CN116440330A - 一种多功能防粘连生物膜及其制备方法和应用 - Google Patents
一种多功能防粘连生物膜及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物医学材料技术领域，具体涉及一种多功能防粘连生物膜及其制备方法和应用。本发明利用鸡蛋内膜作为膜基底，并通过改性、负载药物及涂覆疏水层处理制备为多功能防粘连生物膜。首先通过醋酸溶解法去除鸡蛋外壳，并对内膜进行清洗；进一步浸泡醋酸溶液及清洗，去除膜基地内侧粘附的非内膜成分备用；同时通过热处理、浸渍抗菌药物、涂覆的骨蜡层等步骤，制备成为多功能防粘连生物膜。基于鸡蛋内膜制备的防粘连生物膜，具有天然的通透性结构和结构稳定性，同时在进一步功能化过程中，还赋予其抗菌、止血及疏水性能，实现了防粘连生物膜的功能化，在组织粘连等组织再生修复中具有较大的潜力，因此具有良好的实际应用之价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医学材料技术领域，具体涉及一种多功能防粘连生物膜及其制备方法和应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
粘连如术后腹部粘连、韧带粘连等，其发生的因素很多，在腹部常见原因有腹腔内细菌感染、异物残留刺激、内出血血污淤积、及炎症等，而韧带部位主要由于感染、组织异常增生及组织结节等所致。为避免腹腔肠部位或术后韧带部位粘连的形成，可通过提前植入隔离层或术后使用隔离层进行隔离治疗。而目前常见的抗粘连材料主要有PLA纤维材料，但是此类材料存在降解周期较长、不能满足抗炎、抗菌等功能需求，还需要进一步的优化。而理想的抗粘连材料需要满足如下的要素：一定的力学强度、良好的生物相容性、抗炎和抗菌生物学功能、细胞粘连性能较差、合理的降解周期等条件。
目前生物半透膜逐渐在力学强度、降解性、载药及疏水性功能化等方面表现出巨大的潜力。鸡蛋结构由蛋壳、蛋清和蛋黄等构成，其中蛋壳下层含有一层蛋壳内膜，该膜为生物半透膜。但是目前基于该蛋壳内膜制备防粘连生物膜的研究鲜有报道。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种多功能防粘连生物膜及其制备方法和应用。本发明创新性的将鸡蛋内膜（半透膜）进行加工、改性和功能化处理，从而最终实现对鸡蛋内膜的生物医用材料的转变。基于上述研究，从而完成本发明。
具体的，本发明涉及如下技术方案：
本发明的第一个方面，提供一种多功能防粘连生物膜的制备方法，所述制备方法包括：对鸡蛋蛋壳采用酸处理脱钙，对脱钙后无壳鸡蛋进行取内膜处理，并去除内膜内表面的粘附的蛋清等非内膜成分，然后对鸡蛋内膜进行热变性处理，其中，热变性处理具体条件控制为在60-80℃条件下处理10-30 min。变性处理有利于维持鸡蛋内膜的形貌结构稳定性和通透孔道的开放性，同时还有利于清除膜中的活性酶成分和热源成分，进而保持膜的长期稳定性和安全性。
本发明的第二个方面，提供上述制备方法获得的多功能防粘连生物膜。
此外，需要说明的是，上述技术方案中虽然以鸡蛋蛋壳内膜为例制备多功能防粘连生物膜，但是同样基于本发明的发明构思，采用其他动物（如鸟类、爬行类等）蛋壳内膜以及动物肠膜等制备多功能防粘连生物膜同样亦属于本发明的保护范围之内。
本发明的第三个方面，提供上述多功能防粘连生物膜在制备生物医学材料中的应用。
所述生物医学材料可以为作为术后防组织粘连的组织修复再生材料使用，其同时兼具可降解性、抗炎性、抗菌性能、以及止血性能和抗粘连等多重功效。当然，所述生物医学材料还可以作疝气补片、创面敷料等进行使用。
上述一个或多个技术方案的有益效果：
（1）上述技术方案将鸡蛋半透膜进行加工、改性和功能化处理，实现对鸡蛋内膜的生物医用材料的转变；
（2）鸡蛋内膜组分作为角蛋白、纤维蛋白及黏多糖的共聚物，具有可降解性和通透性，同时成分中的粘多糖还具有一定的抗炎止痛功效，是一种较好的天然防粘连物理隔离材料；
（3）鸡蛋内膜本身作为一种渗透膜和生物活性膜，具有很多的微小孔道，这有利于从结构上实现对小分子药物的负载，进而实现鸡蛋内膜改性加工处理为医用材料时载药功能，同时还具有良好的生物相容性；比如在通透性孔道中负载抗菌药物，进而可实现抗菌性能，负载抗氧化药物，可实现抗氧化性能；
（4）负载抗菌药物的生物透过性膜，还需要一定的疏水涂层涂覆处理，如生物透过性膜两侧涂覆一层骨蜡层，进而封闭通透性孔道两端，实现抗菌药物的缓释；同时涂覆的骨蜡层，还可进一步提升材料的抗粘附性能和提供止血性能，从而制备为防粘连生物膜；
（5）制备的防粘连生物膜具有可降解性、抗炎性、长期稳定的抗菌性能、一定的止血性能及较好的抗粘连功效，进而被制备为多功能防粘连生物膜，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明防粘连生物膜制备模式图；其中，（A）为非负载抗菌非涂层膜制备；（B）为负载抗菌非涂层膜制备；（C）为非负载抗菌涂层膜制备。
图2为本发明实施例1-4制备的防粘连生物膜实物图。
图3为本发明实施例1-4制备的防粘连生物膜的抗菌性能图，其中，A为加入防粘连生物膜0 h时各组菌溶液浊度图，B为加入防粘连生物膜6 h时各组菌溶液浊度图。
图4为本发明实施例1-4防粘连生物膜生物相容性图。
图5为本发明实施例1-4防粘连生物膜抗细胞黏附性图。
图6为本发明实施例1-4防粘连生物膜止血能性图。
图7为本发明实施例1-4防粘连生物膜腹腔2周防粘连应用实际效果图。
图8为本发明实施例7中(a)未热处理鸡蛋膜降解3，7，14天的微观结构形貌；(b)热处理鸡蛋膜降解3，7，14天的微观结构形貌。
具体实施方式
需要指出的是，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
如前所述，目前常见的抗粘连材料存在降解周期较长、不能满足抗炎、抗菌等功能需求，还需要进一步的优化。
有鉴于此，申请人通过潜心研究发现，鸡蛋内膜为生物半透膜，在成分上由纤维蛋白、角蛋白及粘多糖等构成，具有一定的降解周期，而粘多糖还具有一定的抗炎功能，而其具备的半透膜性质表明其存在很多的孔道，这为负载小分子物质提供了理论基础。半透膜的孔道在负载药物后，可通过一定的方式封闭孔道两端的出口，进而实现负载药物的长期释放，赋予半透膜抗菌功能化。而蜡质材料如骨蜡是一种较为常见的商用疏水性材料，在半透膜的两侧涂覆处理时，可封闭半透膜孔道两端的出口，还进一步提供了一定的止血性能和生物半透膜的疏水性能。因此，通过对鸡蛋内膜进行改性、负载药物及涂覆疏水层处理，可以制备为防粘连生物膜。
因此，本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种多功能防粘连生物膜的制备方法，所述制备方法包括：对鸡蛋蛋壳采用酸处理脱钙，对脱钙后无壳鸡蛋进行取内膜处理，并去除内膜内表面的粘附的蛋清等非内膜成分，然后对鸡蛋内膜进行热变性处理，其中，热变性处理具体条件控制为在60-80℃条件下处理10-30 min。变性处理有利于维持鸡蛋内膜的形貌结构稳定性和通透孔道的开放性，同时还有利于清除膜中的活性酶成分和热源成分，进而保持膜的长期稳定性和安全性。当然，热变性处理条件不仅限于热处理，或可进行化学处理，如使用酸或碱进行变性处理。
其中，对鸡蛋蛋壳采用酸处理脱钙具体方法为：采用4-6 mol/L的流动醋酸溶液脱钙处理鸡蛋12-24 h，脱钙至可肉眼看见鸡蛋内膜或外壳较薄可手动清除为止。选用的鸡蛋具体为新鲜、无破损的鸡蛋，从而能够使得最终制备的生物膜效果更佳。
需要说明的是，上述技术方案中虽然以酸度较为柔和的醋酸进行处理，但并局限于此，亦可采用低浓度的中强酸进行脱钙处理；不采用直接破坏外壳处理方式，有利于保持膜的完整性，同时还可避免因破壳处理的外力导致内膜受力不均造成结构破坏。当然，使用机械处理将鸡蛋外壳剥落亦在本申请的保护范围之内。
去除内膜内表面的粘附的蛋清等非内膜成分具体可采用酸溶液进行清理处理，所述酸溶液可以为0.5-1 mol/L的醋酸溶液。当然，并不限于此，还可以使用其他低浓度的中强酸进行处理，通过对内膜内表面的蛋清成分进行低浓度酸处理清洗，可避免蛋清变性堵塞内膜的通透性孔道。此外，蛋清溶液的处理还可结合变性处理进行清除，如酸碱变性或者热变性使残留蛋清等成分成固态进行清除。
本发明的又一具体实施方式中，所述制备方法还包括将药物负载于所述生物膜上和/或在生物膜两侧制备生物膜疏水涂层的步骤。
其中，所述药物可以为现有任意已知具有预防和/或治疗疾病的成分，包括但不限于核酸、抗生素、抗炎剂、抗体或其抗体片段、生长因子、细胞因子、酶、蛋白质、肽、融合蛋白、合成分子、有机分子、金属、碳水化合物或类似物、脂质、激素、微粒体、其衍生物或变体、以及其任何组合。
在本发明的一个具体实施方式中，所述药物可以为小分子抗菌药物，如溶菌酶、纳米银等，从而使得小分子药物扩散在透过性膜的通透孔道中，进而实现药物的抗菌药物的负载；因此，本发明的一个具体实施方式中，所述药物负载方式可通过将上述生物膜进行药物的浸渍处理，该方法简单高效，仅通过浸渍处理这一步骤，即实现药物特别是小分子药物的负载。
在本发明的一个具体实施方式中，所述将药物负载于所述生物膜上的具体方法包括：采用0.5-5 %（v/v）的纳米银溶液，在25-37℃条件下对半透膜进行浸渍处理0.5-1 h；浸渍结束后通过PBS水溶液漂洗生物透过性膜，去除表面的残留纳米银成分后备用。
需要说明的是，上述具体实施方式虽然以纳米银为例，提供了将纳米银负载于生物膜上的方法，但显然基于本发明的发明构思，将其他药物特别是小分子药物通过浸渍处理负载于生物膜上的方法显然同样也属于本发明的保护范围之内。此外，负载药物的方式也不仅局限于浸渍处理，还可以采用诸如接枝、交联等方式进行实现对药物的负载，在此不再进行赘述。
在本发明的一个具体实施方式中，所述在生物膜两侧制备生物膜疏水涂层的具体方法包括对生物膜两侧表面进行疏水性涂层处理，进而可以赋予防粘连生物膜抗黏附和止血功能。
其中，所述疏水性涂层可选用强疏水性材料实现，如生物蜡、磷脂、烃类等，在本发明的一个具体实施方式中，所述强疏水性材料可以为骨蜡。更具体的，所述生物膜疏水涂层制备方法为：采用骨蜡在多功能防粘连生物膜两侧表面涂覆0.01-0.1 mm的骨蜡层，在提供材料疏水特性和止血功能的同时，还可以封闭生物透过性膜表面的孔道，进而实现负载药物的缓释性能。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述制备方法获得的多功能防粘连生物膜。由上述制备方法可知，基于鸡蛋内膜制备的防粘连生物膜，具有天然的通透性结构和结构稳定性，同时在进一步功能化过程中，还赋予其抗菌、止血及疏水性能，实现了防粘连生物膜的功能化。
此外，需要说明的是，上述技术方案中虽然以鸡蛋蛋壳内膜为例制备多功能防粘连生物膜，但是同样基于本发明的发明构思，采用其他动物（如鸟类、爬行类等）蛋壳内膜以及动物肠膜等制备多功能防粘连生物膜同样亦属于本发明的保护范围之内。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述多功能防粘连生物膜在制备生物医学材料中的应用。
所述生物医学材料可以为术后防组织粘连的组织修复再生材料使用，其同时兼具可降解性、抗炎性、抗菌性能、以及止血性能和抗粘连等多重功效，在组织粘连等组织再生修复中具有较大的潜力。当然，所述生物医学材料还可以作疝气补片、创面敷料等进行使用。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明。本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。各实施例中制备产品的抗菌性能、生物相容性、抗细胞黏附性以及止血性能具体试验过程及结果判读说明如下：
抗菌性能试验：将保种的大肠杆菌（E.coil）和金黄色葡萄球菌（S.aues）使用液体LB液体培养基活化，并在37℃和120rpm条件下摇床8-10 h至细菌生长的对数期；之后将菌溶液稀释至105CPU/mL备用；使用无菌PBS作为空白对照组，将制备的各组防黏连膜放置在5mL的EP管中，并添加1 mL的备用菌悬液充分摇匀后放置37℃和120rpm摇床培养6 h，之后观察各组防粘连生物膜与菌悬液的浊度情况；浊度越大，表明细菌含量越多，材料抗菌性能也越差。
生物相容性试验：将冻存的L-929（成纤维细胞）活化后培养传瓶至第二代，之后将经紫外或者辐照Co60灭菌处理的防粘连生物膜放置48孔板中，并使用无血清DMEM培养基浸泡处理24 h；之后移除浸泡培养基，每孔中添加1 mL含有10%血清的DMEM培养基和1×104细胞，培养24 h后使用CCK-8试剂盒在酶标仪450 nm条件检测细胞增殖情况；其中细胞增殖越明显，OD值越高，表明生物相容性良好。
抗细胞黏附性试验：将防粘连生物膜经过无菌处理后，再经无血清培养基浸泡24h；在防粘连生物膜种每孔2×104细胞数，培养48 h后通过活死染色试剂盒，检测防粘连生物膜上的细胞黏附和形态；若防粘连生物膜具有良好的抗黏附效果，视野中表现为细胞数较少，且细胞聚集成块状，对照组则呈现明显的伪足且均匀的铺展开。
止血能性试验：使用SD大鼠断尾模型进行止血实验，即在大鼠尾部距离尾尖1/4处将鼠尾截断，之后使用相应的对照组或者防粘连生物膜进行压迫止血；可通过止血面积及止血时间等参数来判断防粘连生物膜的止血效应，具有止血效应的防粘连生物膜具有较快的止血效果，且止血后的血迹面积较小。
实施例1（非负载抗菌非涂层膜制备）
（1）鸡蛋外壳脱钙：选取新鲜、无破损的鸡蛋，对蛋壳表面进行清洗后，采用 4mol/L的醋酸溶液，在溶液流动条件下脱钙处理鸡蛋24 h，处理至可肉眼看见鸡蛋内膜或外壳较薄可手动清除为止；
（2）鸡蛋内膜的制备及蛋清的清除：对脱钙后无壳鸡蛋根据抗粘连部位的尺寸，定制化的裁剪鸡蛋内膜，之后使用0.5mol/L的酸溶液对内膜内表面的蛋清成分进行清洗，去除残留蛋清成分备用；
（3）鸡蛋内膜热变性处理制备为生物透过性膜：可使用65 ℃的热水对制备的鸡蛋内膜进行热处理15 min后，制备为生物透过性膜备用；
（4）鸡蛋内膜参数：本实施例制备的生物透过性膜颜色洁白（图1，图2），具有0.15-0.35 mm的厚度，同时还具备一定的力学特性，抗菌性能较差（图3），本身具有一定的抗细胞粘连能力（图5），不具备止血功能（图6），具备一定抗粘连效果（图7）。
实施例2（负载抗菌非涂层膜制备）
（1）鸡蛋外壳脱钙：选取新鲜、无破损的鸡蛋，对蛋壳表面进行清洗后，采用6mol/L的醋酸溶液，在溶液流动条件下脱钙处理鸡蛋24 h，处理至可肉眼看见鸡蛋内膜或外壳较薄可手动清除为止；
（2）鸡蛋内膜的制备及蛋清的清除：对脱钙后无壳鸡蛋根据抗粘连部位的尺寸，定制化的裁剪鸡蛋内膜，之后使用0.5mol/L的酸溶液对内膜内表面的蛋清成分进行清洗，去除残留蛋清成分备用；
（3）鸡蛋内膜热变性处理制备为生物透过性膜：可使用65 ℃的热水对制备的鸡蛋内膜进行热处理15 min后，制备为生物透过性膜备用；
（4）生物透过性膜抗菌药物浸渍处理：制备的生物透过性膜，可采用1 %（v/v）的纳米银（南京先锋纳米材料科技有限公司，85-60-9，10 mL）溶液，在25 ℃条件下对半透膜进行浸渍处理1 h；浸渍结束后通过PBS水溶液漂洗生物透过性膜3次，去除表面的残留纳米银成分后备用；
（6）防粘连生物膜参数：本实施例制备的生物透过性膜因负载纳米银颜色偏灰白（图1，图2），具有0.15-0.35 mm的厚度，同时还具备一定的力学特性，具有一定的抗菌性能（图3），本身具有一定的抗细胞粘连能力（图5），不具备止血功能（图6），腹部实验表明2周时具有一定抗粘连性能（图7）。
实施例3（非负载抗菌涂层膜制备）
（1）鸡蛋外壳脱钙：选取新鲜、无破损的鸡蛋，对蛋壳表面进行清洗后，采用 5mol/L的醋酸溶液，在溶液流动条件下脱钙处理鸡蛋24 h，处理至可肉眼看见鸡蛋内膜或外壳较薄可手动清除为止；
（2）鸡蛋内膜的制备及蛋清的清除：对脱钙后无壳鸡蛋根据抗粘连部位的尺寸，定制化的裁剪鸡蛋内膜，之后使用0.5mol/L的酸溶液对内膜内表面的蛋清成分进行清洗，去除残留蛋清成分备用；
（3）鸡蛋内膜热变性处理制备为生物透过性膜：可使用65 ℃的热水对制备的鸡蛋内膜进行热处理15 min后，制备为生物透过性膜备用；
（4）生物膜疏水涂层制备：采用骨蜡在生物透过性膜两侧涂覆一层（0.05 mm左右）骨蜡层（强生国际医疗器械公司，W810T），提供材料疏水特性和止血功能；
（5）生物透过性膜参数：本实施例制备的生物透过性膜因表面有骨蜡涂层颜色偏灰黄（图1，图2），具有0.15-0.35 mm的厚度，同时还具备一定的力学特性，具有一定的抗菌性能（图3），本身具有一定的抗细胞粘连能力（图5），同时还具备止血功能（图6），腹部实验表明2周时具有一定抗粘连性能（图7）。
实施例4（负载抗菌涂层膜制备）
（1）鸡蛋外壳脱钙：选取新鲜、无破损的鸡蛋，对蛋壳表面进行清洗后，采用 5mol/L的醋酸溶液，在溶液流动条件下脱钙处理鸡蛋24 h，处理至可肉眼看见鸡蛋内膜或外壳较薄可手动清除为止；
（2）鸡蛋内膜的制备及蛋清的清除：对脱钙后无壳鸡蛋根据抗粘连部位的尺寸，定制化的裁剪鸡蛋内膜，之后使用1mol/L的酸溶液对内膜内表面的蛋清成分进行清洗，去除残留蛋清成分备用；
（3）鸡蛋内膜热变性处理制备为生物透过性膜：可使用65 ℃的热水对制备的鸡蛋内膜进行热处理15 min后，制备为生物透过性膜备用；
（4）生物透过性膜抗菌药物浸渍处理：制备的生物透过性膜，可采用1 %（v/v）的纳米银（南京先锋纳米材料科技有限公司，85-60-9，10 mL）溶液，在25 ℃条件下对半透膜进行浸渍处理1 h；浸渍结束后通过PBS水溶液漂洗生物透过性膜3次，去除表面的残留纳米银成分后备用；
（5）生物膜疏水涂层制备：采用骨蜡在负载纳米银的生物透过性膜两侧，涂覆一层（0.05 mm左右）骨蜡层（强生国际医疗器械公司，W810T），提供材料疏水特性和止血功能；
（6）生物膜疏水涂层制备：本实施例制备的生物透过性膜负载纳米银后，因整个膜表面有骨蜡涂层颜色偏灰黄（图1），具有0.15-0.35 mm的厚度，同时还具备一定的力学特性，具有一定的抗菌性能（图3），本身具有一定的抗细胞粘连能力（图5），同时还具备止血功能（图6），腹部实验表明2周时具有一定抗粘连性能（图7）。
实施例5
（1）鸡蛋外壳脱钙：选取新鲜、无破损的鸡蛋，对蛋壳表面进行清洗后，采用 5mol/L的醋酸溶液，在溶液流动条件下脱钙处理鸡蛋18 h，处理至可肉眼看见鸡蛋内膜或外壳较薄可手动清除为止；
（2）鸡蛋内膜的制备及蛋清的清除：对脱钙后无壳鸡蛋根据抗粘连部位的尺寸，定制化的裁剪鸡蛋内膜，之后使用0.5mol/L的酸溶液对内膜内表面的蛋清成分进行清洗，去除残留蛋清成分备用；
（3）鸡蛋内膜热变性处理制备为生物透过性膜：可使用60 ℃的热水对制备的鸡蛋内膜进行热处理30 min后，制备为生物透过性膜备用；
（4）生物透过性膜抗菌药物浸渍处理：制备的生物透过性膜，可采用2 %（v/v）的纳米银（南京先锋纳米材料科技有限公司，85-60-9，10 mL）溶液，在37 ℃条件下对半透膜进行浸渍处理0.8h；浸渍结束后通过PBS水溶液漂洗生物透过性膜3次，去除表面的残留纳米银成分后备用；
（5）生物膜疏水涂层制备：采用骨蜡在负载纳米银的生物透过性膜两侧，涂覆一层（0.01 mm左右）骨蜡层（强生国际医疗器械公司，W810T），提供材料疏水特性和止血功能。
实施例6
（1）鸡蛋外壳脱钙：选取新鲜、无破损的鸡蛋，对蛋壳表面进行清洗后，采用6mol/L的醋酸溶液，在溶液流动条件下脱钙处理鸡蛋12 h，处理至可肉眼看见鸡蛋内膜或外壳较薄可手动清除为止；
（2）鸡蛋内膜的制备及蛋清的清除：对脱钙后无壳鸡蛋根据抗粘连部位的尺寸，定制化的裁剪鸡蛋内膜，之后使用0.8mol/L的酸溶液对内膜内表面的蛋清成分进行清洗，去除残留蛋清成分备用；
（3）鸡蛋内膜热变性处理制备为生物透过性膜：可使用80℃的热水对制备的鸡蛋内膜进行热处理10min后，制备为生物透过性膜备用；
（4）生物透过性膜抗菌药物浸渍处理：制备的生物透过性膜，可采用5 %（v/v）的纳米银（南京先锋纳米材料科技有限公司，85-60-9，10 mL）溶液，在30℃条件下对半透膜进行浸渍处理0.5 h；浸渍结束后通过PBS水溶液漂洗生物透过性膜3次，去除表面的残留纳米银成分后备用；
（5）生物膜疏水涂层制备：采用骨蜡在负载纳米银的生物透过性膜两侧，涂覆一层（0.1mm左右）骨蜡层（强生国际医疗器械公司，W810T），提供材料疏水特性和止血功能。
实施例7
（1）鸡蛋外壳脱钙：选取新鲜、无破损的鸡蛋，对蛋壳表面进行清洗后，采用6mol/L的醋酸溶液，在溶液流动条件下脱钙处理鸡蛋12 h，处理至可肉眼看见鸡蛋内膜或外壳较薄可手动清除为止；
（2）鸡蛋内膜的制备及蛋清的清除：对脱钙后无壳鸡蛋根据抗粘连部位的尺寸，定制化的裁剪鸡蛋内膜，之后使用0.8mol/L的酸溶液对内膜内表面的蛋清成分进行清洗，去除残留蛋清成分备用；
（3）鸡蛋内膜热变性处理制备为生物透过性膜：可使用80℃的热水对制备的鸡蛋内膜进行热处理10min后，制备为生物透过性膜备用；
（4）胶原酶降解处理：将热处理和和非热处理的鸡蛋膜，裁剪为5 mm×5 mm的大小，放置于含有0.1%的Ⅱ型胶原酶溶液中，之后分别于37℃，120 rpm条件下处理3，7，14天，之后经干燥使用电子扫描显微镜（SEM）观察两组鸡蛋膜降解后的形貌；
（5）微观结构变化：如图8中（a）和（b）所示，在胶原酶降解的过程中，与经过热处理的鸡蛋膜相比，未经热处理的鸡蛋膜，随着降解时间的增加，鸡蛋膜表面构成微孔道的蛋白微球颗粒（虚线箭头）逐渐减少，且球状形貌也逐渐不明显，而热处理后的鸡蛋膜，蛋白微球颗粒保存较多，且形貌良好；此外，构成鸡蛋膜的蛋白纤维，在未热处理组中，随着酶解时间的增加，蛋白纤维形貌酶解作用较为强烈，因此纤维形貌相对比较粗糙（实线箭头）；总之这些结果表明经过热处理可以增加鸡蛋膜的纤维结构和孔道结构的稳定性，进而有利于维持通透孔道的开放性和保持膜的长期稳定性；同时，作为一种禽类生物体组分，鸡蛋膜经过热处理可以有效破坏鸡蛋膜表面的活性因子或分子活性结构，进而清除膜中的活性酶成分和热源，保征膜的生物安全性。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种多功能防粘连生物膜的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：对鸡蛋蛋壳采用酸处理脱钙，对脱钙后无壳鸡蛋进行取内膜处理，并去除内膜内表面粘附的蛋清成分，然后对鸡蛋内膜进行热变性处理，其中，热变性处理具体条件控制为在60-80℃条件下处理10-30 min。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，对鸡蛋蛋壳采用酸处理脱钙具体方法为：采用4-6 mol/L的流动醋酸溶液脱钙处理鸡蛋12-24 h。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，去除内膜内表面的粘附的蛋清成分采用酸溶液进行清理处理，所述酸溶液为0.5-1 mol/L的醋酸溶液。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括将药物负载于所述多功能防粘连生物膜上和/或在多功能防粘连生物膜两侧制备生物膜疏水涂层的步骤；所述药物包括核酸、抗生素、抗炎剂、抗体或其抗体片段、生长因子、细胞因子、酶、蛋白质、肽、融合蛋白、合成分子、有机分子、金属、碳水化合物或类似物、脂质、激素、微粒体、其衍生物或变体、以及其任何组合。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述药物为小分子抗菌药物，包括溶菌酶、纳米银；所述药物负载的方式包括浸渍、接枝和交联。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，通过将多功能防粘连生物膜进行药物的浸渍处理实现所述药物的负载，方法包括：采用0.5-5 %的纳米银溶液，在25-37℃条件下对多功能防粘连生物膜进行浸渍处理0.5-1 h；浸渍结束后通过PBS水溶液漂洗多功能防粘连生物膜，去除表面的残留纳米银成分后备用。
7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述在所述多功能防粘连生物膜两侧制备生物膜疏水涂层的具体方法包括对多功能防粘连生物膜两侧表面进行疏水性涂层处理的步骤；其中，所述疏水性涂层选用强疏水性材料实现，所述强疏水性材料包括生物蜡、磷脂和烃类材料。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述强疏水性材料为骨蜡；所述生物膜疏水涂层制备方法为：采用骨蜡在多功能防粘连生物膜两侧表面涂覆0.01-0.1 mm的骨蜡层。
9.权利要求1-8任一项所述制备方法获得的多功能防粘连生物膜，其特征在于，所述多功能防粘连生物膜采用非鸡的其他鸟类或爬行类动物的蛋壳内膜以及动物肠膜制备获得。
10.权利要求9所述多功能防粘连生物膜在制备生物医学材料中的应用，其特征在于，所述生物医学材料作为术后防组织粘连的组织修复再生材料、疝气补片或创面敷料使用，其同时兼具可降解性、抗炎性、抗菌性能、以及止血性能和抗粘连的多重功效。
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