CN109550081B - 一种脱抗原神经处理方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种脱抗原神经处理方法，包括如下步骤：(1)取离体新鲜神经，使用生理盐水洗净血污、杂质；(2)将神经浸泡于无菌PBS缓冲液中，震荡5‑8h；(3)将神经浸泡于含有羟乙基淀粉和硫酸软骨素的浸泡液中，进行阶段性加压处理1‑2次；(4)对加压处理后的神经进行脱抗原处理。本发明通过PBS预处理、阶段性加压处理、脱抗原处理过程中各参数的相互配合，有效去除神经所附抗原物质，并且保证了生物相容性，降低了细胞毒性。

Description

一种脱抗原神经处理方法
技术领域
本发明涉及医用材料领域，更具体的说是涉及一种脱抗原神经处理方法。
背景技术
神经损伤通常会造成较高的致残率，因此，临床上需要大量优质的神经修复材料对受损部位进行重建修复。然而，人工材料无法达到天然神经的修复效果，自体神经移植通常会造成供区损伤，而同种神经来源受限，因此，利用异种神经进行损伤修复更具优势。异种神经的脱抗原过程往往会影响生物相容性，增加细胞毒性；因此，如何在脱抗原的过程中提高神经的生物相容性，降低细胞毒性成为本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种脱抗原神经处理方法，处理的脱抗原神经具有良好的生物相容性，且细胞毒性低。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种脱抗原神经处理方法，包括如下步骤：
(1)取离体新鲜神经，使用生理盐水洗净血污、杂质；
(2)将神经浸泡于无菌PBS缓冲液中，震荡5-8h；
(3)将神经浸泡于含有羟乙基淀粉和硫酸软骨素的浸泡液中，进行阶段性加压处理1-2次；
(4)对加压处理后的神经进行脱抗原处理。
先使用PBS缓冲液对神经进行浸泡处理，脱除部分抗原物质，有利于后续浸泡液的浸入，并且可提高后续脱抗原处理的效率；将PBS预处理后的神经浸泡于浸泡液中，并进行阶段性加压，一方面促进抗原物质的脱除，一方面将浸泡液成分浸入神经三维结构内部，进而降低加压过程中神经的力学损伤，提高神经的生物相容性，促进后续神经修复过程中的快速愈合。
优选地，步骤(2)中震荡条件为25℃，70-100rpm。
优选地，步骤(3)中神经与浸泡液的比例为10-20g神经/100ml浸泡液。
进一步优选地，进行第2次阶段性加压处理之前需更换浸泡液。
优选地，阶段性加压过程控制温度为4℃。
优选地，阶段性加压处理程序如下：
1)0.5-2MPa，20-30min；
2)10-15MPa，3-5min；
3)25-30MPa，1-2min。
阶段性加压对神经的结构损伤较小，且浸泡液成分浸入效果好，进而后续减少脱抗原步骤处理时间、降低处理试剂浓度，从而降低细胞毒性。
进一步优选地，阶段性加压处理程序如下：
1)1.5MPa，20min；
2)10MPa，5min；
3)25MPa，2min。
优选地，浸泡液中含羟乙基淀粉40-60g/L，硫酸软骨素35-45g/L。
进一步优选地，羟乙基淀粉分子量15-60万Da。
进一步优选地，羟乙基淀粉分子量40万Da。
适宜分子量的羟乙基淀粉浸入神经三维结构之间，形成微型交联结构，进而有利于增加神经的力学强度，并且使浸泡液中其他组份在神经修复愈合过程中缓慢释放，提高神经的生物相容性，促进损伤部位愈合。
进一步优选地，浸泡液中还包括胶原蛋白10-20g/L。
优选地，脱抗原处理步骤如下：
1)将神经置于2MNaCl溶液中浸泡过夜，无菌蒸馏水清洗2-3min；
2)使用SB-10与SDS的混合溶液浸泡神经0.5-1h，混合溶液中SB-10体积分数为0.004％，SDS质量分数为0.07％，无菌蒸馏水清洗2-3min；
3)重复步骤1)-2)；
4)乙醇或异丙醇浸泡过夜，无菌蒸馏水清洗4h以上；
5)无菌PBS中4℃保存。
优选地，步骤5)中无菌PBS中添加有羟乙基淀粉10-15g/L，硫酸软骨素5-10g/L，进一步增加神经的生物相容性。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种脱抗原神经处理方法，通过PBS预处理、阶段性加压处理、脱抗原处理过程中各参数的相互配合，有效去除神经所附抗原物质，并且增加了生物相容性，降低了细胞毒性。
附图说明
下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为细胞毒性试验结果；
其中，A为空白对照组，B为实施例1组，C为对比例1组；D为对比例2组，E为对比例3组。
图2附图为扫描电镜结果；
其中，A为实施例1组，B为对比例1组；C为对比例2组，D为对比2例3组。
图3附图为雪旺细胞H&E染色结果；
其中，A为对照组；B为实施例1组。
具体实施方式
下面将结合本实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种脱抗原神经处理方法，包括如下步骤：
(1)取哺乳动物离体新鲜神经，使用生理盐水洗净血污、杂质。
(2)将神经浸泡于无菌PBS缓冲液中，25℃，100rpm，震荡5h。
(3)将神经置于浸泡液中，20g神经/100ml浸泡液，4℃下进行阶段性加压处理，阶段性加压处理程序如下：
1)1.5MPa，20min；
2)10MPa，5min；
3)25MPa，2min。
浸泡液组分如下：羟乙基淀粉(分子量40万Da)50g/L，硫酸软骨素40g/L，胶原蛋白15g/L，加水溶解，调节pH 6.8-7.2。
(4)对加压处理后的神经进行脱抗原处理，具体步骤如下：
1)将神经置于2MNaCl溶液中浸泡过夜，无菌蒸馏水清洗2min；
2)使用SB-10与SDS的混合溶液浸泡神经0.5h，混合溶液中SB-10体积分数为0.004％，SDS质量分数为0.07％；无菌蒸馏水清洗2min；
3)重复步骤1)-2)1次；
4)乙醇浸泡过夜，无菌蒸馏水清洗4h；
5)无菌PBS中4℃保存；无菌PBS中添加有羟乙基淀粉10g/L，硫酸软骨素5g/L。
实施例2
一种脱抗原神经处理方法，包括如下步骤：
(1)取哺乳动物离体新鲜神经，使用生理盐水洗净血污、杂质。
(2)将神经浸泡于无菌PBS缓冲液中，25℃，70rpm，震荡8h。
(3)将神经置于浸泡液中，10g神经/100ml浸泡液，4℃下进行阶段性加压处理，阶段性加压处理程序如下：
1)0.5MPa，30min；
2)15MPa，3min；
3)30MPa，1min。
处理后更换新的浸泡液，重复上述程序1次。
浸泡液组分如下：羟乙基淀粉(分子量60万Da)50g/L，硫酸软骨素35g/L，胶原蛋白20g/L，加水溶解，调节pH 6.8-7.2。
(4)对加压处理后的神经进行脱抗原处理，具体步骤如下：
1)将神经置于2MNaCl溶液中浸泡过夜，无菌蒸馏水清洗3min；
2)使用SB-10与SDS的混合溶液浸泡神经0.8h，混合溶液中SB-10体积分数为0.004％，SDS质量分数为0.07％；无菌蒸馏水清洗3min；
3)重复步骤1)-2)1次；
4)异丙醇浸泡过夜，无菌蒸馏水清洗5h；
5)无菌PBS中4℃保存；无菌PBS中添加有羟乙基淀粉15g/L，硫酸软骨素10g/L。
实施例3
一种脱抗原神经处理方法，包括如下步骤：
(1)取哺乳动物离体新鲜神经，使用生理盐水洗净血污、杂质。
(2)将神经浸泡于无菌PBS缓冲液中，25℃，80rpm，震荡6h。
(3)将神经置于浸泡液中，15g神经/100ml浸泡液，4℃下进行阶段性加压处理，阶段性加压处理程序如下：
1)1MPa，25min；
2)12MPa，4min；
3)28MPa，1.5min。
浸泡液组分如下：羟乙基淀粉(分子量15万Da)60g/L，硫酸软骨素45g/L，胶原蛋白10g/L，加水溶解，调节pH 6.8-7.2。
(4)对加压处理后的神经进行脱抗原处理，具体步骤如下：
1)将神经置于2MNaCl溶液中浸泡过夜，无菌蒸馏水清洗3min；
2)使用SB-10与SDS的混合溶液浸泡神经1h，混合溶液中SB-10体积分数为0.004％，SDS质量分数为0.07％；无菌蒸馏水清洗3min；
3)重复步骤1)-2)1次；
4)乙醇浸泡过夜，无菌蒸馏水清洗6h；
5)无菌PBS中4℃保存；无菌PBS中添加有羟乙基淀粉12g/L，硫酸软骨素8g/L。
实施例4
设置对比例，其中，对比例1无加压处理步骤，PBS预处理后直接置于2M NaCl溶液中浸泡，SB-10与SDS混合溶液浓度加倍，处理时间加倍，其余步骤同实施例1。
对比例2加压处理过程不使用浸泡液浸泡，脱抗原处理后无菌PBS保存液中不添加羟乙基淀粉和硫酸软骨素，其余步骤同实施例1。
对比例3神经洗净血污、杂质后不进行脱抗原处理。
对实施例1、对比例1-3制备的脱抗原神经进行细胞毒性试验。
37℃下使用含血清的DMEM-H培养基浸提脱抗原神经24h，浸提比例0.2g/mL，所得浸提液备用。
培养L929细胞，接入96孔板，每孔100μL浸提液，细胞密度1×105/mL，48h后进行MTT检测，设置未浸提DMEM-H培养基组为空白对照。
按如下公式计算细胞增值率：
RGR＝(A570nm-A630nm)×100/(AB570nm-AB630nm)
式中：
RGR-相对增值率，％；
A-供试样品组吸光度；
AB-空白对照组吸光度。
实验结果如图1及表1所示，实施例1组细胞数量最多，且状态最好；对比例1细胞数量最少，对比例3细胞中有浊物。
表1
Figure BDA0001881748140000081
实施例5
对实施例1、对比例1-3处理的神经进行生物相容性试验。
试验所用细胞系为雪旺细胞，培养基为DMEM-H培养基，接种密度为1×105/mL，72h后扫描电镜观察细胞附着状态，HV 25.00kV，WD 10.7-10.8mm，典型图片放大倍数1200X，扫描电镜结果如图2所示，未进行脱抗原处理的神经(对比例3)上几乎观察不到雪旺细胞的存在，其余组均观察到了雪旺细胞，少量细胞观察到了伪足，其中实施例1组的细胞数明显多于其余组，对比例1组细胞数相对较少。
实施例6
对实施例1处理的神经上附着的雪旺细胞进行H&E染色，并以无毒材料上附着的雪旺细胞作为对照，结果如图3所示，二者无明显区别。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (8)

1.一种脱抗原神经处理方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取离体新鲜神经，使用生理盐水洗净血污、杂质；
(2)将神经浸泡于无菌PBS缓冲液中，震荡5-8h；
(3)将神经浸泡于含有羟乙基淀粉和硫酸软骨素的浸泡液中，进行阶段性加压处理1-2次；
所述浸泡液中含羟乙基淀粉40-60g/L，硫酸软骨素35-45g/L；
羟乙基淀粉分子量为15-60万Da；
所述阶段性加压处理程序如下：
1)0.5-2MPa，20-30min；
2)10-15MPa，3-5min；
3)25-30MPa，1-2min；
(4)对加压处理后的神经进行脱抗原处理。
2.根据权利要求1所述的一种脱抗原神经处理方法，其特征在于，所述步骤(2)中震荡条件为25℃，70-100rpm。
3.根据权利要求1所述的一种脱抗原神经处理方法，其特征在于，所述步骤(3)中神经与浸泡液的比例为10-20g神经/100ml浸泡液。
4.根据权利要求1所述的一种脱抗原神经处理方法，其特征在于，所述阶段性加压过程控制温度为4℃。
5.根据权利要求1所述的一种脱抗原神经处理方法，其特征在于，所述阶段性加压处理程序如下：
1)1.5MPa，20min；
2)10MPa，5min；
3)25MPa，2min。
6.根据权利要求5所述的一种脱抗原神经处理方法，其特征在于，所述浸泡液中还包括胶原蛋白10-20g/L。
7.根据权利要求1所述的一种脱抗原神经处理方法，其特征在于，所述脱抗原处理步骤如下：
1)将神经置于2M NaCl溶液中浸泡过夜，无菌蒸馏水清洗2-3min；
2)使用SB-10与SDS的混合溶液浸泡神经0.5-1h，混合溶液中SB-10体积分数为0.004％，SDS质量分数为0.07％，无菌蒸馏水清洗2-3min；
3)重复步骤1)-2)；
4)乙醇或异丙醇浸泡过夜，无菌蒸馏水清洗4h以上；
5)无菌PBS中4℃保存。
8.根据权利要求7所述的一种脱抗原神经处理方法，其特征在于，所述步骤5)中无菌PBS中添加有羟乙基淀粉10-15g/L，硫酸软骨素5-10g/L。
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