KR102191912B1

KR102191912B1 - 난각막(Egg Shell Membrane)을 추출하는 방법 및 난각막을 추출하여 적층하는 방법

Info

Publication number: KR102191912B1
Application number: KR1020200039283A
Authority: KR
Inventors: 강경수; 최월석; 조유미
Original assignee: 강경수
Priority date: 2020-03-31
Filing date: 2020-03-31
Publication date: 2020-12-16

Abstract

본 발명은 계란으로부터 난각막을 추출하는 방법과, 계란으로부터 난각막을 추출하여 적층하는 방법에 관한 발명이다.
계란 표면의 오물 제거를 위한 1차 표면 소독단계와;
(a) 계란 1개당 약 3% Acetic Acid 8.5ml을 처리하여 24시간 동안 침지시킨 후, (b) 외력을 가하여 난각을 파쇄하는 난각제거단계와;
계란의 첨단부와 둔단부를 각각 잘라서 내용물을 제거한 후에, 원통형상의 난각막을 수직방향으로 절개하고, 둔단부 및 첨단부의 절단면에 일정 간격을 두고 수직방향을 일부 절취한 후에 펼치는 난각막 평판화단계와;
PBS(Phosphate-Buffered Saline)로 3회 세척하는 난각막 1차 세척단계와;
0.1N NaOH 용액에 24시간 침지하는 정화단계와;
0.1N HCl에 난각막을 침지하여 10분간 중화하는 중화단계와;
PBS(Phosphate-Buffered Saline)로 30분간 3회 반복하는 난각막 2차 세척단계
세척단계를 거친 난각막을 글리세롤에 침지하는 글리세롤 침지단계와;
로 이루어지는 것을 특징으로 한다.

Description

난각막(Egg Shell Membrane)을 추출하는 방법 및 난각막을 추출하여 적층하는 방법{Method for Egg Shell Membrane}

본 발명은 계란으로부터 난각막을 추출하는 방법과, 계란으로부터 난각막을 추출하여 적층하는 방법에 관한 발명이다.

난각막은 인공배양 피부모델(시험용), 인공피부, 창상피복제, 유착방지제, 오가노이드 제작용 멤브레인 등으로 다양하게 활용되고 있다.

그러나, 지금까지 계란으로부터 난각막을 추출하기 위한 방법이 다양하게 알려져 있지 않아, 그 활용도가 매우 높은 데 반해 생산성이 매우 낮아, 새로운 방법의 난각막 획득 방법이 요구되고 있다.

공개된 중국공개특허 CN106310385호(이하 '종래기술1'이라 한다)에는 “인공 피부에 사용되는 난각막(ESM) 복합 나노 은박막(Nano-Silver Film)을 추출하는 방법”이 개시되어 있다.

종래기술1의 추출방법은, 신선한 계란의 흰자와 노른자를 제거하고 탈 이온수로 계란 껍질을 세척하는 단계; 껍질막을 분리하고 껍질막을 탈 이온수로 세척하는 단계; 달걀 껍질 막을 (1~3cm)*(1~3cm) 크기로 절단하고 껍질막을 1 ~ 100mM의 농도 및 pH 1 ~ 3 (수소의 전위)를 갖는 염산 용액에 넣는 단계; 실온에서 1 ~ 4일 동안 침지시키고 탈 이온수로 세척하는 단계; 이어서 난각 막을 2 ~ 4mg/mL의 농도 및 pH 8.5 ~ 9.5의 도파민 용액에 넣는 단계; 실온에서 6 ~ 20 시간 동안 침지시키고 탈 이온수로 세척하는 단계; 이어서 난각 막을 10 ~ 50nM의 농도의 질산은 용액에 넣는 단계; 빛없이 실온에서 6 ~ 20 시간 동안 침지시킨 후, 탈 이온수로 세척하는 단계; 인공 피부에 사용되는 난각막 복합 나노 은박막을 얻기 위해 상온에서 자연 건조하는 단계를 포함한다.

그러나, 종래기술1에 의한 난각막 추출방법은 공정에 많은 시간이 소요되고, 여러 종류의 화합물이 요구되며, 사용시 필요한 크기를 조절하는 데 어려움이 있고 생산 수율이 매우 낮은 문제점이 있다.

그리고, 일본공개특허 JP 1994-192443(이하 '종래기술2'라 한다)에는 “글리세린 등의 난각막 성분 이외의 성분을 포함시키지 않고도 물에 잘녹지 않는(물불용성) 막으로 만들 수 있는 재형성 난각막 제조방법”에 관한 내용이 개시되어 있다.

그러나, 상기 종래기술2의 방법은 난각막을 분쇄한 후에 재성형하는 공정에 관한 발명으로서, 난각막의 원형(原形) 그대로를 사용하는 것이 아니므로 세포외기질의 특성인 투과성과 세포 융착성이 높은 성질을 지닌 고품질의 멤브레인을 얻을 수 없는 문제점이 있다.

CN

106310385

A

JP 1994-192443 A

본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위해 안출된 발명으로서, 생산 수율을 높이면서도 고품질의 다중 적용 가능 난각막을 추출할 수 있는 방법을 제안하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 추출된 난각막을 다양한 용도로 활용하기 위해, 난각막을 여러 겹으로 적층하는 방법을 제안하는 것을 목적으로 한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명에 따른 난각막 추출방법은,

계란 표면의 오물을 제거하고,

(a) 계란 1개당 약 3% Acetic Acid 8.5ml을 처리하여 24시간 동안 침지시키는 화학적 처리단계와, (b) 상기 화학적 처리단계를 거친 계란에 외력을 가하여 난각을 파쇄 물리적 처리단계를 거쳐 난각을 제거하는 시간을 절약하며,

계란의 첨단부와 둔단부를 각각 잘라서 내용물을 제거한 후에, 원통형상의 난각막을 수직방향으로 절개하고, 둔단부 및 첨단부의 절단면에 일정 간격을 두고 수직방향을 일부 절취한 후에 펼침으로써, 필요한 크기의 난각막을 얻음과 동시에 버려지는 난각막을 최소화하고,

PBS(Phosphate-Buffered Saline)로 3회 세척하고, 0.1N NaOH 용액에 24시간 침지하여 정화하고 0.1N HCl에 난각막을 침지하여 10분간 중화한 후, PBS(Phosphate-Buffered Saline)로 30분간 3회 반복 세척한 후에, 난각막을 글리세롤에 침지하는 공정을 거쳐, 포장 및 멸균과정으로 이루어지는 것을 특징으로 한다.

그리고, 본 발명에 따른 난각막을 적층하는 방법은,

계란 표면의 오물을 제거하고,

PBS(Phosphate-Buffered Saline)로 3회 세척하고, 0.1N NaOH 용액에 24시간 침지하여 정화하고 0.1N HCl에 난각막을 침지하여 10분간 중화한 후, PBS(Phosphate-Buffered Saline)로 30분간 3회 반복 세척한 후에,

표면온도 40℃의 작업대 위에서, 제1층 난각막을 펼쳐 놓고, 그 표면에 가교제(무독성 의료용 접착제-피브린 글루 또는 콜라겐 글루)를 바르고, 그 위에 제2층 난각막을 적층하는 제1 접착공정과, 제1 접착공정이 완료된 2겹의 난각막을 압축 가압한 상태로 4℃ 냉장실에 1시간 냉장시키는 제1 경화공정과, 2겹의 난각막을 표면온도 40℃의 작업대 위에 올려놓고, 그 표면에 가교제를 바르고, 그 위에 제3층 난각막을 적층하는 제2 접착공정과, 제2 접착공정이 완료된 3겹의 난각막을 압축 가압한 상태로 4℃ 냉장실에 1시간 냉장시키는 제2 경화공정과, 상기한 접착공정 및 경화공정을 반복함으로써 n겹의 난각막을 형성한 후에,

난각막을 글리세롤에 침지하는 공정을 거쳐, 포장 및 멸균과정으로 이루어지는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면, 기존의 방법에 비해 생산 수율을 월등하게 높이면서도 고품질의 난각막을 추출할 수 있다.

그리고, 다양한 용도에 맞게 난각막을 여러 겹으로 적층하는 작업이 용이해져, 난각막의 활용성을 높일 수 있다.

도 1은 계란 난각막의 첨단부와 둔단부를 절단하는 상태를 도시한 설명도
도 2는 난각막을 잘라 평면으로 펼친 상태를 예시적으로 도시한 도면
도 3은 SEM(scanning electron microscope)를 이용한 ESM 표면 사진
도 4는 각 배율에 따른 ESM의 bright field 사진과 DAPI(4′,6-diamidino-2-phenylindole)염색을 통한 세포 핵 존재 확인 사진
도 5는 SEM을 이용한 ESM 사람 섬유아세포 배양 결과 사진
도 6은 각 배율에 따른 ESM의 bright field 사진 과 DAPI(4′,6-diamidino-2-phenylindole)염색을 통한 사람 세포 핵 존재 확인 사진 (파란색 현광 염색이 된 세포 존재 확인)
도 7은 SEM을 이용한 ESM 돼지 소장 상피 세포 배양 결과 사진
도 8은 각 배율에 따른 ESM의 bright field 사진과 DAPI(4′,6-diamidino-2-phenylindole)염색을 통한 돼지 세포 핵 존재 확인 사진(파란색 현광 염색이 된 세포 존재 확인)

준비단계로, SPF 닭에서 생산된 계란 표면의 오물 제거를 위한 1차 표면 소독을 실시한다. SPF 계란이라도 그 표면에 분변이 묻어 있으므로, 반드시 세척과정을 실시해야 한다.

다음 단계는 난각 제거단계로서, 소독된 계란의 난각과 불순물을 제거하기 위한 물리적, 화학적 처리단계를 지칭한다.

난각 제거를 위한 화학적 처리단계는 다음과 같다.

계란 1개당 약 3% Acetic Acid 8.5ml을 처리하여 24시간 동안 침지시킨다.

상기 화학적 처리단계를 거친 계란을 꺼내, 외력을 가하여 난각을 파쇄하는 물리적 단계(물리적 처리단계)를 수행한다. 상기 화학적 처리단계만으로 난각을 완전히 제거하기 위해서는 약 7일 정도가 소요되기 때문에, 물리적인 파쇄과정을 거치는 것이 매우 바람직하다. 물리적으로 난각을 파쇄하는 방법은 계란을 바닥에 대고 전체면에 골고루 힘을 가한다. 이 때, 난각이 깨지면서 난각막이 찢어질 수 있으므로, 난각막의 손상을 막기 위해 PBS(Phosphate-Buffered Saline)에 적신 와이프올(부직포재질의 타월)로 계란을 감싸 원통형 실리콘 튜브 내부에 넣은 상태에서 외력을 가함으로써, 난각막의 손상을 최소화하고, 쉽고 빠르게 난각을 파쇄할 수 있다.

여기서, PBS란, 해리 전 세척, 세포 또는 조직 이동, 계수 전 세포 희석, 시약 조제 등 다양한 세포 배양 어플리케이션에 사용하는 평형염액을 의미한다.

다음 단계는, 난백 및 난황 등의 내용물을 제거하는 단계(내용물 제거단계)로서, 메스 또는 미세 가위를 이용하여 난각막을 잘라, 내용물(난백, 난황)을 제거한다.

내용물을 제거할 때에 난각막의 전체적인 원형(原形)을 유지하기 위해 계란의 둔단부와 첨단부를 각각 절취하여 내용물을 제거하는 것이 바람직하다. 바람직한 예로서, 엄지와 검지로 계란의 첨단부를 5mm 정도 잡아쥐고, 옆으로 눕힌 상태에서 Iris Scissors를 사용하여 둔단부를 자르는 것이 바람직하다.

다음으로 난각막을 전개하여 펼치는 난각막 평판화단계로서, 첨단부와 둔단부를 잘라낸 후, 원통형상의 난각막을 수직방향으로 절개하여 펼치는 작업이 수행된다. 이 때, 둔단부 및 첨단부의 절단면에 일정 간격을 두고 수직방향을 일부 절취한 후에 펼치면, 펼쳐진 난각막의 두께 불균일을 최소화할 수 있다. 실제로 당업계에서 통용되는 인공피부용 멤브레인 또는 창상 피복용 멤브레인 등의 최대 크기는 3cm X 4cm 정도이므로, 이와 같은 방법으로 얻어지는 난각막의 활용 가능한 면적은 공지의 멤브레인 크기를 충분히 충족시킬 수 있다.

도 1은 계란 난각막의 첨단부와 둔단부를 절단하는 상태를 도시한 설명도이며, 도 2는 난각막을 잘라 평면으로 펼친 상태를 예시적으로 도시한 것이다.

다음 단계는, 내용물 제거단계에 의해 얻어진 난각막을, PBS(Phosphate-Buffered Saline)로 세척하는 난각막 1차 세척단계이다. 난각막 1차 세척단계는 난각막 표면의 불순불을 제거하는 단계로서, 제거되지 못하고 붙어 있는 각종 이물질 및 난각 조각들을 난각막 손상이 없도록 제거하기 위한 단계이다. 상기 난각막 1차 세척단계는 3회 반복하는 것이 바람직하다.

다음 단계로서, 난각막을 0.1N NaOH 용액에 24시간 침지하는 정화단계이다. 상기 정화단계에서는 난각막 표면에서 콜라겐 이외의 잔류물(난백과 난황 찌꺼기 등)을 제거하게 된다. 난백에는 오보뮤코신, 오보트렌스페린과 같은 항생물질이 포함되어 있어 반드시 제거하여야 한다.

0.1N NaOH용액에 침지하는 경우, porosis 와 hydrophilicity가 증가됨을 확인할 수 있다.

다음 단계는 중화처리단계로서, 0.1N HCl에 난각막을 침지하여 10분간 중화한다. 이 단계는 난각막의 NaOH 처리후에 중성화시키기 위한 단계이다.

다음단계로, 중화된 난각막을, PBS(Phosphate-Buffered Saline)로 세척하는 난각막 2차 세척단계이다. 난각막 2차 세척단계는, PBS(Phosphate-Buffered Saline)로 30분간 3회 반복하는 것이 바람직하다.

마지막 단계는, 난각막의 물리적 강성을 유지하도록 하기 위해 난각막 세척단계를 거친 난각막을 글리세롤에 침지하는 글리세롤 침지단계이다. 본 발명에 따른 글리세롤 침지단계는 글리세롤 함량을 단계적으로 증가시키면서 3단계에 걸쳐 실시한다.

글리세롤 1차 침지단계는 50% 글리세롤에 침지하는 단계로서, 이 때 50% 글리세롤용액의 적정온도는 4℃가 바람직하며 16시간동안 침지시킨다.

다음은 글리세롤 2차 침지단계로서, 70% 글리세롤에 침지하되, 33℃의 온도에서 3시간 동안 침지시킨다.

그 후, 글리세롤 3차 침지단계로서, 85% 글리세롤에 침지하되, 33℃의 온도에서 3시간 동안 침지시킨다.

이와 같이, 글리세롤의 함유량을 단계적으로 증가시키면서 3단계에 걸쳐 난각막을 침지시키는 이유는, 난각막을 손상 없이 원형 그대로 보존하기 위한 목적으로서, 난각막은 수분이 손실될 경우에 물리적 강도가 급격히 떨어지는 특성이 있기 때문에 이를 보호 하고 다음 공정을 위한 저장성을 높이기 위함이다.

포장단계에서는 멸균과정을 거치는데, 밀봉 포장된 상태에서 감마선 조사를 통하여 멸균작업을 수행한다. 이때, 조사되는 방사선은 60-Co gamma irradiation이며, 조사선량 25 kGy로 영하 70℃ 이하 조건에서 수행한다.

이와 같은 방법으로 얻어진 난각막은, 콜라겐을 함유하여 세포배양이 가능하므로 다양한 용도로 활용될 수 있다.

상기 난각막은 콜라겐을 충분히 함유하고 있으므로 세포배양 없이 유착방지제 또는 창상 피복용으로 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 상기한 난각막에 세포를 배양하여 인공피부로 활용하는 것도 가능하다.

본 발명에 따른 난각막을, 예를 들어 창상 피복용으로 사용하고자 하는 경우에는 충분한 강성을 가져야 하므로, 상기 난각막을 20겹(약 1mm) 이상 겹쳐야 창상 피복용으로 활용할 수 있다.

또 다른 적용분야로서, 인공피부로 사용할 경우에는 세포배양 또는 세포 이식 과정이 필요한 것은 별개로 하더라도, 상기 난각막 3겹을 겹쳐 접착하는 것이 바람직하며, 상기 난각막을 유착방지제로 사용하고자 하는 경우에는 8~12겹(0.4~0.6mm) 적층이 필요하다.

이하에서는 본 발명에 따른 난각막을 적층하는 방법을 구체적으로 설명한다.

계란 표면의 오물을 제거하고,

화학적 처리단계와 물리적 처리단계를 거쳐 난각을 제거하는 단계와,

난각막 평판화단계와, 1차 세척단계, 정화단계, 중화단계 및 2차 세척단계까지는 상기 난각막 추출방법의 공정과 동일하다.

그 다음 단계로서, 난각막을 여러 겹으로 적층하는 작업을 선행한 이후에, 글리세롤 침지단계를 수행하는 것이 특징이다.

먼저, 얇은 난각막의 취급을 용이하게 하기 위해, 제1 메쉬망 위에 동결 건조된 제1층 난각막(이하 '멤브레인'이라고도 한다. 이하 같다) 1겹을 올려 놓고, 적층할 제2층 멤브레인을 제2 메쉬망 위에 1겹 올려놓는다.

상기 제1층 멤브레인의 상부 표면에 스프레이나 붓을 이용하여 얇게 가교제(무독성 의료용 접착제-피브린 글루 또는 콜라겐 글루)를 바른다. 가교제를 바를 때는 난각막의 하부면은 수분이 충분하고 상부면은 약간 마른 상태에서 바르기 시작하는 것이 바람직하다.

이 때 작업대 표면은 40℃로 유지한다. 이와 같이 가온 작업대(hot plate) 표면 온도가 40℃ 이하가 되면 가교제가 빠르게 굳어버리므로 접착력이 저하되는 문제가 발생된다.

다음으로 제2층 멤브레인과 제2 메쉬망을 함께 들어올려 뒤집으면서, 가교제를 바른 제1층 멤브레인 위에 겹쳐 접착시킨다(접착공정). 이 상태에서 멸균된 가압판으로 적층된 제1층 및 제2층 멤브레인을 가압하여 두 멤브레인 사이의 공기층을 제거하여 긴밀하게 접착되도록 유지하면서, 4℃ 냉장실에 1시간 냉장시켜 가교제를 경화시킨다(경화공정).

3겹의 멤브레인을 형성하고자 하는 경우에는, 2겹의 멤브레인을, 40℃의 작업대 위에 올려 가교제를 바른 다음, 제3 메쉬망을 이용하여 제3층 멤브레인을 제2층 멤브레인 위에 겹쳐 접착시킨다(접착공정). 그리고 가압판으로 적층된 제1층 및 제2층 멤브레인을 가압하여 두 멤브레인 사이의 공기층을 제거하여 긴밀하게 접착되도록 유지하면서, 4℃ 냉장실에 1시간 냉장시켜 가교제를 경화시킨다(경화공정).

상기한 접착공정 및 경화공정을 반복함으로써 n겹의 멤브레인을 형성한 후에, 글리세롤에 침지하는 공정을 수행한다.

n겹 멤브레인의 물리적 강성을 유지하도록 하기 위한 글리세롤 침지단계는 글리세롤 함량을 단계적으로 증가시키면서 3단계에 걸쳐 실시한다.

그 후, 글리세롤 2차 침지단계로서, 85% 글리세롤에 침지하되, 33℃의 온도에서 3시간 동안 침지시킨다.

이와 같이, 글리세롤의 함유량을 단계적으로 증가시키면서 3단계에 걸쳐 난각막을 침지시키는 이유는, 난각막을 손상없이 원형 그대로 보존하기 위한 목적으로서, 난각막은 수분이 손실될 경우에 물리적 강도가 급격히 떨어지는 특성이 있기 때문에 이를 보호 하고 다음 공정을 위한 저장성을 높이기 위함이다.

다음으로, 포장단계에서는 멸균과정을 거치는데, 밀봉 포장된 상태에서 감마선 조사를 통하여 멸균작업을 수행한다. 이때, 조사되는 방사선은 60-Co gamma irradiation이며, 조사선량 25 kGy로 영하 70℃ 이하 조건에서 수행한다.

위와 같은 적층작업을 반복적으로 수행함으로써, 난각막을 20겹 이상 적층하는 창상 피복용 멤브레인, 난각막을 20겹 이상 적층하는 유착방지제 멤브레인의 제작이 가능하다.

1: 난각
2: 난각막

Claims

삭제
SPF 닭에서 생산된 계란 표면의 오물 제거를 위한 1차 표면 소독단계와;
(a) 계란 1개당 3% Acetic Acid 8.5ml을 처리하여 24시간 동안 침지시키는 화학적 처리단계와, (b) 상기 화학적 처리단계를 거친 계란에 외력을 가하여 난각을 파쇄하는 물리적 처리단계로 구성되는 난각 제거단계와;
상기 난각 제거단계에 의해 얻어진 난각막을 잘라, 내용물(난백, 난황)을 제거하고 펼치는 단계로서, 계란의 첨단부와 둔단부를 각각 잘라서 내용물을 제거한 후에, 원통형상의 난각막을 수직방향으로 절개하고, 둔단부 및 첨단부의 절단면에 일정 간격을 두고 수직방향을 일부 절취한 후에 펼치는 난각막 평판화단계와;
상기 평판화단계에 의해 얻어진 난각막을, PBS(Phosphate-Buffered Saline)로 3회 세척하는 난각막 1차 세척단계와;
0.1N NaOH 용액에 24시간 침지하는 정화단계와;
0.1N HCl에 난각막을 침지하여 10분간 중화하는 중화단계와;
PBS(Phosphate-Buffered Saline)로 30분간 3회 반복하는 난각막 2차 세척단계와;
난각막 2차 세척단계를 거친 난각막을 글리세롤에 침지하는 글리세롤 침지단계와;
상기 글리세롤 침지단계를 거친 난각막을 포장 및 멸균하는 포장단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 난각막 추출방법에 있어서,

상기 글리세롤 침지단계는, 글리세롤 함량을 단계적으로 증가시키면서 3단계에 걸쳐 실시하되,
50% 글리세롤용액에 4℃를 유지하며 16시간동안 침지하는 글리세롤 1차 침지단계와;
70% 글리세롤에 33℃의 온도에서 3시간 동안 침지하는 글리세롤 2차 침지단계와;
85% 글리세롤에 33℃의 온도에서 3시간 동안 침지하는 글리세롤 3차 침지단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 난각막 추출방법.
SPF 닭에서 생산된 계란으로부터 난각막을 획득하여 n겹의 난각막으로 적층하는 방법으로서,
SPF 닭에서 생산된 계란 표면의 오물 제거를 위한 1차 표면 소독단계와;
(a) 계란 1개당 3% Acetic Acid 8.5ml을 처리하여 24시간 동안 침지시키는 화학적 처리단계와, (b) 상기 화학적 처리단계를 거친 계란에 외력을 가하여 난각을 파쇄하는 물리적 처리단계로 구성되는 난각 제거단계와;
상기 난각 제거단계에 의해 얻어진 난각막을 잘라, 내용물(난백, 난황)을 제거하고 펼치는 단계로서, 계란의 첨단부와 둔단부를 각각 잘라서 내용물을 제거한 후에, 원통형상의 난각막을 수직방향으로 절개하고, 둔단부 및 첨단부의 절단면에 일정 간격을 두고 수직방향을 일부 절취한 후에 펼치는 난각막 평판화단계와;
상기 평판화단계에 의해 얻어진 난각막을, PBS(Phosphate-Buffered Saline)로 3회 세척하는 난각막 1차 세척단계와;
0.1N NaOH 용액에 24시간 침지하는 정화단계와;
0.1N HCl에 난각막을 침지하여 10분간 중화하는 중화단계와;
PBS(Phosphate-Buffered Saline)로 30분간 3회 반복하는 난각막 2차 세척단계와;
표면온도 40℃의 작업대 위에서, 제1층 난각막을 펼쳐 놓고, 그 표면에 가교제를 바르고, 그 위에 제2층 난각막을 적층하는 제1 접착공정과, 제1 접착공정이 완료된 2겹의 난각막을 압축 가압한 상태로 4℃ 냉장실에 1시간 냉장시키는 제1 경화공정과;
2겹으로 적층된 난각막을 표면온도 40℃의 작업대 위에 올려놓고, 그 표면에 가교제를 바르고, 그 위에 제3층 난각막을 적층하는 제2 접착공정과, 제2 접착공정이 완료된 3겹의 난각막을 압축 가압한 상태로 4℃ 냉장실에 1시간 냉장시키는 제2 경화공정과;
상기한 접착공정 및 경화공정을 반복 수행함으로써 n겹의 난각막을 형성하는 반복단계와;
n겹의 난각막을 글리세롤에 침지하는 글리세롤 침지단계와;
상기 글리세롤 침지단계를 거친 난각막을 포장 및 멸균하는 포장단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 난각막을 추출하여 적층하는 방법.
제3항에 있어서,
상기 글리세롤 침지단계는, 글리세롤 함량을 단계적으로 증가시키면서 3단계에 걸쳐 실시하되,
50% 글리세롤용액에 4℃를 유지하며 16시간동안 침지하는 글리세롤 1차 침지단계와;
70% 글리세롤에 33℃의 온도에서 3시간 동안 침지하는 글리세롤 2차 침지단계와;
85% 글리세롤에 33℃의 온도에서 3시간 동안 침지하는 글리세롤 3차 침지단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 난각막을 추출하여 적층하는 방법.