CN115607739A

CN115607739A - 一种生物肩袖补片及其制备方法

Info

Publication number: CN115607739A
Application number: CN202211632017.XA
Authority: CN
Inventors: 黎建波; 孔庆俊; 高腾; 刘旭东; 章磊
Original assignee: Beijing Deyidamei Medical Technology Co ltd
Current assignee: Beijing Deyidamei Medical Technology Co ltd
Priority date: 2022-12-19
Filing date: 2022-12-19
Publication date: 2023-01-17
Anticipated expiration: 2042-12-19
Also published as: CN115607739B

Abstract

本申请涉及生物材料制备技术领域，具体公开了一种生物肩袖补片及其制备方法。所述生物肩袖补片的制备方法，包括S1：选取动物真皮作为原材料；S2：利用过氧乙酸溶液对步骤S1中的动物真皮进行浸泡；S3：利用曲拉通溶液和十二烷基硫酸钠溶液进行脱细胞处理，制得脱细胞真皮补片；S4：对所述脱细胞真皮补片进行去抗原处理，制得去抗原真皮补片；S5：利用交联剂对所述去抗原真皮补片进行交联处理，制得生物肩袖补片。所得生物肩袖补片的拉伸强度≥1.97MPa，顶破强度≥24kPa，撕裂强度≥18N/mm，且无细胞残留，毒性低。

Description

一种生物肩袖补片及其制备方法

技术领域

本申请涉及生物材料制备技术领域，更具体涉及一种生物肩袖补片及其制备方法。

背景技术

肩袖损伤是骨外科最常见肌腱损伤之一，是导致肩关节疼痛、活动度降低、功能减弱的常见原因。据统计，在60岁以上的人群中，肩袖全层损伤的发病率较高，到达了28%以上。

肩袖修补术后，肌腱与骨交界面处（腱-骨界面）不易愈合是目前医学上面临重点问题之一。许多相关学者对上述问题进行了深入研究，并提出了在施行肩袖修补手术时可采用生物肩袖补片进行加强，旨在促进受损肩袖组织快速地愈合。

目前，根据生物材料来源的不同，生物肩袖补片大致可分为三类，包括自体组织、同种异体组织和脱细胞化组织。自体组织移植材料主要来源于自体的阔筋膜、肱二头肌长头肌腱等组织。自体组织移植类补片不会引起机体的炎症反应，但是，取材时可能会给自体带来额外创伤，影响肩关节稳定性。同种异体组织移植材料通常来源于同源肩袖组织、异体髌腱组织、跟腱组织及股四头肌肌腱组织等。同种异体类补片虽然容易取材，但是，力学性能受供体差异影响大，不能较好地解决肌腱退变或肌腱损伤等常见的生物性问题。脱细胞化组织移植材料经物理方法或化学方法脱细胞化操作后，可去除细胞DNA中的免疫成分，同时保留细胞外基质（ECM）中原有的三维结构及胶原纤维成分，脱细胞化组织移植材料类补片具有良好的生物相容性及抗拉伸的力学特性，有效地促进肩袖组织中胶原纤维及血管的再生，在肩袖修补术中具有明显的优越性，逐渐成为研究及应用的热点。但是，此类补片在力学强度方面比人体原生肌腱或韧带弱。因此，需要一种取材方便、安全性及强度高的生物肩袖补片。

发明内容

为了提高生物肩袖补片的强度，本申请提供了一种生物肩袖补片及其制备方法。

第一方面，本申请提供了一种生物肩袖补片，所述生物肩袖补片是利用动物真皮进行制得，且生物肩袖补片的拉伸强度≥1.97MPa，顶破强度≥24kPa，撕裂强度≥18N/mm。

在本申请中，利用动物真皮制得一种脱细胞化组织的生物肩袖补片，制得肩袖补片强度较高，且无毒性，无细胞残留，安全性更高，与人体原生肌腱或韧带的力学强度更加接近。

本申请中真皮指的是位于表皮和皮下组织之间的组织，动物指的是猪、牛和羊等动物，所以，本申请中动物真皮来源较为广泛，且优先使用安全性更高的猪真皮。

第二方面，本申请提供一种生物肩袖补片的制备方法，包括以下步骤：

S1：选取动物真皮作为原材料；

S2：利用过氧乙酸溶液对步骤S1中的动物真皮进行浸泡；

S3：利用曲拉通溶液和十二烷基硫酸钠溶液进行脱细胞处理，制得脱细胞真皮补片；

S4：对所述脱细胞真皮补片进行去抗原处理，制得去抗原真皮补片；

S5：利用交联剂对所述去抗原真皮补片进行交联处理，制得生物肩袖补片。

在本申请中，挑选检疫合格的动物真皮作为原材料，加入过氧乙酸溶液进行浸泡，在室温，摇床100r/min条件下，浸泡时间1-3h，在过氧乙酸溶液中浸泡后，再利用纯化水超声清洗3-5遍，每遍清洗时间不少于15min。

进一步地，所述过氧乙酸溶液的浓度为0.2%~0.4%。

进一步优选地，所述过氧乙酸溶液的浓度为0.3%。

进一步地，所述过氧乙酸溶液的加入量为10~30mL/g。

进一步优选地，所述过氧乙酸溶液的加入量为20mL/g。

本申请中过氧乙酸溶液按照上述浓度进行配制，将动物真皮在过氧乙酸溶液中浸泡，使得动物真皮中初始污染菌的含量保持在最低水平。当过氧乙酸的浓度低于0.2%时，不能有效地去除初始污染菌；当过氧乙酸的浓度大于0.4%时，对动物真皮造成损伤，降低了生物肩袖补片的强度。

本申请中，根据动物真皮的重量加入过氧乙酸溶液，每克动物真皮需要加入10~30mL的过氧乙酸溶液。过氧乙酸溶液的加入量可以为10mL/g，12mL/g，15mL/g，18mL/g，20mL/g，25mL/g或30mL/g。

在步骤S3中，首先分别配制曲拉通和十二烷基硫酸钠的溶液，再按照相应的比例进行混合，制得混合溶液，然后在室温，摇床120r/min的条件下，利用混合溶液对浸泡后的动物真皮进行清洗，清洗时间为12h以上，之后再利用纯化水清洗4-5遍，制得脱细胞真皮补片。

进一步地，所述曲拉通的浓度为0.1~0.5%。

进一步地，所述十二烷基硫酸钠的浓度为0.1~0.5%。

进一步地，所述曲拉通和所述十二烷基硫酸钠的体积比为1 :（0.5-2）。

进一步优选地，所述曲拉通和所述十二烷基硫酸钠的体积比为1 : 0.5。

曲拉通是一种非离子洗涤剂，通过分解脂质-脂质，脂质-蛋白质，脱氧核糖核酸（DNA）-蛋白质的相互作用来溶解细胞膜并解离DNA与蛋白质，但是保持了蛋白质-蛋白质的相互作用。由于蛋白质不能变性，非离子洗涤剂可以清除遗传内容物，而不会损害胶原蛋白的结构和取向，但是不足以完全去除细胞和DNA，进而使得生物肩袖补片的安全性较差。

十二烷基硫酸钠（Sodium dodecyl sulfate，简称SDS）是一种离子洗涤剂，通过破坏脂质-脂质，脂质-蛋白质，DNA -蛋白质和蛋白质-蛋白质相互作用来溶解核膜和细胞质膜，从而消除细胞和遗传内容物。所以，SDS的浓度在脱细胞处理过程中起着至关重要的作用。

当SDS浓度小于0.1%时，胶原蛋白的保留含量越高，细胞外基质（ECM）蛋白变性越少，细胞残留物越多，细胞毒性作用越强。当SDS浓度大于0.5%时，SDS浓度过大，降低了生物肩袖补片机械强度，同时，SDS浓度过大时，导致SDS的残留，进而降低了生物肩袖补片的安全性。

由于离子洗涤剂中断蛋白质-蛋白质相互作用，所以对ECM结构和生物活性成分存在一定影响。所以采用十二烷基硫酸钠和曲拉通联用的方式进行脱细胞处理，在完全去除细胞成分的同时，既能保证生物肩袖补片的强度，又能保证生物肩袖补片的安全性。

在步骤S4中，利用核酸酶溶液对脱细胞真皮补片进行清洗，清洗时间在3h以上，完毕后再利用纯化水超声清洗，接着再利用α-GaL抗原酶溶液清洗3h，最后利用纯化水超声清洗，即得去抗原真皮补片。

进一步地，核酸酶为脱氧核糖核酸酶。

进一步地，所述核酸酶溶液的浓度为5~15U/mL。

进一步优选地，所述核酸酶溶液的浓度为5U/ml。

在本申请中，核酸酶选用的是脱氧核糖核酸酶，又称为DNA酶。DNA酶能够有效地降低DNA含量，同时通过切割核酸序列保留蛋白质。动物真皮经过曲拉通和十二烷基硫酸钠洗涤后，增加了其内部间距和孔隙率，使脱氧核糖核酸酶更容易和更快地渗入组织中。渗透的DNA酶可以去除残留的核酸和细胞碎片，并有助于去除多余或残留的洗涤剂。

进一步地，α-GaL抗原酶为α-半乳糖苷酶抗原酶。

进一步地，所述α-GaL抗原酶溶液的浓度为10~50U/mL。

进一步优选地，所述α-GaL抗原酶溶液的浓度为10U/ml。

在步骤S5中，利用交联剂对所述去抗原真皮补片进行交联处理，处理时间为4h以上，处理结束后再利用75%乙醇超声清洗3遍，每遍10min，清洗结束后使用纯化水清洗，即得生物肩袖补片。

在一个实施方案中，所述交联剂为京尼平溶液或戊二醛。

在一个实施方案中，所述京尼平溶液的浓度为1~5mmol/L。

在本申请中，利用交联剂对去抗原真皮补片进行处理，形成强度较高的网状结构，制得的生物肩袖补片强度较高，生物肩袖补片的拉伸强度≥1.97MPa，顶破强度≥24kPa，撕裂强度≥18N/mm。

本申请中，交联剂优选为京尼平溶液，在碱性环境下，京尼平受到OH-攻击，开环形成单个醛基中间体，开环的京尼平单分子发生自聚合反应后形成稳定的长链结构，聚合物末端的醛基结合胶原中的-NH₂生成Schiff键，形成一种交联的网状结构。此外，京尼平具有生物相容性好，抗降解能力强和细胞毒性低等优点。

在本申请中，所述京尼平溶液的浓度可以为1 mmol/L、2 mmol/L、3 mmol/L、4mmol/L或5 mmol/L。京尼平溶液的浓度在1-5 mmol/L范围内，交联效果较优，所得生物肩袖补片的拉伸强度≥2.14MPa，顶破强度≥25.6kPa，撕裂强度≥19.2N/mm。

当京尼平溶液的浓度超过5 mmol/L后，所得生物肩袖补片的拉伸强度、顶破强度和撕裂强度基本不在提高，随着京尼平溶液的浓度继续增大时，降低了生物肩袖补片的安全性。

综上所述，本申请具有以下有益效果：

1、本申请采用动物真皮制得生物肩袖补片，生物肩袖补片的拉伸强度≥1.97MPa，顶破强度≥24kPa，撕裂强度≥18N/mm；

2、本申请中生物肩袖补片的制备方法包括选材、浸泡、脱细胞处理、去抗原处理和交联处理，制备方法简单，易于控制，且生物肩袖补片的强度较高；

3、本申请优选曲拉通的浓度为0.1~0.5%，十二烷基硫酸钠的浓度为0.1~0.5%，脱细胞效果较优，安全性较高；

4、本申请优选京尼平溶液的浓度为1~5mmol/L，交联效果好，生物肩袖补片强度高。

附图说明

图1为实施例1所得生物肩袖补片；

图2为实施例1所得生物肩袖补片的HE染色结果图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本申请作进一步详细说明。

原料

本申请所述原料来源如表1所示，如无特殊说明，均可通过市售获得。

表1 原料来源

实施例

实施例1

生物肩袖补片的制备包括以下步骤：

S1：取检疫合格的猪真皮做为原材料，剔除表面多余软组织；

S2：将步骤1中的处理后猪真皮置于0.3%的过氧乙酸溶液中，在室温下，摇床100r/min浸泡1h，其中过氧乙酸溶液的加入量为20mL/g；

浸泡结束后，使用等体积的纯化水超声清洗3遍，每遍清洗时间不少于15min；

S3：脱细胞处理，采用浓度为0.1%曲拉通溶液和浓度为0.1%十二烷基硫酸钠溶液进行配制混合溶液，其中曲拉通溶液和十二烷基硫酸钠溶液的体积比为1:1；

利用所得混合溶液对步骤2中的处理后猪真皮进行清洗，在室温下摇床120r/min清洗12h，其中按照每克猪真皮加入20mL的混合溶液；

清洗结束后，再采用等体积纯化水清洗5遍；

按照步骤3的方法重复清洗3次，制得脱细胞真皮补片；

S4：去抗原处理，使用核酸酶溶液对脱细胞真皮补片进行清洗3h，清洗完毕后再使用纯化水超声清洗；

清洗结束后再使用α-GaL抗原酶溶液清洗3h，清洗完毕后使用纯化水超声清洗，得到去抗原真皮补片；

其中核酸酶溶液的浓度为5U/mL，核酸酶为脱氧核糖核酸酶；

其中α-GaL抗原酶溶液的浓度为10U/mL，α-GaL抗原酶为α-半乳糖苷酶抗原酶；

S5：交联处理，利用3mmol/L的京尼平溶液（用0.1mol氢氧化钠调节pH值，使得pH=8））对去抗原真皮补片处理4h，处理结束后使用75%乙醇超声清洗3遍，每遍10min，清洗结束后使用纯化水清洗，制得生物肩袖补片。

实施例2-7，对比例1-4

实施例2-7，对比例1-4与实施例1的区别参数如表2所示。

表2 实施例2-7，对比例1-4与实施例1的区别参数

性能检测试验

将上述由实施例1-7和对比例1-4制得的生物肩袖补片进行力学性能测试，细胞残留检测，细胞毒性检测。

力学性能测试主要包括拉伸强度实验、顶破强度实验和撕裂强度实验。

其中拉伸强度实验参照GB/T3923.1标准进行检测；

其中顶破强度实验参照YY/T0500-2021中A.5.3.5规定方法进行检测；

其中撕裂强度实验参照GB/T3917.2规定的方法进行检测。

细胞残留检测通过HE染色实验进行观察细胞有无残留，将制得的生物肩袖补片经过福尔马林固定48h后，进行脱水、石蜡包埋、病例切片、HE染色，然后置于显微镜下观察。

细胞毒性检测：参考GB/T 16886.5-2017第5部分：体外细胞毒性试验。具体方法为：将所得生物肩袖补片按0.2g/mL的比例加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，37℃下浸提24h，得到浸提液。

取细胞密度约80%-90%的L929细胞系，弃去原培养基，加入浸提液，以原培养基做为对照，继续培养72h后，采用MTT法检测细胞活力，记录相对增长率（%）。

具体检测结果如表3所示。

表3 力学性能检测结果

结合实施例1-7和对比例1-4并结合表3可以看出，由实施例1-7制得的生物肩袖补片具有强度高、无细胞残留且毒性低；所得生物肩袖补片的拉伸强度≥1.97MPa，顶破强度≥24kPa，撕裂强度≥18N/mm。

参照图1，按照实施例1所述的制备方法获得的生物肩袖补片。

参照图2，将实施例1制得的生物肩袖补片经过福尔马林固定48h后，进行脱水、石蜡包埋、病例切片、HE染色，然后置于显微镜下观察。

观察后发现：所得生物肩袖补片中无细胞残留，且肌腱组织保存完好，胶原纤维之间存在间隙，利于后期自体细胞及组织的长入。

结合实施例1/4/5和对比例4/5并结合表3可以看出，当十二烷基硫酸钠溶液的浓度在0.1-0.5%范围内，随着十二烷基硫酸钠溶液的浓度逐渐递增，所得生物肩袖补片的强度逐渐下降。

实施例8-9，对比例5-6

实施例8-9，对比例5-6与实施例1的不同之处如表4所示。

表4 实施例8-9，对比例5-6与实施例1的区别参数

性能检测试验

将上述由实施例8-9和对比例5-6制得的生物肩袖补片进行力学性能测试，细胞残留检测，细胞毒性检测。主要包括拉伸强度实验、顶破强度实验和撕裂强度实验，具体检测结果如表5所示。

表5 力学性能检测结果

结合实施例1/8/9和对比例5/6并结合表5可以看出，当京尼平溶液的浓度在1-5mmol/L范围内，随着京尼平溶液的浓度逐渐递增，交联效果较优，所得生物肩袖补片的强度逐渐升高；当京尼平溶液的浓度超过5mmol/L时，所得生物肩袖补片的强度基本不在增加，京尼平溶液的浓度过高时，细胞毒性增高。

可以理解的是，以上实施方式仅仅是为了说明本申请的原理而采用的示例性实施方式，然而本申请并不局限于此。对于本领域内的技术人员而言，在不脱离本申请的精神和实质的情况下，可以做出各种变型和改进，这些变型和改进也视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种生物肩袖补片，其特征在于，所述生物肩袖补片是利用动物真皮进行制得，且生物肩袖补片的拉伸强度≥1.97MPa，顶破强度≥24kPa，撕裂强度≥18N/mm。

2.一种如权利要求1所述生物肩袖补片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：选取动物真皮作为原材料；

S2：利用过氧乙酸溶液对步骤S1中的动物真皮进行浸泡；

3.根据权利要求2所述生物肩袖补片的制备方法，其特征在于，在所述步骤S2中，所述过氧乙酸溶液的浓度为0.2%~0.4%。

4.根据权利要求2所述生物肩袖补片的制备方法，其特征在于，在所述步骤S3中，所述曲拉通溶液的浓度为0.1~0.5%。

5.根据权利要求2所述生物肩袖补片的制备方法，其特征在于，在所述步骤S3中，所述十二烷基硫酸钠溶液的浓度为0.1~0.5%。

6.根据权利要求2所述生物肩袖补片的制备方法，其特征在于，所述曲拉通溶液和所述十二烷基硫酸钠溶液的体积比为1 :（0.5-2）。

7.根据权利要求2所述生物肩袖补片的制备方法，其特征在于，在步骤S4中，利用核酸酶溶液对脱细胞处理的动物真皮进行清洗，清洗完毕后使用纯化水超声清洗，再利用α-GaL抗原酶溶液进行清洗，清洗完毕后使用纯化水超声清洗。

8.根据权利要求7所述生物肩袖补片的制备方法，其特征在于，所述核酸酶溶液的浓度为5~15U/mL，所述α-GaL抗原酶溶液的浓度为10~50U/mL。

9.根据权利要求2所述生物肩袖补片的制备方法，其特征在于，所述交联剂为京尼平溶液或戊二醛。

10.根据权利要求9所述生物肩袖补片的制备方法，其特征在于，所述京尼平溶液的浓度为1~5mmol/L。