CN111643735A

CN111643735A - 脱细胞异种小血管的制备方法

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Publication number: CN111643735A
Application number: CN202010525009.XA
Authority: CN
Inventors: 刘育宏; 陈春阳; 吴忠仕; 唐贞洁; 卢婷; 袁浩泳; 刘四喜; 解鑫隆; 钱涛
Original assignee: Second Xiangya Hospital of Central South University
Current assignee: Second Xiangya Hospital of Central South University
Priority date: 2020-06-10
Filing date: 2020-06-10
Publication date: 2020-09-11
Anticipated expiration: 2040-06-10
Also published as: CN111643735B

Abstract

本发明涉及生物材料技术领域，尤其涉及脱细胞异种小血管的制备方法。该方法采用超声、灌流、洗涤剂和酶的结合方法，利用高频超声波的空化作用，破碎生物材料基质内的细胞，再利用灌流的方式，把洗涤剂压入材料内部，进一步洗涤细胞成分和部分免疫原性物质；经过超声和洗涤剂的初步作用后，细胞基本破碎，大部分细胞成分也被冲洗掉，进一步通过DNase‑I及RNase‑A作用，去除绝大部分的核酸物质，残留量小于100ng/mg；最后再通过反复的无菌PBS溶液灌洗，达到良好的脱细胞效果。

Description

脱细胞异种小血管的制备方法

技术领域

本发明涉及生物材料技术领域，尤其涉及脱细胞异种小血管的制备方法。

背景技术

冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)死亡率居各种疾病之首，且呈上升趋势。冠状动脉旁路移植术(CABG)是冠心病的主要治疗手段之一。仅美国每年需要60余万根小口径移植血管(内径3～5mm)用于CABG，我国约需要15万根/年，且正在迅速增长。目前这种移植血管主要采用自体动脉或大隐静脉，但30％患者由于基础疾病、截肢、二次手术等问题无法获取理想的自体血管，同时自体血管的获取必然给身体带来创伤。遗憾的是，至今没有一种合适的小口径人工血管可供临床应用。

小口径人工血管(内径≤6mm)的研究与开发是生物医学工程材料领域近十几年的热点。用于CABG的小口径人工血管应具备良好的生物力学性能，免疫原性低等特点。应用天然生物材料、可降解高分子材料及复合材料等，采用包括静电纺丝、自组装、快速成型及凝胶纺丝等技术制备的生物合成材料构建的小口径人工血管研究，取得了很多进展，但总体上来说与临床应用相距甚远。基于种植细胞培养的组织工程血管，因过分依赖于患者细胞的收获和扩张、生物反应器培养和预处理，使得组织工程血管的制造过程漫长且费用昂贵，限制了其临床应用。

作为天然材料的异种小动脉具备结构形态、生物相容性等方面诸多优势，通过对其进行有效的脱细胞处理，能充分去除细胞成分，消除免疫原性，保持其良好的生物力学性能，是一种充满前景的小口径血管替代材料。一套标准的脱细胞化方法，包括解剖提取组织，采用合适的缓冲液和抗菌剂进行处理，以保持组织的湿润度和抗蚀性、抑制细菌的生长。组织在经过物理处理、洗涤剂和/或酶制剂以去除细胞成分和染色体、DNA、免疫原性物质，而保留完整的细胞外基质和三维结构，有利于细胞的粘附、浸润、增殖。目前异种小血管材料的脱细胞方案，主要包括物理方法(如通过低渗和高渗反复交替、反复冻融、冷冻干燥、超高压等)、化学方法(高浓度的离子、非离子、两性离子洗涤剂(Triton X-100(曲那通X-100)，十二烷基硫酸钠(SDS)、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸盐(CHAPs)等)和酶的方法(胰蛋白酶和核酸酶(DNAse和RNAse)等)脱去细胞。

单一的脱细胞方案会因为强度或试剂浓度过高导致对异种小血管材料的力学性能破坏较大，而过低的强度或试剂浓度又会导致脱细胞不够彻底，免疫成分残留的问题。例如物理方式的处理是通过破坏细胞质材料来裂解细胞，它们往往不足以除去所有的细胞成分和免疫原性内容物，而且处理时间长，单次处理需要6到9天的时间；许多化学方法都已用于脱细胞中，这些洗涤剂中的每一种都有其独特的方式来改变细胞的结构和成分以及细胞外基质的三维结构，对材料的力学性能有所影响，甚至引起部分纤维的断裂，暴露更多的抗原位点，而导致体内的急性免疫反应。酶是一种功能强大的脱细胞工具，由于它们的高特异性，可用于消化核酸(DNA和RNA)或去除不需要的ECM残基。胰蛋白酶和核酸酶一直用于脱细胞的工具。但胰酶对细胞外基质结构的损害较大，可破坏异种血管的三维结构，使血管的力学性能受损。

因此采用物理，化学和酶处理的复合手段才是最佳的脱细胞方法，可以降低物理作用的强度、降低化学试剂或酶的使用浓度，减轻对细胞外基质的损害，在充分去除细胞成分、降低免疫原性的同时，最大限度的维持细胞外基质成分，保证其生物力学性能。目前，国内外应用最多的联合方法一般是化学试剂+酶学的方法,常利用SDS或者Triton X-100结合核酶和胰酶处理。也有学者提出利用震荡或者超高压的物理方式，结合化学法和酶法的处理，可以去除异种小血管材料的细胞成分和免疫原等。

但是，目前这些方法制备的脱细胞材料也都无法应用于临床中，因此，进一步研究异种小血管材料的脱细胞方法仍是本领域亟待解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于脱细胞异种小血管的制备方法，该方法能有效去除细胞成分和抗原性物质，且维持良好的力学性能。

本发明提供的脱细胞异种小血管的制备方法包括：

步骤1：经清洗、杀菌的动物血管，以洗涤剂灌流的同时进行超声，然后以含抗生素无菌PBS缓冲液冲洗；

步骤2：以酶解液灌流，然后以含抗生素无菌PBS缓冲液冲洗；

步骤3：以含抗生素无菌PBS缓冲液灌流；

所述洗涤剂为含有抗生素、SDS和Triton X-100的PBS缓冲液；

所述酶解液为含有抗生素、DNase-I和RNase-A的PBS缓冲液；

所述超声的条件为80～120W，频率20～22KHz，超声每工作50～70s，停3～7秒。

本发明提供的制备方法中，采用超声、灌流、洗涤剂和酶的结合方法，利用高频超声波的空化作用，破碎生物材料基质内的细胞，再利用灌流的方式，把洗涤剂压入材料内部，进一步洗涤细胞成分和部分免疫原性物质；经过超声和洗涤剂的初步作用后，细胞基本破碎，大部分细胞成分也被冲洗掉，但是还有细胞核的染色体、DNA、RNA、破碎的磷脂等小物质停留在生物材料内，需要进一步的DNase-I及RNase-A作用，去除绝大部分的核酸物质；最后再通过反复的无菌PBS溶液灌洗，达到良好的脱细胞效果。

在本发明实施例中，所述动物血管为哺乳动物的血管，一些实施例中，所述血管来自牛、猪、狗、羊或人类的小口径血管(内径3～10mm)；一些具体实施例中，所述动物血管为牛乳内动脉血管。

在脱细胞过程，根据动物血管的种类和部位，针对血管的细胞含量不同，组织结构致密程度的不同，摸索了适宜的参数，其中灌流的流速、洗涤剂、酶解液的浓度以及超声波的功率和工作周期都对结果产生了重要的影响，本发明提供的方案，是最适宜动物血管的方案，能够达到最佳的脱细胞效果。

在本发明实施例中，所述动物血管的内径为3～10mm。

在本发明实施例中，所述洗涤剂为含有100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素、0.1wt％～0.5wt％SDS和0.1wt％～0.5wt％Triton X-100的PBS缓冲液。

核酶的处理过程中，需注意浓度和作用时间，过高的浓度和过久的时间可以导致细胞外基质结构的损害。本发明针对牛的乳内动脉，对核酸酶的工作浓度进行了优化。一些实施例中，所述酶解液为含有100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素、20～30u/mL DNase-I和0.2～0.3mg/mL RNase-A的PBS缓冲液；

所述含抗生素无菌PBS中，抗生素为100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素。

在本发明实施例中，步骤1中所述灌流的温度为18～30℃，流速为80ml/min～100ml/min，时间为18h～24h；

步骤2中所述灌流的温度为37℃，流速为80ml/min～100ml/min，时间为12h～18h；

步骤3中所述灌流的温度为18～30℃，流速为80ml/min～100ml/min，时间为24h～48h。

在本发明实施例中，步骤1中所述清洗、杀菌包括：将血管用抗生素的无菌PBS缓冲液清洗后浸入0.1wt％的苯扎溴铵30min，然后用含抗生素的无菌PBS缓冲液冲洗管腔内侧和外侧10min 3次。

本发明中，采用苯扎溴铵对材料进行前处理可以起到较好的杀菌效果，防治后续的脱细胞过程中出现细菌大量增生的污染。苯扎溴铵浸泡时间不能过长，否则管道会变硬，细胞外基质结构变性。

在本发明实施例中，步骤3之后还包括75vol％酒精浸泡，25KGyγ射线照射灭菌的步骤。

以本发明所述制备方法制得的脱细胞异种小血管。

本发明还提供了制备脱细胞异种小血管的制剂组合，其包括：

I)、含抗生素无菌PBS缓冲液；

II)、含有抗生素、SDS和Triton X-100的PBS缓冲液；

III)、含有抗生素、DNase-I和RNase-A的PBS缓冲液。

用于制备脱细胞异种小血管的容器包括进液管(6)、出液管(5)和灌流筒(1)，所述灌流筒包括筒体(2)和托板(3)，其中：

所述筒体用于盛放灌流液；

所述筒体的内侧设置有用于固定所述进液管或所述出液管的卡槽(4)；

所述托板设置于所述筒体内，所述筒体的筒底和筒口分别与所述托板保持大于零的预设距离，所述托板上设置有多个用于允许所述超声用液体上下流动的第一通孔(9)，以及用于允许所述出液管穿过的第二通孔(8)。

所述托板的上侧设置有用于放置血管的定位槽(7)，所述定位槽呈螺旋状布置。

所述定位槽的底部设置有所述第一通孔。

用于制备脱细胞异种小血管的装置，包括所述用于制备脱细胞异种小血管的容器、超声仪和蠕动泵。

所述用于制备脱细胞异种小血管的装置中，所述超声仪的破碎室内部上方设置有超声探头、下方设置放置容器的放置台。所述超声仪破碎室的侧壁设置进液孔和出液孔，进液管一端通过进液孔伸入制备脱细胞异种小血管的容器中，进液管的另一端与蠕动泵相连。制备脱细胞异种小血管的容器的底部设置出液口，出液口与出液管相连，出液管通过出液孔与蠕动泵相连。

所述放置台与破碎室内部的支架连接，连接处设置螺丝。

通过调节螺丝松紧调节放置台的高度。从而调节超声探头深入容器的长度。

本发明提供的制备方法中，采用超声、灌流、洗涤剂和酶的结合方法，利用高频超声波的空化作用，破碎生物材料基质内的细胞，再利用灌流的方式，把洗涤剂压入材料内部，进一步洗涤细胞成分和部分免疫原性物质；经过超声和洗涤剂的初步作用后，细胞基本破碎，大部分细胞成分也被冲洗掉，进一步通过DNase-I及RNase-A作用，去除绝大部分的核酸物质，残留量小于100ng/mg；最后再通过反复的无菌PBS溶液灌洗，达到良好的脱细胞效果。实验表明，在整个去细胞流程结束后，生物材料的细胞外基质保持完整，无疏松或断裂的损害，同时力学性能满意，与脱细胞之前比较，两者无明显区别；因此，该脱细胞材料可保留良好的生物力学性能和结构，有利于宿主细胞的浸润、粘附和增殖。

附图说明

图1示用于制备脱细胞异种小血管的的容器示意图；

图2示用于制备脱细胞异种小血管的的容器示意图；

图3示用于制备脱细胞异种小血管的的容器实物图；

图4示用于制备脱细胞异种小血管的的装置示意图；

图5示实施例1的脱细胞异种小血管的HE染色示意图；

图6示实施例1中牛乳内动脉脱细胞前后DNA含量；

图7示新鲜牛乳内动脉力学曲线图；

图8示脱细胞后牛乳内动脉力学曲线图；

图9示术中兔腹主动脉的牛乳内动脉植入；

图10示术后7天，彩超提示血管通畅；

图11示术后2周，标本的HE染色提示血管结构仍完整(2×)；

图12示术后2周，标本的HE染色提示血管结构仍完整(20×)；

图13示2.5对照验证中，脱细胞组织的HE染色结果(4×)；

图14示2.5对照验证中，脱细胞组织的HE染色结果(10×)；

图15示2.5对照验证中，脱细胞组织的DNA含量测定。

具体实施方式

本发明提供了脱细胞异种小血管的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，具体说明本发明的技术方案。

实施例1

1、脱细胞异种小血管的制备

1.)前期处理：从屠宰场的黄牛(体重约400-500Kg)体内取出双侧的乳内动脉，热缺血时间30分钟内，分离脂肪和外膜，用含抗生素无菌PBS液(青霉素和链霉素，浓度分别为100U/ml,100ug/ml)清洗多次，浸入0.1％新洁尔灭30min，含抗生素无菌PBS冲洗管腔内侧和外侧10min×3次，低温4℃保存。

2.)脱细胞处理：三步法

①高频超声波+灌流+洗涤剂：将血管裁剪成10cm长，一端连接灌流管，另一端不接，灌流速度90ml/min，置于特殊设计的容器中(见图1)；用含抗生素无菌PBS配置0.5％的SDS和0.5％的Triton X-100溶液500ml，加入容器中；将超声探头浸入溶液中，距离小血管约4cm左右；超声机参数：6mm探头，100W，频率21KHz，工作时间12小时，超声每工作60s，停5秒；于室温下，采用0.5％的SDS和0.5％的Triton X-100灌流及结合超声波的方法，持续时间24h，达到破碎细胞，并依靠灌流冲洗破碎的细胞成分(示意图见图2～4)。含抗生素无菌PBS冲洗管腔内侧和外侧10min×3次，去除残留的SDS和Triton X-100成分。

②核酶处理：采用30u/ml DNase-I及0.3mg/ml RNase-A的无菌含抗生素PBS液约330ml，37℃下灌流处理18h。酶解残留的DNA和RNA及天然抗原成分，降低免疫原性。其中，灌流速度为80ml/min。含抗生素无菌PBS冲洗管腔内侧和外侧10min×3次，去除残留的核酶成分

③漂洗：室温下利用含抗生素无菌PBS液500ml灌流冲洗血管24小时，每8小时更换一次含抗生素无菌PBS溶液，其中灌流速度为80ml/min。

3.)保存灭菌：置入75％酒精中保存，密闭封口，竖立存放，25KGyγ射线照射灭菌

2、产品检测指标：

2.1、HE染色(图5)结果显示，在光镜下未见细胞存在，且牛乳内动脉的基底膜完整，各纤维结构无紊乱或疏松、断裂；

2.2、牛乳内动脉脱细胞前后DNA含量，结果如图6，经脱细胞处理后，生物组织材料的DNA残留量显著降低，达到中华人民共和国医药行业标准(＜100ng/mg)

2.3、力学性能数据

新鲜牛乳内动脉力学曲线图及脱细胞后牛乳内动脉力学曲线图依次如图7～8所示，

表1：牛乳内动脉脱细胞前后力学性能各指标平均值比较

结果表明，脱细胞前后两者力学性能各指标未导致明显变化，维持了良好的力学性能。

2.4、体内植入结果(图9～12)

对脱细胞动脉进行新西兰白兔的腹主动脉替换术，可观察到血管在体内的血液相容性可，细胞浸润和粘附可；

术后2周，标本的HE染色提示血管结构仍完整，无明显降解或纤维断裂，并可见细胞在基质中浸润、增殖，提示血管的生物相容性满意，良好的细胞外基质的三维结构和力学性能，有利于体内的长期植入。

2.5对照验证

为确认实施例1中超声和灌流联合的作用，对另一份牛乳内动脉采用上述方案中的0.5％SDS及0.5％Triton X-100放入容器中震荡24小时，后用PBS漂洗10min*3次；再在37℃下，用30u/ml DNase-I及0.3mg/ml RNase-A震荡18小时；在含抗生素无菌PBS液继续震荡漂洗血管24小时，每8小时更换一次含抗生素无菌PBS溶液。脱细胞结束后，予行HE染色及DNA含量测定。

结果图13～15所示，HE染色结果；可见组织中明显存在细胞核残留，说明去细胞效果不满意。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.脱细胞异种小血管的制备方法，其特征在于，包括：

步骤2：以酶解液灌流，然后以含抗生素无菌PBS缓冲液冲洗；

步骤3：以含抗生素无菌PBS缓冲液灌流；

所述洗涤剂为含有抗生素、SDS和Triton X-100的PBS缓冲液；

所述酶解液为含有抗生素、DNase-I和RNase-A的PBS缓冲液；

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述动物血管为哺乳动物的血管。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述动物血管的内径为3～10mm。

4.根据权利要求1～3任一项所述的制备方法，其特征在于，

所述洗涤剂为含有100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素、0.1wt％～0.5wt％SDS和0.1wt％～0.5wt％Triton X-100的PBS缓冲液；

所述酶解液为含有100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素、20～30u/mL DNase-I和0.2～0.3mg/mL RNase-A的PBS缓冲液；

5.根据权利要求1～4任一项所述的制备方法，其特征在于，

步骤1中所述灌流的温度为18～30℃，流速为80ml/min～100ml/min，时间为18h～24h；

6.根据权利要求1～5任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤1中所述清洗、杀菌包括：将血管用抗生素的无菌PBS缓冲液清洗后浸入0.1wt％的苯扎溴铵30min，然后用含抗生素的无菌PBS缓冲液冲洗管腔内侧和外侧10min×3次；

步骤3之后还包括75vol％酒精浸泡，25KGyγ射线照射灭菌的步骤。

7.权利要求1～6任一项所述的制备方法制得的脱细胞异种小血管。

8.制备脱细胞异种小血管的制剂组合，其特征在于，包括：

I)、含抗生素无菌PBS缓冲液；

II)、含有抗生素、SDS和Triton X-100的PBS缓冲液；

III)、含有抗生素、DNase-I和RNase-A的PBS缓冲液。

9.用于制备脱细胞异种小血管的的容器，其特征在于，包括进液管、出液管和灌流筒，所述灌流筒包括筒体和托板，其中：

所述筒体用于盛放灌流液；

所述筒体的内侧设置有用于固定所述进液管或所述出液管的卡槽；

所述托板设置于所述筒体内，所述筒体的筒底和筒口分别与所述托板保持大于零的预设距离，所述托板上设置有多个用于允许所述超声用液体上下流动的第一通孔，以及用于允许所述出液管穿过的第二通孔。

10.用于制备脱细胞异种小血管的装置，其特征在于，包括权利要求9所述的用于制备脱细胞异种小血管的容器、超声仪和蠕动泵。