CN1861202A - 异种脱蛋白骨支架材料及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及骨支架材料，特别是涉及一种用于修复各种原因引起的骨缺损的异种骨支架材料，本发明进一步涉及制备所说的骨支架材料的方法。本发明的骨支架材料基本上没有免疫原性，但保留有良好的机械强度和力学性能。

Description

异种脱蛋白骨支架材料及其制备方法

技术领域

本发明涉及骨支架材料，特别是涉及用于修复各种原因引起的骨缺损的组织工程骨支架材料及其制备方法。

背景技术

随着组织工程领域骨缺损修复研究的进展，骨支架材料成为限制组织工程骨能否真正应用于临床的一个关键因素。目前，对骨组织工程中支架材料的选择尚有分歧(Boyan Bo，Lonmann CH，Romeo J，Schwartz Z，Bone and cartilagetissue engineering，Clin Plast Surg，1999，26(4)：629-645.)，应用于骨组织工程的支架材料种类繁多，国内外学者作了许多有益的尝试(Burg KJ，Porter S，Kellam JF.Biomaterials developments for bone tissue engineering.Biomaterials，2000，21(23)：2347-2359.Karabuda C，Ozdemir O，Tosun T，et al.Histological andclinical evaluation of 3 different grafting materials for sinus lifting procedure basedon 8 cases.J Periodontol，2001，72(10)：1436-1442.)。理想的骨组织工程支架材料应具备良好的生物相容性、可降解性、合理的三维立体孔隙一网架结构、可塑性和一定的机械强度以及良好的细胞一材料界面等特点(Burg KJ，Porter S，KellamJF.Biomaterials developments for bone tissue engineering.Biomaterials，2000，21(23)：2347-2359)。当前骨组织工程研究中所用的支架材料有两类：(1)生物衍生材料，如，冻干脱钙骨、脱蛋白骨和胶原等；(2)人工合成材料，如聚乳酸、聚乙醇酸和聚偶磷氮等。采用不同理化技术制备的天然衍生骨支架材料与化学合成材料相比，材料经脱脂、脱钙、脱蛋白等处理后，去除了具有阻滞作用的脂质和杂质蛋白，降低了材料的抗原性，且材料的天然网孔系统未受破坏。这种天然结构利于种子细胞的粘附和生长，并为细胞外基质的分泌提供了宽大的表面积和内部空间，具有良好的组织亲和性和结合力(Mendes SC Tibbe JM，Veenhof M，et al.Bone Tissue Engineered Implants Using Human Bone MarrowStromal Cells：Effect of Cluture Conditions and Donor Age.Tissue Engineering，2002，8(6)：911-919；Orban JM，Marra KG，Hollinger J.Composition Options of TissueEngineered Bone.Tissue Engineering，2002，8(4)：529-536)。由于骨组织结构在不同种属动物间存在高度同源性，生物衍生骨植入后易于被宿主细胞识别而替代，显示良好的生物降解性，材料来源丰富，制作简便，且理化性能、组织相容性、生物降解性和功能适应性方面优于人工合成材料。

以往的研究发现，完全脱蛋白骨，如Oswestry骨、Anorganic骨等，虽然基本上消除了抗原性，但机械强度却相对较差(Valentini P，Abensur D，Densari D，etal.Histological evaluation of Bio-Oss in a 2-stage sinus floor elevation andimplantation procedure：a human case report.Clin Oral ImplantsRes，1998，9(1)：59-67)。而部分脱蛋白骨，如Kiel骨，虽然机械强度尚可，但具有弱抗原性，效果不理想。所以，在具体制作工艺中，异种骨脱蛋白处理的无机与有机成分比至关重要。异种骨有机成分中很多非胶原的酸溶性蛋白具有免疫原性，去除不充分则保留较强抗原性，但去除过多胶原蛋白则材料易碎，影响生物力学强度。

基于以往脱蛋白制备工艺中所存在的缺陷，全面地分析了免疫原的消除与骨体机械强度的保留之间的关系。在此基础上，本发明全面改进了异种骨组织的处理方法和步骤，使本发明的异种骨既消除了抗原性，又能保有良好的生物力学强度和骨诱导性，从而使之在人体骨修复中更好的作用。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种异种脱蛋白组织工程骨支架材料，使之具有(1)没有或只有极低的免疫原性；(2)有足够的抗压强度和机械耐受性；(3)具有良好的骨传导性和骨诱导性，(4)具有良好的三维结构和高孔隙率，从而更有利于细胞的植入和粘附；(5)可根据需要随意加工成各种形状和大小，并在植入后可保持再生组织的大体形态内态；(6)可与骨形态蛋白(BMP)、转移生长因子-β等生物学活性因子复合，有效地诱导骨发生。

本发明人在仔细研究和分析了已有异种骨支架材料及其生产方法的基础上，巧妙采用并组合了一系列有机溶剂、酶制剂和其他化学试剂处理工艺，并结合使用已知的Soxhlet提取器，经过反复大量的实验研究，终于成功地制备出了本发明的异种骨支架材料。我们对本发明异种脱蛋白骨组织的各种物理和化学的分析结果显示，其具有理想的骨组织工程支架材料应具备的所有特点和良好性能。特别是，我们用本发明异种脱蛋白骨组织与目前市售的同类产品所作的比较试验表明，本发明的异种脱蛋白骨在生物相容性、可降解性、三维立体孔隙和网架结构、可塑性和机械强度等理化和生物学性能方面均明显好于Oswestry骨、Anorganie骨等现有技术产品(数据未示出)。

本发明的第二个目的是提供一种制备所述异种脱蛋白组织工程骨支架材料的方法。

为了得到本发明的异种脱蛋白组织工程骨支架材料，首先对新鲜猪肋骨及四肢骨进行预处理：去除全部软组织和骨髓、分别锯或切割成长度约10mm、20mm和30mm，宽度及厚度相等的骨块。然后，依次按下述方法处理：

首先，在常温下，将切割或锯好的骨组织置于20％H₂O₂中浸泡24小时，用ddH₂O冲洗(30分钟)冲洗后，再次在20％H₂O₂中浸泡24小时。用ddH₂O冲洗(30分钟)后，依次用叠氮钠(5mmol/L)、含1％tritonX-100的NaOH(1N)、5％胰蛋白酶和20％H₂O₂各浸泡12小时，并于每次浸泡后分别用ddH₂O冲洗30分钟。然后，再依次用1∶1甲醇/氯仿混合物、无水乙醚、乙二胺和无水乙醇浸泡24、12、24和24小时。并且，每次浸泡之间均用ddH₂O冲洗30分钟，但无水乙醇浸泡24小时后，应使用ddH₂O继续浸泡24小时。将经过如上处理的骨组织于50℃烘箱中烘干。最后，用⁶⁰Co(25KGY)辐照灭菌。

其中，1∶1甲醇/氯仿混合浸泡、无水乙醚和乙二胺浸泡步骤是在soxhlet提取器内完成的。将脱蛋的骨放入提取管内，依次加入1∶1甲醇/氯仿、无水乙醚及乙二胺，于提取器中60-70℃分别加热24小时、12小时和24小时，上述溶液在提取器中流动为10次/小时，以充分溶解并去除骨中的脂肪细胞或组织，有效地抑制内源性酶的活性。

本发明的异种骨来源于动物体内，因此使之材料来源广泛、成本低廉。特别是，由于动物来源的材料具有与人细胞外基质非常相似的网架结构和成分，所以经过简单的去脂、去细胞和蛋白等处理后，即可得到可直接用于临床的本发明的支架材料。本发明人在已知技术的基础上，选择并优化各种不同浓度的试剂、选择并确立必要的处理条件及其设备，最终令人惊奇地制备出理化和生物学特征及性能都好于现有同类产品的异种脱蛋白组织工程骨支架材料。

本发明方法中处理骨组织所使用的氧化剂、有机溶剂、去污剂、蛋白酶等试剂均为本领域熟知的常用试剂。这些试剂其中，双氧水(H₂O₂)的作用在于脱除骨内蛋白质，并使蛋白质变性；20％ H₂O₂可使大部分骨组织中的胶原蛋白变性并发挥正常生理功能，其中胶原不仅为细胞提供支持和保护作用，而且与细胞的粘附、生长、表型表达均有密切关系；叠氮钠的作用是使骨细胞失活；TritonX-100为常用的非离子性除垢剂，用于破坏细胞膜脂及脂蛋；强碱NaOH溶液处理是为了进一步去除特异性非胶原蛋白；胰蛋白酶消化旨在使细胞间蛋白质水解，以更有利于细胞的游离；氯仿和甲醇浸泡不仅可以溶解并去除骨中的脂肪细胞或组织，而且可有效地抑制内源性酶的活性；乙醚处理则进一步去除残存的脂肪细胞；乙二胺的功能在于去除骨内磷蛋白、唾液蛋白等结合蛋白质，最后，用无水乙醇浸泡是为了进一步清除脂溶性物质并吸除水份。

虽然本发明的方法中使用了较多的强氧化剂、有机溶剂、去污剂、蛋白酶等试剂处理骨组织，但由于本发明人基于已有经验，在试剂的选择、处理时间和条件上均作了许多改进，所以为得到具有优于现有技术的异种脱蛋白骨支架材料提供了前提和必要的技术支持。

与以往使用的脱蛋白技术相比，由于本发明打破传统观念，有效的选择并组合使用了各种浸泡和残留蛋白质和细胞等的提取试剂，并且在必要时结合使用了soxhlet提取器。因此，在没有破坏骨组织固有形态和亚结构的前提下，成功地去除了几乎所有抗原物质。从而得到既消除了免疫原性，又保留有良好和足够的机械强度和性能的异种脱蛋白骨支架材料。而这，也正是体现了本发明的技术进步。

附图说明

图1显示本发明脱蛋白骨的扫描电镜(SEM)照片，可见有原骨组织支架的三维多孔结构及网状孔隙。

图2显示本发明的脱蛋白骨组织样品的红外分析图谱。可见1400-1700cm^-1处有胶原相关键的振动。

图3显示未经处理的新鲜骨组织样品的红外分析图谱。其中在2927cm^-1处可观察到C-H键的拉伸振动伴有一尖锐峰。

图4显示植入按本发明方法制备的异种脱蛋白骨组织后1周，局部有以淋巴细胞和单核细胞为主的大量炎性细胞浸润(HE×400)。

图5显示植入后2周，局部炎性细胞浸润明显减少(HE×400)。

具体实施方式

以下实施例旨在举例说明，而不是以任何方式限制本发明。

一.制备异种脱蛋白组织工程骨支架材料

首先对新鲜猪肋骨及四肢骨进行预处理：去除全部软组织和骨髓、分别锯或切割成长度约10mm、20mm和30mm，宽度及厚度相等的骨块。然后，依次按下述方法处理：

在常温下，将切割或锯好的骨组织置于20％H₂O₂中浸泡24小时，用ddH₂O冲洗(30分钟)冲洗后，再次在20％H₂O₂中浸泡24小时。用ddH₂O冲洗(30分钟)后，依次用叠氮钠(5mmol/L)、含1％tritonX-100的NaOH(1N)、5％胰蛋白酶和20％H₂O₂各浸泡12小时，并于每次浸泡后分别用ddH₂O冲洗30分钟。然后，再依次用1∶1甲醇/氯仿混合物、无水乙醚、乙二胺和无水乙醇浸泡24、12、24和24小时。并且，每次浸泡之间均用ddH₂O冲洗30分钟，但无水乙醇浸泡24小时后，应使用ddH₂O继续浸泡24小时。将经过如上处理的骨组织于50℃烘箱中烘干。最后，用⁶⁰Co(25KGY)辐照灭菌，即得异种脱蛋白组织工程骨支架材。

上述方法中1∶1甲醇/氯仿混合浸泡、无水乙醚和乙二胺浸泡是在soxhlet提取器内完成的。将脱蛋的骨放入提取管内，依次加入1∶1甲醇/氯仿、无水乙醚及乙二胺，于提取器中60-70℃分别加热24小时、12小时和24小时，上述溶液在提取器中流动为10次/小时，以充分溶解并去除骨中的脂肪细胞或组织，有效地抑制内源性酶的活性。

二.将上述所得异种脱蛋白组织工程骨支架材进行分析：

实施例1：本发明的异种脱蛋白骨的理化性质分析

对制备的异种脱蛋白骨进行组织学、扫描电镜、红外线光谱、X射线衍射分析、X线能量散射分析、微量凯氏定氮及力学性能测定。这些观察和实验分析的结果如下所述。

1.大体及组织学观察：制得的脱蛋白骨为白色柱状(大小约10mm×5mm×3mm)，肉眼可见多孔蜂窝状结构、质地坚硬、无异味。HE染色显示，脱蛋白骨小梁结构清晰，间质及细胞已脱去，皮质骨板层状结构完整；而新鲜骨可见间质及细胞。脱蛋白骨间质胶原纤维染色阳性，粘蛋白染色阴性；而新鲜骨组织粘蛋白及胶原染色均阳性。

2.扫描电镜(SEM)观察：脱蛋白骨可见有原骨组织支架的三维多孔结构及网状孔隙(参见图1)，孔隙之间相互交通，其孔隙率为65.5％±6.45％，孔径大小为472.5±7.02μm。

3.红外光谱分析：本发明的脱蛋白骨在1400-1700cm^-1处有胶原相关键的振动，表明有胶原的存在(图2)。而新鲜骨在2927cm^-1处可观察到C-H键的拉伸振动伴有一尖锐峰，表明骨中含有一定量脂肪(图3)。

4.X射线衍射分析：新鲜骨与脱蛋白骨的图谱均为曲线型羟基磷灰石，但新鲜骨含有较多的非晶成分。

5.X射线能量散射分析：新鲜骨的Ca/P比值为1.71±0.95，而脱蛋白骨为1.68±0.76，二者间无显著性差异(P＞0.05)。

6.蛋白质含量测定：用微量凯氏定氮法测得新鲜骨粉蛋白质含量为26.6±2.23％，脱蛋白骨的19.1±2.14％，二者差异显著(P＜0.01)。

7.力学性能测定：新鲜骨和脱蛋白骨的载荷变形曲线为受载后函数记录仪描记出骨块截荷-变形曲线，随着载荷的增加，骨块被压缩，曲线由线性关系变为非线性改变，并形成第一个波峰，即载体变化不大而变形增加明显。此时，可见骨块有部分骨小粱断裂。当时间持续形成第二个波峰时，更多骨小粱被压缩，最后破坏，脱蛋白骨除弹性模量升高外，压缩破坏载荷及破坏极限载荷与新鲜骨之间无显著性差异(参见表1)。

表1  两组材料的生物力学强度比较(n＝10)

测试组	压缩载荷(KN)	压缩极限(MPa)	弹性模量(MPa)
				新鲜骨脱蛋白骨	3.01±0.952.93±0.64	39.03±5.1237.1±4.51	718.39±210.86*936.56±297.64

*与新鲜骨比较P＜0.05

因此可以看出，本发明的脱蛋白骨具有良好的力学强度、机械耐受性，并具有良好的三维结构和高孔隙率。

实施例2：本发明的异种脱蛋白骨的生物安全性研究

本实施例旨在采用急性和亚急性毒理试验、溶血试验、热源试验、皮内注射试验、肌肉埋植试验及细胞毒性试验等标准方法，评价本发明的异种脱蛋白骨植入体内后的生物安全性。以下简要说明这些实验的结果。

1.急性和亚急性毒理试验：小鼠观察期内，受体小鼠食欲正常精神饱满，活动自如，无呼吸抑制、急促等不良反应。72小时后动物体重明显增加。解剖观察无腹水，腹腔内容物无粘连，HE染色显示肝、脾、肾等器官均未见异常。

2.溶血试验：本发明脱蛋白骨的浸提液对兔血溶血率为2.82％(参见表2)

表2  溶血试验结果(OD值)

分且	吸光度值(OD值)
		阳性对照组阴性对照组浸提液组	0.7920.0820.084

注：脱蛋白骨的溶血指数＝(0.084-0.082)/(0.792-0.082)×100％＝2.82％

3.热源试验：所有实验动物注射前后体温波动在0.8℃以内，且注射后不高于注射前体温，波动幅度小于1.4℃。

4.皮肤刺激试验：注射后各时间点观察显示，注射浸提液及生理盐水处未发现有红斑，水肿或坏死出现，注射20％酒精生理盐水后6小时至72小时可见注射区有1.5-2.0cm直径的红斑，中心部分水肿明显，然后红斑加深并渐渐出现中心部分坏死结痂。

5.肌肉埋植试验：植入后48小时伤口有红肿并有炎性细胞浸润，1周后伤口愈合。植入2周后，纤维包膜开始形成，且后炎性细胞减少，材料周围可见多核巨细胞吞噬颗粒。镜下未见有肌肉组织变性、坏死或植入物被排斥现象(图4、5)

6.细胞毒性试验：异种脱蛋白骨对L929细胞的细胞毒性为0级(见表3)，细胞增殖率与阴性对照之间无显著性差异(P＞0.05)，与阳性对照组比较差异显著(P＜0.05)。

表3  不同材料对L929细胞的影响(OD值)

分组	2d	4d
			阴性对照管试验管阳性对照管	0.17±0.020.21±0.040.16±0.01	0.27±0.030.3±0.050.26±0.03*

*：与试验组比较P＜0.05

实施例3：本发明的异种脱蛋白骨的细胞相容性研究

本实施例描述异种脱蛋白骨的细胞相容性研究的结果。

将本发明的异种脱蛋白骨与骨髓基质细胞复合培养后，采用倒置相差显微镜和扫描电镜观察贴壁生长状态，并以MTT法、流式细胞仪及碱性磷酸酶(ALP)活性检测来判断细胞的被移植出来上的存活率、分化水平及活力和代谢水平。

1.倒置相差显微镜和组织学观察

脱蛋白骨与骨髓基质细胞符合培养24小时后，细胞在材料表面和孔隙内均可粘附和分布，随着培养时间的延长，细胞进一步生长、分化和增殖。骨髓基质细胞与材料复合培养7天后，可见细胞贴壁、聚集成团或连接成网状。HE染色显示细胞在材料孔隙内增殖并有基质分泌。

2.扫描电镜观察

骨髓基质细胞与材料符合培养7天后，细胞在材料表面均可粘附。细胞呈梭形或多角形，相邻细胞间有突起相互连接，细胞周围有网状胶原附着。

3.MTT法检测

与细胞单独培养相比较，骨髓基质细胞与材料复合培养1、3、5和7天，细胞活力无统计学意义(P＞0.05)。

表4  材料对骨髓基质细胞活力的影响(n＝4，均数±标准差)

组别	1天	3天	5天	7天
					材料细胞细胞	0.1471±0.00720.1461±0.0075	0.3051±0.01060.3348±0.0291	0.5913±0.00810.6468±0.0273	0.6189±0.00510.6861±0.0261

P＞0.05

4.流式细胞仪检测细胞周期

与单独细胞培养相比，骨髓基质细胞与材料复合培养7天后，各组细胞周期未见明显变化，未见异常倍体细胞(参见表5)。

表5  材料对骨髓基质细胞周期和倍体水平的影响(n＝4)

组别	DNA合成前期(G1，％)	DNA合成期(S，％)	分裂前期及分裂期裂期(G2/M，％)	G1期细胞DNA含量
					材料细胞细胞	68.874.9	12.210.1	18.616.1	48.146.1

5.碱性磷酸酶(ALP)活性定量检测

随着培养时间的延长，骨髓基质细胞与材料复合培养与单独培养两组细胞APL活性都用所增加，但同一时间点两组间ALP水平无显著差异(P＞0.05)。

表6  碱性磷酸酶活性测定值(u/g蛋白质，平均数±标准差)

组别	1天	3天	5天	7天
					材料细胞细胞	2.031±0.7411.923±0.610	3.412±0.5413.143±0.849	5.906±0.4915.512±0.912	6.869±0.8336.619±0.613

P＞0.05

由以上观察和实验研究的结果可以看出，本发明的异种脱蛋白骨确实具有良好的细胞相容性。

实施例4：本发明的异种脱蛋白骨在复合细胞体内异位成骨研究

本实施例使用本发明的异种脱蛋白骨作为骨髓基质细胞支架材料，研究将其植入异种异体动物体内植入后对受体动物成骨作用的影响。

将本发明的异种脱蛋白骨与培养的骨髓基质细胞复合培养1周后，植入兔背部肌肉内(实验组)，同时使用常规方法制备的异种脱蛋白骨植入作为对照组，进行平行的比较实验。植入手术后第4和8周，手术取出被植入的材料，进行肉眼观察、常规组织学检查、血浆和组织内碱性磷酸酶(ALP)含量检测，借以分析和比较植入物表面的成骨水平，进而判断异种脱蛋白骨移植物对对受体动物成骨作用和骨再生的影响。

大体标本观察可见，植入手术后4和8周，各组动物的植入材料周围软组织均未见坏死、化脓、积液等现象。但可见材料有大量纤维组织和血管软组织包裹并长入，而且难以分离。

2.ALP活性检测

与植入后4周相比，植入8周后的实验组动物的血浆ALP活性明显升高(P＜0.05)。而且，与对照组相比，在植入后同一时间，实验组动物也表现有较高的ALP活性(P＜0.01)(参见表7)。

表7  各组材料ALP活性测定结果(IU，)(平均数±标准差)

组别

术后4周

术后8周

材料细胞材料

1.014±0.2360.071±0.012

2.163±0.6150.161±0.048

植入后4周，与实验组相比P＜0.05，与同一时相检测的对照组相比^*P＜0.01

3.常规组织学检查

术后4周，实验组可见有软骨带形成，其中有少量钙化的骨组织，周围可见梭形间充质细胞向软骨细胞分化。术后8周，可见编织骨和髓腔形成，其内见有岛状小梁骨，周边仍可见软骨细胞。对照组中未见任何软骨或新骨形成，随植入时间延长，并可见材料周围的肌肉组织、纤维组织、血管等由外向内逐渐长入材料孔隙内。

4.成骨程度定量分析

使用常规方法评定实验组植入物的成骨程度。结果可见，4周时为2.89±0.61，8周时为4.78±0.81。且随植入时间的延长，新骨更趋成熟。

实施例5：本发明的异种脱蛋白骨的免疫学研究

本实施例研究异种脱蛋白骨植入体内后可能引起的免疫反应，为本发明异种骨组织的临床应用提供免疫学依据。

分别将按本发明方法制备的异种脱蛋白骨、自体骨和未处理的新鲜异种骨植入BALB/C小鼠的股后肌袋。然后，分别于术后第1、2、4和6周处死动物，观察移植后小鼠的细胞、体液免疫反应及局部组织反应。

结果：

1.淋巴细胞刺激增殖实验

将上述三种不用的骨组织植入BALB/C小鼠后，观察受体动物在各时相点上的脾淋巴细胞遭受相应植入物刺激时的增殖反应(参见下列表8)。

表8  植入后体外淋巴细胞二次刺激增殖刺激指数(SI)

组别

1w

2w

4w

6w

新鲜骨脱蛋白骨自体骨

1.810±0.4931.032±0.4010.961±0.461

3.245±0.9131.124±0.3561.093±0.481

3.025±0.9781.104±0.3160.937±0.305

2.149±0.6710.942±0.3890.945±0.298

由表8所示的结果可以看出，植入1周后，新鲜骨组织淋巴细胞体外增殖刺激指数明显高于脱蛋白骨及自体骨组(P＜0.01)，植入后2周后，新鲜骨组织淋巴细胞刺激指数达高峰，而脱蛋白骨及自体骨组无明显升高，SI值明显低于新鲜骨组(P＜0.01)。

这些结果提示，新鲜骨具有较强的免疫原性，植入体内后可刺激机体免疫系统，引发明显的细胞免疫。而本发明的脱蛋白骨则对淋巴细胞增殖影响不大，抗原性微弱。

血清特异性抗体水平检测：各实验组动物植入经处理的异种骨后，血清特异性抗体检测结果如下列表9所示。

表9  植入后血清特异性抗体(OD值)

组别	1w	2w	4w	6w
					新鲜骨脱蛋白骨自体骨	0.171±0.0790.102±0.0490.091±0.041	0.214±0.1120.119±0.0310.113±0.045	0.348±0.1190.161±0.0720.172±0.031	0.289±0.1240.134±0.0710.095±0.046

新鲜骨组在各时相点明显高于脱蛋白骨及自体骨组(P＜0.05)

由表9所示的数据可以看出，本发明的脱蛋白骨和自体骨在各时相点的OD值之间未见显著性差异(P＞0.05)。此结果表明，本发明的脱蛋白骨植入动物体内后，并没有诱导明显可见的体液免疫反应。

组织学观察：新鲜骨植入后，各时相点均可见局部的大量炎性细胞浸润，即表现出明显的排斥反应；本发明的脱蛋白骨及自体骨尽管在植入初期有少量中性白细胞渗出，但2-4周后浸润细胞消失，并显示有大量的纤维组织长入。此结果表明，本发明的脱蛋白骨具有较好的组织相容性。

Claims (5)

1、一种用于组织工程的异种骨支架材料，其特征在于该材料既消除了免疫原性，又保留有良好的机械强度和力学性能。

2、根据权利要求1的异种骨支架材料，其特征在于该材料来源于猪。

3、制备根据权利要求1的异种骨支架材料的方法，该方法包括：

(1)将经过预处理的异种骨置于双氧水中浸泡24后，依次在浓度为5mmol/L的叠氮钠、含1％tritonX-100的1N氢氧化钠溶液、5％胰蛋白酶和20％H₂O₂溶液中各浸泡12小时，

(2)然后再依次用1∶1甲醇/氯仿混合物、无水乙醚、乙二胺和无水乙醇各浸泡24、12、24和24小时。

4、根据权利要求3的方法，特征在于其中步骤(2)是在soxhlet提取器内完成的。

5、根据权利要求3的方法，特征在于所说的材料来源于猪。

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