CN111330080A - 一种引导口腔骨再生的生物膜及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种引导骨再生(GBR)生物膜，这种GBR膜,其特征在于，与口腔牙周软组织接触的一层（A层），为去细胞的种畜ECM膜，具有良好的交联度，防止A层膜过早降解，让隔离效果更持久；同时与牙槽骨缺损处接触的一层（B层），为去细胞的幼畜ECM膜，如来自仔猪腿部骨膜或小肠粘膜下层；源自幼畜的B层含有更多生物活性因子（如HA）,诱导组织再生能力强；这类GBR膜，既有持久隔离功效，又有良好促骨组织再生功能、完全可降解可吸收；生产中没有使用交联剂来增强抗酶解性能，避免交联剂残留；本发明的GBR膜，既有利于引导骨组织高质量地重建，也能诱导其尽早再生，可同时兼顾又好又快。

Description

一种引导口腔骨再生的生物膜及其制备方法

技术领域

本发明属于口腔用可吸收生物材料领域，尤其涉及一种引导口腔骨再生的生物膜及其制备方法。

背景技术

目前随时生活水平的不断提高，种植牙修复成为缺失牙患者的首选治疗方案，但种植牙修复成功的关键是缺失牙局部要有足够的牙槽骨存量或者是足够的牙槽骨增量，然而临床上由于年龄、体质、炎症、外伤、废用性萎缩、颌骨肿瘤术后、先天缺牙等多种因素，存在大量由于种植区可用骨高度或宽度不足，而导致无法常规种植修复的病例。

国际上在八十年代初，首次提出引导组织再生(Guided Tissue Regeneration,GTR)这一科学概念，随后根据GTR的推论，骨组织的隔离膜引导再生技术被定义为引导骨再生(Guided Bone Regeneration GBR)技术，它的核心基理是，不同细胞的特性、生长速度和迁移速率不尽相同，且有的差异很大；如通常骨细胞生长缓慢，而牙周软组织中的成纤维细胞生长快，导致成纤维细胞的迁移速率远远大于骨细胞；因此在骨修复过程中，若没有将这两类细胞有效隔离，就很容易出现成骨类细胞与成纤维细胞，在空间位置上的侵占，以及对营养物质利用上的争夺，进而出现竞争性抑制现象；即谁生长快，谁就有更多先天优势，包括能挤占更多的物理空间和利用更多营养物质，导致骨细胞没有足够自由的空间和有效充足的营养来保持骨组织的正常生长。

种植牙时要先拔牙，会形成牙窝；这时牙龈上皮组织中的成纤维成长快，而牙槽骨或牙周膜细胞中的骨细胞生成非常缓慢；若无生物屏障膜的保护，纤维结缔组织就会直接优先占领骨缺损的部位，致使骨组织没有空间再生，而生物屏障膜的主要作用，就是在成骨的过程中,阻挡软组织的侵扰。此时若不能有效且持久地将两者进行隔离屏蔽，就会直接影响新的牙骨质和牙周膜纤维的形成，进而影响牙周组织的再生；利用生物隔离膜将牙龈中的成纤维细胞，隔离在骨缺损区外，成骨细胞在不受干扰的情况下，完成骨缺损区域的成骨修复。其原理就是由于不同细胞的迁移速率不同，纤维结缔组织细胞的迁移速率远远大于骨细胞。

实际上GBR技术的关键，就是应用一张生物膜材料，在牙槽骨缺损的表面，建立并维持一个局部封闭的空间，以阻断外周牙龈纤维结缔组织的长入，使骨细胞骨组织，能充分调动组织自身的愈合能力，在这个封闭空间里，在没有外界不良干扰的情况下，完成高质量的骨再生与骨重塑改建的过程，以达到较完美的骨性愈合，能承受正常或更强的牙科咬力。

根据引导骨再生膜（简称GBR膜）是否可降解的特性，将临床治疗用GBR膜可分为，不可生物降解膜和可生物降解膜。早期用于引导骨再生的第一代再生膜是以聚四氟乙烯（e-PTFE）类为代表的不可降解膜，其有较高的机械强度和足够强且很持久的空间维持能力，但类膜由于不能被组织吸收，放置一段时间（如6周后）需要二次手术取出，增加了创伤的机会，再次手术可能对组织造成损伤，且对新附着的细胞和组织产生破坏作用，并且，这类膜也缺乏抗菌能力常容易出现口腔感染等并发症发生，或导致牙骨修复再生失败。

生物可降解膜是目前GBR膜研究较多的，该类膜生物相容性好，分解代谢产物无毒，易于成型和加工，有一定的强度以维持组织增生所需的空间，在组织再生后，膜完全降解或被组织吸收，是很具有应用前景的一类膜。生物可降解膜分为合成生物膜（也称人工合成高分子膜）膜和天然生物膜（天然高分子膜）。合成类生物膜，如聚己内酯、聚乳酸类等代表的人工合成高分子膜，具有较好的力学性能，但其亲水性不理想，生物相容性有限；专利申请号201010105573.2和201310586143.0均以聚乳酸类膜制备引导组织再生膜；但由于聚乳酸水解酯键断裂后使羧基显露增加导致局部pH值下降，易导致患者出现无菌性炎症反应或。

天然生物膜又分为胶原类膜和非胶原类膜；天然非胶原类膜，如壳聚糖类(CS)等；天然胶原膜，按国家药监局综合司药监综械注〔2019〕23 号文件可以分为若干子类；胶原膜是天然生物膜，其具有抗原性低、生物相容性好，且有凝血作用，可参与组织愈合过程等优点，是目前国内外使用最多的GBR膜，如已经在中国上市的瑞士Bio-Gide胶原膜、山东海奥口腔修复膜、福建博特医用胶原膜等。Bio-Gide胶原膜是临床上最广泛使用的可生物降解膜之一，具有双层结构，一层排列致密，具有良好的细胞阻隔作用，一层疏松多孔，利于成骨细胞粘附。然而Bio-Gide仍然存在，例如降解速度过快、抗菌性能较差和机械性能薄弱等缺点。

关于胶原膜的其他技术资料，可参考杂志《Polymers》2016发表的文章“Biodegradable Polymer Membranes Applied in Guided Bone/Tissue Regeneration:A Review”其中表2，其详细介绍了常见的两类可吸收胶原膜（非交联和交联膜）。

非交联胶原膜有CollaTape/CollaPlug/CollaCote (Integra LifeSciencesCorp., Plainsboro, NJ, USA)；Periogen (Collagen Corporation, Palo Alto, CA,USA)；Bio-Gide (Geistlich, Wolhusen, Switzerland，Type I and III Porcine skin2-4 weeks)，Tutodent (Tutogen Medical GmbH,Neunkirchen, Germany)，这些非交联胶原膜的吸收时间，少的只有10—14天，多的也仅有8—16周，即4个月左右。

而交联胶原膜（Cross-linked collagen membrane），其吸收时间，最短的也可达到2个月（8周），最长的可以达到9个月（38周）之久；市场上的产品有OsseoGuard ，OsseoGuard Flex ，BioMend ，BioMendExtend (Zimmer Biomet, Inc.,Carlsbad, CA,USA)，Ossix Plus(Datum Dental Ltd., Lod, Israel) ；RCM6 (ACE Surgical SupplyCo. Inc.,Brockton, MA, USA)，Mem-Lok (BioHorizons IPH, Inc.,Birmingham,England)，Neomem (Citagenix Inc.,Montreal, QC, Canada)；OssGuide (Bioland,Cheongju, Korea)。另外薛媛发表在杂志《生物医学工程与临床》 2016 年 1 月第 20 卷第 1 期的文章“口腔修复膜的研究进展及其应用“，其中表1里也介绍了各类口腔修复膜的特点，包括交联的胶原料类膜。

GBR技术的核心是生物隔离膜，要能对牙龈软组织中成纤维细胞的侵入生长起到长期有效的阻挡，因此较为理想的GBR膜，除了应具备良好的生物相容性，安全性好，没有毒副作用，无化学试剂残留、具有良好贴合性、临床上易操作性，更重要的因素是要能起到持久有效的隔离屏障功能、即慢降解、缓吸收，以有效匹配骨细胞生长慢、骨组织难愈合的特点。

目前临床广泛应用的非交联胶原GBR膜，均存在以下缺陷，在体内降解速度快，不能起到持久有效地隔离与屏障作用，直接影响骨组织再生速度和骨愈合质量。为了延缓胶原GBR膜的吸收与降解，有的通过不同的交联技术及加工工艺，以求放缓这类GBR膜的降解速度，例如福建博特公司的医用胶原修复膜就是使用醛类交联剂对源自牛腱的胶原蛋白交联加工而成的。

专利CN201710126662.7和N201710124188.4均采用戊二醛为交联剂以到达提高机械性能和降低降解速度的效果，但交联剂的引入，特别是醛类交联剂的引入，有可能会对人体产生潜在的毒副作用。

专利201811251660.1一种表没食子儿茶素没食子酸酯交联的小肠粘膜下层引导骨再生膜的制备方法，公开了一种表没食子儿茶素没食子酸酯交联的小肠粘膜下层膜，其交联指数为15.76％ 21.44％，该膜具有良好的力学性能，且降解缓慢，能维持骨组织再生处的空间结构，同时具有良好的生物相容性和成骨效果，克服了现有小肠粘膜下层膜作为引导骨再生膜存在的机械性能差、降解速度快和空间维持能力差等缺点。但是交联则涉及到交联剂的来源，交联剂的质量，交联剂的使用浓度，作用时间长短、交联度控制和残留的交联剂清除等多种技术工艺步骤和参数，较为复杂，技术尚不成熟，实用性并不强，还需要反复地不断地摸索。

其他与本发明相关的专利文献还有，如专利CN109260518A名称为一种口腔缺损修复膜及其制备方法，其公开了口腔缺损修复膜及其制备方法，包括：(1)取猪小肠空肠段，清洗，径向切开，去除粘膜层、肌膜层、浆膜层，获得猪小肠粘膜下层组织膜；(2)将步骤(1)所得猪小肠粘膜下层组织膜置于过氧乙酸溶液或者氢氧化钠溶液中浸泡，取出清洗，获得猪小肠粘膜下层组织脱细胞基质；(3)用多巴胺溶液浸泡步骤(2)所得猪小肠粘膜下层组织脱细胞基质，灭菌，获得脱细胞基质材料，该发明能够避免猪小肠粘膜下层组织膜中的细胞生长因子的损失，确保所得脱细胞基质材料具有较好组织微孔结构和机械性能，能够满足口腔骨损伤修复的需求；免疫原性低、安全性好。另外其他还有通过自蒸发、浸渍-沉淀、静电纺丝以及溶剂浇铸等技术对天然胶原GBR膜进行改良、改进或修饰，虽然有所改进，但总体而言，这类非交联天然胶原膜的降解速度虽有有所放缓，但仍都存在耐酶解能力差，在体内稳定性欠佳，，其隔离屏障作用仍不持久，难以满足临床上对GBR膜高质量的实际需求。

从创新角度来看，市场上仍需要研发一种不用交联剂或者也不需要额外交联处理，但能达到降解缓慢，隔离效果更持久的天然GBR膜，即需要天然GBR膜的降解周期应当与骨再生的时间相匹配相协调，最优态是GBR屏障膜的完全降解，稍晚于骨再生组织基本框架的形成；这类GBR膜既不能过早过快地降解，但也不能不降解，这才能更好地满足临床上，对高质量GBR膜的迫切需求。同时理想的天然GBR膜，在能成功持久地阻止非成骨细胞（软组织成纤维细胞）对骨细胞再生过程的干扰之外，还应该能有效地促进骨缺损区域成骨类细胞（包括牙髓干细胞等）的粘附与增殖，促进相关骨组织的再生。

发明内容

鉴于现有引导骨再生复合膜存在的缺陷和不足，本发明的第一目的是，提供一种没有使用任何化学交联剂，也没有采用物理交联方法处理，但具有良好的耐酶降解性能，能够起到持久隔离屏障作用的更稳定的天然GBR胶原膜；这类天然生物膜，要具有良好的生物相容性、可降解可吸收，无化学试剂残留，更重要的是，要能克服现有天然GBR胶原膜，稳定性欠佳，降解较快，隔离屏障作用不持久的缺陷；能更长久地阻止牙龈软组织进入牙骨生长区，为牙骨缺损区域的新骨生长预留充足的再生空间，并引导成骨类细胞在骨缺损区生长成新骨，进而达到骨性愈合的目的。

本发明的第二目的是，除了提供更稳定的天然GBR胶原膜，同时提供一种能够更早、更好地诱导骨细胞生长和骨组织再生，促进牙功能更早全面康复的GBR胶原膜。

为了达到本发明的这二个目的，发明人着重深入研究GBR胶原膜的稳定性、耐酶解性和细胞诱导亲和性这三个技术概念的内涵和外延，紧紧围绕这些特定技术特点，通过大量文献阅读，结合自身对相关学术理论的仔细分析，以及多年丰富的工作经验，将丰富理论与多年实践密切结合，巧妙且方便、合理地解决了常见GBR胶原膜易降解，隔离效果不持久、不能高质量地引导骨再生的技术难题。

现有动物源性GBR胶原膜都是取自新鲜的来自商业化屠宰场的动物，经去细胞工艺，或者是酸碱等方法提纯胶原蛋白等步骤加工而成；其所使用的新鲜屠宰动物组织，都是已达到出栏重的商品化肉猪、肉羊、肉牛；例如屠宰场里待宰的肉猪，绝大多数都是刚出栏的商品化肉猪，品种以三元杂交品种为主；出栏肉猪体重在90—120公斤；饲养日龄为150—180天；肉羊或肉毛兼用型品种的出栏体重，则因品种不同而有较大的差异。

发明人解决GBR胶原膜易降解的技术问题，发明人采用了与现有技术完全不同的技术思路，既不是停留在胶原膜多几层的简单叠加，如美国COOK公司的产品DynamatrixPlus只是比Dynamatrix,口腔修复膜多四层，Dynamatrix已在中国注册，国食药监械(进)字2019 第3171771号；前者（Plus）是8层SIS膜，后者只是4层SIS膜；同时发明人也没有额外采用物理方法或化学方法进行交联，这样避免了交联剂的品种选择、配比、浓度改进，交联时间长短控制以及残留交联剂的清除等复杂繁琐的方法；同时也没有采取其他加工方法，如静电纺丝等来提高膜的性能。

发明人从制备去细胞GBR膜的第一步，即原料的源头抓起，从最初动物及相关组织部位的选择出发，以此为技术突破点或着力点来进行深入研究。

本发明产品的第一创新点，就在于去细胞GBR膜中A层，A层是与直接口腔牙周软组织直接接触的一层；其动物组织原料的选择，不是现在大家使用的商品级肉畜，而是选用种畜，优选经产母畜，特别优选的是因繁殖性能有所下降而健康淘汰母猪和种公猪；发明人在深入养猪第一线，在与大型养猪场负责人充分沟通后，根据其讲述的养殖模式（通常都是自繁自养）和养殖周期（肉猪5--6个月出栏，体重约90—110公斤；而能繁母猪通常在产八胎仔猪后，会因繁殖性能下降，无论是产仔数，还是产仔猪的质量，以及断奶窝重，都一胎不如一台，且越来越差，这类母猪渐渐会被淘汰，此时饲养已有约36--40（三年）个多月；发明人通过分析比较检测，源自经产母猪和商品肉猪所制备的同类组织的两种去细胞膜，这两类膜的耐酶降解性能之间的差异，发现用经产母猪源去细胞膜，其耐酶降解性能（即稳定性）要比商品肉猪源去细胞膜要强许多，即稳定性更好。例如去细胞的真皮、腹膜和SIS膜，种猪源的膜都要比商品肉猪源的膜，其耐酶降解性能都要好得多，韧性也好很多，不易降解，其稳定性更好。

本发明产品的第二创新点，就在于去细胞GBR膜中B层，B层是与牙槽骨缺损处直接接触的一层；其动物组织原料的选择，不是常规的来自屠宰场的商品级肉畜，而是直接在养殖场里选用幼畜，如选择新生犊牛（出生体重30--40公斤），断奶后已饲养2-6周的保育仔猪，此时保育仔猪日龄通常为40—70天，体重约20--30公斤左右，此时生长速度快，消化吸收能力强、可塑性大、饲料利用率高；这提示幼畜组织的细胞生长因子和生物活性成份（如HA）相对含量（按干物质百分比计算），要比已达出栏重的商品肉畜或高许多；同时幼畜其组织再生能力强，损伤愈合时间短，创面愈合率高，这也可以充分佐证幼龄动物组织中的细胞生长因子和生物活性成份含量高或活性强；最优选的去细胞幼畜组织为，断奶仔猪的腿骨膜(periosteum)，骨膜是骨祖细胞和局部成骨相关生物因子的重要来源，也是吸引与募集成骨类细胞和相关生物因子的天然活性支架；由于骨膜与成骨作用之间存在十分密切的联系，因此将幼畜骨膜，通过使用温柔地试剂，像植物非离子表面活性剂（如天然皂素）温柔地方法去细胞，将此类原料采用去细胞方法所制备的引导骨再生膜，与待再生骨组织，具有天然的同源位点优势，具有高度的进化遗传同源性，同源性能显著提高组织可转化性；并且在骨膜的微观、超微观结构、组织层次分布、ECM孔径大小，以及主要结构成分的组成和比例等多方面，都与待再生骨组织是极其相似的，其他可制备A层的去细胞幼畜幼嫩组织，还有幼畜、幼畜小肠粘膜下层（SIS）、幼畜膀胱、胃粘膜下层、真皮、心包膜、脑膜、腹膜、筋膜及实质脏器膜中的一种或多种组合，这类去细胞能够保留较完整的ECM立体结构和ECM中较多的有效活性成分（如HA），这类嫩组织非常敏感，对去细胞试剂的要求很高，不仅要考虑试剂类型，工作浓度，作用时的温度，处理的时间长短；总之条件要温和，方法要恰当，才能获得较完好的天然立体三维结构和保留更多的活性成份。

发明原理：

本发明的GBR膜A层，其原料来源是种畜，如已产过几胎的母猪，饲养时长通常超过24个月；正常母猪每年产2--2.3胎，母猪妊娠期平均是114天,空怀期为10--15天,哺乳天数为21—28天；淘汰母猪主要是因为繁殖性能下降，如产仔数少，产弱仔多，难配种或者奶水少，断奶窝重轻等因素，通常淘汰母猪，其饲养月龄达到40个月以上；相对于商品肉猪而言，经产母猪各方面的组织和器官发育都很完全，在亚器官水平和结构、介观和微观性能、组织学强度等指标上实现了真正意义上，充分且全面地成熟；进一步从分子水平和分子结构上来讲，可能胶原蛋白羟基化程度高，三螺旋结构稳定性更好，胶原间天然交联度高，稳定性较好，耐酶降解能力强，同时也具有更好的韧性；

而现在膜原料的来源都是，商品肉畜如肉猪，其通常饲养周期短，只有5-6个月时间，其出栏体重90—120公斤，相对于经产母猪（包括淘汰母猪180--200公斤）的体重和大小而言，商品肉猪的体重是明显偏轻的，其体积是偏小的；而且商品肉猪在屠宰出栏时，其饲养时长只有5--6个月，而经产母猪的饲养时长达至少在12个月以上（按只生了一胎仔窝计算），淘汰母猪则会达到40个月；饲养时长是出栏重商品肉猪（体重90—120公斤）的2到8倍；同时商品肉猪的各组织器官，相对经产母猪而言，只是表面初具规模，框架结构成形，但实际上其内部结构、微观性能、组织学强度等指标，并没有真正彻底地充分且全面地成熟，进一步从分子水平和分子结构上来讲，可能胶原蛋白羟基化程度低，三螺旋结构稳定性差，胶原间天然交联度低，不能有效抵抗（胶原）酶的降解；稳定性也相对较差。

本发明的GBR膜B层原料来源是幼畜，主要原因有以下三点：

一：幼畜组织生长速度特别快，其各组织的生长速度正处于一生中的旺盛阶段；这提示幼畜组织的细胞生长因子和生物活性成份（如HA和FN）相对含量（按干物质百分比计算），要比已达出栏重的商品肉畜或已初步发育好的肉畜高许多；幼畜其组织再生能力强，损伤愈合时间短，创面愈合率高，这也可以充分佐证幼龄动物组织中的细胞生长因子和生物活性成份含量高或活性强；

二：幼畜组织及其制备的生物材料，因其先天固有的结构特性（如天然的交联程度低，结构疏松）和发育特点，相对要比已达到出栏重的肉畜组织源其生物材料，其结构相对疏松，幼嫩，从而更有利于宿主成纤维细胞的浸入、生长和繁殖；更容易被降解与吸收，更有利于创面组织中新生血管的形成和肉芽组织的生成；

三：优选幼畜骨膜作为B层原料，骨膜是由微血管化的致密结缔组织组成的，它通过夏贝氏纤维(Sharpey’sfibers)紧紧地覆盖在皮质骨外表面，形成一层薄而坚韧的膜。骨膜是高度血管化的组织，其中含有成骨和成软骨祖细胞以及其他相关的生物活性因子，而被描述成血管化较好的“骨/软骨器官”，它为骨提供血液循环，被认为是骨的“脐带”，骨膜剥落通常会破坏骨的动脉营养供应。从组织结构上讲，骨膜被分成不同的两层:由成纤维细胞和夏贝氏纤维组成的外层纤维层，以及含有多能间充质干细胞和骨母细胞的内层生发层，这些细胞有助于正常骨的生长、愈合和再生。

这个灵感是来自，发明人对幼龄动物组织生长速度特别快，这一特点或优越性能的充分认识；在幼龄阶段，其各组织的生长速度正处于一生中的旺盛阶段；这一公认的事实，足以直接提醒我们在幼龄动物的各组织中，其细胞生长因子和生物活性成份（（如透明质酸HA和纤连蛋白FN）相对含量（按干物质百分比计算）或有效活性，明显比已达到成年的或者是已初步发育好的相应动物组织高许多，多一倍或数倍，且的确已有国外相关文献报道（Breen,M.,Weinstein, H.G.,Blacik, L.J.,Borcherding, M.S., and Sittig, R.A.Microanaly and characterization of glycosaminoglycans from human tissue viazone electrophore. In Whistler, R.L., and BeMiller, J.N.,eds. Methods inCarbohydrate Chemistry, Vol 7. New York: Academic Press,pp.101-115）。幼畜其组织再生能力强，损伤愈合时间短，创面愈合率高，这也可以充分佐证幼龄动物组织中的细胞生长因子和生物活性成份含量高或活性强。

优选幼畜组织骨膜和幼畜小肠粘膜下层作为，制备去细胞GBR膜中B层，其优势体现还有以下几点：

一：这类幼畜组织中含有丰富的胶原蛋白，透明质酸；这对新血管和基膜的形成具有明显的促进作用；无论是什么原因造成的伤口或破损，都能够更好地促进受损处的组织修复；幼畜组织再生能力强，含有更高含量的生物活性成份和细胞生长因子，如透明质酸HA（按干物质计算）；更有利于组织的快速再生和创面的迅速愈合；暴露在外的组织损伤，若不能及时愈合创面，则更易发生感染和炎症，进而更加难以愈合和功能的全面恢复。

二：因为新生幼畜有一种现象fetal maternal microchimerism，即母畜怀孕时，通过胎盘，母亲的细胞向胎儿转移，胎儿的细胞向母体转移的现象。现有研究表明这种现象有助于创面的愈合。详见Dany Nassar, Kiarash Khosrotehrani and Selim Aractingi2012年发表的文章《Fetal microchimerism in skin wound healing》以及，其他人2014年发表的文章《Microchimeric fetal cells play a role in maternal wound healingafter pregnancy》。新生幼畜体内组织中，含有母畜产生的外泌体(Exosome)一种由细胞（免疫细胞、神经细胞、干细胞）分泌而来的微小囊泡；母畜通过血液、唾液、母乳等体液中，将外泌体传至新生幼畜体内，外泌体内含有与细胞来源相关的蛋白质rRNA和microRNA，外泌体可通过细胞膜受体，直接激活受体细胞，也可运输蛋白质、mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA，甚至细胞器进入受体细胞，参与细胞间通讯。外泌体在免疫应答、炎症反应、血管生成、凋亡、凝血等生理过程发挥关键作用，不同细胞来源的exosome所含有的RNA和蛋白成分不尽相同。

三：小肠粘膜下层（SIS）的成份构成，以I型纤维胶原蛋白为主，同时还含有III、IV、VI型胶原蛋白，特别是其中含有重要的IV型胶原蛋白，对新血管和基膜的形成具有明显的促进作用；同时依据美国STEPHEN F. BADYLAK的多篇文章表明SIS补片的降解产物具有较强的抗菌活性，有类似于猪防御素（porcine defensin, pBD-1）的功能；以及GeorgeS.Hussey 2018年的文章《Extracellular Matrix Bioscaffolds for BuildingGastrointestinal Tissue》报道SIS补片降解产物还具有诱导细胞趋化和有丝分裂的作用。

另外，在本发明中，去细胞试剂之所以选用植物源皂素，主要是因为这是一类天然的非离子型表面活性剂，其去细胞的方式针对性强，主要是通过破坏脂质细胞膜和细胞器膜，正因为作用方式针对性强，对其他成份几无破坏，不会影响功能蛋白的活性发挥和结构蛋白的稳定性，对ECM结构无损伤无破坏；这对组织的良好修复非常关键；而原料在采用植物皂素去细胞后，所留下来的ECM立体结构，正好可以成为组织修复所期盼的支架；同时采用温和的植物源皂素去细胞，不会引起ECM中有效成份（如透明质酸HA等）和细胞生长因子（如成纤维细胞生长因子FGF）等的流失和破坏；相比于其他化工类或半合成类去污剂而言，同样都能达到有效地去净细胞及细胞残留物的效果，但植物源皂素作用方式独特且温和，使用这类植物源皂素去细胞，能保存较完好ECM空间立体结构和保留更多ECM中的有效成份，例如透明质酸；采用本发明方法中的去细胞试剂，要明显与化工类去污剂去细胞，能保留更多的细胞生长因子和生物活性成份，含量更高，活性更强。

本发明的方法中，去细胞试剂选用植物源非离子型表面活性剂，优选植物源皂素，这类试剂去细胞的方式针对性强，主要是通过破坏脂质细胞膜和细胞器膜，作用方式针对性强，对ECM结构无损伤，不会引起ECM中有效成份（如糖胺聚糖）的流失；相比于其他化工类或半合成类去污剂而言，都是去细胞效果彻底，但植物源皂素作用方式独特且温和，使用这类植物源皂素去细胞，能保留更多ECM中有效成份；如采用本发明方法制备的生物膜，与化工类去污剂去细胞制备的生物膜相比，其生物膜中糖胺聚糖（GAGs）含量要明显高；糖胺聚糖(Glycosaminoglycans，GAGs)的糖链结构具有很高的复杂性和时空特异性，是糖链合成相关酶在不同细胞组织和器官的不同发育阶段不同的表达调控方式和水平所致，糖胺聚糖结构的复杂性赋予其功能的多样性和适应性。

与现有技术相比，本发明具有以下显著优点和有益效果：

1.本发明的引导骨再生膜中A层，其为去细胞的种畜组织，而不是源自商品肉畜，具有更好的天然交联度，但这类种畜ECM，其耐酶降解能力较强或很强，能防止在体内过早过快地降解；GBR膜中A层所起到的隔离屏障作用更加持久，有利于骨组织的再生和愈合；

2.本发明的引导骨再生膜中A层，能防止周围组织中的成纤维细胞侵入骨损伤部位和骨移植材料脱出，同时A层膜能双向进出，方便地通过氨基酸、钙磷离子、氧气等各类营养成份，可以为成骨细胞、间充质干细胞重建骨组织提供较理想的生长微环境，促进骨组织再生；

3.本发明的引导骨再生膜中其B层，其为去细胞的幼畜源膜，含有更高含量的透明质酸HA和细胞生长因子，能明显促进凝血、促进创面组织和成骨类相关细胞的再生；

4.本发明的引导骨再生膜中的B层，其为去细胞的幼畜骨膜，SIS等天然生物膜，相对质地较为疏松多孔，各类细胞容易长入，也相对较容易降解，这也就叫意味着更容易吸收和有效利用；

5.本发明的技术方案，没有使用蛋白消化酶及化工去污剂，使用温和的植物皂素去细胞，不会对ECM中胶原蛋白结构和生物活性因子产生明显损伤和破坏，能够保留较完整的细胞外基质三维立体结构；特别是B层具有更好的诱导细胞和促进血管长入功能，在新组织长入的同时，B层膜自身随之降解并被吸收；

6. 本发明的技术方案，采用植物皂素作为去细胞试剂，不使用合成类试剂去细胞，无化学残留，安全无副作用；

7.本发明的引导骨再生GBR膜，没有使用任何的交联剂和合成类去污剂残留，不会有潜在细胞毒性，不会导致纤维化、慢性炎症；

8.本发明的引导骨再生膜中的B层，具有良好的生物相容性，不仅能促进细胞的粘附、增殖与成骨分化，在异种植入时，也并不会引发明显的免疫炎性反应；可以在口腔引导骨再生技术中，发挥有效的促进成骨的作用；

9. 本发明的引导骨再生膜中的A层和B层，都可完全降解吸收，A层降解很缓慢，能很好地起到屏障隔离作用，更有效地阻止非成骨细胞（软组织成纤维细胞）对骨细胞再生过程的干扰；保证较难生长的成骨类细胞（包括牙髓干细胞等），能在屏障膜的保护下安心地高质量地慢慢生长，以充分保障再生骨的坚固性和稳定性。B层降解较快，能第一时间就促进血管化、以及成骨类细胞的生长，有助于骨组织的再生。

为了实现前述的二个发明目的，提供一种更稳定、同时也具有更好诱导骨再生能力的GBR膜。

本发明具体是通过以下技术方案来实现的；先分别制备A层和B层，所述A和B层都是对新鲜动物源组织，先进行预处理、然后采用包括脱细胞等在内的去抗原工艺处理加工，然后将制备的A和B层，按需要层数进行复合，再干燥、灭菌、包装而成。

其中制备A层，其去细胞的动物组织原料，是源自成年种畜，而不是源自已达到出栏重的商品肉畜。

进一步的，所述成年种畜包括种猪、种牛、种羊、种马、种驴、种骆驼、种犬、种兔等。

1.进一步的，优选成年种畜为经产的母猪、母牛、母羊、母马、母驴、母驼、母犬、母兔等。

进一步的，优选成年种畜为因繁殖性能下降而被淘汰的母猪、母牛、母羊、母马等。

进一步的，所述去细胞引导骨再生膜的原料，包括骨膜、腹膜、真皮、小肠粘膜下层、胃粘膜下层、心包膜、脑膜、羊膜、脏器膜中的一种或多种原料的组合。

进一步的，优选的动物组织原料为淘汰母猪的骨膜、腹膜、真皮或小肠粘膜下层中的一种或多种原料的组合。

进一步的，所述A层膜是经清洗、去杂、消毒、去脂、去细胞、去DNA、以及还可以定型、干燥等步骤加工而成。

另外，制备B层，其去细胞的动物组织原料，是源自幼畜，而不是源自已达到出栏重的商品肉畜。

进一步的，所述幼畜包括小猪、小牛、小羊、小马、小驴、小骆驼、小犬、小兔等。

进一步的，优选幼畜为断奶后继续饲养2--8周的保育猪、牛、羊、马等，更优选体重20—25公斤左右保育猪。

进一步的，所述去细胞的原料包括骨膜、小肠粘膜下层、膀胱粘膜下层、胃粘膜下层、真皮基质、心包膜、脑膜、羊膜、脏器膜、腹膜的一种或多种原料的组合。

进一步的，优选的动物组织原料为保育猪的小腿骨膜、保育猪的小肠粘膜下层。

进一步的，所述A层膜是经清洗、消毒、脱脂、去细胞、去DNA，以及进一步定型、干燥、灭菌等步骤加工而成。

最后将已制备好的A和B层，按实际各自需要的层数进行复合，再进行干燥、灭菌、包装而成。

本发明的引导骨再生膜的详细制备方法进一步还包括如下步骤：

1)取材和预处理，取相应动物的结缔组织，充分洗净；机械刮除其中非结缔组织，并扔弃；将靶组织冲洗干净，置于弱酸溶液中浸泡，得到预处理待用膜原料；

2)预消毒：用含过氧乙酸和乙醇的混合溶液，在超声及室温条件下，浸泡膜原料，进行消毒；再用纯化水超声清洗；

3) 去脂：使用乙醇溶液，在超声、常温条件下浸泡膜原料，之后用注射用水超声清洗；

4) 去细胞：用含胰蛋白酶、含植物源非离子表面活性剂、SDS之一或组合的溶液，在超声下浸泡膜原料；

5)去DNA：含DNA酶的水溶液浸泡膜原料，浸泡温度为36℃，浸泡时间为15--40分钟；清洗后，还可以使用含α-半乳糖苷酶溶液，浸泡膜原料，时间为15--40分钟；

6)进一步，还可以使用弱碱水溶液，常温超声条件下，浸泡膜原料；再用PBS清洗直至中性；待进一步加工处理。

进一步具体操作方法是：

1.取材和预处理：分别取种畜的腹膜或真皮（制备A层用）或幼畜的骨膜、小肠粘膜下层（制备B层用），充分洗净；机械刮除除去非需要的组织，主要留下胶原结缔组织，置于醋酸溶液中浸泡，浸泡时间30--120分钟，小肠粘膜下层与醋酸溶液的比例为1:5--1:10；得到预处理待用膜原料；

2.预消毒：用含有过氧乙酸和乙醇的混合溶液，在超声及室温条件下，浸泡A层或B层膜原料，进行消毒；过氧乙酸浓度为0.5-1.5％，乙醇浓度为15-25％，A层或B层膜原料与混合水溶液的比例为1:5--1：10，浸泡时间为30--120分钟；再用纯化水超声清洗；

3.去脂：使用乙醇溶液，在超声、常温条件下浸泡A层或B层膜原料，乙醇浓度为90-100%，A层或B层膜原料与乙醇比例为1:5--1:10，常温浸泡时间为0.5--6h；之后使用注射用水超声清洗；

4.去细胞：使用含植物源皂素溶液，在4-15℃和超声下浸泡A层或B层膜原料10—60分钟；A层或B层膜原料与溶液的比例为1:10（W/V）；之后用同浓度新鲜皂素溶液对A层或B层膜原料浸泡5--60分钟；接着用PBS-EDTA进行浸泡10--60分钟；重复去细胞1-5次；

5.去DNA：含DNA酶的水溶液浸泡A层或B层膜原料，浸泡温度为36℃，浸泡时间为15--40分钟；还可以选择，在清洗后再用含α-半乳糖苷酶的水溶液，浸泡A层或B层膜原料，浸泡时间为15--40分钟；

6.使用10mM NaOH水溶液，常温、超声条件下，浸泡A层或B层膜原料；再用PBS超声清洗直至中性。

进一步的，在去细胞工艺（步骤4）中，优选以下技术参数：

皂素溶液中有效皂素的含量为0.05---1%（W/W），A层或B层膜原料与植物源皂素溶液的比例为1:5---1:10，在超声条件下，于低温4—10℃条件下浸泡20--60分钟；然后用同浓度的新鲜皂素溶液对再A层或B层膜原料浸泡5--45分钟；接着用PBS-EDTA进行浸泡10--45分钟；重复去细胞1次；

进一步的，在去细胞工艺（步骤4）中，更优选，以下技术参数：皂素溶液中有效皂素的含量为0.25--0.5%（W/W），A层或B层膜原料与植物源皂素溶液的比例为1:10-15，在超声条件下，于低温4℃条件下浸泡20--40分钟；

进一步的，植物源表面活性剂是指植物源三萜烯皂素、类固醇皂素之一或其组合物；

进一步的，植物源三萜烯皂素是Quil-A来源、茶皂素之一或其组合物；

最后一步，将1、2、3、4、5、6、7、8层的半成品A与1、2、3、4、5、6、7、8层的半成品B，按所需层数和大小，如将3层A与4层B重叠组合，按大小进行裁切加工，接着固定于模具上，再干燥、包装、辐照灭菌，可得成品，引导骨再生GBR膜。

中英文术语/名词

在本专利中所涉及的中英文名词术语中，除非已经在公知常识中，得到大家普通认可、毫无异议、已完全达成高度共认的内容之外，术语及其衍生物的含义内容，首选按下列文字说明来理解和解释，并可作适当扩张性解释与说明除非另有详细说明，其他名词术语按本领域普通技术人员水平来理解其含义。

特别注明，自定义术语A层和B层。

A层:在本专利中指的是，引导骨再生复合GBR膜中，朝向牙周软组织或牙龈组织,与牙周软组织(Schneiderian membrane)接触的一层，其主要作用是起持久隔离与屏障作用，可以双向通过水、氧气、氨基酸等各类营养物质。

B层:在本专利中指的是，引导骨再生复合膜GBR中，与牙槽骨缺损处,直接接触的一层，其主要起诱导血管生成，促进成骨类细胞生长的作用。

第一部位：与口腔相关的名词。

1)牙周膜也称牙周韧带，是位于牙槽骨和牙骨质之间的一种特殊结缔组织，主要联结牙齿和牙槽骨，发挥牙齿支持、营养、感知以及牙周组织修复功能。牙周膜成纤维细胞(periodontal fibroblast cells,PDLFs)是牙周膜组织中最重要的细胞，具有干细胞特性，能够分化为成骨细胞、牙骨质样细胞以及脂肪细胞。PDLFs是最先接受正畸力的细胞，通过一些生物化学信号(细胞因子、前列腺素类及神经递质)诱导PDLFs成骨向分化，协助正畸过程中骨组织的重建，已成为正畸学者所普遍关注的问题。牙周膜中纤维聚合成束，排列成一定方向，称为主纤维束；主纤维束的一端埋入牙骨质中，另一端埋入牙槽骨中，或分布在牙龈中。主纤维束之间的疏松结缔组织是间隙组织，其中有血管、神经、淋巴管。牙周膜的血管丰富，一部分是经牙龈而来，一部分是由牙槽而来，另一部分是由根尖部与牙髓血管同一来源。牙周膜能形成牙槽骨及牙骨质，被破坏后能重建;能支持牙齿抵抗咀嚼力，并能缓冲外来的力量使其不直接作用于牙槽骨；牙周膜还能营养牙骨质和牙槽骨，牙周膜的功能和它的结构有密切关系，一个埋没在颌骨中的牙齿，或长期未用的牙齿，其主纤维束发育不良或消失，牙周膜变薄，常在0.1mm以下。但有功能的牙齿，其主纤维束粗大，牙周膜厚，大约在0.2mm左右。牙周组织对于垂直方向的压力有强大的抵抗能力，但对侧方压力则易受损伤。

2)牙科相关细胞：牙周膜成纤维细胞periodontal ligament fibroblasts(PDLFs)，牙龈角质形成细胞gingival keratinocytes（GKC），牙龈成纤维细胞gingivalfibroblasts（GF）。

3)牙周膜成纤维细胞(又称牙周韧带细胞，PDLFs))是牙周膜中最常见的细胞,大量实验结果显示 ,牙周膜成纤维细胞是一群异质性细胞，体外培养的牙周膜成纤维细胞至少存在2种表型 ,即成纤维细胞表型和成骨细胞表型.成纤维细胞表型细胞具有较强合成胶原的能力 ,成骨细胞表型细胞能发育为成骨细胞或成牙骨质细胞。人们认为牙周膜成纤维细胞能产生造骨细胞样的细胞外基质蛋白,并且比牙龈成纤维细胞产生更高的碱性磷酸酶活性。

第二部位：与引导骨再生膜产品相关的名词和技术名称。

1.组织修复材料、组织再生材料、生物生物膜、生物修生物膜、生物支架、可降解生物膜、可吸收生物膜Bio-Mesh、Bio-Patch、Patch、Bioscaffold，这些个中英文名词或术语，表面上虽有不同，但其目的和用途基本是一样的；除非有特殊的具体说明，否则上述几个名词的内涵，在实质上是等同的。

2. 细胞外基质ECM（Extracellular Matrix）：是存在于所有组织和器官中的非细胞成分，其不仅对细胞组织提供必需的物理支撑，为各种细胞的正常生理活动，提供适宜的场所及微环境；而且对组织的形态发生、细胞的趋化和分化，以及重要的生理生化和生物力学等方面，起到重要的杠杆调节作用，从而影响或调控组织和器官的功能。细胞50%的功能是由细胞外基质所营造的外部微环境所决定的。

3. 组织衍生细胞外基质材料(extracellular matrix，ECM)是由同种异体或异种的组织经过脱细胞技术的处理而获得，其基础与应用研究在组织工程与再生医学的研究领域已逐渐成为研究热点。脱细胞组织的细胞外基质支架材料是在有效去除天然组织中具有免疫原性的细胞成分的基础上，最大限度地保留了其天然发生的内部三维支架结构以及结构中的结构蛋白成分(包括胶原蛋白、弹性蛋白等)、特殊蛋白成分(包括纤连蛋白、层粘连蛋白、原纤蛋白等)、蛋白聚糖成分(包括糖胺多糖、硫酸肝素、软骨素)和各种各样的生长因子成分，这些组织特有的内部结构和天然成分都是人工合成材料所无法完美复制的。

4. 细胞外基质的物质组成：是以结构蛋白，如胶原蛋白（Collagen）、弹性蛋白(elastins)、纤丝蛋白等大分子成份为主要框架结构，并附着了一些功能蛋白如纤连蛋白FN(fibronectins)、层连蛋白LN (laminins)等；同时其中还携带有各类细胞生长因子(如成纤维细胞因子FGF、转化生长因子TGF、血管内皮生长因子VEGF；可能也含有极少量但很重要的表皮生长因子EGF和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)另外细胞外基质中还含有糖胺聚糖（GAGs）类、蛋白聚糖等活性成分。

5. 引导骨再生膜、引导骨再生复合膜、引导骨再生GBR膜、口腔胶原膜、引导骨再生膜、口腔天然生物膜、口腔修复膜，可降解生物膜，可再吸收膜、引导骨再生GBR/GTR膜、口膜（简称），甚至有的骨膜前述这些术语或名词，在本专利中，除非另有详细的说明与解释之外，可以理解为实质相同或等同，其主要成份都是胶原蛋白（大于50%以上），这类产品按药监综械注〔2019〕23 号文件，统一归口称为口腔胶原膜。

6. 口腔胶原膜，根据国家药监局综合司药监综械注〔2019〕23 号文件，由北京大学口腔医学院口腔医疗器械检验中心承担《口腔胶原膜通用技术要求》（项目编号：N2019091-BD）中的分类，这类产品按成分或工艺分为：脱细胞基质膜（ECM膜）和非脱细胞基质膜（非ECM膜），非ECM膜又可分为二类，一类是纯化后的胶原膜（以I型胶原蛋白为主），这多是取自动物的肌腱、真皮、腹膜、小肠粘膜下层等结缔组织，通过特定的处理技术提取出纯I 型和或III型胶原蛋白，再通过冷冻干燥等制成一定结构的膜片；另一个类是非纯化胶原蛋白膜。这些口腔胶原膜，可以复合其他物质，包括不限于，可降解的聚合物或高分子物质，如聚乳酸类、壳聚糖类等，以及采用其他方法制备（如静电纺丝等），并且可以使用其他添加物（添加交联剂，改性剂、保护剂，抗菌剂、无机矿物质等，以赋予或增强口膜材料一定的性能；通常胶原蛋白主要是I型胶原蛋白、III型胶原蛋白或其混合物；胶原蛋白还可以包括一定比例的II型、IV型、VI型或VIII型胶原蛋白或其任何组合或任何胶原蛋白类型。

7. ECM组织原料：包括但不限于来自，如猪、牛、马、羊、驴、驼、犬、兔等养殖的哺乳动物，取其小肠粘膜下层(SIS)、腹膜、心包膜、羊膜、真皮、韧带、肌腱、骨膜、膈肌(胸膈)、网膜、肌肉或器官的筋膜；通过成熟工艺去脂、去抗原、去DNA，所获得的生物材料，主要含有I型胶原蛋白，同时来自部份组织的，ECM也可以含有小于50%弹性蛋白。

8. 小肠粘膜下层SIS（Small Intestinal Submucosa)，小肠组织包括空肠和回肠部分，在除去小肠粘膜层、肌层、浆膜层后所剩余的部分，以胶原蛋白为主要成份，约占80%以上。

9. 骨膜(periosteum)：是紧密附着在骨组织表面的、由致密结缔组织构成的一薄层结缔组织纤维膜，具有丰富的血液供应和神经支配，在骨生长和改建过程中发挥重要的作用。它不仅是骨祖细胞和局部成骨因子的重要来源，而且是募集成骨细胞和相关生物因子的天然生物支架。骨膜是紧密附着在骨组织表面的、由致密结缔组织构成的一薄层结缔组织纤维膜，具有丰富的血液供应和神经支配，在骨生长和改建过程中发挥重要的作用；位点同源生物材料与其他非同源位点生物材料相比，位点同源组织ECM对组织修复再生更具优势，基于以上原理，骨膜ECM比其他来源的引导骨再生膜材料，在促进骨细胞和骨组织再生方面更具优势。

10. 糖胺聚糖GAGs（Glycosaminoglycan）：也称粘多糖，为杂多糖的一种，主要存在于动物结缔组织中，是参与组织及软组织组织等正常生理活动的重要原料；按单糖残基、残基间连键的类型以及硫酸基的数目和位置，糖胺聚糖可分为5个主要类别，透明质酸（HA)、硫酸软骨素(CS)、硫酸皮肤素(DS)、硫酸角质素(KS)、硫酸乙酰肝素和肝素(HP)。

11. 去细胞基质ACTM（Acellular Tissue Matrix）或无细胞组织基质：是指采用特定的试剂和处理方式，将动物器官或组织中的细胞、病毒、DNA等会产生免疫排斥反应的成分充分地去除或灭活，最大限度地保留原有天然立体结构的完整性，以及尽量保留原有基质中的细胞生长因子和活性功能成份；脱细胞基质由于其天然立体三维（3-D）结构、含有生物活性因子、能够被受体降解、易诱导受体干细胞移（易）位分化等特点，被广泛应用于临床中，用于组织的修复和再生（先天缺损和后天创伤）；脱细胞基质是新型的组织再生修复材料，具有良好的生物支架性能。

12. 骨粉:主要成份是源自动物骨加工而成的，羟基磷灰石、β-磷酸三钙、硅酸钙、石墨烯和纳米粘土片中的一种或多种；物理形态可以是粉、颗粒，大小可以调整优化。

13. 牙周组织相关的生长因子主要有血小板衍生生长因子（platelet-derivedgrowthfactor ，PDGF）、碱性成纤维细胞生长因子（basicfibroblastgrowthfactor，bFGF）、釉基质蛋白（enamelmatrixproteins ，EMD ）、BMP 、转化生长因子β（transforminggrowthfactorbeta，TGF-β）等。

第三部位：与动物及动物组织相关的名词和技术名称。

(一)种畜：是针对商品肉畜而言的；饲养的主要目的是用来繁育幼畜的，而不是作为商品肉畜来短期饲养的；饲养商品肉畜主要目的是用于长肉，以供人食用，以提供动物源蛋白质；本专利中的种畜，包括猪、牛、羊、马、驴、驼、犬、兔；所述种畜都是成年的，能繁能育的，通常饲养时间至少一年以上；例如种猪包括母猪和公猪，这里的母猪就是指能繁殖的成年母猪，不包括年轻的后备母猪。

(二)经产母畜：属于种畜的一部分，是至少生过一胎的母畜；是相对于后备母畜而言的，后备母畜主要是指因为年龄或月龄还没有到，还没有怀过孕的的年轻母畜。

(三)淘汰母畜：本属于种畜的一部分；在养殖场里，管理者考虑到，当母畜繁殖性能下降到一定程度，如产仔数少，泌乳量低，断奶窝重轻，以及综合考虑母畜栏的利用率、淘汰母猪的价格等多种因素；从经济学角度来判断分析，认为继续饲养该母畜所获得的价值已显著降低，淘汰这类母畜会更加划算；每个养殖场对淘汰母畜的评判标准存在一定的差异；例如通常母猪在分娩8胎之后会渐渐地被淘汰；不同品种的猪之间略有差异。

(四)幼畜：指通常指包括刚出生，吃奶、断奶、以及未到初情期之前的家畜，幼畜正处于发育阶段，其生长发育十分迅速，从生理机能到体况都与成年家畜有着很大的不同，幼畜包括已经断奶但未尚未发育的家畜，还包括处于吃奶阶段的和刚出生的家畜；不包括已经发育成熟或发育快结束的家畜。

(五)保育猪：是指仔猪断奶后（4周左右断奶）至70日龄左右的仔猪；商品肉猪的饲养分三个阶段，即1、哺乳仔猪（产房内），2、保育猪（保育舍内,断奶到70日龄），3、生长肥育阶段（70日龄到肉猪出栏），通常普通商品肉猪出栏日龄达到160--180日龄，毛重约90--110公斤左右）。

除非上下文有清楚的说明，本说明书和所附权利要求中用到的单数形式“一个”和“该”包括复数含义。因此，例如，“该方法”包括一或多种方法，和/或步骤，它们属于本文所述类型和/或是本领域技术人员阅读了本文后很明显能认识到的。术语“约”或“接近”是指统计学意义上的范围值，范围可以是在一个数量级之内，通常在指定数值或范围的50％以内，进一步指在20％以内，还更通常在10％以内，甚至更通常在5％以内。术语“约”或“接近”所涵盖的能允许的变化取决于研究的具体体系，是本领域技术人员可以很容易地认识到的。

下面结合具体实施例，以进一步描述本发明的原理和方案；应当理解，这些实施例只是为了举例说明和方便理解本发明的思想，但不能局限于此；实施例并非以任何方式来限制本发明范围，以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

具体实施方式

实施例一：A层制备，脱细胞骨膜（淘汰母猪骨膜）

具体步骤如下：

1.取材与预处理：选淘汰母猪，胎龄8胎以上,饲养已超过40个月,体重180公斤左右，空怀；待屠宰后，取前腿(肱骨、桡骨、腓骨)，物理机械去除骨的表皮层、筋膜层后，露出腿骨表面骨膜层，应用手术刀在选定骨膜区域的四周切开骨膜，并应用骨膜剥的镊子小心剥离选区内完整的骨膜组织。将分离出的骨膜，置于1.0%醋酸溶液浸泡30分钟，幼猪骨膜与醋酸溶液的比例为1:10，再使用纯化水浸泡，得到A层膜原料；

2.消毒：使用含有1.0％过氧乙酸和20％乙醇的混合水溶液，A层材料与混合水溶液的比例为1:10，超声条件下，室温浸泡90分钟，进行消毒。之后使用纯化水超声清洗3遍；

3.脱脂：使用浓度为95%乙醇，A层材料与乙醇的比例为1:10，超声条件下，常温浸泡2小时；之后使用去离子清洗3遍；

4.去细胞：使用含0.5%皂素的溶液，在4℃和超声条件下浸泡A层膜原料30分钟；之后用同样浓度0.5%皂素溶液对A层原料进行冲洗15分钟；接着再用PBS-EDTA溶液对生物膜浸泡20分钟；可重复前述去细胞步骤一次；

5.去DNA：使用含5U/mlDNA 酶的水溶液，A层材料与DNA酶溶液的比例为1:8，超声条件下，于37℃条件下浸泡25分钟；之后使用PBS冲洗3遍；使用含5U/ml 的水溶液，A层材料与α-半乳糖苷酶溶液比例为1:8，超声条件下，于30℃条件下浸泡25分钟；之后使用PBS溶液冲洗；

6.使用浓度为15mM 的NaOH溶液浸泡，之后使用PBS清洗直至中性；待后续加工之用。

实施例二：A层制备，脱细胞SIS（淘汰母猪）

步骤基本同实施例一，区别点只在于原料部位的选取，例一是骨膜，本实施例是淘汰母猪的小肠粘膜下层，使用机械刮除法，除去小肠空肠的粘膜层、肌层、浆膜层、淋巴结等，得到B层小肠粘膜下层（SIS）原料。区别点之二：原料预处理时，使用1.8%醋酸浓度代替1.0%醋酸，其余未说明步骤和试剂完全同实施例一。

实施例三：A层制备，脱细胞真皮（淘汰母猪）

步骤基本同实施例二，区别点只在于原料部位的选取，例一是骨膜，本实施例是淘汰母猪的真皮，取腹部中间皮肤，充分清洗，机械去除内表层的脂肪和外表层，用去离子水冲洗干净，用取皮机取0.15mm厚的真皮。

实施例四：B层制备，脱细胞骨膜（保育期仔猪）

步骤基本同实施例一，区别点在于：选取的动物年龄，本实施例为保育期仔猪（日龄为60天，体重约22公斤），而例一为淘汰母猪。

实施例五：B层制备，脱细胞SIS（保育期仔猪）

步骤基本同实施例二，区别点在于：选取的动物年龄，本实施例为保育期仔猪（日龄为60天，体重约22公斤），而例二为淘汰母猪。

实施例六：脱细胞SIS（出栏重的普通商品肉猪）

步骤基本同实施例二和五，区别点只是在，猪的年龄；取材部位都是一样的；例二是淘汰母猪，例五是保育猪，本实施例是普通的出栏商品肉猪（165-170天左右，100公斤毛重）。

实施例七：GBR复合膜的制备（成品生产）

将实施例一、二、三、四和五所制备的去细胞半成品A层膜或B层膜，将1、2、3、4、5、6、7、8层的半成品A与1、2、3、4、5、6、7、8层的半成品B，按所需层数和大小，如将3层A与4层B重叠组合,型号命名为A3B4，按13mm *25mm，25mm*25mm,30mm*40mm,16mm*22mm大小进行裁切加工，接着固定于模具上，再干燥、包装、辐照灭菌，可得本发明的产品成品，即引导骨再生GBR膜。

实施例八：A层的耐酶解性能（稳定性）检测

对实施例1、2、3、6制备得到的A层膜样品或对照组样品进行检测；具体方法和结果如下：

将膜样品在干燥后，裁剪为10毫米×10毫米大小，称重，放在细细的尼龙网中，将其浸泡到5mL I型胶原蛋白酶液(1mg/mL)中，于37℃中水浴锅中，静置6小时、12小时、24小时后取样，冲洗后并冻干测定质量，计算各时间点的残留材料质量比，比较各个膜样品的降解程度；残留膜重量比(％)＝降解后质量/降解前质量×100%。

实施例八：B层中的生物活性因子含量的检测

对实施例4、5、6制备得到的B层膜样品，在干燥后，进行生物活性因子的检测；采用商业化试剂盒对活性成份透明质酸（HA）的含量进行检测；样品预处理方式是采用低温研磨法进行处理，检测结果如下表：

组别	动物及组织来源	透明质酸HA（ug/mg）
			实施例四	B层 保育猪骨膜	2.51
实施例五	B层 保育猪SIS	2.76
			实施例六（对照组）	普通出栏商品肉猪SIS	1.85

本领域中普通技术人员可根据上述说明，对本发明做出多种简单的变化或调整或组合；因而，在不违反本发明的权利要求宗旨的前提下，实施例中的某些细节，不应构成对本发明的限定，本发明将以所附权利要求书界定的范围作为保护范围。

Claims (9)

1.一种引导口腔骨再生的生物膜，其特征在于，所述生物膜中,与口腔牙周软组织接触的一层（A层），为去细胞处理的种畜结缔组织ECM膜。

2.根据权利要求1所述的引导口腔骨再生的生物膜，其特征在于，所述生物膜，与牙槽骨缺损处接触的一层（B层），含有去细胞处理的幼畜结缔组织ECM膜。

3.根据权利要求1中所述的引导口腔骨再生的生物膜，其特征在于，所述种畜为成年公畜和母畜，所述母畜为经产的母猪、母牛、母羊、母马、母驴、母驼、母犬、母兔。

4.根据权利要求1所述的引导口腔骨再生的生物膜，其特征在于，所述种畜，为经产的、健康淘汰母猪。

5.根据权利要求1和2中所述的引导口腔骨再生的生物膜，其特征在于，所述结缔组织，是指骨膜、小肠粘膜下层、腹膜、真皮、心包膜、胃膜、膀胱、肌腱、筋膜中的一种或其组合。

6.根据权利要求2中所述的引导口腔骨再生的生物膜，其特征在于，所述幼畜，为足月的、刚出生的、吃奶阶段的，以及保育阶段的猪、牛、羊、马，骆驼、驴、犬、兔，所述幼畜，为断奶后保育猪。

7.根据权利要求2所述的引导口腔骨再生的生物膜，其特征在于，所述结缔组织，指腿部骨膜、小肠粘膜下层中的一种或其组合。

8.根据权利要求1和2所述的引导口腔骨再生的生物膜，其特征在于，所述去细胞，是采用去细胞试剂进行处理，所述去细胞试剂，由植物源非离子表面活性剂组成，所述植物源非离子表面活性剂，是植物源五环三萜烯皂素、类固醇皂素之一或其组合物，去细胞试剂的有效工作浓度重量比为0.05-1%。

9.一种口腔用引导骨再生膜的制备方法，其特征在于，制备方法中，与骨缺损接触的一层（B层），其原料为幼畜组织ECM膜，与口腔牙周软组织接触的一层（A层），其原料为种畜组织ECM膜，所述A层和B层，都经过以植物源非离子表面活性试剂为主的脱细胞步骤处理。