种省略、修改、替换和改变。本发明的特征并不是“关键”或“必要”的，除非明确限定为“关键”或“必要”。

本领域中普通技术人员可根据上述说明，在发明原理的直接启示下，能够对本发明做出多种简单的变化或调整或组合；在不违反本发明的权利要求宗旨的前提下，实施例中的某些细节，不应构成对本发明的限定，本发明将以所附权利要求书界定的范围作为保护范围。

Claims (9)

1.一种耳科生物材料，其特征是，含有去细胞的幼畜组织，幼畜是指出生到初情期之前的幼年家畜。

2.根据权利要求1所述的耳科生物材料，其特征在于，所述幼畜组织，是经过去细胞试剂处理的。

3.根据权利要求1所述的耳科生物材料，其特征在于，所述幼畜是指，包括但不限于刚出生的、断奶前的、刚断奶的猪、牛、羊、马，骆驼、驴、兔、猫、狗。

4.根据权利要求1所述的耳科生物材料，其特征在于，所述组织是指小肠粘膜下层、膀胱粘膜下层、胃粘膜下层、真皮基质、脑膜、羊膜、腹膜、阔筋膜中的一种或多种组合。

5.根据权利要求1所述的耳科生物材料，其特征在于，所述幼畜组织指刚断奶仔猪的小肠粘膜下层。

6.根据权利要求2所述的耳科生物材料，其特征在于，所述去细胞试剂，以植物源非离子表面活性剂为主要成份。

7.根据权利要求2所述的耳科生物材料，其特征在于，所述去细胞试剂主要由三萜烯皂素、类固醇皂素之一或其复合物组成。

8.根据权利要求2所述的耳科生物材料，其特征在于，所述去细胞，其去细胞试剂主要由Quil-A组成；所述去细胞试剂，有效工作浓度为重量比0.1-1％，与生物材料原料作用时间为每次5-60分钟，去细胞作用温度为2-20℃。

9.一种耳科生物材料，其特征在于，剂型可以是粉末、颗粒、胶状、膏状，膜片状中的一种或组合；使用方法灵活，可以动手术，也可以不用动手术，可采用吹粉法，直接涂抹法。