CN105126170A - 脱细胞真皮基质及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脱细胞真皮基质及其制备方法，脱细胞真皮基质的制备方法包括如下步骤：对哺乳动物的皮肤进行预处理后得到真皮层皮片；对真皮层皮片分别进行脱脂处理、病毒灭活处理和去除免疫原性处理，得到脱细胞真皮基质前体，去除免疫原性处理的操作为：将真皮层皮片交替浸泡在蛋白酶溶液和表面活性剂溶液中；以及对脱细胞真皮基质前体依次进行脱水、冻干和定型，得到脱细胞真皮基质。这种脱细胞真皮基质的制备方法通过将真皮层皮片交替浸泡在蛋白酶溶液和表面活性剂溶液中可以最大限度的降低真皮基质的免疫原性，又保留了真皮基质的正常胶原结构，制得的脱细胞真皮基质具有适当的降解速率、良好的生物相容性与骨诱导能力。
Description
技术领域
本发明涉及医疗材料领域，特别是涉及一种脱细胞真皮基质及其制备方法。
背景技术
自体皮和异体皮的来源极为有限，异种(如：猪、牛等)脱细胞真皮就成为了当今软组织修复技术研究的一大主题。而真皮组织在修复过程中很容易出现一系列的免疫排斥反应，主要来自于细胞和脂肪。脱细胞真皮基质的制备方法有很多种，目的是能够去除真皮内所有的细胞成分而最大限度保留真皮内胶原结构等的完整性。
现有的专利公开了各种脱细胞真皮基质的制备方法，例如公开号为CN104288837A的专利申请公开了一种单纯利用碱液对超薄乳头层皮肤进行脱细胞的方法，但该真皮基质脱细胞方法的适用范围及应用都非常有限；公开号为CN1775189的专利申请采用哺乳动物皮肤用氢氧化钠溶液反复处理，去除组织中细胞遗传物质DNA，再用去污剂去除细胞膜中的脂类物质，但是不能有效去除细胞碎屑成分；公开号为CN201350162Y的专利公开了一种脱细胞异体真皮基质组织补片，但对其制备方法未做详述。
因此针对现有技术的不足，提供一种既能够降低真皮基质的免疫原性，又保留了真皮基质的正常胶原结构的脱细胞真皮基质及其制备方法。
发明内容
基于此，有必要提供一种大小、形状容易控制的脱细胞真皮基质及其制备方法。
一种脱细胞真皮基质的制备方法，包括如下步骤：
对哺乳动物的皮肤进行预处理后得到真皮层皮片；
对所述真皮层皮片分别进行脱脂处理、病毒灭活处理和去除免疫原性处理，得到脱细胞真皮基质前体，其中，所述脱脂处理、所述病毒灭活处理和所述去除免疫原性处理的操作顺序可以相互更换，所述脱脂处理的操作为：将所述真皮层皮片依次浸泡在质量百分含量为0.5％～3％的碱溶液及有机溶剂中进行脱脂，所述去除免疫原性处理的操作为：将所述真皮层皮片交替浸泡在蛋白酶溶液和表面活性剂溶液中；以及
对所述脱细胞真皮基质前体依次进行脱水、冻干和定型，得到脱细胞真皮基质。
在一个实施例中，所述对哺乳动物的皮肤进行预处理后得到真皮层皮片的操作为：用机械法对所述哺乳动物的皮肤进行初步脱脂及除毛，接着用取皮机将所述哺乳动物的皮肤去掉0.15mm～0.4mm表皮与皮下组织后制成厚度为0.3mm～1.0mm的真皮层皮片。
在一个实施例中，所述哺乳动物的皮肤包括依次层叠的皮毛、表皮层、真皮层和皮下组织。
在一个实施例中，所述哺乳动物的皮肤为猪、牛、羊或马的皮肤。
在一个实施例中，所述将所述真皮层皮片依次浸泡在质量百分含量为0.5％～3％的碱溶液及有机溶剂中进行脱脂的操作中，所述真皮层皮片与所述碱溶液的体积比为1：1～4，所述碱溶液的溶质选自碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠和氢氧化钾中的一种，所述真皮层皮片浸泡在所述碱溶液中的时间为6h～24h；
所述将所述真皮层皮片依次浸泡在质量百分含量为0.5％～3％的碱溶液及有机溶剂中进行脱脂的操作中，所述真皮层皮片与所述有机溶剂的体积比为1：1～4，所述有机溶剂选自丙酮、乙醇、正己烷和异丙醇中的一种或两种，所述真皮层皮片浸泡在所述有机溶剂中的操作重复1次～8次，所述真皮层皮片每次浸泡在所述有机溶剂中的时间为15min～60min。
在一个实施例中，所述病毒灭活处理的操作为：按照体积比为1：1～4，将所述真皮层皮片浸泡在病毒灭活溶液处0.5h～8h进行病毒灭活处理，所述病毒灭活溶液为过氧化物和乙醇的混合溶液或过氧化物溶液，所述过氧化物和乙醇的混合溶液中的过氧化物的质量百分含量为0.1％～10％，所述过氧化物和乙醇的混合溶液中的乙醇的质量百分含量为20％～70％。
在一个实施例中，所述病毒灭活处理的操作为：对所述真皮层皮片在50℃～120℃下进行干热灭活处理3h～48h。
在一个实施例中，所述将所述真皮层皮片交替浸泡在蛋白酶溶液和表面活性剂溶液中操作中，所述蛋白酶溶液的溶质为胰蛋白酶、胃蛋白酶或中性蛋白酶，所述蛋白酶溶液的溶质的质量百分含量为0.05％～0.5％，所述表面活性剂溶液的溶质选自烷基葡萄糖苷、十二烷基硫酸钠、TritonX-100、脱氧胆酸钠、3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸、硫代甜菜-10和硫代甜菜-16中的一种，所述表面活性剂溶液的溶质的质量百分含量为0.01％～5％，所述交替浸泡的次数为2次～6次，所述交替浸泡的操作中每次操作的时间为6h～24h。
在一个实施例中，所述对所述脱细胞真皮基质前体依次进行脱水、冻干和定型的操作为：将所述脱细胞真皮基质前体脱水后放入冷冻干燥机冻干，接着置于5MPa～30MPa的压力下保压1h～30h进行定型处理。
一种脱细胞真皮基质，所述脱细胞真皮基质采用如上述的脱细胞真皮基质的制备方法制备得到。
这种脱细胞真皮基质的制备方法通过对真皮层皮片进行脱脂处理、病毒灭活处理和去除免疫原性处理，将真皮层皮片交替浸泡在蛋白酶溶液和表面活性剂溶液中可以最大限度的降低真皮基质的免疫原性，又保留了真皮基质的正常胶原结构，制得的脱细胞真皮基质具有适当的降解速率、良好的生物相容性与骨诱导能力。
附图说明
图1为一实施方式的脱细胞真皮基质的制备方法的流程图；
图2是实施例1制得的制备脱细胞真皮基质的光滑面的扫描电子显微镜照片；
图3是实施例1制得的制备脱细胞真皮基质的粗糙面的扫描电子显微镜照片；
图4是实施例1制得的制备脱细胞真皮基质的截面的扫描电子显微镜照片；
图5是实施例1制得的制备脱细胞真皮基质经过苏木精-伊红染色后的倒置显微镜照片。
具体实施方式
下面主要结合附图及具体实施例对脱细胞真皮基质及其制备方法作进一步详细的说明。
如图1所示的脱细胞真皮基质的制备方法，包括如下步骤：
S10、对哺乳动物的皮肤进行预处理后得到真皮层皮片。
对哺乳动物的皮肤进行预处理后得到真皮层皮片的操作为：用机械法对哺乳动物的皮肤进行初步脱脂及除毛，接着用取皮机将哺乳动物的皮肤去掉0.15mm～0.4mm表皮与皮下组织后制成厚度为0.3mm～1.0mm的真皮层皮片。
哺乳动物的皮肤包括依次层叠的皮毛、表皮层、真皮层和皮下组织。
具体的，哺乳动物的皮肤为猪、牛、羊或马的皮肤。
得到的真皮层皮片可以低温储存备用。具体的，得到的真皮层皮片可以储存在-20℃下备用。
S20、对S10得到的真皮层皮片分别进行脱脂处理、病毒灭活处理和去除免疫原性处理，得到脱细胞真皮基质前体。
需要说明的是，脱脂处理、病毒灭活处理和去除免疫原性处理的操作顺序可以相互更换。
S20中，脱脂处理的操作具体为：将真皮层皮片依次浸泡在质量百分含量为0.5％～3％的碱溶液及有机溶剂中进行脱脂。
将真皮层皮片依次浸泡在质量百分含量为0.5％～3％的碱溶液中的操作中，真皮层皮片与碱溶液的体积比为1：1～4，碱溶液的溶质选自碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠和氢氧化钾中的一种，真皮层皮片浸泡在碱溶液中的时间为6h～24h。
优选的，真皮层皮片与碱溶液的体积比为1：3，碱溶液的溶质为氢氧化钠，碱溶液的溶质的质量百分含量为2％，真皮层皮片浸泡在碱溶液中的时间为8h。
将真皮层皮片依次浸泡在有机溶剂中的操作中，真皮层皮片与有机溶剂的体积比为1：1～4，有机溶剂选自丙酮、乙醇、正己烷和异丙醇中的一种或两种，二次脱脂的操作重复1次～8次，真皮层皮片每次浸泡在有机溶剂中的时间为15min～60min。
优选的，真皮层皮片与有机溶剂的体积比为1：3，有机溶剂为乙醇和异丙醇的混合溶液，二次脱脂的操作重复2次，真皮层皮片每次浸泡在有机溶剂中的时间为60min。
得到的脱脂后的真皮层皮片采用磷酸盐缓冲溶液清洗干净后备用。
S20中，病毒灭活处理的操作可以为：按照体积比为1：1～4，将真皮层皮片浸泡在病毒灭活溶液处0.5h～8h进行病毒灭活处理，病毒灭活溶液为过氧化物和乙醇的混合溶液或过氧化物溶液，过氧化物和乙醇的混合溶液中的过氧化物的质量百分含量为0.1％～10％，过氧化物和乙醇的混合溶液中的乙醇的质量百分含量为20％～70％。
S20中，病毒灭活处理的操作还可以为：对脱脂后的真皮层皮片在50℃～120℃下进行干热灭活处理3h～48h。
S20中，去除免疫原性处理的操作为：将真皮层皮片交替浸泡在蛋白酶溶液和表面活性剂溶液中。
蛋白酶溶液的溶质为胰蛋白酶、胃蛋白酶或中性蛋白酶，蛋白酶溶液的溶质的质量百分含量为0.05％～0.5％，表面活性剂溶液的溶质选自烷基葡萄糖苷、十二烷基硫酸钠、TritonX-100、脱氧胆酸钠、3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸和硫代甜菜-10,-16(SB-10，SB-16)中的一种，表面活性剂溶液的溶质的质量百分含量为0.01％～5％，交替浸泡的次数为2次～6次，交替浸泡的操作中每次操作的时间为6h～24h。
优选的，蛋白酶溶液的溶质的质量百分含量为0.15％，表面活性剂溶液的溶质的质量百分含量为0.5％，交替浸泡的次数为3次，交替浸泡的操作中每次操作的时间为12h。
得到去除免疫原性的真皮层皮片用磷酸盐缓冲溶液清洗干净后备用。
S30、对S20得到的脱细胞真皮基质前体依次进行脱水、冻干和定型，得到脱细胞真皮基质。
将S20得到的脱细胞真皮基质前体进行脱水的操作之前，还需要对脱细胞真皮基质前体进行清洗，具体为：采用质量百分含量为0.9％～7％的NaCl溶液和pH为7～7.5的磷酸盐缓冲溶液交替清洗2次～6次，每次清洗的时间为6h～24h。
优选的，对脱细胞真皮基质前体进行清洗的操作为：采用质量百分含量为5％的NaCl溶液和pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液交替清洗5次～6次，每次清洗的时间为6h。
S30中，对脱细胞真皮基质前体依次进行脱水、冻干和定型的操作为：将脱细胞真皮基质前体脱水后放入冷冻干燥机冻干，接着置于5MPa～30MPa的压力下保压1h～30h进行定型处理。
优选的，定型处理的压力为30MPa，处理时间为1h。
这种脱细胞真皮基质的制备方法通过对真皮层皮片进行脱脂处理、病毒灭活处理和去除免疫原性处理，将真皮层皮片交替浸泡在蛋白酶溶液和表面活性剂溶液中可以最大限度的降低真皮基质的免疫原性，又保留了真皮基质的正常胶原结构，制得的脱细胞真皮基质具有适当的降解速率、良好的生物相容性与骨诱导能力。
一实施方式的脱细胞真皮基质，采用上述的脱细胞真皮基质的制备方法制备得到。
这种脱细胞真皮基质通过上述的方法制备而成，具有光滑面与粗糙面的两面结构；通过采用酶与表面活性剂交替处理，处理过程中对真皮的支架结构破坏较小，能很好的保证纤维支架的完整性，有利于后期细胞的粘附与生长。
下面为具体实施例。
实施例1
(1)制备真皮层皮片：将健康猪的整张腹部与背部皮用机械法进行初步脱脂，用镊子把毛剔除干净，用电动取皮机先将猪皮的皮下组织去掉，再去掉表皮0.4mm，制成厚度为0.3mm的真皮层皮片，储存在-20℃环境中备用；
(2)脱脂处理：一次脱脂是采用质量浓度1.0％的氢氧化钠进行脱脂24h，皮片与脱脂剂的体积比为1:3；二次脱脂是将皮片置于有机溶剂正乙烷、乙醇中进行二次脱脂，正乙烷处理时间为60min，乙醇处理时间为30min；脱脂后的脱细胞真皮基质用磷酸缓冲盐溶液清洗，清洗时间为2h，每隔20min换一次磷酸缓冲盐溶液；
(3)病毒灭活处理：将皮片用过氧乙酸-乙醇溶液进行病毒灭活，过氧乙酸的质量分数为0.2％，乙醇的质量分数为50％，皮片与病毒灭活溶液的体积比为1:4；
(4)脱细胞处理：将步骤(3)制备的真皮层皮片用胃蛋白酶处理24h，再用十二烷基硫酸钠(SDS)处理6h，该步骤重复5次；
(5)清洗及脱水处理：采用质量分数为7％的NaCl溶液和pH值为7.4的磷酸缓冲盐溶液交替清洗，NaCl溶液处理时间为12h，磷酸缓冲盐溶液处理时间为12h，每隔6h换液，重复5次，最后采用机械力脱水设备进行脱水处理；
(6)冻干、定型处理：将清洗及脱水后的脱细胞真皮基质在冻干机中进行冻干，并在30MPa的压力下保压1h进行定型处理，得到所需的脱细胞真皮基质。
将实施例1制得的脱细胞真皮基质在扫描电子显微镜(SEM)下观察，得到图2～图4。
由图2～图4可以看出，实施例1制得的脱细胞真皮基质具有良好的胶原纤维支架结构，光滑面致密，粗糙面为多孔纤维结构，有利于后期成骨细胞在粗糙面的粘附与生长。
对实施例1制得的脱细胞真皮基质进行苏木精-伊红(HE)染色后在倒置显微镜下观察，得到图5。
由图5可以看出，实施例1制得的脱细胞真皮基质中没有细胞碎片残留，并且可以观察到纤维结构。
实施例2
(1)制备真皮层皮片：将健康猪的整张腹部与背部皮用机械法进行初步脱脂，用镊子把毛剔除干净，用电动取皮机先将猪皮的皮下组织去掉，再去掉表皮0.16mm，制成厚度为0.7mm的真皮层皮片，储存在-20℃环境中备用；
(2)脱细胞处理：将步骤(1)制备的真皮层用胃蛋白酶处理12h，再用十二烷基硫酸钠(SDS)处理24h，该步骤重复3次；
(3)脱脂处理：一次脱脂是采用质量浓度3.0％的碳酸氢钠进行脱脂12h，皮片与脱脂剂的体积比为1:4；二次脱脂是将皮片置于有机溶剂异丙醇、乙醇中进行二次脱脂，异丙醇处理时间为60min，乙醇处理时间为60min；脱脂后的脱细胞真皮基质用磷酸缓冲盐溶液清洗，清洗时间为4h，每隔30min换一次磷酸缓冲盐溶液；
(4)病毒灭活处理：将皮片用过氧化氢-乙醇溶液进行病毒灭活，过氧化氢的质量分数为2.0％，乙醇的质量分数为30％，皮片与病毒灭活溶液的体积比为1:4；
(5)清洗及脱水处理：采用质量分数为3％的NaCl溶液和pH值为7.4的磷酸缓冲盐溶液交替清洗，NaCl溶液处理时间为12h，磷酸缓冲盐溶液处理时间为12h，每隔6h换液，重复6次，最后采用机械力脱水设备进行脱水处理；
(6)冻干、定型处理：将经清洗及脱水后的皮片放入特定程序的冷冻干燥机冻干，将冻干后的脱细胞真皮基质置于20MPa的压力下保压3h进行定型处理，得到所需的脱细胞真皮基质。
实施例3
(1)制备真皮层皮片：将健康猪的整张腹部与背部皮用机械法进行初步脱脂，用镊子把毛剔除干净，用电动取皮机先将猪皮的皮下组织去掉，再去掉表皮0.25mm，制成厚度为0.6mm的真皮层皮片，储存在-20℃环境中备用；
(2)病毒灭活处理：将皮片用过氧乙酸-乙醇溶液进行病毒灭活，过氧乙酸的质量分数为0.5％，乙醇的质量分数为50％，皮片与病毒灭活溶液的体积比为1:3；
(3)脱脂处理：一次脱脂是采用质量浓度1.5％的氢氧化钾进行脱脂24h，皮片与脱脂剂的体积比为1:2；二次脱脂是将皮片置于有机溶剂丙酮、异丙醇中进行二次脱脂，丙酮处理时间为10min，异丙醇处理时间为45min；脱脂后的脱细胞真皮基质真空干燥后用磷酸缓冲盐溶液清洗，清洗时间为1h，每隔10min换一次磷酸缓冲盐溶液；
(4)脱细胞处理：将步骤(3)制备的真皮层用胃蛋白酶处理6h，再用3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)处理18h，该步骤重复3次；
(5)清洗及脱水处理：采用质量分数为0.9％的NaCl溶液和pH值为7.4的磷酸缓冲盐溶液交替清洗，NaCl溶液处理时间为8h，磷酸缓冲盐溶液处理时间为8h，每隔2h换液，重复6次，最后采用烘箱干热方法进行脱水处理；
(6)冻干、定型处理：将二次脱脂后的脱细胞真皮基质放入冷冻干燥机进行冻干处理，将冻干后的脱细胞真皮基质置于10MPa的压力下保压48h进行定型处理，得到所需的脱细胞真皮基质。
实施例4
(1)制备真皮层皮片：将健康猪的整张腹部与背部皮用机械法进行初步脱脂，用镊子把毛剔除干净，用电动取皮机先将猪皮的皮下组织去掉，再去掉表皮0.2mm，制成厚度为0.8mm的真皮层皮片，储存在-20℃环境中备用；
(2)病毒灭活处理：将皮片经过90℃干热灭活24h；
(3)脱细胞处理：将步骤(2)制备的真皮层皮片用中性酶溶液处理12h，再用3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)处理8h，该步骤重复2次；
(4)脱脂处理：一次脱脂是采用质量浓度3％的碳酸钠进行脱脂6h，皮片与脱脂剂的体积比为1:2；二次脱脂是将脱细胞真皮基质置于有机溶剂正己烷、异丙醇中进行二次脱脂，正己烷处理时间为60min，异丙醇处理时间为50min，脱脂后的脱细胞真皮基质用磷酸缓冲盐溶液清洗，清洗时间为4h，每隔20min换一次磷酸缓冲盐溶液；
(5)清洗及脱水处理：采用质量分数为0.9％的NaCl溶液和pH值为7.2的磷酸缓冲盐溶液交替清洗，NaCl溶液处理时间为12h，磷酸缓冲盐溶液处理时间为12h，NaCl溶液每隔1h换液，交替清洗3次，最后采用洗衣机进行脱水处理；
(6)冻干、定型处理：将经清洗工艺后的皮片，放入特定程序的冷冻干燥机中冻干，将冻干后的脱细胞真皮基质置于20MPa的压力下保压5h，进行定型处理，得到所需的脱细胞真皮基质。
实施例5
(1)制备真皮层皮片：将健康猪的整张腹部与背部皮用机械法进行初步脱脂，用镊子把毛剔除干净，用电动取皮机先将猪皮的皮下组织去掉，再去掉表皮0.18mm，制成厚度为1.0mm的真皮层皮片，储存在-20℃环境中备用；
(2)脱脂处理：一次脱脂是采用质量浓度1.2％的碳酸氢钠进行脱脂12h，皮片与脱脂剂的体积比为1:3；二次脱脂是将皮片置于有机溶剂正己烷中进行二次脱脂，正己烷处理时间为30min；脱脂后的脱细胞真皮基质真空干燥后用磷酸缓冲盐溶液清洗，清洗时间为3h，每隔30min换一次磷酸缓冲盐溶液；
(3)脱细胞处理：将步骤(2)制备的真皮层用胃蛋白酶处理18h，再用烷基葡萄糖苷处理6h，SDS每隔1h换液，该步骤重复3次；
(4)病毒灭活处理：将脱细胞处理后的皮片用过氧乙酸-乙醇溶液进行病毒灭活，过氧乙酸的质量分数为0.10％，乙醇的质量分数为20％，皮片与病毒灭活溶液的体积比为1:3；
(5)清洗及脱水处理：采用质量分数为0.9％的NaCl溶液和pH值为7.5的磷酸缓冲盐溶液交替清洗，NaCl溶液处理时间为10h，磷酸缓冲盐溶液处理时间为12h，每隔2h换液，交替清洗4次，最后采用机械力脱水设备进行脱水处理；
(6)冻干、定型处理：将经清洗及脱水后的皮片，放入冷冻干燥机进行冻干处理，再将冻干后的脱细胞真皮基质置于5MPa的压力下保压48h进行定型处理，得到所需的脱细胞真皮基质。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
对哺乳动物的皮肤进行预处理后得到真皮层皮片；
对所述真皮层皮片分别进行脱脂处理、病毒灭活处理和去除免疫原性处理，得到脱细胞真皮基质前体，其中，所述脱脂处理、所述病毒灭活处理和所述去除免疫原性处理的操作顺序可以相互更换，所述脱脂处理的操作为：将所述真皮层皮片依次浸泡在质量百分含量为0.5％～3％的碱溶液及有机溶剂中进行脱脂，所述去除免疫原性处理的操作为：将所述真皮层皮片交替浸泡在蛋白酶溶液和表面活性剂溶液中；以及
对所述脱细胞真皮基质前体依次进行脱水、冻干和定型，得到脱细胞真皮基质。
2.根据权利要求1所述的脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于，所述对哺乳动物的皮肤进行预处理后得到真皮层皮片的操作为：用机械法对所述哺乳动物的皮肤进行初步脱脂及除毛，接着用取皮机将所述哺乳动物的皮肤去掉0.15mm～0.4mm表皮与皮下组织后制成厚度为0.3mm～1.0mm的真皮层皮片。
3.根据权利要求1或2所述的脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于，所述哺乳动物的皮肤包括依次层叠的皮毛、表皮层、真皮层和皮下组织。
4.根据权利要求3所述的脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于，所述哺乳动物的皮肤为猪、牛、羊或马的皮肤。
5.根据权利要求1所述的脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于，所述将所述真皮层皮片依次浸泡在质量百分含量为0.5％～3％的碱溶液及有机溶剂中进行脱脂的操作中，所述真皮层皮片与所述碱溶液的体积比为1：1～4，所述碱溶液的溶质选自碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠和氢氧化钾中的一种，所述真皮层皮片浸泡在所述碱溶液中的时间为6h～24h；
所述将所述真皮层皮片依次浸泡在质量百分含量为0.5％～3％的碱溶液及有机溶剂中进行脱脂的操作中，所述真皮层皮片与所述有机溶剂的体积比为1：1～4，所述有机溶剂选自丙酮、乙醇、正己烷和异丙醇中的一种或两种，所述真皮层皮片浸泡在所述有机溶剂中的操作重复1次～8次，所述真皮层皮片每次浸泡在所述有机溶剂中的时间为15min～60min。
6.根据权利要求1所述的脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于，所述病毒灭活处理的操作为：按照体积比为1：1～4，将所述真皮层皮片浸泡在病毒灭活溶液处0.5h～8h进行病毒灭活处理，所述病毒灭活溶液为过氧化物和乙醇的混合溶液或过氧化物溶液，所述过氧化物和乙醇的混合溶液中的过氧化物的质量百分含量为0.1％～10％，所述过氧化物和乙醇的混合溶液中的乙醇的质量百分含量为20％～70％。
7.根据权利要求1所述的脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于，所述病毒灭活处理的操作为：对所述真皮层皮片在50℃～120℃下进行干热灭活处理3h～48h。
8.根据权利要求1所述的脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于，所述将所述真皮层皮片交替浸泡在蛋白酶溶液和表面活性剂溶液中操作中，所述蛋白酶溶液的溶质为胰蛋白酶、胃蛋白酶或中性蛋白酶，所述蛋白酶溶液的溶质的质量百分含量为0.05％～0.5％，所述表面活性剂溶液的溶质选自烷基葡萄糖苷、十二烷基硫酸钠、TritonX-100、脱氧胆酸钠、3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸、硫代甜菜-10和硫代甜菜-16中的一种，所述表面活性剂溶液的溶质的质量百分含量为0.01％～5％，所述交替浸泡的次数为2次～6次，所述交替浸泡的操作中每次操作的时间为6h～24h。
9.根据权利要求1所述的脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于，所述对所述脱细胞真皮基质前体依次进行脱水、冻干和定型的操作为：将所述脱细胞真皮基质前体脱水后放入冷冻干燥机冻干，接着置于5MPa～30MPa的压力下保压1h～30h进行定型处理。
10.一种脱细胞真皮基质，其特征在于，所述脱细胞真皮基质采用如权利要求1～9中任一项所述的脱细胞真皮基质的制备方法制备得到。
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