CN113827785B - 一种可吸收生物膜的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可吸收生物膜的制备方法，包括以下步骤；猪心包层的制备，采用0.1‑0.5%胰蛋白酶，在37℃、80‑180rpm震荡2‑5h，脱除大猪心包层部分细胞，去除端肽，然后使用纯化水清洗6次后，再用0.1%‑1%SDS室温80‑180rpm震荡1‑4h，纯化水清洗10次，本发明制备获取的可吸收生物膜有足够的力学性能支撑软组织的压力，阻止上皮细胞和纤维细胞等侵入骨缺损区，有适当的厚度和孔隙率，使膜具有良好的贴合性和舒适性，利于氧气、营养物质、生物活性物质向组织扩散，促进细胞生长。
Description
技术领域
本发明涉及生物膜制备技术领域，具体为一种可吸收生物膜的制备方法。
背景技术
公知的，引导骨组织再生术是一种广泛应用于口腔种植外科的手术方法，能有效地解决骨量不足的问题，其原理是将屏障膜放置于软组织与骨缺损之间，建立一个生物屏障，将快速再生的软组织与生长缓慢的骨组织分离，保证成骨细胞有充足的时间能够占据成骨空间，实现骨组织的再生，屏障膜的种类有不可吸收性膜、可吸收性膜。不可吸收性膜主要包括聚四氟乙烯膜（e-PTFE）、钛膜、多聚乙醛膜等，但是这类屏障膜一般材质较硬、塑形困难，并且由于机体不能吸收，需要二次手术取出，增加患者痛苦，可吸收膜分为高分子合成膜与天然基质膜，高分子合成膜有聚乳酸（PLA）、聚乙醇酸、聚羟基乙酸（PGA）等，由于材料降解、代谢产物造成成骨环境的不稳定性，不利机体成骨，因此限制了临床使用，天然基质膜是采用异体或异种组织作为原材料，通过提纯、重组方法制备成屏障膜，或是通过理化方法去除组织细胞成分制备成脱细胞基质膜。
如申请公布号为CN106390201A，申请公布日为2017年02月15日，名称为《一种可吸收医用生物膜及其制备方法》的中国发明申请，其具体方法为一种可吸收医用生物膜，所述生物膜是采用动物心包膜、胸膜或肠膜作为动物源胶原蛋白基膜材，通过脱细胞处理、加入生物活性因子和灭菌工艺所得到的，取材：收集动物源胶原蛋白基膜材，剪裁除去不规整部分、黏连的脂肪层和结缔组织；组织脱细胞处理：将动物源胶原蛋白基膜材利用低渗和高渗溶液交错处理方式进行初步处理，然后将初处理后的动物源胶原 蛋白基膜材置于表面活性剂溶液中继续处理，以封闭材料中羧基、磺酸基类酸性基团，降低免疫原性，赋予生物膜促凝血性能；加入生物活性因子：采用压力范围为200～300Pa的低压渗透法向经过脱细胞处理后的动物源胶原蛋白基膜材中加入可促伤口愈合的生物活性因子，加速受损部位的恢复；灭菌：使用γ射线对处理后的动物源胶原蛋白基膜材进行辐照灭菌处理。
现有技术的不足之处在于，重组类屏障膜存在降解过快的问题，脱细胞基质膜生物相容性很好，临床认可度较高，但是只能起到物理隔离的作用，需要依赖机体自身的潜力修复缺损，无明显骨诱导的活性，并且材料植入口腔后一周内有细菌感染的风险，通常需要GBR手术一周内全身使用抗生素来防止伤口感染，全身用药易引起菌株耐药性。
发明内容
本发明的目的是提供一种可吸收生物膜的制备方法，以解决现有技术中的上述不足之处。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种可吸收生物膜的制备方法，包括以下步骤；
S1：猪心包层的制备，采用0.1-0.5%胰蛋白酶，在37℃、80-180rpm震荡2-5h，脱除大猪心包层部分细胞，去除端肽，然后使用纯化水清洗6次后，再用0.1%-1%SDS室温80-180rpm震荡1-4h，然后使用纯化水清洗10次；
S2：促生长层的制备，将脱细胞后的猪心包层粗糙面朝上放置于平皿中，加入生物活性因子溶液，室温孵育2-4h，然后将孵育好的猪心包膜进行冻干处理；
S3：凝胶层的制备，将聚乙二醇、壳聚糖（或聚乙烯醇、海藻酸钠）和抗生素混合除泡后制备成凝胶液，将冻干后的复合膜猪心包光滑面朝上，浇注凝胶液。
作为上述技术方案的进一步描述：所述步骤S3凝胶层的制备后还包括：S4：最终成型，将上述制备的可吸收生物膜用气动压力机压制平整，压力为300-1000N，压制时间为5-20s获得可吸收生物膜。
作为上述技术方案的进一步描述：所述步骤S4最终成型后还包括：S5：包装灭菌，将可吸收生物膜包装后辐照灭菌，剂量为5-20kGy。
作为上述技术方案的进一步描述：所述步骤S2中生物活性因子为肝素、骨形态发生蛋白-2、骨形态发生蛋白-9、血管内皮生长因子（VEGF）以及血小板衍生生长因子（PDGF）其中的一种或两种。
作为上述技术方案的进一步描述：所述步骤S2中将孵育好的猪心包膜进行冻干处理具体包括以下步骤：
S2.1：预冻，保持温度为-20℃进行预冻，预冻时间为2-8h；
S2.2：冻干，升华干燥温度为-20--10℃，解析干燥温度为10-30℃，冻干时间至少为24h。
作为上述技术方案的进一步描述：所述步骤S3中抗生素为四环素、庆大霉素、氯霉素其中的一种。
作为上述技术方案的进一步描述：所述步骤S3中浇注凝胶液具体方法为：使用可调式涂布器在复合膜猪心包光滑面进行浇注涂布凝胶层，凝胶层的厚度为0.5-1mm，涂布完成后在室温下静置5-12h。
作为上述技术方案的进一步描述：所述步骤S3制备凝胶液为将聚乙烯醇、海藻酸钠和抗生素混合除泡后制备成凝胶液，将冻干后的复合膜猪心包光滑面朝上，浇注凝胶液。
一种可吸收生物膜，其由上述一种可吸收生物膜的制备方法制备获得，包括猪心包膜，所述猪心包膜的光滑面引入有抑菌层，所述猪心包膜粗糙面引入有活性层。
在上述技术方案中，本发明提供的一种可吸收生物膜的制备方法制备获取的可吸收生物膜有足够的力学性能支撑软组织的压力，阻止上皮细胞和纤维细胞等侵入骨缺损区，有适当的厚度和孔隙率，使膜具有良好的贴合性和舒适性，利于氧气、营养物质、生物活性物质向组织扩散，促进细胞生长。具有良好的生物相容性，不会引起机体的排异和炎症反应。具有一定的骨诱导骨传导功能，以促进缺损骨的修复，缩短治疗周期，减少病人的痛苦和经济心理负担。具有抗菌性，能够控制种植体周围炎症，降低感染率。即该可吸收生物膜的制备方法以猪心包膜为支架，在心包膜光滑面和粗糙面分别引入抑菌层和活性层，在保持机械性能和生物相容性优势的基础上，既能起到抗菌作用，又能诱导骨组织的修复再生。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的一种可吸收生物膜的制备方法流程示意图；
图2为本发明实施例提供的未脱细胞猪心包病理染色图；
图3为本发明实施例提供的脱细胞后可吸收生物膜的病理染色图。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合附图对本发明作进一步的详细介绍。
实施例一，请参阅图1-3，本发明实施例提供一种技术方案：一种可吸收生物膜的制备方法，包括以下步骤；
S1：猪心包层的制备，采用0.1-0.5%胰蛋白酶，在37℃、80-180rpm震荡2-5h，脱除大猪心包层部分细胞，去除端肽，然后使用纯化水清洗6次后，再用0.1%-1%SDS室温80-180rpm震荡1-4h，然后使用纯化水清洗10次；猪心包膜由三层结构组成：浆膜层、纤维层和间质层，浆膜层靠近心脏，覆盖一层间皮细胞，纤维层是心包的主要成分，这两层的胶原结构较为细腻光滑孔隙致密，一般被称为光滑面，间质层为一些结缔组织与脂肪等连接，这层胶原结构粗大、质地粗糙，被称为粗糙面。目前国内外均有心包制备的膜类产品用于人体组织修复，猪心包作为异种生物组织，引起免疫原性的主要原因一是动物源性细胞成分，二是组成猪心包的胶原蛋白的端肽区也具有一定的免疫原性，可选的，脱细胞还可以采用物理法，如搅拌或震荡、低渗和高渗，化学法有酸和碱、去垢剂，酶法有胰蛋白酶等。
S2：促生长层的制备，将脱细胞后的猪心包层粗糙面朝上放置于平皿中，加入生物活性因子溶液，室温孵育2-4h，然后将孵育好的猪心包膜进行冻干处理；
S3：凝胶层的制备，将聚乙二醇、壳聚糖（或聚乙烯醇、海藻酸钠）和抗生素混合除泡后制备成凝胶液，将冻干后的复合膜猪心包光滑面朝上，浇注凝胶液。水凝胶是一种三维亲水性网络状聚合物，具有半通透性，可以吸收大量的水或生物体液，能够阻隔细菌，防止感染。水凝胶所具有的高含水量和柔软结构，相比其他人工合成的生物材料，更类似于活体组织，因此可应用于生物和医学工程领域。
步骤S3凝胶层的制备后还包括：S4：最终成型，将上述制备的可吸收生物膜用气动压力机压制平整，压力为300-1000N，压制时间为5-20s获得可吸收生物膜。
步骤S4最终成型后还包括：S5：包装灭菌，将可吸收生物膜包装后辐照灭菌，剂量为5-20kGy。
步骤S2中生物活性因子为肝素、骨形态发生蛋白-2、骨形态发生蛋白-9、血管内皮生长因子（VEGF）以及血小板衍生生长因子（PDGF）其中的一种或两种。
步骤S2中将孵育好的猪心包膜进行冻干处理具体包括以下步骤：
S2.1：预冻，保持温度为-20℃进行预冻，预冻时间为2-8h；
S2.2：冻干，升华干燥温度为-20--10℃，解析干燥温度为10-30℃，冻干时间至少为24h。
步骤S3中抗生素为四环素、庆大霉素、氯霉素其中的一种。
步骤S3中浇注凝胶液具体方法为：使用可调式涂布器在复合膜猪心包光滑面进行浇注涂布凝胶层，凝胶层的厚度为0.5-1mm，涂布完成后在室温下静置5-12h。
步骤S3制备凝胶液为将聚乙烯醇、海藻酸钠和抗生素混合除泡后制备成凝胶液，将冻干后的复合膜猪心包光滑面朝上，浇注凝胶液。
实施例二：
一种可吸收生物膜的制备方法，包括以下步骤；
S1：猪心包层的制备，采用0.1%胰蛋白酶，在37℃、180rpm震荡3h，脱除大猪心包层部分细胞，去除端肽，然后使用纯化水清洗6次后，再用0.1%SDS室温180rpm震荡3h，纯化水清洗10次；
S2：促生长层的制备，将脱细胞后的猪心包层粗糙面朝上放置于平皿中，加入入肝素、骨形态发生蛋白-2混合液，室温孵育4h，然后将孵育好的猪心包膜进行冻干处理；
S3：凝胶层的制备，将聚乙二醇、壳聚糖和四环素混合除泡后制备成凝胶液，将冻干后的复合膜猪心包光滑面朝上，浇注凝胶液。
步骤S3凝胶层的制备后还包括：S4：最终成型，将上述制备的可吸收生物膜用气动压力机压制平整，压力为300N，压制时间为20s获得可吸收生物膜。
步骤S4最终成型后还包括：S5：包装灭菌，将可吸收生物膜包装后辐照灭菌，剂量为20kGy。
步骤S2中将孵育好的猪心包膜进行冻干处理具体包括以下步骤：
S2.1：预冻，保持温度为-20℃进行预冻，预冻时间为2h；
S2.2：冻干，升华干燥温度为-20℃，解析干燥温度为30℃，冻干时间为24h。
步骤S3中浇注凝胶液具体方法为：使用可调式涂布器在复合膜猪心包光滑面进行浇注涂布凝胶层，凝胶层的厚度为0.5mm，涂布完成后在室温下静置5h。
实施例三：
一种可吸收生物膜的制备方法，包括以下步骤；
S1：猪心包层的制备，采用0.5%胰蛋白酶，在37℃、80rpm震荡3h，脱除大猪心包层部分细胞，去除端肽，然后使用纯化水清洗6次后，再用0.5%SDS室温80rpm震荡2h，纯化水清洗10次；
S2：促生长层的制备，将脱细胞后的猪心包层粗糙面朝上放置于平皿中，加入入肝素、骨形态发生蛋白-9混合液，室温孵育2h，然后将孵育好的猪心包膜进行冻干处理；
S3：凝胶层的制备，将聚乙烯醇、海藻酸钠、庆大霉素混合除泡后制备成凝胶液，将冻干后的复合膜猪心包光滑面朝上，浇注凝胶液。
步骤S3凝胶层的制备后还包括：S4：最终成型，将上述制备的可吸收生物膜用气动压力机压制平整，压力为1000N，压制时间为8s获得可吸收生物膜。
步骤S4最终成型后还包括：S5：包装灭菌，将可吸收生物膜包装后辐照灭菌，剂量为15kGy。
步骤S2中将孵育好的猪心包膜进行冻干处理具体包括以下步骤：
S2.1：预冻，保持温度为-20℃进行预冻，预冻时间为4h；
S2.2：冻干，升华干燥温度为-20℃，解析干燥温度为10℃，冻干时间为30h。
步骤S3中浇注凝胶液具体方法为：使用可调式涂布器在复合膜猪心包光滑面进行浇注涂布凝胶层，凝胶层的厚度为1mm，涂布完成后在室温下静置6h。
实施例四：
一种可吸收生物膜，其由权利要求1-8任一项所述的一种可吸收生物膜的制备方法制备获得，其特征在于，包括猪心包膜，所述猪心包膜的光滑面引入有抑菌层，所述猪心包膜粗糙面引入有活性层。
实验例，将实施例三制备辐照后的可吸收生物膜剪裁为1cm×3cm的长条，两端分别夹到拉力试验机的夹具中，夹具间距10mm，以50mm/min的速度进行拉伸，直到断裂。计算样品的拉伸强度和断裂伸长率，如下表：
表一：可吸收生物膜的拉伸强度和断裂伸长率检测表：
根据上表结果显示可吸收生物膜的拉伸强度大于5MPa，断裂伸长率大于10%，达到市场上同类产品的技术要求
按照中华人民共和国卫生部《消毒技术规范》2002版2.1.11.3产品杀菌性能、抑菌性能及其稳定性鉴定检测可吸收生物膜抑菌性能：
表二：可吸收生物膜的抑菌性能检测表：
根据上表结果显示可吸收生物膜具有显著的抑菌性能。
以上只通过说明的方式描述了本发明的某些示范性实施例，毋庸置疑，对于本领域的普通技术人员，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以用各种不同的方式对所描述的实施例进行修正。因此，上述附图和描述在本质上是说明性的，不应理解为对本发明权利要求保护范围的限制。
Claims (7)
1.一种可吸收生物膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤；
S1：猪心包层的制备，采用0.1-0.5%胰蛋白酶，在37℃、80-180rpm震荡2-5h，脱除大猪心包层部分细胞，去除端肽，然后使用纯化水清洗6次后，再用0.1%-1%SDS室温80-180rpm震荡1-4h，然后使用纯化水清洗10次；
S2：促生长层的制备，将脱细胞后的猪心包层粗糙面朝上放置于平皿中，加入生物活性因子溶液，室温孵育2-4h，然后将孵育好的猪心包膜进行冻干处理；
所述步骤S2中生物活性因子为肝素、骨形态发生蛋白-2、骨形态发生蛋白-9、血管内皮生长因子（VEGF）以及血小板衍生生长因子（PDGF）其中的一种或两种；
所述步骤S2中将孵育好的猪心包膜进行冻干处理具体包括以下步骤：
S2.1：预冻，保持温度为-20℃进行预冻，预冻时间为2-8h；
S2.2：冻干，升华干燥温度为-20--10℃，解析干燥温度为10-30℃，冻干时间至少为24h；
S3：凝胶层的制备，将聚乙二醇、壳聚糖和抗生素混合除泡后制备成凝胶液，将冻干后的复合膜猪心包光滑面朝上，浇注凝胶液。
2.根据权利要求1所述的一种可吸收生物膜的制备方法，其特征在于，所述步骤S3凝胶层的制备后还包括：
S4：最终成型，将上述制备的可吸收生物膜用气动压力机压制平整，压力为300-1000N，压制时间为5-20s获得可吸收生物膜。
3.根据权利要求2所述的一种可吸收生物膜的制备方法，其特征在于，所述步骤S4最终成型后还包括：
S5：包装灭菌，将可吸收生物膜包装后辐照灭菌，剂量为5-20kGy。
4.根据权利要求1所述的一种可吸收生物膜的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中抗生素为四环素、庆大霉素、氯霉素其中的一种。
5.根据权利要求1所述的一种可吸收生物膜的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中浇注凝胶液具体方法为：使用可调式涂布器在复合膜猪心包光滑面进行浇注涂布凝胶层，凝胶层的厚度为0.5-1mm，涂布完成后在室温下静置5-12h。
6.根据权利要求1所述的一种可吸收生物膜的制备方法，其特征在于，所述步骤S3制备凝胶液，将聚乙二醇、壳聚糖替换为聚乙烯醇、海藻酸钠制备成凝胶液，将冻干后的复合膜猪心包光滑面朝上，浇注凝胶液。
7.一种可吸收生物膜，其由权利要求1-6任一项所述的一种可吸收生物膜的制备方法制备获得，其特征在于，包括猪心包膜，所述猪心包膜的光滑面引入有抑菌层，所述猪心包膜粗糙面引入有活性层。
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