CN113813446B

CN113813446B - 去除同种或异种生物材料的细胞成分和/或核酸物质的方法

Info

Publication number: CN113813446B
Application number: CN202110821959.1A
Authority: CN
Inventors: 宋明哲; 姜振林; 吴忠仕; 唐贞洁; 齐晓科; 刘育宏; 解鑫隆; 吴其应
Original assignee: Second Xiangya Hospital of Central South University
Current assignee: Second Xiangya Hospital of Central South University
Priority date: 2021-07-20
Filing date: 2021-07-20
Publication date: 2022-12-27
Anticipated expiration: 2041-07-20
Also published as: CN113813446A

Abstract

本发明涉及医药材料领域，特别涉及去除同种或异种生物材料的细胞成分和/或核酸物质的方法。本发明采用洗涤剂和酶结合的方法，充分利用新型洗涤剂的破膜和去污能力，同时利用核酶的特异性分解作用，有效去除细胞成分。达到时间短，脱细胞性效果好的优势。

Description

去除同种或异种生物材料的细胞成分和/或核酸物质的方法

技术领域

本发明涉及医药材料领域，特别涉及去除同种或异种生物材料的细胞成分和/或核酸物质的方法。

背景技术

心脏瓣膜疾病是一种具有高发病率及高致死率的疾病，全世界范围内心脏瓣膜疾病率随着老年化的日益加重，正逐年攀升，已成为世界范围内危及生命的主要医疗保健问题之一。晚期瓣膜性疾病导致丧失自我修复功能，瓣膜置换术成为唯一的手术选择。全世界每年进行近30万例瓣膜置换手术，预计到2050年这个数字将增加两倍。目前人造心脏瓣膜主要由机械心脏瓣膜和生物假体心脏瓣膜两大类型组成，并已广泛应用了几十年。两种人造瓣膜各有优缺点；机械瓣膜耐久高，可以达到二十年以上，但是其容易形成血栓，需要终生抗凝。而生物心脏瓣膜由于其较机械瓣膜有更低的血栓形成性，从而避免了终生抗凝的需要，并且能表现出与天然瓣膜相似的优良的血流动力学特性而越来越多地被临床采用，但是生物心脏的耐久性较差，使用寿命只有10-15年，导致患者需承受再次开胸手术的痛苦。

生物人工心脏瓣膜主要来源于牛心包或猪心脏瓣膜，具有较好的血流动力学特性，无需抗凝治疗。然而由于生物瓣膜材料属于异种组织材料，不可避免的会有免疫原性，从而发生排斥反应。来自异种组织的细胞往往被机体视为外来物，从而发生免疫排斥反应攻击外来细胞，导致细胞的失活和死亡，从而导致组织瓣膜的钙化和衰败。为了防止生物瓣膜的钙化和衰败，脱细胞化已被提出作为一种降低组织抗原性的方法，从而获得更好的组织相容性、重塑和长期持久性。

目前生物瓣膜材料的脱细胞方案，主要包括物理方法(如通过低渗和高渗反复交替、反复冻融、冷冻干燥、超高压等)、化学方法(高浓度的离子、非离子、两性离子洗涤剂(Triton X-100(曲那通X-100)，十二烷基硫酸钠(SDS)、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸盐(CHAPs)等)和酶的方法(胰蛋白酶和核酸酶(DNAse和RNAse)等)脱去细胞。

单一的脱细胞方案会因为强度或试剂浓度过高导致对生物瓣膜材料的力学性能破坏较大，而过低的强度或试剂浓度又会导致脱细胞不够彻底，免疫成分残留的问题。例如物理方式的处理是通过破坏细胞质材料来裂解细胞，它们往往不足以除去所有的细胞成分和免疫原性内容物，而且处理时间长，单次处理需要6到9天的时间；许多化学方法都已用于脱细胞中，这些洗涤剂中的每一种都有其独特的方式来改变细胞的结构和成分以及细胞外基质的三维结构，对材料的力学性能有所影响，甚至引起部分纤维的断裂，暴露更多的抗原位点，而导致体内的急性免疫反应。酶是一种功能强大的脱细胞工具，由于它们的高特异性，可用于消化核酸(DNA和RNA)或去除不需要的ECM残基。胰蛋白酶和核酸酶一直用于脱细胞的工具。但胰酶对细胞外基质结构的损害较大，可破坏异种生物瓣膜材料的三维结构，使力学性能受损。

因此采用化学试剂和酶处理的复合手段才是最佳的脱细胞方法，可以降低物理作用的强度、降低化学试剂或酶的使用浓度，减轻对细胞外基质的损害，在充分去除细胞成分、降低免疫原性的同时，最大限度的维持细胞外基质成分，保证其生物力学性能。目前，国内外应用最多的联合方法一般是化学试剂+酶学的方法,常利用SDS或者Triton X-100结合核酶和胰酶处理。

虽然国内外有多种脱细胞的方法，但仍存在一些问题：(1)相应的化学试剂可引起细胞外基质三维结构的破坏，对脱细胞组织的力学性能有负面影响；(2)其相应的处理时间持续较长，特别是单一或者仅两者方法结合的，其处理过程均在一周以上。

因此，如何快速高效的去除牛心包的细胞成分，维持异种生物瓣膜完整的细胞外基质结构，并保证其良好的生物力学性能，具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明采用新型的两性离子去污剂椰油酰胺丙基甜菜碱(CAB)及核酶结合的复合手段对生物瓣膜牛心包材料进行脱细胞。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了去除同种或异种生物材料的细胞成分和/或核酸物质的方法，包括如下步骤：

步骤1：取同种或异种生物材料经第一漂洗后，与杀菌剂混合，获得杀菌后的生物材料；

步骤2：取步骤1制得的所述杀菌后的生物材料与洗涤剂混合，经第二漂洗后再分别经DNA酶和RNA酶处理，经第三漂洗，保存，灭菌；

所述洗涤剂包括CAB。

在本发明的一些具体实施方案中，所述杀菌剂包括新洁尔灭。

在本发明的一些具体实施方案中，所述杀菌剂的浓度为0.1％。

在本发明的一些具体实施方案中，所述洗涤剂包括含抗生素的PBS配制的3％CAB；所述杀菌后的生物材料与所述洗涤剂的质量体积比为1:5；所述抗生素包括青霉素和链霉素，所述青霉素的浓度包括100U/ml；所述链霉素的浓度包括100μg/ml。

在本发明的一些具体实施方案中，步骤2所述混合具体为：于37℃下处理24h，每12h换液一次。

在本发明的一些具体实施方案中，步骤2中所述DNA酶的浓度包括2～3U/ml；所述RNA酶的浓度包括0.02～0.03mg/ml，所述RNA酶还包括2.5mM的Mg²⁺和0.1mM的Ca²⁺。

步骤2中所述DNA酶的浓度为3U/ml；所述RNA酶的浓度为0.03mg/ml。

在本发明的一些具体实施方案中，步骤2中所述处理具体为：37℃震荡处理24h，每12h换液一次。

在本发明的一些具体实施方案中，步骤1或步骤2中的所述漂洗采用的漂洗剂包括抗生素无菌PBS液或无菌蒸馏水，所述抗生素无菌PBS液中抗生素包括青霉素和链霉素，所述青霉素的浓度包括100U/ml；所述链霉素的浓度包括100μg/ml；

所述第一漂洗的次数至少为3次，每次10min；

所述第二漂洗的次数至少为3次，每次10min，漂洗的同时摇动洗去残余的CAB溶液；

所述第三漂洗具体为：25℃±5℃下漂洗24h，每8h换液一次。

基于上述研究，本发明还提供了所述的方法制得的同种或异种生物材料。

更重要的是，本发明还提供了所述的同种或异种生物材料在制备治疗疾病的生物材料中的应用。

本发明采用新型的两性离子去污剂，通过不断摸索、反复调整处理参数，提出一种新型的生物瓣膜牛心包脱细胞方案，具备脱细胞效率高，对细胞外基质破坏低，残留免疫原性低，处理时间短等优点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示CAB处理条件下的HE染色结果；

图2示TritonX-100处理条件下的HE染色结果；

图3示DNA含量分析结果；

图4示DNA landder结果；

图5示CAB脱细胞力学曲线图；

图6示TritonX-100脱细胞力学曲线图；

图7示新鲜牛心包力学曲线图；

图8示厚度的检测结果；

图9示弹性模量的检测结果；

图10示最大拉伸应力的检测结果；

图11示拉伸应变率的检测结果；

图12示最大值载荷的检测结果；

图13示断裂载荷的检测结果。

具体实施方式

本发明公开了去除同种或异种生物材料的细胞成分和/或核酸物质的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明一种新型生物瓣膜免疫原性去除方案是按以下步骤操作：

1)样品制备：牛心包由当地屠宰场提供，标本在屠宰场采集。取出样品后侵入预冷的PBS溶液中保存，于4小时内运送至实验室。含抗生素无菌PBS液(青霉素和链霉素，浓度分别为100U/ml,100ug/ml)清洗多次，浸入0.1％新洁尔灭30min，含抗生素无菌PBS冲洗心包10min×3次，低温4℃保存。

2)免疫原性去除处理：50ml无菌离心管加入使用含抗生素的PBS配制的3％CAB约35ml，将材料放于离心管中，盖上盖子，37℃下处理24小时，每12小时换液一次。使用含抗生素的无菌PBS液漂洗10min×3次并摇动洗去残余的CAB溶液；3U/mL的DNA酶/0.03mg/mL的RNA酶(加2.5mM的Mg²⁺、0.1mM的Ca²⁺)37℃震荡处理24小时，每12小时换液一次。室温下使用含抗生素的无菌PBS液漂洗24小时，每8小时换液一次。

3)保存灭菌：置入75％酒精中保存，密闭封口，竖立存放，25KGyγ射线照射灭菌。

所述的制备方法中，其关键点在于洗涤剂和酶的结合方法，利用洗涤剂的初步作用后，细胞膜破裂，细胞基本破碎，大部分细胞成分也被冲洗掉，但是还有细胞核的染色体、DNA、RNA、破碎的磷脂等小物质停留在生物材料内，需要进一步的DNase-I及RNase-A作用，去除绝大部分的核酸物质；最后再通过反复的无菌PBS溶液漂洗，去除残留的碱基片段，达到满意的免疫原性去除效果。

所述的制备方法中，其关键点在于新洁尔灭浸泡。本发明中，新洁尔灭浸泡可以起到较好的杀菌效果，防止后续处理和保存过程中出现细菌的污染。

所述的制备方法中，其关键点在于洗涤剂的浓度和作用时间：在生物瓣膜免疫原性去除过程中，这些参数的调整取决去所选材料的种类和材料的部位，对于生物材料的细胞含量不同，组织结构致密程度的不同，可以相应的上调或下调各浓度、时间和温度，达到最佳的免疫原性去除效果。

所述的制备方法中，核酶使用其关键点在于其浓度(2～3U/mlDNase-I及0.02～0.03mg/ml RNase-A)和工作时间18h到24h左右。具体浓度和时间的选择根据所选材料的特性决定。核酶的处理过程中，需注意浓度和作用时间，过高的浓度和过久的时间可以导致细胞外基质结构的损害。

本发明提供的去除同种或异种生物材料的细胞成分和/或核酸物质的方法中，所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1前期处理

牛心包由当地屠宰场提供，标本在屠宰场采集。取出样品后侵入预冷的PBS溶液中保存，于4小时内运送至实验室。含抗生素无菌PBS液(青霉素和链霉素，浓度分别为100U/ml,100ug/ml)清洗多次，浸入0.1％新洁尔灭30min，含抗生素无菌PBS冲洗心包10min×3次，低温4℃保存。

实施例2样品修剪

用放大镜观察有无明显刀伤，剪去所有不符合要求的区域，用剪刀、镊子仔细拨除材料基质上的脂肪组织，镊子与材料平行夹取，以免损伤材料，此过程动作应尽量轻柔，最大限度的保护组织纤维不被破坏，以免影响其力学性能。

实施例3免疫原性去除处理

50ml无菌离心管加入使用含抗生素的PBS配制的3％CAB约35ml，将材料放于离心管中，盖上盖子，37℃下处理24小时，每12小时换液一次。使用含抗生素的无菌PBS液漂洗10min×3次并摇动洗去残余的CAB溶液；3U/mL的DNA酶/0.03mg/mL的RNA酶(加2.5mM的Mg²⁺、0.1mM的Ca²⁺)37℃震荡处理24小时，每12小时换液一次。室温下使用含抗生素的无菌PBS液漂洗24小时，每8小时换液一次。

实施例4保存灭菌

置入75％酒精中保存，密闭封口，竖立存放，25KGyγ射线照射灭菌。

对比例

将实施例3中的CAB替换为TritonX-100，其余操作同实施例1～实施例4。

结果例

样品制备：牛心包由当地屠宰场提供，标本在屠宰场采集。取出样品后侵入预冷的PBS溶液中保存，于4小时内运送至实验室。用放大镜观察有无明显刀伤，剪去所有不符合要求的区域，用剪刀、镊子仔细拨除材料基质上的脂肪组织，镊子与材料平行夹取，以免损伤材料，此过程动作应尽量轻柔，最大限度的保护组织纤维不被破坏，以免影响其力学性能。

脱细胞处理：

A组：50ml无菌离心管加入3％CAB约35ml，将材料放于离心管中，盖上盖子，37℃下处理24小时，无菌PBS液漂洗10minⅹ3次并摇动；3U/mL的DNA酶/0.03mg/mL的RNA酶(加2.5mM的Mg²⁺、0.1mM的Ca²⁺)37℃震荡处理24小时。无菌PBS液漂洗24小时。

B组：50ml无菌离心管加入0.25％Triton X－100约35ml，将材料放于离心管中，盖上盖子，37℃下处理48小时，无菌PBS液漂洗10minⅹ3次并摇动；3U/mL的DNA酶/0.03mg/mL的RNA酶(加2.5mM的Mg²⁺、0.1mM的Ca²⁺)37℃震荡处理24小时。无菌PBS液漂洗24小时。

组织学染色：

HE染色：样品在4％多聚甲醛中浸泡1d，然后埋入石蜡中进行切片。H&E染色用于定性评估脱细胞效果。

定量化学分析

用DNA检测试剂盒，详见说明书。在上述实验中，每组测试6个样本。

力学性能测试

将各组材料裁剪成1cm＊5cm长条状(n＝20)，应用电子拉力测验机(美国，Instron，电子万能材料试验机)，测量并记录每个样品的厚度和拉伸长度。设定拉伸速率为50mm/min，得到每个样品的应力-应变曲线图，再计算出材料的弹性模量(MPa)、最大拉伸应力(MPa)、最大值载荷(N)、断裂载荷(N)和断裂应变率(％)。

如图1、图2所示，CAB处理光镜下未见明显细胞核存在，且纤维排列规则。而TritonX-100处理光镜下可见明显细胞核以及碎片存在。

如图3、图4所示，从DNA含量和DNAlandder可以看到CAB和TritonX-100虽然对DNA都能去除，但是对于碱基的去除，CAB处理要明显好于TritonX-100处理。

如图5～13以及表1所示，表明脱细胞前后两者力学性能各指标未导致明显变化，维持了良好的力学性能。

表1

统计学结果在图中已表示，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01ns表示P＞0.05。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.去除同种或异种生物材料的细胞成分和/或核酸物质的方法，其特征在于，包括如下步骤：

所述洗涤剂包括CAB。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述杀菌剂包括新洁尔灭。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述杀菌剂的浓度为0.1%。

4.如权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，所述洗涤剂包括含抗生素的PBS配制的3% CAB；所述杀菌后的生物材料与所述洗涤剂的质量体积比为1：5；所述抗生素包括青霉素和链霉素，所述青霉素的浓度包括100U/mL；所述链霉素的浓度包括100μg/mL。

5.如权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，步骤2所述混合具体为：于37℃下处理24h，每12h换液一次。

6.如权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，步骤2中所述DNA酶的浓度包括2~3U/ mL；所述RNA酶的浓度包括0.02~0.03mg/mL，所述RNA酶还包括2.5mM的Mg²⁺和0.1mM的Ca²⁺。

7.如权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，步骤2中所述处理具体为：37℃震荡处理24h，每12h换液一次。

8.如权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，步骤1或步骤2中的所述漂洗采用的漂洗剂包括抗生素无菌PBS液或无菌蒸馏水，所述抗生素无菌PBS液中抗生素包括青霉素和链霉素，所述青霉素的浓度包括100U/mL；所述链霉素的浓度包括100μg/mL；

所述第一漂洗的次数至少为3次，每次10min；

所述第二漂洗的次数至少为3次，每次10min，漂洗的同时摇动洗去残余的CAB；

所述第三漂洗具体为：于25℃±5℃下漂洗24h，每8h换液一次。

9.如权利要求1至8任一项所述的方法制得的同种或异种生物材料。

10.如权利要求9所述的同种或异种生物材料在制备治疗疾病的生物材料中的应用。