CN115429939B - 一种产品性能可控的口腔生物膜的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种产品性能可控的口腔生物膜的制备方法，包括如下步骤，去除结缔组织层；精制；去除浆膜层；冻干定型；辐照灭菌等几个步骤。本发明所述的制备方法制备的生物膜，根据临床使用需求，选择厚度不同的生物膜，可以有效控制降解速度，当缺口小、恢复快时，选择薄款口腔胶原膜；当缺口大、恢复慢时，选择复合胶原膜。既起到物理屏障的作用，又能诱导组织再生。

Description

一种产品性能可控的口腔生物膜的制备方法
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，尤其是涉及一种产品性能可控的口腔生物膜的制备方法。
背景技术
口腔胶原膜的工作原理是通过物理屏障隔离快速生长的上皮细胞及结缔组织细胞，使成骨细胞等更好地在缺损区进行增殖，促进牙槽骨骨量及骨质的提升。
目前国内外市场上存在的可吸收口腔膜分为高分子合成膜与天然基质膜，理想的口腔修复膜应该具有良好的生物相容性、屏障性、骨传导性和骨诱导性、易操作性以及可降解性。目前国内外上市的可吸收膜在体内降解速度难以控制，过快降解则导致修复失败；过慢降解，则会产生慢性炎症和“占位”效应。现有材料存在降解不可控的问题，限制了临床使用；如何有效控制产品在体内的降解速度是目前的一大难题。
发明创造内容
有鉴于此，本发明旨在提出一种产品性能可控的口腔生物膜的制备方法，以克服现有技术的不足。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种产品性能可控的口腔生物膜的制备方法，包括如下步骤，
1)去除结缔组织层：将猪心包膜置于至少-80℃的冷冻环境中冷冻10-30min，10-30℃复融1-5min，糙面结缔组织层朝上置于精密剖层机中，去除结缔组织层，剩余0.10-0.15mm的猪心包膜；
2)精制：将步骤1)处理过的猪心包膜置于脱细胞溶液中震荡清洗4-8h，然后用纯化水清洗至无加工助剂的残留，置于纯化水中放置6-24h；此时猪心包膜经过精制过程后，厚度加倍，变为0.2-0.3mm；
3)去除浆膜层：将脱细胞后的猪心包膜置于冻干机中冷冻干燥0.5-2h，得到含水量为50-70％的胶原膜；通过冻干过程，猪心包膜再次变厚，厚度在0.3-0.5mm之间；光滑面浆膜层朝上置于精密剖层机中，去除浆膜层，剩余0.1mm的猪心包膜；
4)冻干定型：将经步骤3)处理的猪心包膜继续冻干，直至含水量小于10％。
5)辐照灭菌：将经以上步骤处理的猪心包膜剪裁后，送至电子束或γ辐照灭菌。
优选的，步骤4)与步骤5)中还包括以下处理，将若干个单层猪心包膜通过组织密封剂复合。
优选的，所述组织密封剂为以下组分中的一种或两种，0.2-0.8％(w/w)Carbopol934、0.5％-3％(w/w)CMC-Na 6000、0.5％-2％(w/w)壳聚糖、10-30％(w/w)PEG 20000。
优选的，步骤1)中的冷冻环境为液氮环境。
优选的，步骤2)中的脱细胞溶液包括如下组分：0.5％-1％(w/v)氢氧化钠、15％-25％(w/v)氯化钠、0.05％-0.1％(w/v)SDS。即100mL脱细胞溶液中，含有0.5-1g氢氧化钠、15-25g氯化钠、0.05-0.1g SDS。
优选的，步骤3)中的冷冻干燥的温度为-40℃--30℃。
优选的，步骤4)中的冻干，升华干燥温度为-30℃--20℃，解析干燥温度为10℃-20℃。
优选的，步骤5)中，电子束或γ辐照灭菌，辐照剂量：15-25kGy。
本发明同时提供一种口腔生物膜，其由上所述的制备方法制备获得。
本发明也提供如上所述的制备方法制备获得口腔生物膜在制备面骨或牙槽骨的缺损、牙周损伤或牙科种植修复相关的骨隙或骨缺损的修复或引导组织的再生的产品中的应用。
相对于现有技术，本发明所述的一种产品性能可控的口腔生物膜的制备方法，具有以下优势：
(1)本发明所述的制备方法制备的生物膜，根据临床使用需求，选择厚度不同的生物膜，可以有效控制降解速度，当缺口小、恢复快时，选择薄款口腔胶原膜；当缺口大、恢复慢时，选择复合胶原膜。既起到物理屏障的作用，又能诱导组织再生。
(2)猪心包膜是由3层结构组成：浆膜层、纤维层、结缔组织层。纤维层主要包括胶原束以及少量弹性纤维和聚糖类等。胶原中又以Ⅰ型胶原占绝大部分，种属间差异小，免疫原性低，具有良好的生物相容性。通过工艺处理，去除浆膜层与结缔组织层，留有中间的纤维层。一方面可以提高其生物相容性，另一方面可以通过多层复合，根据临床需求选择不同厚度的产品。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明实施例1制备的单层口腔生物膜的扫描电镜图；
图2为本发明实施例所述的细胞相容性检测实验，显微镜下细胞生长情况；
图3为本发明实施例所述的细胞增殖检测实验，相对增殖率示意图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例来详细说明本发明创造。
实施例1
单层口腔胶原膜的制备，包括以下步骤：
(1)去除结缔组织层：将猪心包膜置于-80℃冰箱中冷冻20min，室温复融2min，糙面(结缔组织层)朝上置于精密剖层机中，去除结缔组织层，剩余0.10mm的猪心包膜。
(2)精制：将猪心包膜置于脱细胞溶液中震荡清洗6h，然后用纯化水清洗至无加工助剂的残留，置于纯化水中放置24h。
其中脱细胞溶液包括如下组分：0.5％(w/v)氢氧化钠、15％(w/v)氯化钠、0.05％(w/v)SDS。
(3)去除浆膜层：将脱细胞后的猪心包膜置于冻干机中冷冻(-40℃)干燥0.5h，得到含水量为70％的胶原膜。光滑面(浆膜层)朝上置于精密剖层机中，去除浆膜层，剩余0.1mm的猪心包膜。
(4)冻干定型：将单层猪心包膜继续冻干24h，直至含水量小于10％；升华干燥温度为-30℃，解析干燥温度为20℃。
(5)辐照灭菌：根据产品型号规格将猪心包膜剪裁为合适大小后，γ辐照灭菌；灭菌剂量：20kGy。
将单层口腔胶原膜参照GB/T 36422-2018《化学纤维微观形貌及直径的测定扫描电镜法》进行电镜观察。如图1所示，结果表明，单层胶原膜的两面结构一致，呈定向波浪状平行排列。
实施例2
复合口腔胶原膜的制备，包括以下步骤：
(1)去除结缔组织层：将猪心包膜置于液氮中冷冻10min，室温复融5min，糙面(结缔组织层)朝上置于精密剖层机中，去除结缔组织层，剩余0.10mm的猪心包膜。
(2)精制：将猪心包膜置于脱细胞溶液中震荡清洗8h，然后用纯化水清洗至无加工助剂的残留，置于纯化水中放置17h。其中脱细胞溶液包括如下组分：1％(w/v)氢氧化钠、20％(w/v)氯化钠、0.05％(w/v)SDS。
(3)去除浆膜层：将脱细胞后的猪心包膜置于冻干机中冷冻(-40℃)干燥1h，得到含水量为50％的胶原膜。光滑面(浆膜层)朝上置于精密剖层机中，去除浆膜层，剩余0.1mm的猪心包膜。
(4)冻干定型：将单层猪心包膜继续冻干24h，直至含水量小于10％；升华干燥温度为-30℃，解析干燥温度为10℃。
(5)多层复合：将三个单层猪心包膜通过组织密封剂复合，形成“三明治”结构。组织密封剂的成分为0.5％(w/w)Carbopol 934。
(6)辐照灭菌：根据产品型号规格将猪心包膜剪裁为合适大小后，γ辐照灭菌；辐照剂量：25kGy。
细胞相容性检测：
将实施例2制备的复合口腔胶原膜，依据GB/T 16886.5-2017《医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验》和GB/T 16886.12-2017《医疗器械生物学评价第12部分：样品制备与参照材料》制备样品浸提液后，L929细胞接种至96孔板，培养24h，至形成半汇合单层，然后与试验样品组和对照组浸提液接触。接触24h后显微镜下观察试验组和对照组细胞生长情况。如图2所示，结果显示，镜下观察，试验样品浸提液，胞浆内有离散颗粒，无细胞溶解，无细胞增殖下降情况，细胞生长良好。
细胞增殖检测：
将实施例1制备的单层口腔胶原膜与市售同类产品(由猪胶原加工纯化制成的双层可吸收胶原膜)进行细胞增殖检测。具体为人骨间充质干细胞(hBMSCs)被植入到一个96孔板，达到90-100％的汇合度。第二天，将产品切成直径5mm的小片，在膜上播种5×103个细胞，13天内观察细胞相对增殖率(以第一天的细胞数量进行标准化)。结果显示，与市售同类产品对比，本发明制备的复合口腔胶原膜更利于hBMSCs细胞的增殖。

Claims (10)

1.一种产品性能可控的口腔生物膜的制备方法，其特征在于：包括如下步骤，
1)去除结缔组织层：将猪心包膜置于至少-80℃的冷冻环境中冷冻10-30min，10-30℃复融1-5min，糙面结缔组织层朝上置于精密剖层机中，去除结缔组织层，剩余0.10-0.15mm的猪心包膜；
2)精制：将步骤1)处理过的猪心包膜置于脱细胞溶液中震荡清洗4-8h，然后用纯化水清洗至无加工助剂的残留，置于纯化水中放置6-24h；此时猪心包膜经过精制过程后，厚度加倍，变为0.2-0.3mm；
3)去除浆膜层：将脱细胞后的猪心包膜置于冻干机中冷冻干燥0.5-2h，得到含水量为50-70％的胶原膜；通过冻干过程，猪心包膜再次变厚，厚度在0.3-0.5mm之间；光滑面浆膜层朝上置于精密剖层机中，去除浆膜层，剩余0.1mm的猪心包膜；
4)冻干定型：将经步骤3)处理的猪心包膜继续冻干，直至含水量小于10％；
5)辐照灭菌：将经以上步骤处理的猪心包膜剪裁后，送至电子束或γ辐照灭菌。
2.根据权利要求1所述的产品性能可控的口腔生物膜的制备方法，其特征在于：步骤4)与步骤5)中还包括以下处理，将若干个单层猪心包膜通过组织密封剂复合。
3.根据权利要求2所述的产品性能可控的口腔生物膜的制备方法，其特征在于：所述组织密封剂为以下组分中的一种或两种，0.2-0.8％(w/w)Carbopol 934、0.5％-3％(w/w)CMC-Na 6000、0.5％-2％(w/w)壳聚糖、10-30％(w/w)PEG 20000。
4.根据权利要求1-3任一项所述的产品性能可控的口腔生物膜的制备方法，其特征在于：步骤1)中的冷冻环境为液氮环境。
5.根据权利要求1-3任一项所述的产品性能可控的口腔生物膜的制备方法，其特征在于：步骤2)中的脱细胞溶液包括如下组分：0.5％-1％(w/v)氢氧化钠、15％-25％(w/v)氯化钠、0.05％-0.1％(w/v)SDS。
6.根据权利要求1-3任一项所述的产品性能可控的口腔生物膜的制备方法，其特征在于：步骤3)中的冷冻干燥的温度为-40℃--30℃。
7.根据权利要求1-3任一项所述的产品性能可控的口腔生物膜的制备方法，其特征在于：步骤4)中的冻干，升华干燥温度为-30℃--20℃，解析干燥温度为10℃-20℃。
8.根据权利要求1-3任一项所述的产品性能可控的口腔生物膜的制备方法，其特征在于：步骤5)中，电子束或γ辐照灭菌，辐照剂量：15-25kGy。
9.一种口腔生物膜，其由权利要求1-8任一项所述的制备方法制备获得。
10.由权利要求1-8任一项所述的制备方法制备获得口腔生物膜在制备颌面骨或牙槽骨的缺损、牙周损伤或牙科种植修复相关的骨隙或骨缺损的修复或引导组织的再生的产品中的应用。
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